JPH09101306A - 標的蛋白質の親和性精製に有用なペプチドリガンドの選択のための組み合わせペプチドライブラリーのスクリーニング - Google Patents

標的蛋白質の親和性精製に有用なペプチドリガンドの選択のための組み合わせペプチドライブラリーのスクリーニング

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JPH09101306A
JPH09101306A JP8135710A JP13571096A JPH09101306A JP H09101306 A JPH09101306 A JP H09101306A JP 8135710 A JP8135710 A JP 8135710A JP 13571096 A JP13571096 A JP 13571096A JP H09101306 A JPH09101306 A JP H09101306A
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JP8135710A
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A Buettner Joseph
ジヨセフ・エイ・ビユツトナー
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Bayer Corp
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Bayer AG
Bayer Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 標的と相互作用するリガンドは、検出系から
擬陽性相互作用（特異的もしくは非特異的のいずれか）
が標的特異的相互作用から識別される場合には一層容易
な同定を可能にする。標的蛋白質と結合するペプチドを
同定する改良法の提供。 【解決手段】 ペプチドのランダムライブラリーを支持
体材料に結合させ、検出試薬をペプチドおよび支持体材
料に接触させ、次いでそれらの相互作用を同定し、その
後に標的蛋白質を選択的にそれらのペプチドに結合さ
せ、検出用試薬を結合化標的蛋白質に接触させ、そして
同定される支持体材料に結合しているペプチドの特性決
定を行う各段階を含んでなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般的には他の分子
に結合するリガンドの同定方法に関し、そして具体的に
はアッセイにおいて用いられる検出試薬と特異的もしく
は非特異的に結合するリガンドから標的特異的リガンド
を差別化することにより標的特異的リガンドを識別する
同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチド親和性カラムは蛋白質の精製用
の既存のクロマトグラフィー技術を陵駕する実質的な利
点を提供する（１）。この精製方法の威力が既知の結合
性配列に基づき刊行物（２）において強調されている
が、主な制約はリガンドとして作用しうる既知の配列の
欠如である（１）。最近開発されたランダムペプチドラ
イブラリー（組み合わせライブラリー、ミモトープライ
ブラリー、もしくはエピトープライブラリーとも称され
る）は特定された長さのペプチドのための莫大な数のア
ミノ酸の組み合わせ物を含み、このライブラリーにより
蛋白質−ペプチド相互作用の特徴付けのための合理的な
アプローチが可能になった（３〜１３）。
【０００３】ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈにより最初に
提唱された方法（３）に従うと、６量体（６つのアミノ
酸残基）ライブラリーを、化学的に合成されたオリゴヌ
クレオチドのランダム配列（１８の異なるコドンからな
るもの）をスプライシングさせてバクテリオファージコ
ート蛋白質のコーディング領域内に導入することにより
作製することが可能である。可能性として考えられる１
０14の独特なヌクレオチドコドンの内の１０7を上回る
ものを現在のファージ−提示技術（３〜６）で表すこと
が可能である。このファージを宿主である大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞内で複製させ、回
収し、そして培養皿の表面上に固定化させてある標的蛋
白質と共に直接インキュベートする（３）。その標的蛋
白質と特異的に相互作用を行うペプチド配列を含むファ
ージがその標的蛋白質により固定化される一方で、その
標的蛋白質に特異的には結合しないファージは後続の洗
浄時に失われる。結合したファージを回収し、そしてそ
の標的蛋白質に特異的に結合するペプチドを同定するこ
とが可能なように処理する。
【０００４】しかしながら親和性精製用のリガンドの組
み合わせライブラリーをスクリーニングするための方法
は以下のような主な制約を有しており、それらは：１）
その標的蛋白質に結合するファージ提示性ペプチドをバ
イオパニング法により単離する必要があり；２）結合性
ファージのＤＮＡの配列決定を行う必要があり；３）そ
のペプチドの結合もしくはそれを用いての精製の評価が
可能になる前に、ペプチドを合成および精製する必要が
あり、そしてその後にはクロマトグラフィー用支持体上
へのそのリガンドの化学的カップリングを実施する必要
があり；そして４）そのクロマトグラフィー用支持体の
表面上に存在するペプチド配列の微細環境はそのペプチ
ドがその標的に結合する能力に根本的に影響を及ぼす可
能性があり、その微細環境はファージにより提示される
ものとはまったく異なる可能性がある、ということであ
る。
【０００５】最初にＦｕｒｋａ（７）により例示された
混合、分割、および結合合成法では、１００万の独特な
ペプチド配列がポリスチレンを基にする樹脂性ビーズ上
に作製される。この技術に対する後続改変法により反応
性配列を同定することが可能になった（１０）。しかし
ながらこれらの結合性アッセイによる標的特異的配列の
同定は、不十分なバッチ洗浄からの高いバックグラウン
ド染色、ならびにその標的蛋白質と特異的に相互作用す
るものからその検出試薬と相互作用するビーズ上の配列
との間を識別する能力がもともと不十分であることによ
りその信頼性が低くめられている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】どの独特なペプチド
（ビーズ）がその標的蛋白質と特異的に相互作用をし、
そしてどのペプチド（ビーズ）がその検出試薬と反応す
るかを識別する時点での困難性を克服するために、本発
明者は親水性クロマトグラフィー用樹脂上でペプチドを
合成し、そして検出用試薬と反応するビーズをある色に
染色し、かつ標的蛋白質に特異的なものを他の色に染め
る２段階染色方法を考案した。典型的にはこの作業は検
出試薬としての抗体−酵素複合体を用いて実施される
が、他の試薬を使用することが可能である。可能と思わ
れる最も効率のよい洗浄条件を作出するために、本発明
者は全アッセイを、樹脂の素通り特性を利用して高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム中で実施す
る。各試薬を、塩の濃度勾配液により非特異的結合物を
除去する洗浄プログラムを用いながら個別のＨＰＬＣ注
入の際にそのビーズと接触させる。こうしてアッセイの
自動化が行われ、かつバッチアッセイに関して共通の操
作毎の変動が除去される。
【０００７】標的蛋白質に特異的に結合するペプチドを
同定する際の困難性に加え、ペプチド合成およびＨＰＬ
Ｃ用の支持体を提供することが可能なクロマトグラフィ
ー用媒体の使用は限定されている。大半のペプチド合成
用支持体はポリスチレンを基にする樹脂であり、これは
生物学的アッセイに関する使用には不適切である。ポリ
スチレン−ビーズ樹脂が様々な血漿蛋白質と特異的にも
非特異的にも相互作用することが刊行物において良く知
