JP2016535282A - 酵素の切断活性の検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、酵素の切断活性の検出に関する。本発明の種々の態様は、基質を切断できる酵素の活性の試験検体中における存在を検出または測定するための酵素検出デバイス、キット、方法および使用を含む。本発明はまた、本発明を実施するのに有用な指示薬および結合分子に関する。酵素基質は、酵素による切断時にのみ示される隠れた結合部位を含む。

Description

本発明は、酵素の切断活性の検出に関する。本発明の種々の態様は、基質を切断できる酵素の活性の試験検体中における存在を検出または測定するための酵素検出デバイス（device）、キット、方法および使用を含む。本発明はまた、本発明を実施するのに有用な指示薬および結合分子に関する。

酵素は、生体内の化学反応を触媒することに関与するタンパク質のファミリーを構成する。それらの重要性により、酵素レベル、および重要なことには酵素活性を測定することが必要および／または有益である状況が多数ある。

特に、酵素活性の増加は、特定の病態および／または疾患に相関することが分かっている。例えば、上方制御プロテアーゼ活性は、癌進行の多くの態様に関係している。したがって、特定の病態を有するかまたは特定の病態もしくは疾患を有する疑いがある個体から採取された検体中における酵素活性の測定は、予測的または診断的な目的に有用であり得る。

酵素ファミリー内に基質切断を促進することにより作用するたくさんのクラスの酵素がある。例えば、ペプチダーゼおよびプロテアーゼは、それぞれの基質内のペプチド結合の加水分解を触媒する。従来、研究者らは、場合によっては最初の酵素基質からの断片または「脱離基」の放出を測定するキットまたはデバイスを用いてこの種の活性を測定しようとした。

この基本原理に基づくアッセイは、場合によっては発明者らがレポーター部分に結合する改変基質分子を記載してきたように改良されてきた。検出される酵素による基質の切断が存在する場合、当業者が利用できる様々な技術により検出できる該レポーターの放出を引き起こす。この種のアッセイは、例えば特許文献1に記載されている。

他の者は、酵素基質の修飾形態と未修飾形態を識別する原理に基づく酵素活性の測定のためのアッセイを開発しようとした。この点に関して、特許文献2には、検出可能な標識を伴う「基質認識分子」（SRM）を利用する酵素検出デバイスが記載されており、ここで該SRMは、未修飾状態で特異的に酵素基質に結合し、その際に酵素の基質への結合を示す。

特許文献3には、HIVプロテアーゼを抑制する化合物を同定するための方法が記載されている。当該方法は、競合的結合放射線免疫検定法に基づく。特許文献4には、酵素などの反応生成物誘発物質の存在を示すための反応生成物検出方法が記載されている。

米国特許出願公開第2006/0003394号 国際公開第2009/024805号 米国特許第5,171,662号 米国特許出願公開第2005/0164311号

（発明の明示）
本発明は、プロテアーゼ活性検出の感度および／または特異性を向上させようとすることより生じる。特に、尿および環境検体などのある試験検体において、プロテアーゼは非常に低濃度で存在し得る。本明細書に記載のデバイスおよび方法は、低いレベルまたは濃度におけるプロテアーゼ活性の検出を可能にすることを目的とする。特定の切断生成物にのみ結合し、未切断の指示薬分子には結合しない結合分子、例えば抗体の使用は、試験検体（特に尿検体）中において低濃度でプロテアーゼ活性の検出を可能にすることを見出した。特許請求の範囲に記載のフローデバイスに関連して、検出の特異性に影響を与えることなく試薬を過剰に用いることができる特定のアッセイを実施できる。特許請求の範囲に記載のフローデバイスが、診断に関して、類似の酵素免疫捕捉および活性アッセイが提供しない有用な結果を提供することもまた示されている。理論によって拘束されるものではないが、これは異なる手順全体にわたって異なる結合効率によるものであり得る。

したがって、一態様において、本発明は、基質を切断できる酵素の試験検体中における切断活性の存在を検出するための酵素検出デバイスであって、
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子；
(ii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン；ならびに
(iii) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、デバイスを提供する。

同様に、本発明は、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための酵素検出デバイスであって、
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる、指示薬分子；
(ii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンであって、指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン；ならびに
(iii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、デバイスを提供する。

したがって切断領域の2つの部分は、切断部位において互いから分離される。切断部位における切断事象は、新しい結合部位を生じる。

本発明はさらに、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における有無を検出するための方法であって、
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる）；
(ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること（ここで該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む、方法を提供する。

同様に、本発明はまた、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における有無を検出するための方法であって、
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる）；
(ii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子を試験検体に加えること（ここで該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の該部分への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む、方法を提供する。

本発明のデバイスおよび方法は、呼吸器病態の診断の分野における特定の適用を有することが発明者らにより示された。それ故に、本発明はさらに、基質を切断できる酵素の切断活性を検出することにより試験検体中における呼吸器病態（の有無）を診断するための方法であって、
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる）；
(ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること（ここで該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること（ここで、コントロールと比較して切断のレベルが増加することによって呼吸器疾患を診断する）
を含む、方法を提供する。

本発明はまた、基質を切断できる酵素の切断活性を検出することにより試験検体中における呼吸器病態（の有無）を診断するための方法であって、
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる）；
(ii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子を試験検体に加えること（ここで該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の該部分への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること（ここでコントロールと比較して切断のレベルが増加することによって呼吸器疾患を診断する）
を含む、方法を提供する。

特定の実施態様において、呼吸器病態は炎症性呼吸器病態である。

特定の実施態様において、呼吸器病態は、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性線維症が原因の気道（特に肺）の炎症である。本発明者らは、本発明のデバイスおよび方法が呼吸器病態の指示薬として切断活性の上昇を測定するのに有効に適用されることができることを明細書に示す。切断活性のバックグランドレベルを考慮するために、当該方法は、試験検体中の切断の測定レベルをコントロールと比較することを含む。典型的にコントロールは、健常な対象体における切断活性の対応するレベルを示す。「健常な対象体」は、呼吸器病態を患っていない対象体を意味する。コントロールは、適合する健常なコントロールから採取された対応する試験検体中にあり得る。あるいは、コントロールは、様々な健常者および疾患患者において切断活性を測定することによる切断セットの閾値レベルであり得る。閾値を設定するための適切な方法は、当業者に周知である。閾値を、患者データのトレーニングセットから数学的に導き得る。したがって、スコア閾値は、呼吸器病態の有無によって試験検体を分ける。この数の解釈、すなわちカットオフ閾値は、既知の結果を有する患者のセットからの発達またはトレーニング段階に由来してもよい。したがって閾値は、当業者に公知の方法によりトレーニングデータから特許請求の範囲に記載の方法の実施の前に固定されてもよい。

本発明の酵素検出デバイスは、即時使用可能な形式で提供されてもよい。あるいは、本質的な構成要素は、酵素検出デバイスの組立てのための適切な試薬および／または指示書を適宜一緒に有する部品のキットとして提供されてもよい。したがって、別の一態様において、本発明は、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための酵素検出キットであって、
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子；
(ii) 指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子；
(iii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンを形成するために捕捉分子が結合し得る（すなわち結合することができるかまたは結合している）固体支持体；ならびに
(iv) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、キットを提供する。

別の一態様において、本発明は、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための酵素検出キットであって、
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
(b) 捕捉部位；
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる、指示薬分子；
(ii) 指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子；
(iii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンを形成するために捕捉分子が結合し得る（すなわち結合することができるかまたは結合している）固体支持体；ならびに
(iii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、キットを提供する。

関連する態様において、本発明はまた、試験検体における呼吸器病態を診断するための本明細書に記載および定義される酵素検出デバイスの使用を提供する。同様に、本発明はまた、試験検体における呼吸器病態を診断するための本明細書に記載および定義される方法の使用を提供する。本発明はさらに、試験検体における呼吸器病態を診断するための本明細書に記載および定義される酵素検出キットの使用を提供する。これらの使用の各々において、呼吸器病態は、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性線維症が原因の気道の炎症であり得る。

したがって、本発明の態様の多くの中心は指示薬分子である。指示薬分子は、少なくとも1つの切断部位を含む切断領域を含む。切断部位は、関連する酵素切断活性を有する試験検体中の任意の1または複数の酵素により切断される。酵素が検体中に存在する場合、切断が効率的であることを確かにするために、切断領域は切断部位に対して適切な状況を提供する。特定の実施態様において、切断領域はペプチドである。プロテアーゼ切断部位であるペプチド結合に加えて、ペプチド中の更なるアミノ酸が切断の特異性および感度を確かにし得る。ある特定の実施態様において、特に指示薬分子が構造上拘束される場合、例えばそれがまた足場分子を含む場合、切断領域は多数の切断部位を含み得る。

指示薬分子はまた、捕捉部位（少なくとも1つの捕捉部位を包含することを意図する）を含む。捕捉部位は、捕捉ゾーンにおいて切断か未切断かにかかわらず指示薬分子の固定化を可能にする指示薬分子の孤立領域である。捕捉部位を本明細書の以下においてより詳細に説明する。

指示薬分子はまた、以下でより詳細に説明する足場分子を含んでもよい。

指示薬分子の切断は、指示薬分子を分裂して、少なくとも1つの新しい結合部位を現わすかまたは形成する。したがって切断領域の2つの部分は、切断部位において相互に分離される。典型的に、新しい結合部位は、切断の結果として生じる配座エピトープを含む。新しく現れた1または複数の結合部位に特異的に結合し、切断前の指示薬分子に結合しない結合分子の使用は、酵素の切断活性の特異的で感応的な検出を可能にする。したがって、いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位の切断は、指示薬分子の少なくとも1つの部分が捕捉部位を含み（または捕捉部位とつながったままである）、切断の結果として結合分子のための結合部位を含み、ここで当該結合分子は切断が生じるまで結合部位に結合できない、指示薬分子（または指示薬分子の切断領域）の少なくとも2つの部分を生じる。言い換えれば、結合部位は、切断部位で切断が生じるまで隠されているかまたは形成されない。

いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位の切断は、指示薬分子の（切断領域の）少なくとも2つの別々の部分を生じる。したがって、切断は、少なくとも2つの部分または断片：捕捉部位を含むかまたはそれとつながった1つの部分または断片、および捕捉部位を含まないかまたはそれとつながっていない別の部分または断片を生じ得る。結合分子は、捕捉部位を含有するかまたは包含する指示薬分子の1または複数の部分上の新しい結合部位に結合する。これは、捕捉分子に結合することにより指示薬分子の捕捉部位における切断の特異的な検出を可能にする（すなわち結合分子の結合が捕捉ゾーンにおいて検出される）。

しかしながら、切断が結合分子のための新しい結合部位を生じ、結合分子が切断が生じるまで結合部位に結合できない場合、（切断部位における）切断が少なくとも2つの完全に分離した分子を生じることは不可欠ではない。したがって切断は、切断部位において分離される切断領域の2つの部分を生じる。したがって、いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも2つの部分が（各部分に対して）直接的または間接的いずれかで捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる。これを図16Aに概略的に示す。特定の実施態様において、指示薬分子は、少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分を生じるように、切断部位から離れたまたは切断領域の外側の更なる結合またはつながりを含む。これは、切断が、少なくとも1つの部分が更なる結合またはつながりによってつながったままではない少なくとも3つの断片を生じる可能性を除外しない。これは、特に切断領域が2以上の切断部位を含み得る場合である。これを図16Bに概略的に示す。いくつかの実施態様において、更なる結合またはつながりはジスルフィド結合を含み得る。指示薬分子に結合する足場分子の使用は指示薬分子内に更なる結合またはつながりを提供することを見出した。該足場分子は、切断が生じた後でのみ指示薬分子に結合する結合分子を生じさせるのに有用な構造的拘束として作用し得る。理論によって拘束されるものではないが、構造的拘束は、切断部位における切断が生じるまで存在しない特異的で再生可能な結合部位を生じるのを助けると考えられる。足場分子は、本明細書でより詳細に説明するとおり指示薬分子の切断前後の空間配座の差異を高め得る。足場はまた、切断後の特定の空間配座において切断された指示薬分子を含み得る。これは、結合分子が狙うことができるかまたは引き起こすことができる切断後に明確に定義された異なる分子を提供することにより切断および未切断の指示薬分子を識別する結合分子に関して、検出の特異性を向上させるのを助け得る。したがって、いくつかの実施態様において、結合分子は切断領域に結合する。したがって、特定の実施態様において、結合部位は切断後の切断部位の両側（すなわち切断領域の少なくとも2つの部分）を包含し得る。結合分子は、切断後の指示薬分子の該部分両方に結合し得る。

したがって、本発明はまた、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するのに用いるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；
(b) 捕捉部位；および
(c) 切断部位の外側で、例えば切断領域の外側で指示薬分子の少なくとも2つの部分をつなぐために作用する足場分子
を含む指示薬分子であり、該足場が、さらに、少なくとも1つの切断部位の切断が結合分子と結合するが、結合分子が切断が生じるまで指示薬分子に結合できない（新しい）結合部位を生じるように構造上指示薬分子を拘束するために作用する、指示薬分子を提供する。

本発明はまた、基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するのに用いるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断されて切断領域の少なくとも2つの部分を生じ得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；
(b) 捕捉部位；および
(c) 少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分を生じるように、指示薬分子の少なくとも2つの部分をつなぐために作用する足場分子
を含む指示薬分子であり、該足場が、さらに、少なくとも1つの切断部位の切断が結合分子と結合するが、結合分子が、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない（新しい）結合部位を生じるように構造上指示薬分子を拘束するために作用する、指示薬分子を提供する。

