DE69025023T2

DE69025023T2 - Peptide und deren Benutzung

Info

Publication number: DE69025023T2
Application number: DE69025023T
Authority: DE
Inventors: Naotaka Kuroda; Yoshiaki Maeda; Toshihiko Namba; Kiichiro Oka; Hiroshi Shiraki; Yukiko Washitani; Kyoko Yamada
Original assignee: Kuraray Co Ltd
Current assignee: Kuraray Co Ltd
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 1996-08-22
Anticipated expiration: 2010-10-13
Also published as: JPH03127799A; US5194586A; JP2807287B2; ATE133422T1; EP0423649B1; DE69025023D1; EP0423649A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid und dessen Anwendung. Das erfindungsgemäße Peptid ist neu und kann an einen Antikörper spezifisch binden, der eine Spezifität für ein mit der T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen assoziiertes Antigen hat (nachstehend als "ATLA" bezeichnet, "adult T cell leukemia associated antigen"), der Antikörper wird nachstehend als "anti-ATLA-Antikörper" bezeichnet. Das erfindungsgemäße Peptid kann zur Bestimmung eines anti-ATLA-Antikörpers, zur Reinigung eines anti-ATLA- Antikörpers und als Adsorptionsmittel zur Entfernung des anti-ATLA-Antikörpers aus dem Körper eines Erwachsenen, der Träger des T-Zell-Leukämie-Virus ist, verwendet werden.
Ein Reagens zur Bestimmung des anti-ATLA-Antikörpers und ein Adsorptionsmittel für den erfindungsgemäßen anti-ATLA-Antikörper weisen die Fähigkeit auf, den anti- ATLA-Antikörper in Serum oder Plasma mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen sowie die Fähigkeit, den anti-ATLA-Antikörper in Serum oder Plasma mit hoher Spezifität zu adsorbieren, daher sind sie zur Bestimmung und Reinigung des anti-ATLA-Antikörpers und zur Behandlung einer infektiösen T-Zell-Leukämie-Viruserkrankung bei Erwachsenen nützlich.
Es ist bekannt, daß ein T-Zell-Leukämie-Virus bei Erwachsenen (nachstehend als "ATLV" bezeichnet), welcher aus Patienten mit Erwachsenen-T-Zell-Leukämie (nachstehend als "ATL" bezeichnet) isoliert wurde, immunkompetente Zellen infiziert und eine Vielzahl immunologischer Störungen oder die Verringerung der immunologischen Kompetenz, einschließlich ATL, verursacht (vgl. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 78 (1981), 6476). Die Nucleotidsequenz des Virusgens ist bekannt (vgl. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 80 (1983), 3618). Zum Nachweis des anti-ATLA-Antikörpers oder zur Herstellung eines Impfstoffs zur Voybeugung gegen oder zur Behandlung von ATL wurde ein rekombinates Protein des ATLV-assoziierten Antigens mit gentechnischen Verfahren hergestellt (vgl. offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr.124963/1988; Gene 38 (1985), 57; Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 81 (1984), 6202) oder es wurde ein synthetisches Peptid des ATLV-assoziierten Antigens durch das Peptidsyntheseverfahren hergestellt (vgl. Journal of Immunology 136, Nr.7 (1986), 2393; Virology 136 (1984), 338; offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 301896/1988; offengelegte Japanische PatentanmeldungKOKAI Nr. 30600/1986; Leukemia Research 9 Nr 9 (1985), 1111).
Die durch ATLV verursachten Erkrankungen umfassen jene, die direkt durch ATLV verursacht werden, wie ATL- und HTLV-I-assoziierte Myelopathie, und jene, die indirekt durch ATLV verursacht werden, wie chronische Lungenkrankheiten, opportunistische Lungeninfektionen, M-Proteinose, chronisches Nierenversagen, Immunschwäche (z.B. unspezifische Dermatomykose, etc.) und ähnliches. Gegenwärtig wird ATL für Erkrankungen ohne subjektive Symptome oder für chronisch fortschreitende Erkrankungen hauptsächlich durch eine symptomatische Therapie behandelt oder durch Chemotherapie unter Anwendung von mehreren Arzneimitteln, insbesondere von Antitumormitteln, für progressive ATL. Jedoch sind die Wirkungen dieser Methoden nicht klar und daher ist eine noch bessere Methode zur wirksameren und sicheren Behandlung der vorstehend erwähnten Krankheiten erwünscht.
Gegenwärtig wird der anti-ATLA-Antikörper durch ein indirektes Immunfluoreszenzverfahren nachgewiesen, bei dem ATLV-infizierte Zellen auf einem Objektträger aufgebracht werden und der anti-ATLA-Antikörper unter Verwendung eines Fluorochrommarkierten Antikörpers Nature 294 (1981), 770), durch ein Partikelagglutinationsverfahren unter Nutzbarmachung des Phänomens, daß Gelatinepartikel, die mit ATLV oder antigenischen Komponenten davon sensibilisiert wurden, in Gegenwart des anti-ATLA-Antikörpers agglutinieren (Gann 2 (1984), 845), durch einen Radioimmuntest unter Verwendung eines Mikroröhrchens, das mit aus ATLV-infizierten Zellen extrahierten antigenischen Komponenten beschichtet wurde (Journal of Experimental Medicine 159 (1984), 1117), oder durch einen Enzym-gebundenen Immunsorptionstest (nachstehend als "ELISA" bezeichnet) [Gann 74 (1983), 185] nachgewiesen wird.
Jedoch enthalten ATLV-infizierte Zellen und daraus gewonnene, partiell gereinigte antigenische Komponenten auch verschiedene unspezifische antigenische Komponenten. Wenn der anti-ATLA-Antikörper mit diesen ATLV-infizierten Zellen oder mit antigenischen Komponenten davon als Reagens bestimmt wird, werden diese Reagenzien deshalb auch durch andere unspezifische Antikörper in einer Probe, wie ein anti-Kern-Antikörper und ein anti-T-Zell-Antikörper, als dem Ziel-anti-ATLA-Antikörper erkannt. Als Ergebnis wird das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers durch diese Verfahren nicht richtig nachgewiesen.