られている（１１）。検出試薬への非特異的結合を減少
させるために、親水性ペプチド樹脂がペプチドの合成お
よびスクリーニングにおいて用いられている（１２、１
３）。ポリスチレンを基にする数々のペプチド合成用樹
脂が親水性にされているが（８、９）；しかしながらこ
れらは化学合成用に設計されており、そして直接的な生
物学的アッセイ（１３）用でもなく、大用量用のクロマ
トグラフィー用支持体としてのものでもない。
【０００８】Ｍｅｌｄａｌらはペプチドライブラリー作
製用に改変させた市販品として入手可能なアクリルアミ
ドポリマー樹脂の使用を例示している（１２）。ペプチ
ド合成およびライブラリーの探索には適切ではあるもの
の、アクリルアミド樹脂は大用量の高速クロマトグラフ
ィーに必要な化学的保全性を有していない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】疎水性樹脂に関連する問
題を克服するために、本発明者は、ペプチド合成、スク
リーニング、評価、および恐らく最終的にはクロマトグ
ラフィー的使用に用いることが可能な新規の改変化樹脂
を開発した。本発明の基盤を形成する樹脂は、Ｔｏｓｏ
Ｈａａｓ社から市販品として入手可能なポリヒドロキシ
ル化メタクリレートポリマーである（１４）。この樹脂
を際立たせている特性は、このポリマーの固有の親水性
特性、大きな孔径（通常１０００オングストローム）、
機械的および化学的保全性、ならびにクロマトグラフィ
ー分離の際の直接的適用のために等級範囲を揃えたビー
ズ直径にある。この樹脂はペプチド合成用に遊離アミノ
酸を生じるように単純な改良を加えた後、古典的ペプチ
ド合成試薬に対する良好な化学的耐性を示す。
【００１０】この樹脂および２色染色アッセイにより、
本発明者は標的蛋白質に結合するペプチド配列を同定す
ることが可能になり、これらのペプチド配列は従来の技
術とは対照的に、標的蛋白質のみに特異的であり、かつ
試薬には特異的でないものとして選択される。検出用試
薬に結合するビーズは私の方法によって排除される。
【００１１】こうして、本発明によれば、標的物質に結
合するであろうリガンドを選択する方法であって、前記
リガンドが個々の支持体材料に結合する個々のランダム
リガンド集団中に存在し、かつ前記選択がラベル化シグ
ナル提供性検出系を用いて行われるものである方法にお
いて、前記ランダムリガンド集団を、そのリガンド集団
と標的物質とのいずれかの接触以前にその検出系からの
組成物と共にインキュベートし、そうしてその標的物質
との接触後、次いでラベル化シグナル提供検出系の試薬
を再度そのリガンド集団と接触させ、かつそれを用い
て、その標的物質に結合しないランダムリガンドのバッ
クグラウンドに対してこの標的物質に結合するリガンド
の検出を可能にする異なるシグナルを発生させることを
可能にすることを特徴とする方法が提供される。
【００１２】本発明は、組み合わせペプチドライブラリ
ー中のどのペプチドが標的蛋白質と特異的に結合するか
を決定するための方法である。このペプチドライブラリ
ーはクロマトグラフィー用支持体に結合し、そしてその
後に検出用試薬と共にインキュベートされ、このことに
より支持体の検出可能な変化（例えば、色変化）がもた
らされる（この場合、ペプチドもしくは支持体がその検
出用試薬と結合する）。その後に標的蛋白質をその支持
体に、その支持体上のペプチドへの特異的様式での標的
蛋白質結合の助けとなる条件下で添加する。検出用試薬
を再度添加するが、この時点で前のものすなわち最初の
変化からペプチドに特異的に結合した標的蛋白質を識別
する異なる変化（例えば、異なる色）がもたらされる。
好ましい態様では、この検出用試薬は抗体およびそれら
の酵素複合体であり、かつこの方法はＨＰＬＣ装置を用
いて実施される。そして、この装置は試薬の添加および
この系からの未反応の試薬の洗浄のための有効な手法と
して作用する。次いで、同定されたペプチドを製造し、
そして標的蛋白質の親和性精製において使用するために
クロマトグラフィー用支持体に結合させることが可能で
ある。好ましい支持体は親水性でありかつ多孔性のもの
で、約８００〜約１２００オングストローム、好ましく
は約１，０００オングストロームの好ましい平均孔径を
有する。好ましいラベル化検出系には酵素−複合形成化
ラベル（標識）があり、これは選択される基質に依存し
て観察可能な色変化の発生を可能にするが、他のラベル
もしくは標識、あるいは組み合わせ物を使用することも
できる（例えば、放射線ラベル化抗体もしくは蛍光ラベ
ル化抗体）。
【００１３】
【発明の具体的かつ好ましい形態】 材料および方法樹脂の化学特性 ペプチド合成用には、ポリヒドロキシ
ル化メタクリレート−タイプのクロマトグラフィー用樹
脂、好ましくはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ＭＣｈｅｌ
ａｔｅ（６５μｍの粒子サイズ、１０００Åの孔径；Ｔ
ｏｓｏＨａａｓ社、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、
ＰＡ）を、２５ｇの反応容器中、水、メタノール、およ
びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で濯いだ。樹脂のカ
ルボキシレートの５倍モル過剰のメチレンジアミンをそ
のカルボキシレート部分に、ＤＭＦ中のやや過剰ぎみの
モル濃度のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ト
リス−ピロリドノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸
エステル（ＰｙＢＯＰ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＮ−メチルピロリジノン
（ＮＭＭ、ＰｙＢＯＰの３倍モル過剰；Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社：Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、
ＷＩ）を用いて６０分間カップリングさせた。このアミ
ノ化された樹脂をＤＭＦで、次いではメタノールで洗浄
し、その後に減圧下で乾燥させた。
【００１４】非開裂性樹脂を作製するために、２つの標
準的固相ペプチド合成カップリング法を行って２分子の
β−アラニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）スペーサー
残基を導入した（ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋとして引用され
る）。可溶性ペプチド用の開裂性樹脂を作製するために
は、２倍モル過剰（ビーズ上のアミンについて）のｐ−
［（Ｒ，Ｓ）−α−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イ
ル）−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベ
ンジル］−フェノキシ酢酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ
社）をやや過剰ぎみのモル濃度のＰｙＢＯＰおよびＮＭ
Ｍで活性化させ、その後にアミン化ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋ
樹脂に添加した。カップリングは４時間進行させ、その
後にＤＭＦおよびメタノール洗浄を施した。当業者によ
り広く知られており、かつ様々なポリヒドロキシル化メ
タクリレート樹脂に利用可能な機能性部分に対する適合
性を示す他の連結用化学方法を使用することが可能であ
る。市販品として入手可能なＲｉｎｋアミド樹脂を比較
用に用いた。
【００１５】組み合わせライブラリーペプチドの化学特