足場分子は、典型的に、酵素の切断活性が足場により抑制されないように、切断部位から離れた指示薬分子に結合する。したがって切断領域は、1以上のリンカーまたはスペーサー領域により足場分子から分離され得る。いくつかの実施態様において、これらのリンカーまたはスペーサー領域は捕捉部位を組み込み得る。用いられる足場分子および指示薬分子の性質に応じて更なる結合、例えば3、4、5または6個などの結合が用いられることが可能であるが、足場分子は典型的には2個の結合により指示薬分子に結合する。1つの足場分子が複数の指示薬分子に結合することも可能である。足場分子が、3以上のハロゲン置換基、特にブロモメチル置換基、例えば4または6個のブロモメチル置換基を含む場合の実施態様において、足場分子は、複数の指示薬分子に構造的拘束を与え得る。置換基の各ペアは、結合されて切断領域の少なくとも2つの部分をつなぎ得る。したがって足場は、効率的に多数の別々の切断領域を結合する（および構造上拘束する）。特定の実施態様において、指示薬分子は、拘束された2以上のペプチド（切断領域）を含む。切断領域はまた異なり得て、その結果1つの分子が異なる切断可能な配列を含む。ここで、2以上の別個の結合分子（例えば切断された基質に対して生じる抗体）を用いて個別のペプチド切断領域の切断を検出することが可能であってもよい。したがって、2以上のプロテアーゼが存在するときのみアッセイシグナルが必要とされる場合、別個の切断部位すべてが切断したとき結合分子（抗体）の結合だけが起こることが可能である。この場合、結合分子（抗体）は、2以上のプロテアーゼによる切断の後に指示薬分子の形成を生じなければならない。

足場分子は、指示薬分子（通常ペプチド）の切断末端または部分を拘束することを助け、結合分子（通常新しく現れたまたは生じたエピトープ、特に配座エピトープに結合する抗体）に新しい特異的な結合部位を生じる。したがって結合分子は、特に指示薬分子の切断末端もしくは部分または切断部位の両側のいずれか（すなわち切断領域内の切断部位のいずれかの側）に結合し得る。特定の実施態様において、足場はさらに、少なくとも1つの切断部位の切断が、結合分子が結合するが、結合分子が切断が生じるまで指示薬分子に結合できない指示薬分子の切断領域部分の両方を含む結合部位を生じるような方法で指示薬分子を構造上拘束するために作用する。特定の実施態様において、結合部位は切断部位を含む。特定の実施態様において、結合部位は指示薬分子の新しい構造的配座を表す。切断は、少なくとも1つの新しい配座エピトープを生じ得る。結合分子のための新しい結合部位は、酵素切断活性および捕捉が本質的に妨げられなければ指示薬分子のいずれの部分も含み得る。ある特定の実施態様において、結合部位は少なくとも切断領域の一部を含む。特定の実施態様において、結合部位は少なくとも足場分子の一部を含む。

ほとんどの実施態様において、切断部位はプロテアーゼによる切断に対して特異的である。しかしながら、本明細書で述べられるように、本発明の指示薬分子は、他の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素およびリアーゼにより切断され得て、該酵素としてはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、DNA分解酵素およびRNA分解酵素の下位カテゴリーが挙げられる。ある特定の実施態様において、切断部位はエンドペプチダーゼによる切断に特異的である。1以上の種々のプロテアーゼは、本発明により検出され得る。ある特定の実施態様において、切断部位はマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）による切断に特異的である。これは、特に尿検体中における検出を含む本発明の診断適用に適切である。MMPは亜鉛依存のエンドペプチダーゼである。それらは、細胞外マトリックスタンパク質を含む様々なタンパク質の切断に関与している。MMPとしては、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27およびMMP28が挙げられる。他の実施態様において、切断部位は、エラスターゼ、例えば（ヒト）好中球エラスターゼ（HNE）に特異的である。いくつかの実施態様において、多数のプロテアーゼ、例えば多数のMMPおよび／またはHNEと一緒に1以上のMMPに対する切断部位があり得る。適切なHNE基質は、アミノ酸配列：CQESIRLPGC（配列番号（SEQ ID NO）：3）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる。

この基質は、本発明の別の態様を形成する。基質は、固定化を促進するために更なる残基、例えば結合のためのフェニル基を提供するためにチロシン残基を含み得る。特に基質は、代替的な固定化学を用いることができるように、システイン残基を除く更なるアミノ酸残基を含み得る。したがって基質は、アミノ酸配列:YCQESIRLPGC（配列番号4）を含み得る。

いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる（biased）。これは、試験検体における特定のプロテアーゼ活性を検出するために本発明を利用することを可能にする。多くのプロテアーゼが知られており、それらの好ましい切断部位が多く報告されている。ある特定の実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる。より具体的には、いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる。少なくとも1つの切断部位は、MMP-13、9、2、12および8による切断にバイアスがかけられ得る。バイアスは、等しくMMP群に向けてであり得るか、あるいはこの特定の優先順であり得る。本明細書に示すように、特定の指示薬分子、および特定の優先順でこれら特定のMMPによる切断にバイアスがかけられる指示薬分子内の切断部位を狙うことが可能である。したがって、いくつかの実施態様において、切断部位はアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にある。これは指示薬分子の「切断領域」の特定の例と考えられ得る。これらの実施態様において、切断は、アミノ酸配列GPQGを含む指示薬分子の切断領域の一部およびアミノ酸配列IFQGを含む指示薬分子の切断領域の一部を生じる。いずれの部分も捕捉部位につながる部分であり得る。特定の実施態様において、指示薬分子はアミノ酸配列CGPQGIFGQC（配列番号2）を含む。システイン残基の包含は、様々な足場分子ための好都合な結合点であるチオール基を提供する。いくつかの実施態様において、切断領域は、1以上のリンカーまたはスペーサー領域により足場分子のための結合点から分離され得る。したがって指示薬分子は、構造:

を含み得る。

いくつかの実施態様において、捕捉部位は一方または両方のスペーサー内で見られ得る。したがって、本発明の指示薬分子は、NおよびC末端においてまたはそれらの近くに適切なアミノ酸を含み、足場分子への結合を促進し得る。アミノ酸はチオール基を含んでもよい。適切な残基としては、システインおよびセレンが挙げられる。足場分子は、チオエーテル結合によって指示薬分子に結合し得る。

ペプチドに足場分子を結合するための様々な適切な足場分子および方法が、国際公開第2004/077062号および国際公開第2008/013454号に記載されており、これらの関連する開示は、出典明示により本明細書の一部とする。本発明は、切断部位与え、切断後に試験検体中における酵素切断活性（特にプロテアーゼ活性）の検出を可能にする新しい結合部位を生じる新しい方法でこれらの足場分子を用いる。

ある特定の実施態様において、足場分子は（ヘテロ）芳香族分子を含む。より特定の実施態様において、（ヘテロ）芳香族分子は少なくとも2つのハロゲン化ベンジル置換基を含む。いくつかの実施態様において、足場分子はハロメチルアレーンであり、例えばハロメチルアレーンは、ビス(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)ベンゼンおよびテトラ(ブロモメチル)ベンゼンからなる群、またはそれらの誘導体より選択される。特定の実施態様において、当該足場は、オルト-、メタ-およびパラ-ジハロキシレンならびに1,2,4,5-テトラハロデュレンからなる群より選択され、例えばメタ-1,3-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（m-T2）、オルト-1,2-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（o-T2）、パラ-1,4-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（p-T2）、メタ-1,3-ビス(ブロモメチル)ピリジン（m-P2）、2,4,6-トリス(ブロモメチル)メシチレン（T3）、メタ-1,3-ビス(ブロモメチル)-5-アジドベンゼン（m-T3-N3）および／または 1,2,4,5-テトラブロモデュレン（T4）が挙げられる。

ハロメチルアレーンの適切な誘導体としては、オルト、メタおよびパラ-ビス(ブロモメチル)ベンゼンが挙げられる。より具体的には1,2-ビス(ブロモメチル)ベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)ベンゼンおよび1,4-ビス(ブロモメチル)ベンゼンが挙げられる。さらに置換されたハロメチルアレーンとしては、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン、1,2,4,5-テトラキス(ブロモメチル)ベンゼンおよび1,2,3,4,5,6-ヘキサキス(ブロモメチル)ベンゼンが挙げられる。多環式ハロメチルアレーンとしては、2,7-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,4-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,8-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,3-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,2-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、2,3-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、2,6-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,2,3,4-テトラキス(ブロモメチル)-ナフタレン、9,10-ビス(ブロモメチル)-フェナントレン、5,10-ビス(ブロモメチル)-アントラセン、および1-(ブロモメチル)-3-[3-(ブロモメチル)ベンジル]ベンゼンが挙げられる。メチル置換ハロメチルアレーンとしては、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-メチルベンゼン、2,5-ビス(ブロモメチル)-1,3-ジメチルベンゼン、2,5-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメチルベンゼン、2,4-ビス(ブロモメチル)-1,3,5-トリメチルベンゼンおよび3,6-ビス(ブロモメチル)デュレンが挙げられる。ニトロ置換ハロメチルアレーンとしては、3,4-ビス(ブロモメチル)-ニトロベンゼンおよび2,3-ビス(ブロモメチル)-ニトロベンゼンが挙げられる。ヒドロキシ置換ハロメチルアレーンとしては、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-ヒドロキシベンゼンが挙げられ、シアノ置換ハロメチルアレーンとしては、2,6-ビス(ブロモメチル)-ベンゾニトリルが挙げられる。メトキシ置換ハロメチルアレーンとしては、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-メトキシベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)-2-メトキシ-5-メチルベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-ヒドロキシベンゼン、2,3-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメトキシベンゼン、および2,5-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメトキシベンゼンが挙げられる。

本発明の指示薬分子において使用するためのいくつかの適切な足場分子を、図14に示す。多くの特定の適切な指示薬分子をまた、命名案と一緒に図15に示す。

合成での使用の相対剛性および容易さのため、ハロメチルアレーン誘導体が、本発明における足場分子として作用する好ましい候補である。それらは、特に拘束されたペプチド基質を生成するのに好都合である。しかしながら、ペプチドなどの指示薬分子を「環化する」他の適切な化学作用を想定することができる。チオールを含むペプチド場合（例えばシステインの形態において）、1つのジスルフィド結合の形成またはジエポキシド誘導体は、構造の共有結合閉鎖に影響を及ぼすために用いられ得る。別の適切な化学作用としては、安定なトリアゾールを形成するアジドとアルキン間の付加環化反応を含む「クリックケミストリー」法が挙げられる。ここで例えば、2個のアジドリシンアミノ酸を有するペプチドは、分子内でジアルキン試薬により架橋し得る。該反応は銅により触媒されることができる。しかしながら、直鎖アルキンが用いられるような場合のいくつかの例において触媒は必要とされない。更なる化学的経路としては、安定なヒドラゾンの形成が挙げられる。2個のフェニルヒドラジン部分を含む指示薬分子（特にペプチド）は、分子内でジアルデヒド試薬によって架橋し得る。更なる化学的経路は、2個のチロシンアミノ酸を含むペプチドベースの指示薬分子によって可能である。これらのペプチドは、分子内でビス（ジアゾ）足場を用いて架橋されて、対応するジアゾ付加物を形成し得る。

足場分子はまた、さらに、切断部位の酵素切断後の新しい結合部位の生成を促進するために官能基または反応基を含み得る。したがって、切断部位における切断後に、もはや切断部位により互いにつながっていない指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分がある。1以上のこれらの「遊離」部分は、さらに足場分子との相互作用により拘束され得る。これは、分子全体の構造における重要な変化を生じ得る。これは、次に切断前に指示薬分子と交差反応しない特定の結合分子が生成されることを可能にする。したがって、例として足場分子により拘束されるペプチドの場合、切断部位の切断後の特定の配座変化を想定できる。ペプチド鎖中の所与の自由度は、新しい安定な配座における非共有結合相互作用によりそれが自己組織化することを可能にし得て、該分子に特有で結合分子（例えば切断された基質に対して生じる抗体）により認識される新しい配座エピトープを生じる。これらの非共有結合相互作用は、足場分子におけるアミノ酸側鎖と芳香環との間の疎水性相互作用を含み得る。非共有結合相互作用は、さらに、例えば負電荷を持つニトロ置換基が切断領域内に含まれる正電荷を持つアミノ酸、例えばリシン、アルギニンまたはヒスチジンと相互作用できるような広範な置換パターンを有する足場において強められ得る。水素結合相互作用は、メトキシおよび／またはヒドロキシルアリール置換基と、セリン、スレオニンおよびチロシンを含む多くのアミノ酸との間で可能である。加えて、切断領域の2個の切断されたペプチド部分は、切断後に二次構造、例えばヘリックスまたはベータ鎖構造を含む互いと自由に自己組織化できてもよい。更なる実施態様において、上記のペプチド-ペプチド相互作用およびペプチド-足場相互作用の両方の組合せは、結合分子により認識される新しい結合部位を生じ得る。該相互作用は、三次元空間においてその未切断の「閉じた」形態および切断後のその「開いた」形態間の構造を識別することに役立ち、それ故に切断指示薬分子および結合分子（例えば切断ペプチド生成物に対して生じる抗体）間の相互作用の特異性を有意に高める。相互作用の得られる高い特異性は、結合分子が未切断指示薬分子（例えば未切断ペプチドへの結合から切断ペプチドに対して生じる抗体）に結合する危険性なく過剰な指示薬分子の使用を促進するため、検体内の酵素切断活性の検出の感度に有用である。

足場は、1以上の切断部位における切断を防止してはならない。いくつかの実施態様において、足場は指示薬分子（の切断領域）を適応させて、切断部位における切断の効率を最適化または改善し得る。足場は、切断領域を効率的に固定または拘束して、検出される酵素活性に好ましい方法で切断部位を示し得る。任意の所与の基質の切断における足場分子の効果は、単純な経時的実験により容易に試験されることができる。試験は、適切な時間（例えば5〜10分間）内に酵素の存在下で切断が生じるかを測定し得る。この試験は、逆相分析カラム上で別に保持される（異なる分子量を有する）新しく加水分解された分子を生成するので、例えば適宜HPLCと組み合わせたマススペクトル解析により特定されることができる。その後、足場分子を組み込む指示薬分子は、例えば精製された切断形態において免疫原として製造され得る。これは、適切な動物、例えばヒツジにおいて遊離ペプチドまたは担体タンパク質との結合物のいずれかとして抗体を生じるために用いられることができる。その後、固定化抗原に対するELISAにより抗血清を特徴付けることができ、アフィニティー精製して、切断指示薬分子に対して特異的なポリクローナル反応を改良するために抗原カラムを用いることができる。その後、完全な指示薬分子は、本発明の方法により試験されてもよい。