性 組み合わせペプチドライブラリーをＦｕｒｋａ
（７）に類似の様式で作製した。多重ペプチド合成機中
の大用量合成ブロックを用いて半自動化様式で各カップ
リングを実施した。半グラムの乾燥させたアミン化ＴＳ
Ｋ−Ｂｌａｎｋ樹脂を１８の反応容器の各々に添加し、
そして２０の天然に存在するＬ−アミノ酸の内の１８
（この実施例Ｉではシステインとメチオニンが省略され
ており；しかしながらこれは本発明の利用性についての
要件でない）を標準的ＦＭＯＣ化学方法（以下を参照せ
よ）によりカップリングさせた。各容器からの樹脂を合
わせ、そしてアルゴン撹拌を伴いながらＤＭＦ中で洗浄
した。この樹脂を１８の反応容器に均等に再分配し、そ
して次のアミノ酸を最初の要領でカップリングさせた。
この作業を、６０量体ライブラリーが完成するまで反復
させた（２日の作業日数）。この樹脂を合わせ、メタノ
ールで洗浄し、減圧下で乾燥し、その後にＲｅａｇｅｎ
ｔ Ｒ（１８）（９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）、５％のチオアニソール、３％のエタンジチオー
ル、２％のアニソール；全てＡｌｄｒｉｃｈ社からのも
の）で３時間、アルゴン撹拌を伴いながら脱ブロッキン
グした。この樹脂を２０カラム容積のメタノールで洗浄
し、その後に減圧下で乾燥させた。
【００１６】バッチペプチド合成 ペプチド配列は固相
法（１５）により、ＧｉｌｓｏｎＡＭＳ４２２ Ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
（１６）上で、α−アミノ保護基としてＦＭＯＣ（１
６、１７）を用いて合成した。ペプチドが分析用にビー
ズから開裂されるか否かに依存して、アミン化−開裂性
ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋ樹脂、もしくは非開裂性ＴＳＫ−Ｂ
ｌａｎｋ樹脂、あるいはＲｉｎｋ樹脂（比較用）のいず
れかを合成用支持体として用いた。アミノ酸の大用量単
独カップリング（５倍モル過剰；ＤＭＦ中０．５Ｍの１
ｍＬ分）をＰｙＢＯＰ（ＤＭＦ中０．３Ｍ）の０．５ｍ
Ｌ分）およびＮＭＭ（ＤＭＦ中１．１９Ｍの０．２５ｍ
Ｌ分）を用いてインサイチューで、本発明者の改質Ｔｏ
ｓｏＨａａｓ樹脂（０．３ｇ、２００μモル）もしくは
Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５ｇ、２００μモル）を用い
て活性化させた。カップリングはアルゴン気泡震盪を伴
いながら４５分間進行させた。全ペプチドを開裂させ、
そして／またはＲｅａｇｅｎｔ Ｒで３．５時間ブロッ
キングさせた。
【００１７】親和性クロマトグラフィー分析について
は、ＴＳＫ非開裂性樹脂−ペプチドを合成用容器内で脱
保護化し（当該技術分野において一般的に実施される要
領で）、メタノールで徹底的に洗浄し、そして減圧下で
乾燥させた。ペプチド分析については、このＴＳＫ開裂
性樹脂およびＲｉｎｋペプチド−樹脂を開裂させ、そし
て２０ｍＬのシンチレーション容器内で脱保護化した。
これらのペプチド混合物を、中程度の孔度のガラス漏斗
を通してその樹脂から直接４０ｍＬの冷却無水ジエチル
エーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に濾過した。ペプチド
のフィルターケーキを５０％のアセトニトリル／水中に
溶解し、そして風袋重量を測定してあるシンチレーショ
ン容器内で凍結乾燥させた。これらの沈殿した未精製ペ
プチドを２５〜５０ｍｇ／ｍｌで５０％のアセトニトリ
ル／水中に溶解し、そして１ｍＬを精製用ＨＰＬＣ（Ｇ
ｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．社）により２２ｍｍ×２５０ｍｍ
の（Ｃ１８ １５μ ３００Å）逆相カラム（Ｖｙｄａ
ｃ社：Ｈｅｓｐｅｒｉａ社、ＣＡ）で精製した。純度を
確認するために粗精製ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬで５０
％のアセトニトリル／水中に溶解し、そして精製された
ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬで２０％のアセトニトリル／
水中に溶解した。１０μＬのアリコートを微孔性ＨＰＬ
Ｃ（Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕ
ｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．社；Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）
により２．１ｍｍ×１５０ｍｍ Ｃ１８ ５μ ３００
Åの逆相カラムおよび水中の２〜６０％のアセトニトリ
ル濃度勾配液で１２分間にわたり分析した。
【００１８】分析 アミノ酸分析はＳｐｅｃｋｍａｎ
（２０）により記載される要領で、６３００ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社；Ｆｕｌｌｅｒｔｏ
ｎ、ＣＡ）でニンヒドリン検出を用いて実施した。ペプ
チドの質量決定はＪＥＯＬ ＨＸ−１１０二重焦点質量
分析機上での陽イオン高速原子衝撃（ＦＡＢ）イオン化
により実施した。これらのペプチドを５０％のアセトニ
トリル／水中でチオグリセロールマトリックス上にスポ
ットした。質量範囲のスキャンはペプチドの予想質量に
依存して行った。ペプチドの配列決定はエドマン（Ｅｄ
ｍａｎ）化学法により、１２０Ａ ＨＰＬＣ（Ｃ１８
ＰＴＨ、逆相クロマトグラフィー）Ａｎａｌｉｚｅｒと
インターフェースで接続されているＡＢＩ ４７７Ａ
Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＰｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；Ｆｏｓｔ
ｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施して、フェニルチオ
ヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を決定した。サンドゥ
イッチ式ＥＬＩＳＡ検査はＢｅｓｓｏｓ（２１）により
記載される要領で実施した。蛋白質試料はＢｉｕｒｅｔ
アッセイ（２２）により定量化し、その後にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（２３）およびウエスタンブロット技術（２４）
により分析した。
【００１９】ＨＰＬＣライブラリー免疫アッセイ 検出
試薬結合性ペプチド−樹脂ビーズと標的結合性ペプチド
−樹脂ビーズとの間を識別するために、本発明者は２色
ペプチドライブラリー染色用クロマトグラフィー技術を
開発した。図１は、その技術の好ましい態様の概略図で
ある。全アッセイは、２．１ｍｍの内径（Ｉ．Ｄ．）×
１５０ｍｍの長さのステンレス鋼カラム（容積＝５２０
μＬ）内でＵｌｔｒａｆａｓｔ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて３７℃で実施した。乾
燥ライブラリー樹脂を吸引によりカラムに充填し、その
後にそのカラムを検出機のフローセルに連結させ、そし
て２０カラム容積の２０％メタノール／水、５カラムの
１００％ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、
１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2、２０
ｍｇ／ｍＬ Ｄ−マニトール；これら全てはＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ、からのものである）で、次いで５カラム容積の５０
％ Ｂｕｆｆｅｒｅ Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ａに加えて
１．０ＭのＮａＣｌを含む）で洗浄して樹脂を清掃し
た。完全アッセイは、連続して連なりかつバッチとして
実施される７回のクロマトグラフィー注入プログラムで
できている（ＥＸＣｈｒｏｍ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．社；Ｓａｎ Ｒａｍｏ
ｎ、ＣＡ）。各注入プログラムは９０分の長さであっ
た。各注入プログラムの開始時点で１．０ｍＬの試薬の
試料ループを２００μＬ／分で３．５分間注入し、その
後にカラムを５μＬ／分で５０分間灌流させ、それから
流速を作業期間中４００μＬ／分に増加させた。６０〜
７５分目に０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌの塩勾配液に
より非特異的結合性蛋白質が溶出された。この高塩緩衝
液を用いてカラムを１５分間洗浄し、その後にそのカラ
ムを元の状態へと再平衡化させた。
【００２０】各アッセイバッチ用には７回の注入が存在
し：１）Ｂｕｆｆｅｒ Ａブランク；２）標的蛋白質抜
きの０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｍｉｌｅ
ｓ，Ｉｎｃ．社、Ｃｌａｙｔｏｎ、ＮＣ）（図１Ａ）；
３）１：１０００希釈させた第一抗体（図１Ｂ）；４）
１：１０００希釈させた第二抗体−アルカリ性ホスファ
ターゼ複合体（図２Ａ）を用いた。各免疫試薬はＢｕｆ
ｆｅｒ Ａ中の０．５％ ＨＳＡ中に希釈した。第四注
入プログラム後にバッチ作業を第一染色過程のために停
止した。この特別な例に際しては緩衝液の流れを停止さ
せ、カラムの連結を外し、そして樹脂を１００％のＢｕ
ｆｆｅｒ Ａで３００μＬ／分で抽出した。１５分画
（分画当たり２滴）を２４ウエルのマイクロタイタープ
レート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社／Ｃｏｓｔｅｒ社）中に回収
した。
【００２１】ＢＣＩＰ／ＮＢＴを添加し、そして染色を
そのウエル中で実施した。この染色過程の肉眼的観察は
至適染色時間を考慮に入れて実施した。別法ではこの染
色をカラム中で実施し、全過程を全自動化させることが
可能である（図２Ｂ）。染色化樹脂分画を３ｍＬの反応
用試験管に入れ、水で徹底的に洗浄し、減圧下で乾燥さ
せ、次いでその樹脂を分画化した時と同じ順序でカラム
内に乾燥状態で戻し充填した。ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋ樹脂
を用いてカラム排水口を充填していずれかの損失樹脂の
代用とした。カラムを再平衡化させた後に、標的蛋白質
（０．５％のＨＳＡを含むＢｕｆｆｅｒ Ａ中の２．４
ｐモルの試料量）を注入した（注入プログラム番号５）
（図３Ａ）。後続の２回の注入プログラム６および７
は、プログラム番号３および４と同一であった（図３Ｂ
＆４Ａ）。これらのプログラムが完了した後に、この樹
脂ビーズを以前と同じ要領で分画化し、次いでマイクロ
タイタープレート内でＦａｓｔ Ｒｅｄで染色し、そし
て肉眼的調査を行った。
【００２２】標的蛋白質の親和性精製 標的蛋白質の
親和性精製を用いて、特異的であるとして同定されたペ
プチド配列に関して蛋白質を精製する能力を評価した。
標的蛋白質に結合することが見いだされた個々のライブ
ラリー由来の配列はバッチ方式で、先に既述の要領でＴ
ＳＫ−Ｂｌａｎｋ樹脂上で合成した。脱保護化ペプチド
−樹脂を先に記述の要領で空のカラムに乾燥状態で充填
し、そして２０カラム容積の２０％ メタノール／水
で、次いで１０カラム容積のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗浄
し、そして、１）Ｂｕｆｆｅｒ Ａブランク、２）０．
５％のＨＳＡ、および３）０．５％のＨＳＡ中の標的蛋
白質の各１．０ｍＬの連続的注入によりアッセイを行っ
た。非特異的に結合した蛋白質を２カラム容積分の１．
０ＭのＮａＣｌの段階的濃度勾配中でカラムから洗い落
とし、そして標的蛋白質を弱酸溶液中でカラムから溶出
させた。
【００２３】ＨＰＬＣライブラリー免疫アッセイの確認リボヌクレアーゼＳ蛋白質 この態様ではＨＰＬＣアッ
セイの妥当性を、特異的標的蛋白質のための対照結合性
ペプチドの使用により検査した。以前に同定されたＲＮ
アーゼＳ蛋白質−結合性ペプチド（２５）、ＹＮＦＥＶ
Ｌ、を上記に開示した要領でＴＳＫ−Ｂｌａｎｋ樹脂上
で合成し、次いでＴＳＫ−Ｂｌａｎｋに対するペプチド
−樹脂の最終比率が総重量の１：２０になるまでＴＳＫ
−Ｂｌａｎｋで希釈した。図６は、微細孔ＨＰＬＣ注入
プログラムのＵＶトレース、流速曲線、および標的蛋白
質としてＲＮアーゼＳを用いる免疫アッセイ技術（ＨＳ
Ａは蛋白質担体である）の濃度勾配条件が示されてい
る。赤色ビーズ（ＹＮＦＥＶＬ−ＴＳＫ樹脂ビーズと相
互作用する標的蛋白質を示す）がカラム全体中に５％の
頻度で見いだされ、このことによりこのカラムはペプチ
ドライブラリー免疫染色用クロマトグラフィー作業中に
標的もしくは免疫試薬の枯渇を生じないことが示され
た。ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋからの透明白色ビーズも存在
し、このことにより検出系もしくはＲＮアーゼＳ蛋白質
との反応性が全く存在しないことが示される。暗青色ビ
ーズは非特異的もしくは免疫試薬特異的相互作用を示
し、この色のビーズは非常に低い頻度でのみ存在するに
過ぎなかった（０．０１％を下回る）。幾つかのビーズ
には欠けもしくは切れ込みが、合成、開裂、もしくはク
ロマトグラフィー分析の過程中に生じたが、一般的には
クロマトグラフィー用支持体としてのビーズの保全性は
損なわれているようには思われず、それはビーズが高圧
下（４，０００ｐｓｉを上回る）において崩壊しなかっ
たためである。
【００２４】ＨＰＬＣ親和性クロマトグラフィー法の確
認リボヌクレアーゼＳ蛋白質親和性クロマトグラフィー
この態様ではＨＰＬＣ親和性方法の妥当性を、既述のＲ
ＮアーゼＳ蛋白質／ＹＮＦＥＶＬペプチド系により検査
した。ペプチド合成は上記に開示した要領で実施した。
図７は、ＲＮアーゼＳ蛋白質のＨＰＬＣ親和性クロマト
グラフィー分析を示す。１．０ｍＬの容積の４２ｎモル
のＲＮアーゼＳ蛋白質を２００μＬ／分で３分間カラム
に注入した。流速を５μＬ／分に減少させて５分間カラ
ムの灌流を行い、その後に４００μＬ／分に増加させて
未結合蛋白質を洗い落とした。１３分目に１．０ＭのＮ
ａＣｌを含む１．０ｍＬのＢｕｆｆｅｒ Ａの注入によ
り非特異的結合性蛋白質が溶出され、その後にカラムを
１９分目まで０．１ＭのＮａＣｌに戻し、この１９分目
の時点で水中の２％酢酸への急勾配および８００μＬ／
分の流速を開始した。５分後にカラムをＢｕｆｆｅｒ
Ａに戻して樹脂を平衡化させた。２２分目のピークは酸
洗浄中に溶出された標的蛋白質を示す。
【００２５】
【実施例】６量体ライブラリー−因子ＩＸ標的 ６量体ペプチドラ
イブラリーを、このペプチドライブラリー免疫染色性ク
ロマトグラフィーアッセイを用いて、セリンプロテアー
ゼである因子ＩＸチモーゲンと結合する能力についての
アッセイを行った。このライブラリーを既述の要領でア
ッセイし、そして幾つかの赤色ビーズ配列が見いだされ
た。個々の染色化ビーズを解剖用顕微鏡下、ピペットを
用いて手作業で拾いあげた。２つの独立した分析物から
単離された６つのビーズの内の２つのビーズから明確な
配列が取得された（ＹＡＮＫＧＹおよびＹＮＹＦＮ
Ｑ）。ビーズ当たりのペプチドの量は約１０ｐモル
（０．１ミリグラム当量／ｇ）であることが見いださ
れ、この量は配列決定にとって十分なものである。
【００２６】因子ＩＸ／アルブミン親和性精製 先に同
定されたライブラリー由来ペプチドはヒト血清アルブミ
ンの溶液中の市販品として入手可能な高度に精製された