本発明の特定の指示薬分子は図面に示され、システイン残基のチオール基がハロメチルアレーン基との結合によりペプチドを環化するために用いられる配列番号3または配列番号4のアミノ酸配列を含む。したがって本発明の指示薬分子は、次の式Iとして記載される（および図23に示される）構造を含み得る。

切断された型は、次の式IIに示される（そして図23にも示される）。

いくつかの実施態様において、指示薬分子は式IおよびIIで示されるチロシン残基を欠く。このチロシン残基はHNE活性に必要とされない。

本発明における使用のための様々な適切な結合分子は本明細書に記載されており、説明はこれに準用される。典型的に結合分子は抗体を含む。

誤解を避けるために、これらの指示薬分子は、本発明の他の態様のいずれか（デバイス、キット、方法、使用など）において用いられてもよい。

全体として本発明に関連して、1以上の切断部位は、酵素切断可能な結合が存在する任意の部位であり得る。例えば、この結合は指示薬分子の隣接残基間に存在し得る。該残基は、ヌクレオチド、単糖およびアミノ酸より選択され得る。指示薬分子は典型的にペプチド切断領域を含む。したがって、いくつかの実施態様において、切断領域はアミノ酸の配列を含む。本発明の好ましい実施態様において、切断部位は2個のアミノ酸残基間に位置する特定のペプチド結合である。

本発明の更なる実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質または核酸の切断領域内に位置する。ある特定の実施態様において、指示薬分子が酵素の天然基質またはその一部を含み、酵素がその天然の切断部位を提示され、適宜切断領域内で天然の状態にあるように、指示薬分子は改良され得る。ある特定の他の実施態様において、指示薬分子が人工的または非天然の切断部位および／または基質領域を含むように、指示薬分子は改良され得る。例えば、酵素により示される切断活性の割合または切断活性の特異性が、酵素の天然基質に対して比較可能な条件下で測定される酵素の切断活性の割合および／または特異性に対して増加（または減少）するように、指示薬分子中の切断部位は改良または変異され得る。

本発明のある特定の実施態様において、切断領域は、任意の1つの部位における切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる多数の切断部位を含み得る。本発明に関連して、用語「多数の」は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4などを意味する。ある特定の実施態様において、指示薬分子の切断領域は、2、3、4、5から10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、100、500または1000の間の切断部位を含む。いくつかの実施態様において、指示薬分子は、2から5、6、7、8、9または10の間の切断部位を含む。

一実施態様において、多数の切断部位がすべて同一であってもよい。この配置において、繰り返される切断部位は、上記で定義する1の酵素または酵素サブタイプに対して比較的非特異的であり得るか、あるいは非常に特異的であり得る。さらに、このタイプの指示薬分子の使用は、試験検体内に存在する切断部位の濃度を増加させる方法を提供することにより酵素検出デバイスの感度の増加に役立つ。

他の実施態様において、指示薬分子の切断領域は、同一指示薬分子内に存在する少なくとも2つの異なる切断部位がある多数の切断部位を含み得る。本発明の好ましい実施態様において、指示薬分子は、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、および少なくとも8つまでの異なる切断部位を含み得る。

さらに好ましい実施態様において、本発明のデバイスが多数の異なる酵素の活性を検出するために用いられることができるように、異なる切断部位は、上記で定義する異なる酵素または酵素の異なるカテゴリー、サブカテゴリーもしくはサブタイプにより認識される。酵素活性の検出が有用な結果を与えるように、活性は分類され得る。例えば、1以上の酵素基の関連する活性の検出が診断的に有用であるように、酵素群は疾患の状態に関係し得る。

（同一または異なっている）多数の切断部位の使用は、特に試験検体中においてとても低いレベルの酵素活性を検出する状況に有用であり得る。例えば、上記で定義する多数の切断部位を有する指示薬分子は、低いレベルのプロテアーゼを含む尿検体中において酵素活性を検出するのに用いられ得る。多数の切断部位の使用はまた、指示薬分子が足場分子を組み込む場合、特に適用可能であり得る。

少なくとも1つの切断部位を含む切断領域に加えて、指示薬分子は捕捉部位を含む。捕捉部位は、捕捉ゾーン内に存在する捕捉分子への指示薬分子の結合を介在する。したがって、捕捉部位は、捕捉ゾーン内で指示薬分子を保持または局在化することに関与している指示薬分子の一部である。指示薬分子の切断後、捕捉部位がデバイスの捕捉ゾーン内に存在する捕捉分子により認識されて結合されるように、捕捉部位は完全または本質的に完全なままであり得る。これらの状況下において、完全な指示薬分子および切断後の捕捉部位を含む指示薬分子の一部は、捕捉ゾーン内で捕捉分子に結合されるだろう。捕捉部位は、任意の適切な分子、例えばビオチン分子を含み得る。足場分子が、捕捉ゾーンにおける指示薬分子の固定化を可能にするため捕捉部位の一部または全体を形成することも可能である。例えば、捕捉ゾーンは、足場分子に対して生じる抗体を、好ましくは指示薬分子に結合している形態で含み得る。これらの実施態様において、足場分子は結合分子への結合に本質的に関係しない。指示薬分子の有効性に重要なことは、捕捉ゾーンにおける捕捉部位と捕捉分子との間の相互作用による固定化および切断が生じた後の結合分子による同時結合である。足場分子が切断後に結合分子のための結合部位の一部を定義する場合のこれらの実施態様において、捕捉部位は、いずれかまたは両方の結合事象が妨害されることを防ぐために十分に識別されなければならない。

上記のように、切断部位は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質または核酸の切断領域内であり得る。本発明の特定の実施態様において、切断領域および捕捉部位は、ペプチドまたはタンパク質内の孤立アミノ酸またはアミノ酸群によって定義される。本明細書で用いる「ペプチド」は、（約）20、30、40または50以下のアミノ酸のアミノ酸長を意味することを意図する。

あるいは捕捉部位は、切断部位が位置する領域とは異なる指示薬分子の領域に存在し得る。したがって、本発明のある特定の実施態様において、捕捉部位は捕捉領域内に存在し得て、切断部位は指示薬分子の別の切断領域内に存在し得る。捕捉部位が指示薬分子の切断部位とは異なる領域にある場合の実施態様において、捕捉部位は、切断部位を含む分子の領域で見られるものと完全に異なる物質または残基を含み得る。例えば、切断領域はアミノ酸残基を含み得るが、捕捉部位はビオチン部分を含み得るかまたはそれからなり得る。さらに、指示薬分子が切断部位および捕捉部位を有する別々の領域を含む場合の実施態様において、該領域は、当業者に公知の任意の方法により結合され得る。好ましい実施態様において、該領域は、直接共有結合により結合され得る。該領域は直接に隣接してもよく、あるいはリンカーまたはスペーサー、例えばポリエチレングリコール部分により分離されてもよい。

本発明により検出される1または複数の酵素は、切断部位において指示薬分子を切断できなければならない。この活性は、指示薬分子が切断部位において切断され、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分を生じるために、必要とされる。したがって、本発明のいくつかの実施態様において、検出される1または複数の酵素は、酸化還元酵素、加水分解酵素およびリアーゼのカテゴリーより選択され、該酵素としてはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、DNA分解酵素およびRNA分解酵素の下位カテゴリーが挙げられる。特定の実施態様において、酵素はプロテアーゼである。ある特定の実施態様において、プロテアーゼはエンドペプチダーゼを含む。1以上の種々のプロテアーゼは本発明により検出され得る。ある特定の実施態様において、プロテアーゼはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）である。MMPは亜鉛依存のエンドペプチダーゼである。それらは、細胞外マトリックスタンパク質を含む様々なタンパク質の切断に関与している。MMPとしては、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27およびMMP28が挙げられる。他の実施態様において、切断部位は、エラスターゼ、例えば（ヒト）好中球エラスターゼ（HNE）に特異的である。いくつかの実施態様において、多数のプロテアーゼ、例えば多数のMMPおよび／またはHNEと一緒の1以上のMMPに対する切断部位があり得る。適切なHNE基質は、配列番号3または配列番号4のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなり、指示薬分子、例えば式IまたはIIで示される分子（チロシン残基を欠く形態を含む）に組み込まれ得る。

いくつかの実施態様において、本明細書で述べられるように、少なくとも1つの切断部位は、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる。これは、試験検体における特定のプロテアーゼ活性を検出するために本発明を利用することを可能にする。多くのプロテアーゼが知られており、それらの好ましい切断部位が多く報告されている。ある特定の実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる。より具体的には、いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位は、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる。少なくとも1つの切断部位は、MMP-13、9、2、12および8による切断にバイアスがかけられ得る。バイアスは、等しくMMP群に向けてであり得るか、あるいはこの特定の優先順であり得る。本明細書に示すように、特定の指示薬分子、および特定の優先順でこれら特定のMMPによる切断にバイアスがかけられる指示薬分子内の切断部位を狙うことが可能である。したがって、いくつかの実施態様において、切断部位はアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にあり、該配列は切断領域を形成する。これらの実施態様において、切断は、アミノ酸配列GPQGを含む指示薬分子の一部およびアミノ酸配列IFQGを含む指示薬分子の一部を生じる。いずれの部分も捕捉部位を含む部分であり得る。本明細書に示すように、本発明者らは、元の（切断前の）アミノ酸配列でなく、結果として得られる配列を特異的に認識する結合分子を製造している。

本発明の関連の中で指示薬分子は、比較的高い親和性をもって捕捉分子に（捕捉部位により）結合し得る。いくつかの実施態様において、指示薬分子の解離定数（k_d）は、比較的低く、好ましくは0M〜1 x 10^-7Mである（アッセイの必要とされる感度に応じる）。本発明のある特定の実施態様において、指示薬分子の解離定数は、1 x 10^-15M〜1 x 10^-9Mである。

本発明のある特定の実施態様において、該結合相互作用は、捕捉ゾーンに存在する捕捉分子への指示薬分子の捕捉部位の結合を検出する結果として達成され得る。これに関連して、直接結合は、いずれの介在なく指示薬分子の（捕捉部位による）捕捉分子への結合を意味する。

本発明のいくつかの実施態様において、指示薬分子の捕捉部位および捕捉ゾーンに存在する捕捉分子は、結合ペアの2つの部分である。これに関連して、結合ペアは、互いに結合し合える2つの分子または要素からなる。本発明のある特定の実施態様において、結合相互作用は、結合ペアの各構成要素がそれぞれのパートナー、または限られた数の結合パートナーに結合することのみできるように特異的である。さらに上記のように、結合ペアが比較的高い親和性を示すことが好ましい。結合ペアは、相互作用する分子または要素の天然で見られる結合ペアまたは人工的に生成されたペアであり得る。

本発明のいくつかの実施態様において、指示薬分子の捕捉部位と捕捉分子は、結合ペアが以下より選択される結合ペアの2つの部分である：抗原と抗体またはその抗原結合断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはカプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な領域）とタンパク質AまたはG；炭水化物とレクチン；相補的ヌクレオチド配列；リガンドと受容分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定化アミノフェニルボロン酸とシス-ジオール型の分子；ならびにキシログルカンとセルロース繊維ならびにその類似体、誘導体および断片。

本発明の特定の実施態様において、結合ペアはビオチンおよびストレプトアビジンからなる。本発明の更なる実施態様において、指示薬分子の捕捉部位は、エピトープを含み、捕捉分子は、第1の捕捉部位に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を含む。本発明に関連して、用語抗体は、任意の種からの天然の免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体、F(ab')₂断片、Fab断片、Fv断片、sFv断片、および特異的な結合親和性を保持する抗体領域に基づくものなどの非常に関連する分子（例えば単一ドメイン抗体）に及ぶ。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。したがって、特定の実施態様において、捕捉分子は抗体を含む。他の実施態様において、捕捉部位はビオチン分子を含み、捕捉ゾーンはストレプトアビジン分子を含む。

本発明のある特定の実施態様において、デバイスの捕捉分子に指示薬分子の捕捉部位を結合することは、間接的であってもよい。本発明に関連して、「間接結合」は、指示薬分子の捕捉部位および捕捉分子に結合できるいくつかの介在要素、例えば同時に指示薬分子の捕捉部位および捕捉分子に結合できる「アダプター」が介在する結合を意味する。

捕捉分子への指示薬分子の結合が間接的でアダプターが介在する場合、複数の指示薬分子が各捕捉分子に結合することが可能である。これに関連して、複数とは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4などを意味する。これは、ビオチンを含むかまたはビオチンからなる捕捉分子に加えて、多価のアダプター分子、例えば同時に多数のビオチン含有指示薬分子に結合できるストレプトアビジン分子を組み込むことにより達成され得る。

複数の指示薬分子が各捕捉分子に結合する場合のデバイスの実施態様は、本明細書により詳細に記載されるようにアッセイの正確性の向上を達成するために用いられ得る。

本発明の別の重要な分子は結合分子である。本発明は、切断で生じる新しい結合部位、または切断後の捕捉部位を含む指示薬分子の部分に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子による。したがって、特定の実施態様において、結合分子は抗体を含む。誤解を避けるために、用語抗体は、任意の種からの天然の免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体、F(ab')₂断片、Fab断片、Fv断片、sFv断片、および特異的な結合親和性を保持する抗体領域に基づくものなどの非常に関連する分子（例えば単一ドメイン抗体）に及ぶ。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明者らは、切断後のみ切断領域を認識し、それ故に切断部位における切断が生じるまで指示薬分子に（任意の有意な程度）結合できない抗体を製造している。抗体は当業者に公知な技術により生成されてもよい。これは、動物、例えばヒツジ、ウサギまたはヤギの切断生成物による免疫化によってもよい。例えば免疫化は、切断後に捕捉部位につながったままである切断領域の部分（適宜捕捉部位自体を含む）を用いて実施され得る。ポリクローナル抗体は血清から単離され、アフィニティー精製され得る。モノクローナル抗体は、よく知られ特徴付けられたハイブリドーマ技術を用いて生成され得る。

したがって、本発明はまた、切断後に本明細書で定義される指示薬分子に結合する結合分子、典型的には抗体を提供する。本発明は、切断の結果として生じる指示薬分子中における新しい結合部位に結合する結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子、典型的には抗体を提供する。いくつかの実施態様において、結合分子は切断領域において結合する。特定の実施態様において、少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままであり、切断の結果として、切断が生じるまで結合部位に結合できない結合分子に対する結合部位を含む指示薬分子の切断領域の2つの部分を生じる。いくつかの実施態様において、少なくとも1つの切断部位の切断は、指示薬分子の2つの別々の部分を生じ、それ故に結合分子は、切断後の分離した部分の1つまたは両方に結合する。これに一致して、本発明は、アミノ酸配列GPQGを含む指示薬分子に結合するがアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）を（切断領域として）含む指示薬分子に結合しない結合分子、適宜抗体を提供する。同様に本発明は、アミノ酸配列IFGQを含む指示薬分子に結合するがアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）を（切断領域として）含む指示薬分子に結合しない結合分子、適宜抗体を提供する。本発明はさらに、切断されたとき、特にイソロイシン残基とアルギニン残基との間で切断されたときのみ配列番号3または配列番号4のアミノ酸配列を含む指示薬分子に結合する（すなわち切断前のアミノ酸配列に結合しない）結合分子、適宜抗体を提供する。指示薬分子は、本明細書で述べられる足場分子への結合により拘束され得る。一例を図23に示す。

指示薬分子が構造上拘束され、少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分を生じる場合の本発明のこれらの実施態様において、結合分子は切断後の切断領域に結合し得る。特定の実施態様において、結合分子は、切断後に指示薬分子の切断領域の両部分に結合する。したがって結合分子は、切断後の切断部位に有効に橋を架ける領域に結合し得る。例えば本明細書で述べられる足場分子を用いる指示薬分子の構造的拘束は、切断後の結合分子のための、十分に定義され安定した結合部位を提供する。特定の実施態様において、結合分子が結合する結合部位は、指示薬分子の新しい構造的配座である。切断は、少なくとも1つの配座エピトープを生じ得る。結合分子に対する結合部位は、指示薬分子のいずれかの部分を含み得る。これは、酵素切断活性および／または指示薬分子の捕捉が本質的に結合分子の結合により妨害されないことを条件とし得る。ある特定の実施態様において、結合部位は、足場分子が結合し、切断領域から足場分子を分離する、切断領域の少なくとも一部および／またはリンカーもしくはスペーサー領域の少なくとも一部を含む。他の実施態様において、結合分子は、足場分子の少なくとも一部を含む新しい結合部位に結合し得る。

結合分子は、直接または間接的に、指示薬分子への結合分子の結合の検出を可能にするためにレポーター分子で標識され得る。レポーター分子は、当業者が利用可能な任意の方法による検出に好適な任意の物質または部分であり得る。したがってレポーター分子は、典型的にシグナルの発生または生成ができる。本発明のある特定の実施態様において、レポーター分子は、金粒子；色原体；発光化合物；蛍光分子；放射性化合物；可視性化合物；シグナル生成物質を含むリポソームもしくは他のビークル；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せより選択される。レポーター部分として用いるために適切な酵素-基質の組合せは、酵素のアルカリホスファターゼおよび基質のニトロブルーテトラゾリウム-5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートであり得る。本発明の特定の実施態様において、レポーター部分は金粒子である。

レポーター分子での結合分子の直接標識はまた、本発明内と意図される。したがって、レポーター分子は、標識を提供するために結合分子に結合する更なる結合分子に結合され得る。この直接結合は、結合分子およびレポーター分子を同時に結合できるアダプターが介在し得る。結合分子が抗体である場合の例示的な実施態様として、直接標識は、特定の方法で抗体結合分子に結合する更なる抗体が介在し得る。更なる抗体は、直接的にレポーター分子、例えば金粒子；色原体；発光化合物；蛍光分子；放射性化合物；可視性化合物；シグナル生成物質を含むリポソームもしくは他のビークル；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せで標識され得る。レポーター部分として用いるために適切な酵素-基質の組合せは、酵素のアルカリホスファターゼおよび基質のニトロブルーテトラゾリウム-5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートであり得る。本発明の特定の実施態様において、レポーター部分は金粒子である。

レポーター分子がアダプター分子によって結合分子に結合する場合の本発明の実施態様において、アダプターが切断指示薬分子への結合分子の結合を妨害しなければ、アダプターは、指示薬分子に試験検体を加える前に結合分子と予め複合化し得る。

アダプターは、レポーター分子と結合分子の間接的な相互作用を介在できる任意の物質または分子であり得る。いくつかの実施態様において、アダプターは、ストレプトアビジンであり、結合分子は、ビオチン分子を含む。アダプターはまた、「アダプター結合ペア」であって、
(i) 結合分子に結合できる第1の構成要素；および
(ii) ペアの第1の構成要素およびレポーター分子に結合できる第2の構成要素
を含む結合ペアであり得る。本発明のある特定の実施態様において、指示薬分子の検出領域は、ビオチンを含み、アダプター結合ペアの第1の構成要素は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、アダプター結合ペアの第2の構成要素は、ビオチンであり、そしてレポーター分子は、ビオチンを結合できる部分を含む。

アダプター分子またはアダプター結合ペアの包含物は、各結合分子への多数のレポーター分子の結合を促進し得る。例えば、アダプターとしての多価のストレプトアビジンの使用は、多数のビオチン含有レポーター分子に加えてビオチン含有結合分子の両方の同時結合を可能にするだろう。

ある特定の実施態様において、本発明は、ラテラルフローまたは直立フローデバイスで実施され得る。したがって一般的に、本発明は固体支持体のいくつかの形態による。固体支持体は、検体のための液体流路を定義し得る。特定の実施態様において、固体支持体は、クロマトグラフ媒体またはキャピラリーフローデバイスを含む。いくつかの実施態様において、本発明は試験ストリップ型で提供され得る。代表例を図2に示し、本明細書により詳細に記載する。

本発明の特定の実施態様において、捕捉ゾーンは固体支持体上に形成される。捕捉分子が結合されて捕捉ゾーンを形成し得る任意の支持体は、包含されることが意図される。固体支持体は、例えばビーズ（例えばセファロースまたはアガロースビーズ）またはウェル（例えばマイクロプレート）の形態をとり得る。したがって、ある特定の実施態様において デバイスは、捕捉分子が結合して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む。本発明のキットの場合、固体支持体は、捕捉分子が結合されずに提供され得る。これらの実施態様において、キットの使用者は、試験検体と共にデバイスを使用する前に固体支持体上に捕捉分子を固定化して捕捉ゾーンを形成し得る。したがってキットはまた、固体支持体上に捕捉分子を固定化するための手段を含み得る。固定化手段は、捕捉ゾーンを形成することを可能にする任意の適切な試薬を含み得る。固体支持体は、適切な固定化する手段で予め形成され得る。例えば、固体支持体は、捕捉分子（の一部）を形成するアビジン（例えばストレプトアビジン）分子と相互作用するように配置されるビオチン分子を含み得る。当然、他の結合ペア相互作用は、本明細書で述べられるようにおよび当業者により容易に理解されるように、固体支持体上に捕捉分子を固定化して捕捉ゾーンを形成するために用いられ得る。

捕捉ゾーンは、指示薬分子の捕捉部位へ結合できる捕捉分子におけるまたはそれ上での固定化により定義され得る。捕捉分子の固定化は、任意の適切な手段により達成され得る。デバイスがクロマトグラフ媒体を含むフローデバイスである場合、捕捉分子は、媒体へ直接結合することにより固定化されるか、または媒体と関連もしくは結合する担体分子、例えばタンパク質への結合を介して間接的に固定化され得る。

更なる実施態様において、固体支持体は、さらに、試験検体が適用される適用ゾーンを含む。検体適用ゾーンは、試験検体が適用されたときに検体中のいずれかの酵素が検体適用ゾーン内の指示薬分子の切断部位上で作用するように、指示薬分子が予め負荷され得る。検体適用ゾーンは、検体を検体適用ゾーンにおいて所定の時間保持するバリアを含み得る。これは、検体が測定できるレベルの切断を達成するのに十分な時間指示薬分子と相互作用することを可能にする。これは、当業者により容易に理解されるように、検出される酵素に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、60分またはそれ以上であり得る。バリアは、この時間後検体により分解されるかまたはそうでなければ取り除かれ得て、それ故に検体がデバイスを流れ続けられる。あるいは、試験検体および指示薬分子は、デバイス、例えば検体適用ゾーンに混合物を加える前に、予め混合またはインキュベートされ得る。しかしながら、試験検体および指示薬分子が予め混合またはインキュベートされ得る場合、検体適用ゾーンを含めないことが可能である。ここで、直接混合物を捕捉ゾーンに加えて捕捉分子との相互作用により指示薬分子の固定化を可能にすることができる。いくつかの実施態様において、試験検体は、例えばキャピラリー作用により捕捉ゾーンを通過するように、捕捉ゾーンから見て上流部位においてクロマトグラフ媒体に適用され得る。クロマトグラフ媒体は、液体が通ることができる任意の物質、例えば流体チャネルまたは多孔膜からできていてもよい。本発明のある特定の実施態様において、クロマトグラフ媒体は、ストリップまたはメンブレン、例えばニトロセルロースのストリップまたはメンブレンを含む。

結合分子は、切断部位において切断された場合、デバイスにおいて指示薬分子と相互作用できる方法で提供されなければならない。したがって結合分子は、デバイスに適用される前に指示薬分子と予め混合され得る。これは、指示薬分子が試験検体と混合される前または後であり得る。結合分子が指示薬分子の切断部位において（試験検体中の）酵素活性を有し得る任意の効果を避けるために後が好ましい。結合分子はまた、指示薬分子が（捕捉ゾーンを定義する指示薬分子の捕捉部位および捕捉分子間の相互作用により）固定化される前に結合分子が試験検体および指示薬分子に遭遇するように、捕捉ゾーンの上流の任意のポイントにおけるデバイス上またはデバイスにおいて提供されることができる。あるいは、試験検体および指示薬分子が捕捉ゾーンに加えられた後、結合分子は捕捉ゾーンに加えられ得る。これは、確実に、任意の指示薬分子が、（切断された指示薬分子の場合）シグナルを生じるために結合分子のための結合部位を提供する捕捉ゾーンにおいて予め固定化されるようにする。

検出される特定の酵素切断活性に応じて、適切な酵素阻害剤をデバイスまたは方法に組み込むことが必要であり得る。酵素がデバイスまたは方法の他の構成要素、例えば結合分子または捕捉分子に作用することを妨げるために、これは重要であり得る。試験検体を指示薬分子と予めインキュベートする場合、インキュベート時間の終わりに酵素活性の阻害剤を加えることは有利であり得る。これは、好ましくは結合分子を試験検体と接触させる前である。あるいは、結合分子がデバイス上またはデバイスにおいて提供される場合、1または複数の酵素活性阻害剤は、結合分子の上流の任意のポイントにおいてデバイスに含まれ得る。これは、捕捉ゾーンの上流である（上記の説明のとおり）。阻害剤は、デバイスを通過する場合に、試験検体が阻害剤を動員するように、単に乾燥され得るかまたはデバイス上に受動的に吸着され得る。阻害剤の使用は不可欠ではないことに留意されたい。例えば、本発明により検出されるいくつかの酵素活性、例えば特定のプロテアーゼ活性は、基質以外のデバイスまたは方法の構成要素のいずれかに対して作用しない程十分に特異的であり得る。特定の酵素の切断部位は、当該技術分野において周知であり、デバイスおよび方法の様々な構成要素を設計するために用いられ得る。例えば、イン・シリコ・スクリーニングは、検出されるべき酵素の切断部位が関連する分子のいずれか、例えば結合分子および捕捉分子に含まれることを確認するために（例えば標準設定に従いBLASTなどの自由に利用可能なツールを用いて）実施され得る。試験されるべき酵素活性を有する関連する分子（例えば結合分子および捕捉分子）をインキュベートし、切断が生じているかを検出することにより交差反応性を確認することも可能である。いくつかの実施態様において、関連する分子は検出されるべき酵素切断活性の性質によっては作用されない。例として、ヌクレアーゼ活性が検知されている場合、これは、抗体結合分子、ストレプトアビジンまたは抗体捕捉分子に関していずれの切断活性も示すべきでない。

固体支持体は、さらに、検体フローからみて捕捉ゾーンの下流に、デバイスを用いるアッセイが正常に完了したことを示すための、結合分子に結合する更なる結合分子を含むコントロールゾーンおよび存在する場合検体適用ゾーンを含み得る。あるいは、更なる結合分子は、検体またはデバイスに加えられ、デバイスを通り検体と流れる更なる分子に結合し得る。更なる分子は、本明細書で定義されるレポーター分子で直接または間接的に標識され得る。好ましくは、レポーター分子は、異なってもよいが、検出を容易にするために、結合分子に結合される分子と同じレポーター分子である。レポーターが、それぞれのゾーンにおいて結合または固定化される場合、コントロールゾーンは、捕捉ゾーンから空間的に分離されて、例えば2つの別々の判定ライン（test line）を生じる。このコントロールゾーンは、結合分子を含む試験検体がデバイス全体を通過したことを確認するために用いられ、デバイスが正常に作動していることを確認する。陽性シグナルは、酵素切断活性が検体中に存在するか存在しないかに関係なくコントロールゾーンにおいて予想される。更なる結合分子は、指示薬分子の切断部位に結合する結合分子の性質、または検体に加えられる更なる分子の性質に基づいて選択される。結合分子と更なる結合分子または更なる分子と更なる結合分子は、本明細書で定義される結合ペアを形成し得る。例えば、結合分子が種特異抗体（例えばヒツジ抗体）である場合、更なる結合分子は、抗−種抗体（抗-ヒツジ抗体）であり得る。あるいは、更なる分子は、異なる種、例えばニワトリまたはヤギからの抗体である場合、更なる結合分子は、適切な抗-種抗体であり得る。これは、特定の相互作用によりコントロールゾーンにおける結合分子または更なる分子の固定化を可能にする。更なる結合分子は、任意の適切な方法、例えば共有または非共有結合相互作用によりコントロールゾーンにおいて固定化され得る。