因子ＩＸチモーゲンの混合物に結合し、そしてそのペプ
チドによる混合物の精製を行った。ＹＡＮＫＧＹ配列を
既述の要領でバッチ合成し、そして定量的アミノ酸分析
により適切な配列が示された。このペプチド−樹脂を、
因子ＩＸと結合する能力について検査した。図８はクロ
マトグラムを示し、これによりＴＳＫ−Ｂｌａｎｋ上で
合成されたＹＡＮＫＧＹペプチドリガンドは因子ＩＸと
結合することが示された。ＨＳＡは小程度ではあるがこ
のカラムと結合した。しかしながらこのＨＳＡは、酸溶
出間にはピークが非存在であることにより証拠付けられ
るように塩洗浄により溶出された。それとは対照的に因
子ＩＸをＨＳＡに添加した場合には、酸により溶出され
る明確なピークが存在した。このことにより、この標的
蛋白質（因子ＩＸ）は特異性を示すに十分な親和力でこ
のペプチドと結合することが示される。
【００２７】図９は、このカラムに添加された因子ＩＸ
の増加量についてのクロマトグラムを示す。直接的な相
関が、酸ピーク領域および注入された因子ＩＸの量との
間に観察された。因子ＩＸを５分間加熱することによ
り、酸ピーク領域の減少により証明されるのと同様にこ
のカラムへの結合が減少した。図９の上部クロマトグラ
ムはＨＳＡ中の２２０μｇの因子ＩＸのＵＶトレースを
示す。この実験からの酸ピーク領域（図１０、レーン
５）は、ＨＳＡを含まない因子ＩＸのものに対するピー
ク領域（図１０、レーン３）とは有意な差異を示さず、
このことは因子ＩＸがＨＳＡから分離していることと一
致する。この実験から採取された分画のアリコートを因
子ＩＸについてアッセイし、ＥＬＩＳＡによる検出を行
った（データ非公開）。素通りピーク中には因子ＩＸが
全く検出されず（図９、上部トレースより）；注入した
因子ＩＸの内の１７％の量がＮａＣｌピークに見いださ
れ；そして２５％が酸ピーク中に見いだされた。因子Ｉ
Ｘは酸溶出中に部分的に変性を受ける可能性があり、こ
のことがＥＬＩＳＡ結果に基づく完全回収の欠失の原因
である可能性がある。実際に、ＥＬＩＳＡでの分析前に
因子ＩＸに酸を添加した対照ではＥＬＩＳＡシグナルの
４０〜５０％の減少が示される。残りの分画を冷却（−
２０℃）アセトン中で沈殿させ、そして還元的ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析して試料を総蛋白質に対して標準化
させた。図１０は、ＨＳＡからの因子ＩＸの明白な精製
物が存在することを示す。ＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫカラム
への因子ＩＸの結合をウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブ
ロット分析により確証したところ：非常に薄い因子ＩＸ
バンドが出発物質中に見いだされ、そしていずれの素通
り分画中にも検出可能な因子ＩＸは見いだされなかった
が、因子ＩＸに相当する濃いバンドがＮａＣｌ洗浄液お
よび酸ピークの両方において見いだされた。
【００２８】血漿由来因子ＩＸの親和性クロマトグラフ
ィー このライブラリー由来のペプチドリガンドの適性
は、未精製ヒト血漿からヒト因子ＩＸチモーゲンを精製
することである。クエン酸処理を施したヒト血漿の１．
０ｍｌの注入物を先の実施例に教示される様式でアセチ
ル−ＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫカラムと接触させた。素通り
および酸ピークを氷上で回収し、そして即座に総蛋白質
量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ）ブロット分析のためのアッセイを実施した。図１
１〜１２は、回収された分画の精製用クロマトグラム、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ）ブロットを示す。各試料を既述の要領で総蛋白質量
に対して標準化した。出発物質中には様々な蛋白質バン
ドが存在し、優勢なものはアルブミンである。この出発
物質中の因子ＩＸバンドはクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ）染色ゲルにおけるいずれの分画にも可視化されな
い。このブロットは出発物質中においては因子ＩＸを示
さず（この検出系の感度を下回っている）、素通り分画
中にも因子ＩＸは見いだされないが、それでも酸ピーク
には非常に大きなバンドが存在する。ＹＡＮＫＧＹ−Ｔ
ＳＫ親和性カラムに一回通し、総蛋白質量およびウエス
タン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットにより分析すると、血
漿からの大まかな精製率は２００倍となった。このこと
により結局は、このライブラリー由来の配列はヒト血漿
からの因子ＩＸチモーゲンに結合し、そしてそれを精製
することが示される。
【００２９】このＨＰＬＣアッセイ用の他の検出系非比色性検出系 本発明はこれまでの実施例に用いられ
るものに機能的に等価である異なる試薬を用いることに
拡張することが容易に可能であることが当業者によって
更に理解され得る。抗体−複合体は好ましい態様であ
り；しかしながら、標的−酵素の直接複合体もこの技術
に関しては使用可能である。当該技術分野ではペプチド
配列ＨＰＱはストレプトアビジンに結合することが良く
知られている。この配列がペプチドライブラリーに含ま
れていたら、この配列をこの２色ライブラリー染色性ク
ロマトグラフィー技術により同定可能であったであろ
う。この実施例では第三の注入物はそのビーズに色を追
加することが可能な幾つかの種類のラベル化用分子（例
えば、ホスファターゼ分子のようなもの）を含むはずで
ある。このカラムが抽出され、そして第一色試薬（ＮＢ
Ｔ／ＢＣＩＰ）がそのビーズに適用されるであろう。こ
のカラムは先に記述の要領で再充填され、そして標的注
入物はホスファターゼに複合体形成させてあるストレプ
トアビジンであろう。異なる染色用試薬（Ｆａｓｔ Ｒ
ｅｄ）の後続添加に関しては、第二色で染色されたビー
ズがストレプトアビジン標的に特異的となるであろう。
【００３０】その上、この染色用試薬は酵素である必要
がない。シグナルを発生する標識を利用して、標的と反
応するリガンドからこの検出系と反応するリガンドを識
別することが可能であろう。例えば、異なる色を発生す
る蛍光分子を蛍光活性化−細胞選別法による同定と共に
用いることも可能あろうし；放射活性同位体標識（１２
５Ｉ／１３１Ｉもしくは３５Ｓ−Ｍｅｔ／７５Ｔｅ−Ｍ
ｅｔ）がオートラジオグラム内でか、もしくはシンチレ
ーション計測法により同定可能であろうし；あるいは非
放射性同位体標識（例えば、１４Ｎ／１５Ｎ）がＮＭＲ
により同定可能であろうし；あるいは混合モードの色同
定も可能であろう（この場合、検出用試薬と相互作用す
るビーズは先に記述の要領で色を呈し、かつ標的特異的
ビーズは３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセ
タン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ（３．
３．１．１３，７）デカン）−４−イル）フェニルリン
酸二ナトリウム（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社、Ｂｅｄｆ
ｏｒｄ、ＭＡ）もしくは他のいずれかの発光性試薬での
ルミネッセンスにより同定される）。
【００３１】結論として、標的特異的である組み合わせ
ライブラリー由来の配列を迅速に同定することが可能な
方法が開発された。この２色ペプチドライブラリー免疫
染色用クロマトグラフィー分析を用いて、凝固カスケー
ド因子ＩＸチモーゲンに結合する配列が同定された。こ
の技術については、リボヌクレアーゼ（Ｒｉｂｏｎｕｃ
ｌｅａｓｅ）Ｓ蛋白質と結合することが知られているペ