本発明のすべての態様において、試験検体は、切断活性を有する酵素を含むことが知られているかまたは疑われている任意の物質であり得る。試験検体は、任意の供給源に由来し得る。ある特定の実施態様において、試験検体は、体液、例えば血液（血清と血漿を含む）、唾液、尿、乳、創傷からの流体、腹水（ascites fluid）、腹水（peritoneal fluid）、羊水などを含む生物学的供給源に由来し得る。いくつかの実施態様において、試験検体は創傷液であり、デバイスは、創傷の治癒状況および／または割合を評価するための方法として創傷液中における酵素活性、好ましくはプロテアーゼ活性を検出するために用いられる。特定の実施態様において、試験検体は尿であり、デバイスは、尿中における酵素、特にプロテアーゼの活性を検出するために用いられる。本明細書で述べられる本発明の特定の診断適用は、特に、ある代表的な検体タイプ、特に尿、唾液または唾に適用可能であり得る。他の実施態様において、検体は、切断活性が望ましく試験され得る環境検体であり得る。例えば検体は、水、食物またはほこり検体であり得る。食品および飲料検体に関連して、切断活性は、例えば製品の保存可能期間に関して検出され得る。検体はまた、例えば混入物質としてプロテアーゼまたは他の切断酵素について試験するための、研究用または工業用検体であり得る。混入物質は、タンパク質精製などの様々な研究工程中および発酵などの工業工程で見られ得る。

試験検体は、任意の適切な方法により採取され得て、本発明での使用に適した任意の形態（固体または液体の形態を含む）で存在し得る。さらに、供給源から試験検体を得ることの一部として、検体は、本発明を用いて試験をする前に1以上の加工または前処理工程を受け得る。一実施態様において、固体検体は、試験のための溶液または懸濁液が得られるように加工され得る。さらに、ある特定の実施態様において、試験検体は、本発明を用いて試験をする前に任意の所与の時間検体を保管する方法として例えば約-20℃で凍結され保存され得る。

本発明は典型的には単離された検体に基づいてインビトロにおいて実施されることに留意されたい。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、試験のための検体を得る工程を含んでよい。

本発明は、付属する図面に関して例として記載される。
図1は、本発明によるアッセイの4つの異なる型の概略図である。各型は、固体支持体(1)、捕捉分子(2)、捕捉部位(3)および切断部位(4)を含む指示薬分子、ならびに切断(6)が生じた後のみ指示薬分子に結合する結合分子(5)の同じ基本構成要素による。 図2は、本発明による酵素検出デバイスの概略図であり、酵素切断活性が非存在下（図2A）または存在下（図2B）でのデバイスの操作を示す。 図3は、試験検体中におけるMMP活性のレベルとしてのアッセイ（図2に示す）の視覚的読み取りが増加することを示す。 図4は、本発明による酵素検出デバイスの概略図である。図は、各カード構成要素の正確な長手寸法および位置を示す。 図5は、構造上拘束される指示薬分子の合成例を示す。 最初に図5Aにおいて、線状ペプチド(1)を例えば固相Fmoc chemistryを用いて合成する。該ペプチドを例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製し得る。その後、ペプチドをペプチド上のチオール基(2)と足場分子(3)間での反応により拘束または環化する。この反応により構造上拘束され「クリップされた」ペプチド(4)が生じる。 図5Bにおいて、指示薬分子は、例えば予め負荷したビオチン-PEG残基上における線状ペプチドの合成により、捕捉部位(1)を含めるように合成される。 図6は、概略的に、本発明において用いられる結合分子が排他的に切断指示薬分子に結合できることを示す。酵素切断活性が存在しない場合、構造上拘束される指示薬分子(1)は抗体結合分子(2)により結合されない。この抗体は抗原として切断指示薬分子(3)を用いて生成され、それ故にこの分子の「開いた」形態にのみ結合する。 図7（図7Aおよび7B）は、スパイクされたMMP-9緩衝液検体で実施した場合の本発明のアッセイの感度を示す。MMP-9の検出限界は、検体量75μlに対し約4ng/mlであった。図7Aは、MMP-9の濃度範囲全体にわたる読取値を示し、一方図7Bは、0〜15 ng/mlのMMP-9濃度における拡大図である。 図8は、本発明のアッセイの特定の型が、MMP13、MMP12、MMP9、MMP8およびMMP2にバイアスがかけられた切断可能な配列を用いることを示す。本発明のアッセイの他の型は、必要とされる適用に応じた異なる標的を有する配列が用いられ得る。 図9は、活性なプロテアーゼ（特にMMP-9を含むMMP）の測定可能な量が尿検体中で見られ、より高いレベルが呼吸器疾患の患者から得られた検体中に存在することを示す。有意な差異が、健常なコントロールから採取された検体と比較したときCOPDの検体で見られ（P=0.03）、そしてCFの検体でも健常コントロールに対して見られた（P=0.01）。 図10は、EDTAの有無におけるMMP活性を検出するアッセイの性能を比較するグラフである。該グラフは、創傷検体へのEDTAの添加が検体中におけるMMPの存在を確認し、アッセイが活性なMMPを特異的に測定することも確認する読み出しを抑制することを示す。 図11は、市販の活性なMMP-9アッセイキットとMMP9を検出する本発明のアッセイの性能を比較するグラフ（図11Aおよび11B）を含む。図11Aは、MMP-9の濃度範囲全体にわたる読取値を示し、一方図11Bは、0〜50 ng/mlのMMP-9濃度における拡大図である。両方の図は、本発明の方法が急勾配の曲線を生じることを実証する。両方のアッセイによれば、吸光度の値により示される発色は、最も低い標準試験物の4ng/ml MMP9で見られた。 図12は、本発明の実施態様のELISAおよびラテラルフローを用いるMMP9標準曲線を示す。 図13は、本明細書に記載の指示薬分子において有用な多くの足場分子を示す。 図14は、命名案と一緒に、本明細書に記載の指示薬分子において有用な多くの足場分子を示す。 図15は、指示薬分子への足場分子のいくつかの結合選択肢を示す。図15Aは1つの切断部位における切断の生成物を示し、図15Bは2つの別々の切断部位における切断の生成物を示す。 図16は、MOL386ペプチドのHPLC分析を示す。 図17は、MOL386ペプチドのマススペクトルである。 図18は、PEG-ビオチン修飾MOL386ペプチドのマススペクトルである。 図19は、環化MOL386ペプチドのマススペクトル解析である。 図20は、PEG-ビオチン修飾環化MOL386ペプチドのマススペクトル解析である。 図21は、図1に示すすべての組合せについてのMMP9標準曲線を示す。 図22は、図21に示す結果から導き出した最も良い組合せの成績を示す。 図23は、予め消化されている形態および消化される形態の両方におけるヒト好中球エラスターゼ（HNE）の環化ペプチド基質を示す。 図24は、配列番号3のアミノ酸配列を含む環化ペプチド基質のエラスターゼ消化のHPLC分析を示す。図24Aは、生のプロットデータを示す。図24Bは、経時的な生成物の相対的増加および基質の相対的減少を示す経時変化を示す。 図25は、環化された配列番号3の基質が1つの部位において切断されたことを確認するマススペクトルデータを示す。図25Aは基質プロットであり、図25Bは加水分解生成物である。 図26は、図23に示す指示薬分子の切断形態に特異的な抗体を生じるための免疫原を生成するための1つの経路を示す。 図27は、図23に示す指示薬分子の切断形態に特異的な抗体を生じるための免疫原を生成するための代替経路を示す。 図28は、MOL488ペプチドのマススペクトル解析を示す。 図29は、足場分子（1,3-ジブロモメチルベンゼンに由来する）への結合後のMOL488ペプチドのマススペクトル解析を示す。 図30は、HNEを用いる切断後の環化MOL488ペプチド（すなわち足場へ結合している）のマススペクトル解析を示す。

（好ましい実施態様の説明）
図1は、本発明によるアッセイの4つの異なる型の概略図である。各型は、固体支持体(1)、捕捉分子(2)、捕捉部位(3)および切断部位(4)を含む指示薬分子、ならびに切断(6)が生じた後のみ指示薬分子に結合する結合分子(5)の同じ基本構成要素による。

型1および4において、捕捉分子(2)はストレプトアビジンである。ここで、捕捉分子(2)は指示薬分子内のビオチン捕捉部位(3)に結合する。型2および3において、捕捉分子(2)は抗体である。ここで、捕捉分子(2)は指示薬分子内のエピトープ捕捉部位(3)に結合する。エピトープは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）に由来する代替長鎖ペプチド（ALP）で見られる。

本発明の指示薬分子を試験検体に加えると、特異的に切断部位(4)の存在を認識する任意の酵素は、指示薬分子を切断し得る(6)。この切断事象(6)は、特定の抗体結合分子(5)のための結合部位を生じる。結合分子(5)は、切断(6)が生じるまで指示薬分子に結合できない。したがって、型1および3において、抗体結合分子(5)は、GPQGIFGQ配列の切断の結果として生じるアミノ酸配列GPQGに結合する。一方、型2および4において、抗体結合分子(5)は、GPQGIFGQ配列の切断の結果としてまた生じるアミノ酸配列QGFIに結合する。各型において、抗体結合分子(5)は切断前のGPQGIFGQ配列（示していない）には結合しない。

図2は、本発明による酵素検出デバイスの概略図であり、酵素切断活性が非存在下（図2A）または存在下（図2B）でのデバイスの操作を示す。試験ストリップは、デバイスの他の構成要素がその上に組み立てられる粘着性ライナー(1)を含む。右から左へ、検体適用ゾーン(2)は吸収パッドの形態をしている。これは、標識結合分子(7)を含浸させるコンジュゲートパッド(3)と部分的に重ねて置かれる。代替的実施態様において、標識結合分子は検体適用ゾーンに含浸され得て、これは別のコンジュゲートパッドの必要性を取り除く。コンジュゲートパッド(3)は、ニトロセルロースメンブレン(4)と流動接続されている。ニトロセルロースメンブレン(4)は、捕捉ゾーンを定義する固定化ストレプトアビジン分子(5)を含む。該メンブレン(4)は、さらに、検体を備えるデバイスを通過して別のコントロールゾーンを形成する更なる標識分子(11)に結合する捕捉ゾーンの下流に固定化された更なる結合分子(6)を含む。あるいは、固定化された更なる結合分子は、標識結合分子(7)に結合し得る。当該デバイスは、適宜さらに、デバイスの末端に達する任意の試験検体および試薬を吸収するための吸収パッド(8)を含む。

使用において、デバイスの検体適用ゾーン(8)と試験検体を接触させる前に、指示薬分子(9)を試験検体に加える。図2Aに示すとおり、試験検体中に酵素切断活性が存在しない場合、指示薬分子(9)は切断部位において切断されないままである。コンジュゲートパッド(3)への検体フロー後、切断部位の切断が生じないため、結合分子(7)は指示薬分子(9)に結合できない。該指示薬分子は、ストレプトアビジン(5)と指示薬分子(9)のビオチン捕捉部位(10)との相互作用により捕捉ゾーンにおいて結合されることになる。標識結合分子(7)は、指示薬分子(9)に結合できないため捕捉ゾーンにおいて固定化されない。したがって標識結合分子は、コントロールゾーンを通り抜けそれを越えて流出する。更なる標識分子(11)はまた、デバイスを通って、固定化された更なる結合分子(6)に結合することにより固定化されたコントロールゾーンへ通り抜ける。したがって、酵素切断活性が存在しないことは、コントロールゾーンにおいてのみシグナルとして示され、捕捉ゾーンにおいては示されない。可能性として標識結合分子(7)を含む過剰な検体は、吸収パッド(8)に流入する。

図2Bに示すとおり、試験検体中に酵素切断活性が存在する場合、指示薬分子(9)は切断部位において切断される。コンジュゲートパッド(3)への検体フロー後、切断部位の切断が生じるため、結合分子(7)は指示薬分子(9)に結合できる。該指示薬分子は、ストレプトアビジン(5)と指示薬分子(9)のビオチン捕捉部位(10)との相互作用により捕捉ゾーンにおいて結合されることになる。標識結合分子(7)は、切断部位において指示薬分子(9)に結合するため捕捉ゾーンにおいて固定化される。捕捉ゾーンにおける結合部位に対して標識結合分子(7)が相対的に過剰であるため、いくらかの標識結合分子(7)は、コントロールゾーンを通り抜けそれを越えて流出する。更なる標識分子(11)はまた、デバイスを通って、固定化された更なる結合分子(6)に結合することにより固定化されたコントロールゾーンへ通り抜ける。したがって、酵素切断活性が存在することは、捕捉ゾーンおよびコントロールゾーンの両方においてシグナルとして示される。ビオチン捕捉部位(10)を含まない指示薬分子の切断生成物を可能性として含む過剰な検体は、吸収パッド(8)に流入する。

コントロールゾーンは任意であることに留意されたい。酵素切断活性の検体中における有無は、単に捕捉ゾーンにおける対応するシグナルの有無に基づいてモニターできる。

図3は、試験検体中におけるMMP活性のレベルとしてのアッセイ（図2に示す）の視覚的読み取りが増加することを示す。容易に理解できるように、コントロールゾーン(1)におけるシグナルは、MMP量の増加に一定である。対照的に、MMP量の増加につれて捕捉ゾーン(2)におけるシグナルも増加する。これは、MMP活性による切断部位における指示薬分子の切断による。これは、結合部位が、捕捉ゾーンを定義する捕捉分子と指示薬分子の捕捉部位との相互作用により捕捉ゾーン(2)において検出される結合分子の結合を可能にすることを明らかにする。

図4は、本発明による一特定の酵素検出デバイスの概略図である。下記の表は、図の凡例を提供し、この特定の実施態様における各カード構成要素の正確な長手寸法および位置を明示する。当然、当該寸法および位置は、容易に当業者に解されるように変化し得る。

図5は、構造上拘束される指示薬分子の合成例を示す。更なるスペーサーまたはリンカー領域が切断領域と足場分子の結合部位との間に含まれ得ることに留意されたい。

最初に図5Aにおいて、線状ペプチド(1)を例えば固相Fmoc chemistryを用いて合成する。該ペプチドを例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製し得る。その後、ペプチドをペプチド上のチオール基(2)と足場分子(3)間での反応により拘束または環化する。この反応により構造上拘束され「クリップされた（clipped）」ペプチド(4)が生じる。

図5Bにおいて、指示薬分子は、例えば予め負荷したビオチン-PEG残基上における線状ペプチドの合成により、捕捉部位(1)を含めるように合成される。

図6は、概略的に、本発明において用いられる結合分子が排他的に切断指示薬分子に結合できることを示す。酵素切断活性が存在しない場合、構造上拘束される指示薬分子(1)は抗体結合分子(2)により結合されない。この抗体は抗原として切断指示薬分子(3)を用いて生成され、それ故にこの分子の「開いた」形態にのみ結合する。

図13および14は、本発明において用いられるための様々な適切な足場分子を示す。

図15は、概略図で、指示薬分子への足場分子のいくつかの結合選択肢を示す。図15Aは1つの切断部位における切断の生成物を示し、図15Bは2つの別々の切断部位における切断の生成物を示す。

ヒト好中球エラスターゼ基質を本発明の指示薬分子の形態で図23に示す。この基質／指示薬分子の合成を以下の実施例9および10で説明する。基質は、適切な足場（この場合、1,3-ジブロモメチルベンゼン）を用いて環化されたアミノ酸配列CQESIRLPGC（配列番号3）を含む。環化は、足場と結合するために、2個のシステイン残基により提供されるチオール基を利用する。イソロイシン残基およびアルギニン残基間のペプチド結合におけるHNEによる切断は、構造を開いて、新しい結合部位（または「クリプトトープ」）を出現させる。HNEは1つの部位において基質を切断して確実な結合部位を生じさせる。更なるチロシン残基（配列番号4参照）は、本明細書で述べられる担体タンパク質などの更なる部分への結合を促進する。

本発明は、以下の実験的実施例に関連してさらに理解されるだろう。

実施例および図面全体にわたって、本発明は「Ultimate ELTABA」として示され得る。

実施例1：マトリックスメタロプロテアーゼ-9（MMP-9）の検出のための本発明のラテラルフロープラットフォーム。
キットは次の構成要素を含む：
1) 検体採取（例えば尿）のためのデバイス
2) プラスチックケースに載せられたラテラルフロー試験ストリップ。試験ストリップは、試験ストリップの流路を横切る第1の判定ラインとしてポリストレプトアビジンを含む捕捉ゾーンを有する。判定ラインの下流に試験ストリップの流路を横切るコントロールラインとして吸着された抗ニワトリ抗体を含む第2の捕捉ゾーンは、コントロールラインとして含まれ得る。プラスチックケースには、判定およびコントロールラインを見るための観察窓がある。第1の判定ラインの上流に統合検体受入パッドもある。さらに、試験ストリップは、検体の添加により再構成されることができる検体受入パッドの下流に、試験ストリップに乾燥させたヒツジ抗体（CF1522）を支持する金粒子を有する。
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) 捕捉ライン、ポリストレプトアビジンとの複合体を形成できるポリエチレングリコールスペーサー／リンカーによりつながる末端ビオチン基を担持する切断可能な配列、この実施例では（GPQGIFGQ）、を含む指示薬分子。

試験ストリップ
検体中のプロテアーゼ活性の検出のための試験ストリップを、以下に記載するように本発明に従って構築した。アッセイは、様々なMMPの存在下での指示薬分子の切断に基づいており、可視性のエピトープを金粒子に結合したヒツジ抗体（CF1522）に曝露させた。
用いられる方法は、当該技術分野において周知の標準的な手順にすべて従った。

A. CF1522:40nm金コンジュゲートの製造
アフィニティー精製したヒツジ抗体CF1522（Ig Innovations、CF1522）を、520nmにおけるODが5となる濃度において40nm 金粒子（BBI International、GC40）に結合した。抗体を、20 mM BES緩衝液 pH 7.8中15μg/mlの濃度で負荷した。0.2％BSA（Sigma、A7906）を、非特異的結合を最小限にするためにブロッキング溶液として用いた。

B. 金-含浸コンジュゲートパッドの製造
ガラスファイバーコンジュゲートパッド（Millipore、G041、17 mm x 300 mm）に、0.8μl/mmの金乾燥緩衝液（1M Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、3％BSA、5％スクロース、1％ツイーン20、pH 9.4）で希釈したOD4のCF1522:40nm 金コンジュゲート（Mologic）をIsoflowディスペンサーによりスプレーした（スプレー高さ15 mm）。処理されたコンジュゲートバンドを、60℃において5 mm/secの速度のトンネル乾燥機中で乾燥した。乾燥した金コンジュゲート-含浸コンジュゲートパッドを、室温において乾燥剤を入れた密封したホイルパウチ中で保管した。

C. 抗体-含浸ニトロセルロースメンブレンの製造
すべての試薬を、0.1μl/mmの分注率でUnistart CN140メンブレン（Sartorius、CN140、25 mm x 300 mm）上にストリップした。判定ラインの1 mg/mlの濃度のポリストレプトアビジン(BBI、Polystrep N 01041048K）を、メンブレンの基準から7 mmの位置に置いた。加工したメンブレンを、60℃において10 mm/secの速度のトンネル乾燥機中で乾燥した。乾燥した抗体-含浸ニトロセルロースメンブレンを、室温において乾燥剤を入れた密封したホイルパウチ中で保管した。

D. カードの組立て
試験カードを、以下の手順に従い、そして各カード構成要素の正確な長手寸法および位置を規定する図4に従って組み立てた。
1. 背面ラミネートとしての役割を果たし、図4中1で示され、剥離ライナーで保護された粘着剤を有する、60 x 300 mm片の透明なプラスチックフィルム（G&L Precision Die Cutting、GL-48077）を、ワークテーブルの上に配置した。剥離ライナーを剥がして、粘着剤を露出した。
2. 反応メンブレン（セクションCにおいて製造した）を、背面カバーの粘着剤側の上で下方末端から20 mmに結合した。
3. 含浸コンジュゲートパッド（セクションBにおいて製造した）を、背面カバーの上で反応メンブレンの上に2 mm重ねて結合した。
4. サンプルパッド（MDI、FR-1、10 x 300 mm）を、背面カバーの上でコンジュゲートパッドの上に5 mm重ねて配置した。
5. 吸収パッド（ゲルブロッティングペーパー、Ahlstrom、グレード222、22 x 300 mm）を、背面カバーの表側の上で反応メンブレンの上に2 mm重ねて配置した。
カードを、自動化ダイカッター（Kinematic、2360）を用いて5 mm幅のストリップに切り取り、プラスチックハウジング（Forsite）へ組み立てた。デバイスを、このデバイス用にMologicで特別に製造された空気圧式デバイスクランプを用いて閉じた。

表にストリップ構成要素およびバッキングカード上のそれぞれの位置を示す。

標準緩衝液を、1000ng/ml〜1ng/mlの範囲の様々な濃度の活性MMP-9（Alere San Diego）を含むように作成した。

工程1：各標準を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブ（stub）と複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてForsite製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。0〜10点による半定量的な採点法（1が最も低い検出可能な色強度であり、10が最も高い観察可能な色の強度色強度である）を視覚的読み取りに用いた。

図7（図7Aおよび7B）は、スパイクされたMMP-9緩衝液検体で実施した場合のアッセイの感度を示す。MMP-9の検出限界は、検体量75μlに対し約4ng/mlであった。図7Aは、MMP-9の濃度範囲全体にわたる読取値を示し、一方、図7Bは、0〜15 ng/mlのMMP-9濃度における拡大図である。

読取ユニットは次の表に示し、ここで400を超える値が陽性結果といえる。

実施例2：本発明のラテラルフロー型のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）特異性
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。

様々なMMP（Enzo）を、緩衝液（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）中で0.5μg/mlで調製した。

工程1：各MMP溶液を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてForsite製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。0〜10点による半定量的な採点法（1が最も低い検出可能な色強度であり、10が最も高い観察可能な色の強度色強度である）を視覚的読み取りに用いた。

図8は、本発明のこの型が、MMP13、MMP12、MMP9、MMP8およびMMP2にバイアスがかけられた切断可能な配列を用いることを示す。本発明の他の型は、必要とされる適用に応じて異なる標的を有する配列が用いられ得る。

次の表は、試験した各MMPの読取値を示す。

実施例3：尿中における酵素活性の検出
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。

検体を、健常なボランティア（9）および呼吸器疾患を患う患者から採取した。検体は、嚢胞性線維症（CF）の9人の患者および慢性閉塞性肺疾患（COPD）の7人の患者から提供され、使用するまで-80℃で保管した。

工程1：各検体を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてForsite製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。0〜10点による半定量的な採点法（1が最も低い検出可能な色強度であり、10が最も高い観察可能な色の強度色強度である）を視覚的読み取りに用いた。

図9は、活性なプロテアーゼ（特にMMP-9を含むMMP）の測定可能な量が尿検体中で見られ、より高いレベルが呼吸器疾患の患者から得られた検体中において存在することを示す。有意な差異が、健常なコントロールから採取された検体と比較したときCOPDの検体で見られ（P=0.03）、そしてCFの検体でも健常コントロールに対して見られた（P=0.02）。

実施例4：創傷液中における酵素活性の検出
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。

18人の患者からの創傷検体を、この生物マトリックスにおいて活性MMPを測定するために、ultimate ELTABAデバイスで試験した。検体を、MMP緩衝液（50 mM Tris、100 mM 塩化ナトリウム、10 mM 塩化カルシウム、50μM 20 mM 塩化亜鉛、0.025％Brij 35、0.05％アジ化ナトリウムの水溶液、pH 8.0）中でswab（Copan、552C.US）から抽出し、その後、使用するまで-20℃で保管した。キレート剤（5 mM EDTA）を加え、カルシウム依存性酵素、例えばMMPに対するデバイスの特異性を測定した。

工程1：各創傷検体を、MMP緩衝液で1対20に希釈し、75μlを、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、続いてコンジュゲートパッドを接触させ、金粒子に結合している乾燥ビオチンを再度水和した検体受入パッドに滴下した。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてForsite製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。0〜10点による半定量的な採点法（1が最も低い検出可能な色強度であり、10が最も高い観察可能な色の強度色強度である）を視覚的読み取りに用いた。

図10は、創傷検体へのEDTAの添加が、検体中におけるMMPの存在を確認し、アッセイが活性なMMPを特に測定することも確認する読み出しを抑制することを示す。

実施例5：商業MMP-9活性アッセイキットとの本発明の感度の比較
商業キットは、生物検体、例えば培地、血清、血漿、滑液、および組織ホモジネートにおけるMMP-9を特異的に検出するために設計されている。モノクローナル抗-ヒトMMPは、最初に混合物からプロおよび活性な形態両方のMMPを選択するために用いられ、その後、MMP-9の活性を、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ペプチドを用いて定量する。内製で活性化されたMMP-9標準のAMPAを、250 ng/ml〜4 ng/mlの範囲において該キットおよび本発明のラテラルフロー型の両方で実施した。MMP-9を、商業アッセイについてキットで与えられたMMP緩衝液で、およびラテラルフローデバイスについてはTris緩衝生理食塩水中1％ツイーン20で希釈した。

ラテラルフローキットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。

標準緩衝液を、Tris緩衝生理食塩水中1％ツイーン（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）に250ng/ml〜4ng/mlの範囲の様々な濃度の活性MMP-9（Alere San Diego）を含むように作成した。

工程1：各標準を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてForsite製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。0〜10点による半定量的な採点法（1が最も低い検出可能な色強度であり、10が最も高い観察可能な色の強度色強度である）を視覚的読み取りに用いた。

図11（図11Aおよび11B）は、市販の活性なMMP-9アッセイキットとMMP9を検出する本発明のアッセイの性能を比較するグラフである。図11Aは、MMP-9の濃度範囲全体にわたる読取値を示し、一方、図11Bは、0〜50 ng/mlのMMP-9濃度における拡大図である。両方の図は、本発明のアッセイが急勾配の曲線を生じたことを実証している。両方のアッセイによれば、吸光度の値により示される発色は、最も低い標準試験物の4ng/ml MMP9で見られた。

各アッセイの数的読み出しを次の表に示す。

実施例6：ELISAおよびLF型両方における基質の試験
ELISA型
1) 検体採取（例えば尿）のためのデバイス
2) ポリストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレート
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) この実施例において、捕捉ライン、ポリストレプトアビジンとの複合体を形成できるポリエチレングリコールスペーサー／リンカーによりつながる末端ビオチン基を運ぶ断可能な配列（GPQGIFGQ）を含む指示薬分子。
5) アルカリホスファターゼ（AP）に結合したヒツジ抗体CF1522
6) 405nmにおいて読み取られ得る可溶性の黄色の反応生成物の形成を可能にする、アルカリホスファターゼの基質p-ニトロフェニルホスフェート（pNPP）。
検体を、健常なボランティア（9）および呼吸器疾患を患う患者から採取した。検体は、嚢胞性線維症（CF）の9人の患者および慢性閉塞性肺疾患（COPD）の7人の患者から提供され、使用するまで-80℃で保管した。