プチド配列を用いて妥当性の検査が行われている。この
技術を更に拡張して、標的蛋白質の精製用の親和性クロ
マトグラフィー媒体を作製するためのペプチドリガンド
を同定するのに使用した。
【００３２】この方法は追加的で有用な実験スキームに
役立つ。この２色ペプチドライブラリー免疫染色用クロ
マトグラフィー分析に関する組み合わせ樹脂の手法を用
いることにより、類似構造の分子（例えば、蛋白質の異
性体、もしくは異なる源からの同一蛋白質（例えば、ヒ
ツジ乳中に発現される遺伝子導入ヒト アルファー−１
プロテイナーゼ阻害剤からのヒツジ アルファー−１
プロテイナーゼの分離ような））の分離に有用なクロ
マトグラフィー用基質の改良物が同定可能である。これ
らの実施例では、標的蛋白質の異性体はアッセイの上半
期に含まれて第一色を生じる可能性がある。異なる異性
体はアッセイの後半期に含まれて第二色を生じる可能性
がある。従って、第二異性体の特異性が、第二色のみに
より染色されるビーズにより同定されるであろう。
【００３３】結合性相互作用は薬理学的に重要であり、
従ってこの手法は薬剤発見における最先端の同定法に有
用であることが可能である。例えば、ペプチドライブラ
リーを可溶性の細胞性レセプター（例えば、上皮成長因
子レセプターの可溶性形態もしくはエリスロポイエチン
レセプターの可溶性形態のようなもの）での探索を行っ
て薬理学的重要性を有する可能性のあるペプチドリガン
ドを同定することができる。それらの巨大蛋白質のため
のペプチドへの完璧な入手法を提供する目的では大孔径
の樹脂が必要である。この方法を用いて、他の種類（例
えば、非−ペプチド性）の分子の間の結合性相互作用を
同定することもできる。我々は更に、この方法がスクリ
ーニング用ファージライブラリーから取得されるリガン
ドの迅速評定および至適化にも有用であることを見いだ
した。
【００３４】先の実施例は本発明を詳細に説明すること
が意図されており、かつ当業者には変法が思い当たるで
あろうことが考えられる。従って、本発明の範囲を以下
の特許請求の範囲によってのみ限定すべきことが意図さ
れる。
【００３５】引 用 文 献 １．Baumbach, G.A., Hammond, D.J., Biopharm. 524(1
992) ２．Huang, P.Y., Carbonell, R.G., Biotechnol. and
Engin., (印刷中) ３．Scott, J.K., Smith, G.P., Science 249 386(199
0) ４．Devlin, J.J.ら，Science 249 404(1990) ５．Cwirla，S.E.ら，PNAS 87 6378(1990) ６．Folgori, A.ら，EMBO 13 2236(1994) ７．Furka, Aら，Int. J. Pept. Protein Res. 37 487-
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【００３６】１．標的物質に結合するであろうリガンド
を選択する方法であって、前記リガンドが個々の支持体
材料に結合する個々のランダムリガンド集団中に存在
し、かつ前記選択がラベル化シグナル提供性検出系を用
いて行われるものである方法において、前記ランダムリ
ガンド集団を、そのリガンド集団と標的物質とのいずれ
かの接触以前にその検出系からの組成物と共にインキュ
ベートし、そうしてその標的物質との接触後、次いでラ
ベル化シグナル提供検出系の試薬を再度そのリガンド集
団と接触させ、かつそれを用いて、その標的物質に結合
しないランダムリガンドのバックグラウンドに対してこ
の標的物質に結合するリガンドの検出を可能にする異な
るシグナルを発生させることを可能にすることを特徴と
する方法。
【００３７】２．ラベル化検出系が酵素−複合体形成化
標識を含む、前記１の方法。
【００３８】３．標識が抗体である、前記２の方法。
【００３９】４．ラベル化検出系が放射性同位体ラベル
化標識を含む、前記１の方法。
【００４０】５．標識が抗体である、前記４の方法。
【００４１】６．ラベル化検出系が蛍光ラベル化標識を
含む、前記１の方法。
【００４２】７．標識が抗体である、前記６の方法。
【００４３】８．ラベル化検出系が、酵素−複合体形成
化抗体、放射性ラベル化抗体、および蛍光ラベル化抗体
から選択されるいずれかの組み合わせ物を含む、前記１
の方法。
【００４４】９．リガンドがペプチドであり、かつ標的
物質が、血漿蛋白質、および遺伝子工学的に作製された
細胞もしくはハイブリドーマから発現される蛋白質から
選択される蛋白質である、前記１の方法。
【００４５】１０．ペプチドが約３〜１０のアミノ酸残
基を含む、前記９の方法。
【００４６】１１．蛋白質が因子ＩＸである、前記９の
方法。
【００４７】１２．支持体材料が樹脂である、前記１の
方法。
【００４８】１３．支持体材料が親水性である、前記１
２の方法。
【００４９】１４．支持体材料が多孔性である、前記１
２の方法。
【００５０】１５．平均孔径が約８００〜約１２００オ
ングストロームの範囲である、前記１４の方法。
【００５１】１６．各段階がＨＰＬＣカラム内で生じ
る、前記１の方法。
【００５２】１７．ＨＰＬＣカラムの圧力が約０ｐｓｉ
〜４００ｐｓｉである、前記１４の方法。
【００５３】１８．特定の標的蛋白質と結合するペプチ
ドリガンドの同定方法であって、 （ａ） ランダム化ペプチドを個々のクロマトグラフィ
ー用支持体に固定化させて支持体集団を作製する段階、
ここで各支持体ビーズは互いに実質的に同一のペプチド
がその表面に結合させてあるものである； （ｂ） 段階（ａ）の支持体をその標的蛋白質に特異的
に結合することが可能な第一抗体と、その標的蛋白質へ
の特異的および非特異的結合の両方を可能にさせる条件
下で接触させる段階、ここで前記第一抗体は更に支持体
および支持体上のペプチドの両方に特異的および非特異
的に結合することが可能なものである； （ｃ） 段階（ｂ）の支持体を、第一抗体に特異的に結
合することが可能でありかつ少なくとも２つの異なる基
質と反応することが可能な酵素と複合体形成させてある
第二抗体と、２つの異なる色変化を発生させるために、
その第二抗体が第一抗体に結合するに十分な条件下で接
触させる段階、ここで前記第二抗体は更に支持体および
支持体上のペプチドの両方に特異的および非特異的に結
合することが可能なものである； （ｄ） 第一基質を段階（ｃ）の支持体に、第二抗体を
結合させてある個々の支持体上での第一色変化を生じる
に十分な条件下で添加する段階； （ｅ） その標的蛋白質を段階（ｄ）の支持体に、その
支持体に結合している少なくとも一つのペプチドに対す
るその標的蛋白質の特異的結合が可能になるのに十分な
条件下で添加する段階； （ｆ） 段階（ｅ）の支持体を段階（ｂ）の第一抗体
と、その抗体がその標的蛋白質に特異的に結合するのに
十分な条件下で接触させる段階； （ｇ） 酵素を複合体形成させてある段階（ｃ）の第二
抗体を段階（ｆ）の支持体に、その支持体に結合してい
るペプチドに結合している標的蛋白質に結合している第
一抗体に第二抗体が特異的に結合するのに十分な条件下
で添加する段階； （ｈ） 第二基質を段階（ｇ）の支持体に、その標的蛋
白質と結合するペプチドが結合させてある支持体を識別
する第二の異なる色変化を生じるのに十分な条件下で添
加する段階； （ｉ） その標的蛋白質に結合するペプチドを有する支
持体を、前段階により生じる色変化を基に分離する段
階；ならびに （ｊ） 段階（ｉ）において分離された支持体上のペプ
チドの配列決定を行う段階、を含んでなる方法。
【００５４】１９．段階（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と
（ｃ）、（ｃ）と（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）、（ｆ）と
（ｇ）、および（ｇ）と（ｈ）の間に洗浄段階が存在す
る、前記１８の方法。