工程1：各検体を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の検体をストレプトアビジンプレート（Nunc、442404）に加え、さらに1時間周囲環境においてインキュベートしてビオチン標識指示薬分子が、プレートに結合したストレプトアビジンにより固定化された。
工程3：プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1％ツイーン（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）で3回洗浄した。
工程4：CF1522-AP（Mologic）を、PBST中1％BSAで1/500に希釈し、周囲環境において1時間プレート上にてインキュベートした。抗体は、検体中に存在するMMPのいずれかに露出される切断されたスタブと複合体を形成し、切断されたスタブが存在しないとき、抗体の結合は無いだろう。
工程5：プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1％ツイーン（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）で3回洗浄した。
工程6：プレートを、pNPP基質とインキュベートし、その後、37℃で30分間インキュベート後405nmにおいて読み取った。MMP9標準曲線を、参照として図14bに示した。ウェルの色は、図14bにOD 405nmによって表される試験検体中における様々なレベルのプロテアーゼを示す。

ラテラルフロー型
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。

標準緩衝液を、ELISAおよびラテラルフローデバイスそれぞれ用に50ng/ml〜0.39ng/mlおよび62.5ng/ml〜0.97ng/mlの範囲の様々な濃度の活性MMP-9（Alere San Diego）を含むように作成した。

工程1：各検体を、規定量のペプチド（25 ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を、周囲環境温度で規定時間（例えば10分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。

形成されたラインを相対強度により評価した。判定ラインの存在は、試験検体中に存在するプロテアーゼがあることを示した。陰性な判定ラインは、0または検出限界未満である低いレベルのプロテアーゼを示した。これらの末端間の段階は、試験検体中の様々なレベルのプロテアーゼを示した。発現した有色のラインの強度を、視覚的に測定し、そしてNES製ラテラルフローデバイスリーダーを用いて測定した。

MMP9標準曲線の結果は図12にみられる。図12は、ELISAおよびラテラルフローにより作成した2つのMMP9標準曲線は、4ng/ml感度まで類似していることを示す。

2つのアッセイの数的読み出しをまた、次の表に示す。

実施例7 - 典型的な指示薬分子の合成
MOL386と呼ばれるペプチド（アミノ酸配列：CGPQGIFGQC）を、Fmoc-chemistryを用いて 固相上に合成した。要するに、合成をマイクロ波アシスト自動合成（CEM Liberty）で実施した。カップリング工程を、5倍過剰なアミノ酸構成要素、HBTUアクティベーターおよび10倍過剰なDIPEA塩基を含むDMF溶媒中で、Fmoc-Cys(Trt)を予め組み込んだPEG-ポリスチレン残基に実施した。脱保護工程を5％ピペラジン/DMF中で実施した。完成したペプチド樹脂を乾燥し、その後、2時間95％TFA、2.5％TIPSおよび2.5％水を用いて切断した。TFA水溶液を真空乾燥し、エーテル中沈殿させて、無色のペプチド固体を得た。回収されたペプチドを、50％アセトニトリルから凍結乾燥し、C18逆相カラムおよび5％アセトニトリル／水（0.1％TFA）から100％アセトニトリル（0.1％TFA）のグラジェントを用いてHPLC（図16）により精製した。単離したフラクションを合わせ、凍結乾燥し、エレクトロスプレイ質量分析（図17）によって分析して、目的ペプチドを同定した（予測MH+ 1010.17、実測値 1010.3）。ビオチニル化形態（CGPQGIFGQC-PEG-ビオチン）を、ビオチン-PEG-NovaTag Resin（Merck）から合成した（予測MH+ 1438.76、実測値 1439.7、図18）。ビオチンは、指示薬分子の固定化のための捕捉部位を提供する。

足場分子の結合（環化ペプチドの合成）
ペプチド（1 mg）を、1,3-ジブロモメチルベンゼン1 mgと一緒にPBS 250μlに溶解し、穏やかに一晩撹拌した。その後、反応物を水1 mlで希釈し、精製のためにC18逆相カラムおよび5％アセトニトリル／水（0.1％TFA）から100％アセトニトリル（0.1％TFA）のグラジェントを用いてHPLCに直接注入した。生成物ピークを単離し、凍結乾燥して、無色の固体を得た（予測MH+ 1112.30、実測値 1112.8、図19）。同じ手順をビオチニル化ペプチドに用いた（予測MH+ 1540.89、実測値 1539.8、図20）。

実施例8 - 試験型の生成
抗体を、切断されたペプチド配列を認識するために生成した。この実施例では、MMP消化の標的（GPQGIFGQ）は、免疫アッセイにおいて用いられ、臨床検体中における酵素活性を測定する。抗体は、当業者に公知の方法を用いてペプチドKLHコンジュゲートを生じる。ヒツジ抗体CF1522およびCF1523を、切断されたスタブ「IFGQ」を認識するために生成し、一方ヒツジ抗体CF1524およびCF1525を、切断されたスタブ「GPQG」を認識するために生成した。抗体を、生成された特定のペプチドを用いてアフィニティー精製し、その後、最も適切なアッセイ型を決定するためにELISAによって分析して、最も良い感度を得た。
切断可能な配列（GPQGIFGQ）を含むペプチドを、C-末端（それぞれMOL038およびPCL008-A2）またはN-末端（それぞれMOL310およびMOL378）のいずれかに結合にしたビオチンまたはPEG化ビオチンで合成した。

該ペプチドは、ビオチンによるストレプトアビジン捕捉物またはALP配列によるヒツジ抗体CF1060捕捉物いずれかに固定されることができる。図1に概略的に示した提案する型を評価した。

ELISA型
1) 検体採取（例えば尿）のためのデバイス
2) ポリストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレート(Nunc、442404)またはCF1060、周囲環境において一晩（Nunc、Maxisorb）
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) この実施例において、NまたはC-末端にポリエチレングリコールスペーサー／リンカーによりつながり得る末端ビオチン基を運ぶ切断可能な配列（GPQGIFGQ）を含む指示薬分子。
5) アルカリホスファターゼ（AP）に結合したヒツジ抗体CF1522、CF1523、CF1524およびCF1525
6) 405nmにおいて読み取られ得る可溶性の黄色の反応生成物の形成を可能にする、アルカリホスファターゼの基質p-ニトロフェニルホスフェート（pNPP）。
Active MMP9（Alere San Diego）を、 in MMP緩衝液（50 mM Tris、100 mM 塩化ナトリウム、10 mM 塩化カルシウム、50μM 20 mM 塩化亜鉛、0.025％Brij 35、0.05％アジ化ナトリウムの水溶液、pH 8.0）で2、0.25、0.062、0.0156および0.039μg/mlに希釈した。

工程1：各MMP9標準を、規定量の各ペプチド（20ng/試験）を有する採取デバイスに入れる。採取デバイスを、検体を基質溶液と十分に混合するために激しく回転させた。この反応混合物を周囲環境温度で規定時間（例えば30分間）インキュベートした。
工程2：インキュベート時間の終わりに、規定量の検体をストレプトアビジンプレートおよびCF1060感光プレートに加え、さらに1時間周囲環境においてインキュベートし、ペプチドが、プレートに結合したストレプトアビジンまたはCF1060により固定化された。
工程3：プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1％ツイーン（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）で3回洗浄した。
工程4：アルカリホスファターゼに結合したヒツジ抗体（Mologic）を、PBST中1％BSAで1/500に希釈し、周囲環境において1時間プレート上にてインキュベートした。抗体は、検体中に存在するMMP9のいずれかに露出される切断されたスタブと複合体を形成し、切断されたスタブが存在しないとき、抗体の結合は無いだろう。
工程5：プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1％ツイーン（50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1％vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0）で3回洗浄した。
工程6：プレートを、pNPP基質とインキュベートし、その後、37℃で30分間インキュベート後405nmにおいて読み取った。MMP9標準曲線を、すべての組合せに対して図21に示した。ウェルの色差は、OD 405nmによって表される試験検体中における様々なレベルのプロテアーゼを示す。

図21は、各型を試験した結果を示す。ストレプトアビジン捕捉ラインについて、選択されたペプチドは、予測されるように、ヒツジ抗体CF1522を含むMOL378、およびヒツジ抗体CF1525を含むPCL008-A2である。両ペプチドは、いくらか立体障害を縮小することが必要とされるPEG-Asp-AEEAc-AEEAcを含んだ。CF1060捕捉ラインについて、選択されたペプチドは、予測されるように、ヒツジ抗体CF1522を含むMOL038またはPCL008-A2、およびヒツジ抗体CF1525を含むMOL378である。最も良い組合せの実施を、図22に示す。ここで、ペプチドMOL378を含むヒツジ抗体CF1522を用いる型4は、最も有望性を示す。

実施例9 - ヒト好中球エラスターゼ感受性指示薬分子の合成
MOL488と呼ばれるペプチド（アミノ酸配列YCQESIRLPGC - 配列番号4）を、Fmoc-chemistryを用いて固相上に合成した。要するに、合成をマイクロ波アシスト自動合成（CEM Liberty）で実施した。カップリング工程を、5倍過剰なアミノ酸構成要素、DICおよびOxymaを含むPEGポリスチレンに実施した。脱保護工程を20％ピペリジン/DMF中で実施した。完成したペプチド残基を乾燥し、その後、2時間95％TFA、2.5％TIPSおよび2.5％水を用いて切断した。TFA水溶液を真空乾燥し、エーテル中沈殿させて、無色のペプチド固体を得た。回収されたペプチドを、50％アセトニトリルから凍結乾燥し、C18逆相カラムおよび5％アセトニトリル／水（0.1％TFA）から100％アセトニトリル（0.1％TFA）のグラジェントを用いてHPLCにより精製した。単離したフラクションを合わせ、凍結乾燥し、エレクトロスプレイ質量分析によって分析した（予測MH+ 1268.5、実測値 1267.86 ±1.39）。図28参照。

足場分子の結合（環化ペプチドの合成）
ペプチド（1 mg）を、1,3-ジブロモメチルベンゼン1 mgと一緒にPBS 250μlに溶解し、穏やかに一晩撹拌した。その後、反応物を水1 mlで希釈し、精製のためにC18逆相カラムおよび5％アセトニトリル／水（0.1％TFA）から100％アセトニトリル（0.1％TFA）のグラジェントを用いてHPLCに直接注入した。生成物ピークを単離し、凍結乾燥して、無色の固体を得た（予測MH+ 1370.6、実測値 1371.9 ± 3.8）；図29参照。

環化MOL488の予備酵素切断
環化ペプチド（1 mg）を、5 mg/mlの最終濃度で切断緩衝液（100 mM Tris pH 8.0、0.05％Brij）に溶解した。酵素ヒト好中球エラスターゼ（Leebio Solutions Inc.）を、U/mlの最終濃度に加えた。反応の進行を追跡するために、時限式アリコートを5容量の開始緩衝液（5％アセトニトリル、0.1％TFA）でクエンチし、HPLCで確認した。新しい生成物ピークを経時的に発生させ、約3時間後反応を停止し、生成物フラクションをHPLCにより精製した（予測MH+ 1388.6、実測値 1388.8 ± 2.5）。図30参照。

チロシン残基を欠く場合（配列番号3）であるが、同様の基質に関して、同じ手順をまた実施した。

HPLCの結果を図24にまとめた。図24Aから、1つの切断の生成物がペプチドにおいてHNE活性により生じることが見られる。図24Bは、経時的な生成物の相対的増加、基質の相対的増加を示す経時変化を示す。

図25は、基質が1つの部位において切断されたことおよびそうでなければ基質はそのままであることを確認するマススペクトルデータを示す。図25Aは基質のプロットであり、図25Bは加水分解された生成物である。

実施例10 - 結合方法
免疫して抗体を発現するために担体タンパク質にプロテアーゼ-消化ペプチド生成物を結合するために、クリップチオールアルキル化ルートに垂直な化学が適用されることが必要である。3つの異なる化合物（ジアゾ、オキシムおよびトリアゾール）の結合は、結合を達成するためにこの場合考慮される。第1の選択肢（図26）において、ペプチドをつりさげ型のチロシン残基で合成できる。ヘテロ二機能性試薬FBDP（Sigma）を、つりさげ型のアジド後部を形成するチロシンのフェノール基上にアミノオキシリンカー（Berry Associates）を結合するために用いる。次にこれを、アルキン試薬で標識した担体タンパク質に結合できる。あるいは、ペプチドをアミノオキシ末端（図27）で合成でき、その後、これを、FBDP試薬を用いて担体タンパク質上のチロシン残基に直接架橋できる。

本発明は、本明細書に記載の特定に実施態様による範囲に限定されない。実際には、本明細書に記載のものに加えて本発明の様々な改良が、先の記載および付属の図面から当業者に明らかであろう。そのような改良を特許請求の範囲の範囲内とするように意図する。さらに、本明細書に記載のすべての態様および実施態様は、広く任意およびすべての他の矛盾しない実施態様（必要に応じて（分離して含む）本発明の他の態様から得られたものを含む）と適用可能で併合可能であると考えられる。多様な刊行物が本明細書に引用され、これらの開示は出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。

Claims (101)

1. 基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための酵素検出デバイスであって、
   (i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
   (a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
   (b) 捕捉部位；
   を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子；
   (ii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン；ならびに
   (iii) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
   を含む、デバイス。
2. 少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の2つの部分を生じ、結合分子が、捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる、請求項1に記載の酵素検出デバイス。
3. 少なくとも1つの切断部位の切断が、指示薬分子の2つの別々の部分を生じる、請求項1または2に記載の酵素検出デバイス。
4. 少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の2つの部分を生じるように、指示薬分子が構造上拘束される、請求項1または2に記載の酵素検出デバイス。
5. 結合分子が、切断後に切断領域に結合する、請求項1〜4のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
6. 結合分子が、切断後に指示薬分子の切断領域の両部分に結合する、請求項5に記載の酵素検出デバイス。
7. 少なくとも1つの切断部位が、2個のアミノ酸残基間に位置するペプチド結合を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
8. 基質を切断できる酵素がプロテアーゼを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
9. プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項8に記載の酵素検出デバイス。
10. 少なくとも1つの切断部位が、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項1〜9のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
11. 少なくとも1つの切断部位が、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項1〜10のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
12. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる、請求項1〜11のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
13. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13、9、2、12および8による切断にバイアスがかけられ、該切断が優先順であってもよい、請求項1〜12のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
14. 切断部位が、切断後にアミノ酸配列GPQGを含む部分およびアミノ酸配列IFGQを含む部分を生じるアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にある、請求項1〜13のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
15. 結合分子が抗体を含む、請求項1〜14のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
16. 捕捉部位がビオチン分子を含み、捕捉ゾーンがストレプトアビジン分子を含む、請求項1〜15のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
17. デバイスが、捕捉分子が結合して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む、請求項1〜16のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
18. 固体支持体が、さらに、検体が適用される検体適用ゾーンを含む、請求項17に記載の酵素検出デバイス。
19. 固体支持体が、さらに、検体適用ゾーンから見て捕捉ゾーンの下流に、該デバイスを用いるアッセイが正常に完了したことを示すための、結合分子に結合する更なる結合分子を含むコントロールゾーンを含む、請求項17または18に記載の酵素検出デバイス。
20. 固体支持体がクロマトグラフ媒体を含む、請求項17〜19のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
21. 基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における有無を検出するための方法であって、
    (i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
    (a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
    (b) 捕捉部位；
    を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる）；
    (ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること（ここで、該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
    (iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
    (iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
    を含む、方法。
22. 基質を切断できる酵素の切断活性を検出することにより試験検体の呼吸器病態を診断するための方法であって、
    (i) 指示薬分子を試験検体と接触させること（ここで、該指示薬分子は、
    (a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
    (b) 捕捉部位；
    を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる）；
    (ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること（ここで、該結合分子は、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない）；
    (iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること；ならびに
    (iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること（ここで、コントロールと比較して切断のレベルが増加することによって呼吸器疾患を診断する）
    を含む、方法。
23. 呼吸器病態が、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性線維症が原因の気道の炎症である、請求項22に記載の方法。
24. 少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の2つの部分を生じ、結合分子が、捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる、請求項21〜23のいずれかに記載の方法。
25. 少なくとも1つの切断部位の切断が、指示薬分子の2つの別々の部分を生じる、請求項21〜24のいずれかに記載の方法。
26. 少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の2つの部分を生じるように、指示薬分子が構造上拘束される、請求項21〜24のいずれかに記載の方法。
27. 結合分子が、切断後に切断領域に結合する、請求項21〜26のいずれかに記載の方法。
28. 結合分子が、切断後に指示薬分子の切断領域の両部分に結合する、請求項27に記載の方法。
29. 少なくとも1つの切断部位が、2個のアミノ酸残基間に位置するペプチド結合を含む、請求項21〜28のいずれかに記載の方法。
30. 基質を切断できる酵素がプロテアーゼを含む、請求項21〜29のいずれかに記載の方法。
31. プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項30に記載の方法。
32. 少なくとも1つの切断部位が、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項21〜31のいずれかに記載の方法。
33. 少なくとも1つの切断部位が、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項21〜32のいずれかに記載の方法。
34. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる、請求項21〜33のいずれかに記載の方法。
35. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13、9、2、8および12による切断にバイアスがかけられ、該切断が優先順であってもよい、請求項21〜34のいずれかに記載の方法。
36. 切断部位が、切断後にアミノ酸配列GPQGを含む部分およびアミノ酸配列IFGQを含む部分を生じるアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にある、請求項21〜38のいずれかに記載の方法。
37. 結合分子が抗体を含む、請求項21〜36のいずれかに記載の方法。
38. 捕捉部位がビオチン分子を含み、捕捉ゾーンがストレプトアビジン分子を含む、請求項21〜37のいずれかに記載の方法。
39. デバイスが、捕捉分子が結合して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む、請求項21〜38のいずれかに記載の方法。
40. 固体支持体が、さらに、検体が適用される検体適用ゾーンを含む、請求項39に記載の方法。
41. 固体支持体が、さらに、検体適用ゾーンから見て捕捉ゾーンの下流に、該デバイスを用いるアッセイが正常に完了したことを示すための、結合分子に結合する更なる結合分子を含むコントロールゾーンを含む、請求項39または40に記載の方法。
42. 固体支持体がクロマトグラフ媒体を含む、請求項35〜37のいずれかに記載の方法。
43. 試験検体を固体支持体に加える前に試験検体と指示薬分子を混合する、請求項35〜38のいずれかに記載の方法。
44. アミノ酸配列GPQGに結合するがアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）には結合しない抗体。
45. アミノ酸配列IFGQに結合するがアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）には結合しない抗体。
46. 基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための酵素検出キットであって、
    (i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
    (a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；および
    (b) 捕捉部位；
    を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子；
    (ii) 指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子；
    (iii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンを形成するために捕捉分子が結合し得る（すなわち結合することができるかまたは結合している）固体支持体；ならびに
    (iv) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
    を含む、キット。
47. 少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の2つの部分を生じ、結合分子が、捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる、請求項46に記載の酵素検出キット。
48. 少なくとも1つの切断部位の切断が、指示薬分子の2つの別々の部分を生じる、請求項46または47に記載の酵素検出キット。
49. 少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の2つの部分を生じるように、指示薬分子が構造上拘束される、請求項46または47に記載の酵素検出キット。
50. 結合分子が、切断後に切断領域に結合する、請求項46〜49のいずれかに記載の酵素検出キット。
51. 結合分子が、切断後に指示薬分子の切断領域の両部分に結合する、請求項50に記載の酵素検出キット。
52. 少なくとも1つの切断部位が、2個のアミノ酸間に位置するペプチド結合を含む、請求項46〜51のいずれかに記載の酵素検出キット。
53. 基質を切断できる酵素がプロテアーゼを含む、請求項46〜52のいずれかに記載の酵素検出キット。
54. プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項53に記載の酵素検出キット。
55. 少なくとも1つの切断部位が、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項46〜54のいずれかに記載の酵素検出キット。
56. 少なくとも1つの切断部位が、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項46〜55のいずれかに記載の酵素検出キット。
57. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる、請求項46〜56のいずれかに記載の酵素検出キット。
58. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13、9、2、8および12による切断にバイアスがかけられ、該切断が優先順であってもよい、請求項46〜57のいずれかに記載の酵素検出キット。
59. 切断部位が、切断後にアミノ酸配列GPQGを含む部分およびアミノ酸配列IFGQを含む部分を生じるアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にある、請求項46〜58のいずれかに記載の酵素検出キット。
60. 結合分子が抗体を含む、請求項46〜59のいずれかに記載の酵素検出キット。
61. 捕捉部位がビオチン分子を含む、請求項46〜60のいずれかに記載の酵素検出キット。
62. 捕捉分子がストレプトアビジン分子を含む、請求項46〜61のいずれかに記載の酵素検出キット。
63. キットが、捕捉分子が結合して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む、請求項46〜62のいずれかに記載の酵素検出キット。
64. 固体支持体が、さらに、検体が適用される検体適用ゾーンを含む、請求項46〜63のいずれかに記載の酵素検出キット。
65. キットが、さらに、結合分子に結合できる更なる結合分子を含む、請求項46〜64のいずれかに記載の酵素検出キット。
66. 固体支持体が、さらに、検体適用ゾーンから見て捕捉ゾーンの下流に、更なる結合分子が結合し得るコントロールゾーンを含む、請求項65に記載の酵素検出キット。
67. 固体支持体がクロマトグラフ媒体を含む、請求項46〜66のいずれかに記載の酵素検出キット。
68. 試験検体における呼吸器病態を診断するための、請求項1〜20のいずれかに記載の酵素検出デバイスの使用。
69. 試験検体における呼吸器病態を診断するための、請求項21〜43のいずれかに記載の方法の使用。
70. 試験検体における呼吸器病態を診断するための、請求項46〜62にいずれかに記載の酵素検出キットの使用。
71. 呼吸器病態が、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性線維症が原因の気道の炎症である、請求項68〜70のいずれかに記載の使用。
72. 基質を切断できる酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するのに用いるための指示薬分子であって、
    (a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域；
    (b) 捕捉部位；および
    (c) 少なくとも1つの切断部位の外側にあり、切断領域の外側であってもよい指示薬分子の少なくとも2つの部分をつなげるために作用する足場分子
    を含む指示薬分子であり、該足場が、さらに、少なくとも1つの切断部位の切断が結合分子と結合する新しい結合部位を生じるように構造上指示薬分子を拘束するために作用し、該結合分子が、切断が生じるまで指示薬分子に結合できない、指示薬分子。
73. 新しい結合部位が指示薬分子の新しい構造的配座を示す、請求項72に記載の指示薬分子。
74. 新しい結合部位が少なくとも切断領域の一部を含む、請求項72または73に記載の指示薬分子。
75. 新しい結合部位が少なくとも足場分子の一部を含む、請求項72〜74のいずれかに記載の指示薬分子。
76. 新しい結合部位が、切断により生じる指示薬分子の少なくとも2つの部分の両方の一部を含む、請求項72〜75のいずれかに記載の指示薬分子。
77. 新しい結合部位が切断部位を含む、請求項72〜76のいずれかに記載の指示薬分子。
78. 切断部位がプロテアーゼによる切断に対して特異的である、請求項72〜77のいずれかに記載の指示薬分子。
79. プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項78に記載の指示薬分子。
80. 少なくとも1つの切断部位が、特定のプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項72〜79のいずれかに記載の指示薬分子。
81. 少なくとも1つの切断部位が、特定のマトリックスメタロプロテアーゼによる切断にバイアスがかけられる、請求項72〜80のいずれかに記載の指示薬分子。
82. 少なくとも1つの切断部位が、MMP-13および／またはMMP-9による切断にバイアスがかけられる、請求項72〜81のいずれかに記載の指示薬分子。
83. 少なくとも1つの切断部位が、適宜望ましい順にMMP-13、9、2、12および8による切断にバイアスがかけられ、該切断が優先順であってもよい、請求項72〜82のいずれかに記載の指示薬分子。
84. 切断部位が、アミノ酸配列GPQGを含む部分およびアミノ酸配列IFQGを含む部分を生じるアミノ酸配列GPQGIFGQ（配列番号1）内にある、請求項72〜83のいずれかに記載の指示薬分子。
85. 図14または15に示す足場分子より選択される足場分子を含む、請求項72〜81のいずれかに記載の指示薬分子。
86. 結合分子が抗体を含む、請求項72〜85のいずれかに記載の指示薬分子。
87. 捕捉部位がビオチン分子を含む、請求項72〜86のいずれかに記載の指示薬分子。
88. 足場分子が（ヘテロ）芳香族分子を含む、請求項72〜87のいずれかに記載の指示薬分子。
89. （ヘテロ）芳香族分子が少なくとも2個のハロゲン化ベンジル置換基を含む、請求項86に記載の指示薬分子。
90. 該足場がハロメチルアレーンである、請求項72〜89のいずれかに記載の指示薬分子。
91. 該ハロメチルアレーンが、ビス(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)ベンゼンおよびテトラ(ブロモメチル)ベンゼンからなる群より選択されるか、あるいはそれらの誘導体である、請求項90に記載の指示薬分子。
92. 該足場が、オルト、メタおよびパラ-ビス(ブロモメチル)ベンゼンからなる群より選択されるか、1,2-ビス(ブロモメチル)ベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)ベンゼンおよび1,4-ビス(ブロモメチル)ベンゼンより選択されてもよく、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン、1,2,4,5-テトラキス(ブロモメチル)ベンゼンおよび1,2,3,4,5,6-ヘキサキス(ブロモメチル)ベンゼンなどのさらに置換されたハロメチルアレーンより選択されるか、2,7-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,4-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,8-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,3-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,2-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、2,3-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、2,6-ビス(ブロモメチル)-ナフタレン、1,2,3,4-テトラキス(ブロモメチル)-ナフタレン、9,10-ビス(ブロモメチル)-フェナントレン、5,10-ビス(ブロモメチル)-アントラセンおよび1-(ブロモメチル)-3-[3-(ブロモメチル)ベンジル]ベンゼンなどの多環式ハロメチルアレーンより選択されるか、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-メチルベンゼン、2,5-ビス(ブロモメチル)-1,3-ジメチルベンゼン、2,5-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメチルベンゼン、2,4-ビス(ブロモメチル)-1,3,5-トリメチルベンゼンおよび3,6-ビス(ブロモメチル)デュレンなどのメチル置換ハロメチルアレーンより選択されるか、3,4-ビス(ブロモメチル)-ニトロベンゼンおよび2,3-ビス(ブロモメチル)-ニトロベンゼンなどのニトロ置換ハロメチルアレーンより選択されるか、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-ヒドロキシベンゼンなどのヒドロキシ置換ハロメチルアレーンより選択されるか、2,6-ビス(ブロモメチル)-ベンゾニトリルなどのシアノ置換ハロメチルアレーンより選択されるか、あるいは1,3-ビス(ブロモメチル)-5-メトキシベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)-2-メトキシ-5-メチルベンゼン、1,3-ビス(ブロモメチル)-5-ヒドロキシベンゼン、2,3-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメトキシベンゼンおよび2,5-ビス(ブロモメチル)-1,4-ジメトキシベンゼンなどのメトキシ置換ハロメチルアレーンより選択される、請求項72〜91のいずれかに記載の指示薬分子。
93. 請求項72〜92のいずれかに記載の指示薬分子を組み込んでいる、請求項1〜20のいずれかに記載の酵素検出デバイス。
94. 請求項72〜92のいずれかに記載の指示薬分子を組み込んでいる、請求項21〜43のいずれかに記載の方法。
95. 請求項72〜92のいずれかに記載の指示薬分子を組み込んでいる、請求項46〜67のいずれかに記載の酵素検出キット。
96. 酵素の切断活性の試験検体中における存在を検出するための、請求項72〜92のいずれかに記載の指示薬分子の使用。
97. 図面に関してここで定義された酵素検出デバイス。
98. 図面に関してここで定義された方法。
99. 図面に関してここで定義された酵素検出キット。
100. 式IもしくはII（チロシン残基を欠いてもよい）で示されるかまたは図面に関してここで定義された指示薬分子。
101. 図面に関してここで定義された結合分子。

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