【００５５】２０．支持体材料が、約８００〜約１２０
０オングストロームの範囲の平均孔径を有する多孔性の
親水性樹脂ビーズを含む、前記１９に記載のペプチド同
定方法。
【００５６】２１．ペプチドが、約３〜１０のアミノ酸
残基の範囲の長さを有する、前記１８のペプチド同定
法。
【００５７】２２．支持体がカラム内に含まれる、前記
１８の方法。
【００５８】２３．カラムが自動化クロマトグラフィー
装置に装着される、前記２０の方法。
【００５９】２４．標的分子に結合するリガンド分子の
同定方法であって、前記標的分子を使用して、ある基質
上に固定化されているリガンド分子のランダムライブラ
リーを探索する段階、ならびに次いで検出試薬を用い
て、観察可能な特徴を変化させる段階であって、前記観
察可能な特徴の変化が、その標的分子と前記基質上のリ
ガンド分子との間の結合を示すものである段階を含む方
法において、更に：前記ランダムライブラリーを標的分
子で探索する前に、検出試薬を使用しランダムライブラ
リーを探索し、前記検出試薬での検索が観察可能な特徴
の異なる変化を生じ、前記観察可能な特徴の異なる変化
がその検出試薬と前記基質上に固定化されているリガン
ド分子のライブラリーとの反応を示し、かつその標的分
子とリガンド分子との間の結合を、その検出試薬と前記
基質上に固定化されているリガンド分子のライブラリー
との反応から識別するのに役立てる、段階を含んでなる
方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】２色免疫染色法の概略を示す図である。 Ａ：ポリペプチド（Ｘ1-6）が結合させてある第一ビー
ズ集団。各個別のビーズ上のポリペプチドは実質的に同
じ配列を有する。カラムを緩衝液での洗浄により平衡化
させる。 Ｂ：第一抗体（ＡｂTP）を添加およびインキュベート
し、その後に濯ぐ。濯ぎにより緩く結合していたＡｂTP
が除去され；このビーズ上の残存物は非特異的および特
異的に結合しているＡｂTPとなる。注：ＡｂTPは標的蛋
白質に特異的に結合する抗体である。
【図２】２色免疫染色法の概略を示す図である。 Ａ：酵素に複合体形成させてある第二抗体（Ａｂ＊Ｅｎ
ｚ）を添加せよ。残存物は、結合化ＡｂTPに強固かつ特
異的に結合しているＡｂ＊Ｅｎｚ、ならびにビーズに非
特異的および特異的に結合しているＡｂ＊Ｅｎｚであ
る。注：Ａｂ＊ＥｎｚはＡｂTPに特異的に結合する。 Ｂ：酵素用の青色染料基質（これはビーズに結合してい
る酵素を青色に染色する）を添加せよ。インキュベーシ
ョンを行い、その後に余剰な青色染料を濯ぎ落とす。
【図３】２色免疫染色法の概略を示す図である。 Ａ：標的蛋白質（ＴＰ｝）を添加せよ。インキュベーシ
ョン、次いで濯ぎを行う。この標的蛋白質は、ビーズ集
団の中の多数のポリペプチドに特異的に結合する。 Ｂ：ＡｂTPを添加およびインキュベートし、その後に濯
ぐ。ＡｂTPはＴＰ｝に特異的に結合する。
【図４】２色免疫染色法の概略を示す図である。 Ａ：Ａｂ＊Ｅｎｚを添加せよ。インキュベーション、次
いで濯ぎを行う。Ａｂ＊ＥｎｚはＡｂTPに特異的に結合
する。 Ｂ：酵素用の赤色基質（これはビーズに結合した酵素を
赤色に染色する）を添加せよ。注：第一色ビーズからの
いずれかの残存性酵素活性によりこれらのビーズは紫色
もしくは茶色になるであろう。
【図５】２色免疫染色法の概略を示す図である。肉眼的
に赤色ビーズを単離し、そしてペプチド配列分析に単一
ビーズを供する。
【図６】ＴＳＫ−Ｂｌａｎｋで希釈した（１：２０ ｗ
／ｗ）ＹＮＦＥＶＬ−ＴＳＫ樹脂上に注入されるリボヌ
クレアーゼ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｓ（ＲＮアー
ゼ Ｓ）用の免疫アッセイ技術のクロマトグラムを示す
図である。上方の線（Ａ）は２８０ｎｍでの吸光度であ
り；中部の線（Ｂ）は流速であり；かつ下方の線（Ｃ）
は勾配液条件を示す。
【図７】ＲＮアーゼ蛋白質およびペプチド−樹脂（ＹＮ
ＦＥＶＬ−ＴＳＫ）によるＨＰＬＣ親和性アッセイの妥
当性検査を示す図である。上部の図は、ヒト血清アルブ
ミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（Ｈ
ＳＡ）（Ａ）およびＨＳＡ中のＲＮアーゼ Ｓ（Ｂ）に
ついての２８０ｎｍの吸光度を示す。下部の図は、クロ
マトグラムＢからの圧力トレースである。
【図８】ＡはＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫへの因子ＩＸの結合
性のクロマトグラムを示す図である。下部のトレース
（Ａ）は緩衝液ブランクである。中部のトレース（Ｂ）
は担体蛋白質（１．０ｍＬの０．５％のＨＳＡ）であ
る。上部のトレースは、カラム内に注入された５５μｇ
ａの因子ＩＸが酸洗浄中に放出されることを示す。Ｂは
拡大スケールで８Ａのクロマトグラムからの因子ＩＸピ
ークを示す図である。
【図９】ＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫ内に注入される因子ＩＸ
の様々な量のクロマトグラムを示す図である。下部のト
レース（Ａ）はＨＳＡを含まない５５μｇの因子ＩＸで
ある。トレースＢは１１０μｇの因子ＩＸであり、そし
てＣは２２０μｇの因子ＩＸであり、両者ともＨＳＡを
含まない。Ｄトレースは、注入前に９５℃で５分間加熱
した２２０μｇの因子ＩＸである。上部のトレース
（Ｅ）はＨＳＡ中の２２０μｇの因子ＩＸである。
【図１０】因子ＩＸおよびＨＳＡの混合物のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（図１０Ａ）およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ）ブロット（図１０Ｂ）を示す図である。レーン１お
よび９は分子量標準である。レーン２は因子ＩＸ（Ｅｎ
ｚｙｍｅ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ社；Ｓｏｕｔｈ
Ｂｅｎｄ、ＩＮ）である。レーン３はＨＳＡ標準（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｉｎｃ．社）である。レーン４は、ＹＡＮＫＧ
Ｙ−ＴＳＫ親和性カラム内に注入された出発物質である
（１．０ｍｌ、ＨＳＡ中の２２０μｇの因子ＩＸ）。レ
ーン５は第一素通りピークである。レーン６は第二素通
りピークである。レーン７はＮａＣｌ洗浄液である。レ
ーン８は酸溶出化ピークである。約１０μｇの総蛋白質
を各ライン内にロードした。
【図１１】アセチル−ＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫ樹脂上での
１．０ｍｌのクエン酸処理化ヒト血漿のクロマトグラ
ム。
【図１２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル
電気泳動）の分析結果を示す図である（図１２Ａ）、お
よびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析結果を
示す図である（図１２Ｂ）。約１０μｇを各ラインにロ
ードし、そして電気ブロット化ゲルをクーマシー（Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅ）染色化ゲルと同一量の試料と共にロー
ドした。レーン１、５、７、９、および１１はブランク
であった。レーン２：１．０μｇａの因子ＩＸ；レーン
１２：０．０６２５μｇの因子ＩＸ。レーン３および１
３：分子量標準。レーン４および１５：ヒト血漿。レー
ン６：素通り分画（t＝０〜１２分）；レーン８：素通
り分画（t＝１２〜１５分）。レーン１０：酸溶出物。
レーン１４：部分精製化された因子ＩＸ中間体。右下の
ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットは出発物質もし
くは素通り分画中には因子ＩＸが全く存在しないことを
示す。因子ＩＸチモーゲンに相当する強力な免疫検出化
バンドは酸溶出物中に存在する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年８月１５日
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】因子ＩＸおよびＨＳＡの混合物のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）およびその
電気泳動に基づくウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロッ
トの結果を示す図面に代わる、それぞれの写真（図１０
Ａおよび図１０Ｂ）である。レーン１および９は分子量
標準である。レーン２は因子ＩＸ（ＥｎｚｙｍｅＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ社；Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、Ｉ
Ｎ）である。レーン３はＨＳＡ標準（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎ
ｃ．社）である。レーン４は、ＹＡＮＫＧＹ−ＴＳＫ親
和性カラム内に注入された出発物質である（１．０ｍ
ｌ、ＨＳＡ中の２２０μｇの因子ＩＸ）。レーン５は第
一素通りピークである。レーン６は第二素通りピークで
ある。レーン７はＮａＣｌ洗浄液である。レーン８は酸
溶出化ピークである。約１０μｇの総蛋白質を各ライン
内にロードした。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル
電気泳動）結果を示す図面に代わる写真（図１２Ａ）、
および、その電気泳動に基づくウエスタン（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ）ブロット分析結果を示す図面に代わる写真である
（図１２Ｂ）。約１０μｇを各ラインにロードし、そし
て電気ブロット化ゲルをクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅ）染色化ゲルと同一量の試料と共にロードした。レー
ン１、５、７、９、および１１はブランクであった。レ
ーン２：１．０μｇａの因子ＩＸ；レーン１２：０．０
６２５μｇの因子ＩＸ。レーン３および１３：分子量標
準。レーン４および１５：ヒト血漿。レーン６：素通り
分画（ｔ＝０〜１２分）；レーン８：素通り分画（ｔ＝
１２〜１５分）。レーン１０：酸溶出物。レーン１４：
部分精製化された因子ＩＸ中間体。右下のウエスタン
（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットは出発物質もしくは素通り
分画中には因子ＩＸが全く存在しないことを示す。因子
ＩＸチモーゲンに相当する強力な免疫検出化バンドは酸
溶出物中に存在する。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的物質に結合するであろうリガンドを
    選択する方法であって、前記リガンドが個々の支持体材
    料に結合する個々のランダムリガンド集団中に存在し、
    かつ前記選択がラベル化シグナル提供性検出系を用いて
    行われるものである方法において、前記ランダムリガン
    ド集団を、そのリガンド集団と標的物質とのいずれかの
    接触以前にその検出系からの組成物と共にインキュベー
    トし、そうしてその標的物質との接触後、次いでラベル
    化シグナル提供検出系の試薬を再度そのリガンド集団と
    接触させ、かつそれを用いて、その標的物質に結合しな
    いランダムリガンドのバックグラウンドに対してこの標
    的物質に結合するリガンドの検出を可能にする異なるシ
    グナルを発生させることを可能にすることを特徴とする
    方法。
  2. 【請求項２】 特定の標的蛋白質と結合するペプチドリ
    ガンドの同定方法であって、 （ａ） ランダム化ペプチドを個々のクロマトグラフィ
    ー用支持体に固定化させて支持体集団を作製する段階、
    ここで各支持体ビーズは互いに実質的に同一のペプチド
    がその表面に結合させてあるものである； （ｂ） 段階（ａ）の支持体をその標的蛋白質に特異的
    に結合することが可能な第一抗体と、その標的蛋白質へ
    の特異的および非特異的結合の両方を可能にさせる条件
    下で接触させる段階、ここで前記第一抗体は更に支持体
    および支持体上のペプチドの両方に特異的および非特異
    的に結合することが可能なものである； （ｃ） 段階（ｂ）の支持体を、第一抗体に特異的に結
    合することが可能でありかつ少なくとも２つの異なる基
    質と反応することが可能な酵素と複合体形成させてある
    第二抗体と、２つの異なる色変化を発生させるために、
    その第二抗体が第一抗体に結合するに十分な条件下で接
    触させる段階、ここで前記第二抗体は更に支持体および
    支持体上のペプチドの両方に特異的および非特異的に結
    合することが可能なものである； （ｄ） 第一基質を段階（ｃ）の支持体に、第二抗体を
    結合させてある個々の支持体上での第一色変化を生じる
    に十分な条件下で添加する段階； （ｅ） その標的蛋白質を段階（ｄ）の支持体に、その
    支持体に結合している少なくとも一つのペプチドに対す
    るその標的蛋白質の特異的結合が可能になるのに十分な
    条件下で添加する段階； （ｆ） 段階（ｅ）の支持体を段階（ｂ）の第一抗体
    と、その抗体がその標的蛋白質に特異的に結合するのに
    十分な条件下で接触させる段階； （ｇ） 酵素を複合体形成させてある段階（ｃ）の第二
    抗体を段階（ｆ）の支持体に、その支持体に結合してい
    るペプチドに結合している標的蛋白質に結合している第
    一抗体に第二抗体が特異的に結合するのに十分な条件下
    で添加する段階； （ｈ） 第二基質を段階（ｇ）の支持体に、その標的蛋
    白質と結合するペプチドが結合させてある支持体を識別
    する第二の異なる色変化を生じるのに十分な条件下で添
    加する段階； （ｉ） その標的蛋白質に結合するペプチドを有する支
    持体を、前段階により生じる色変化を基に分離する段
    階；ならびに （ｊ） 段階（ｉ）において分離された支持体上のペプ
    チドの配列決定を行う段階、を含んでなる方法。
  3. 【請求項３】 標的分子に結合するリガンド分子の同定
    方法であって、 前記標的分子を使用して、ある基質上に固定化されてい
    るリガンド分子のランダムライブラリーを探索する段
    階、ならびに次いで検出試薬を用いて、観察可能な特徴
    を変化させる段階であって、前記観察可能な特徴の変化
    が、その標的分子と前記基質上のリガンド分子との間の
    結合を示すものである段階を含む方法において、更に：
    前記ランダムライブラリーを標的分子で探索する前に、
    検出試薬を使用しランダムライブラリーを探索し、前記
    検出試薬での検索が観察可能な特徴の異なる変化を生
    じ、前記観察可能な特徴の異なる変化がその検出試薬と
    前記基質上に固定化されているリガンド分子のライブラ
    リーとの反応を示し、かつその標的分子とリガンド分子
    との間の結合を、その検出試薬と前記基質上に固定化さ
    れているリガンド分子のライブラリーとの反応から識別
    するのに役立てる、段階を含んでなる方法。
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