Zur Lösung dieses Problems wurden viele Studien im Hinblick auf einen Radioimmuntest oder einen ELISA unter Verwendung eines rekombinanten Proteins oder eines synthetischen Peptids durchgeführt. Beispielsweise schließen Verfahren, welche das rekombinante Protein verwenden, jene ein, die ein env-Protein einsetzen, von dem man annimmt, das es eine hohe Antigenität besitzt (Science 226 (1984), 1094; Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 81 (1984), 6202; offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 166624/1985; offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 166699/1985)), jene, welche ein gag-Protein verwenden (Gene 38 (1985), 57; offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 61534/1985; offengelegte Japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 124963/1988), und ähnliche. Als Verfahren, die ein synthetisches Peptid verwenden, wurde ein Radioimmuntest beschrieben, der Peptide nutzt, die den Aminosäuresequenzen der hydrophilen Bereiche entsprechen, ausgewählt aus dem gag-Proteinbereich oder dem env-Proteinbereich von ATLV, diese Peptide werden mit einem Peptidsynthetisierer synthetisiert (Journal of Immunology 136, Nr. 7 (1986), 2393; Journal of Immunology 142, Nr. 3 (1989), 971; Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 84 (1987), 2479), und ähnliche. Obwohl diese Verfahren die rekombinanten Proteine oder die synthetischen Peptide verwenden, die keine unspezifischen Komponenten enthalten, weisen sie den Nachteil auf, daß die rekombinanten Proteine oder die synthetischen Peptide bei diesen Verfahren nur eine geringe Spezifizität für den anti- ATLA-Antikörper zeigen und daß sie aufgrund der Verwendung von radioaktiven Substanzen nicht sicher sind. Deshalb wurde gewunscht, ein Verfahren zur Bestimmung des anti- ATLA-Antikörpers zu entwickeln, das nicht die Verwendung von radioaktiven Substanzen einschließt, und das ein antigenisches Polypeptid verwendet, welches hoch spezifisch ist ffir den anti-ATLA-Antikörper. In der WO 88/05783 werden immunsuppressive Peptide beschrieben, worin ein einzelner Lysinrest an ein antigenisches Peptidfragment gebunden ist.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Peptids, das an den anti- ATLA-Antikörper spezifisch binden kann.
Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Reagens zur Bestimmung des anti-ATLA-Antikörpers.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Adsorptionsmittels, das den anti-ATLA-Antikörper adsorbieren kann.
Diese und andere Aufgabe sowie Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung deutlich.
Die Figuren 1a und 1b sind graphische Darstellungen, welche die Verteilung der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte zeigen, die aus jeder Serumprobe durch das in Beispiel 19 beschriebene Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 1 hergestellten Peptids bzw. des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids erhalten wurden. In den Figuren 1a und 1b hat jede Markierung die folgende Bedeutung:
: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus dem ATLV-Trägerserum erhalten wurden;
oº: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus dem normalen Humanserum erhalten wurden.
Die Figuren 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f und 2g sind graphische Darstellungen, welche die Verteilung der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte zeigen, die durch das in Beispiel 20 beschriebene Verfahren unter Verwendung von verschiedenen Beschichtungsmengen des in Beispiel 1 hergestellten Peptids bzw. des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids für jede Serumprobe Nr.1 bis Nr.7 erhalten wurden. In den Figuren 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f und 2g hat jede Markierung die folgende Bedeutung:
- -: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die unter Verwendung des in Beispiel 1 hergestellten Peptids für jede Serumprobe erhalten wurden;
-o-: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die unter Verwendung des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids für jede Serumprobe erhalten wurden.
Die Figuren 3a, 3b und 3c sind graphische Darstellungen, welche die Verteilung der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte zeigen, die durch das in Beispiel 21 beschriebene Verfahren unter Verwendung von drei Arten von Teströhrchen, die mit dem in Beispiel 1 hergestellten Peptid beschichtet wurden, für jede Serumprobe erhalten wurden. In den Figuren 3a, 3b und 3c hat jede Markierung die folgende Bedeutung:
: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus ATLV-Trägerserum erhalten wurden;
oº: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus falsch-positivem ATLV-Serum erhalten wurden;
x: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus normalem Humanserum erhalten wurden.
Die Figuren 4a und 4b sind graphische Darstellungen, welche die Verteilung der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte zeigen, die durch das in Beispiel 22 beschriebene Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 15 hergestellten Peptids und des in Beispiel 16 hergestellten Peptids für jede Serumprobe erhalten wurden. In den Figuren 4a und 4b hat jede Markierung die folgende Bedeutung:
: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus ATLV-Trägerserum erhalten wurden;
oº: OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte, die aus normalem Humanserum erhalten wurden.
Erfindungsgemäß werden ein Peptid mit der allgemeinen Formel:
H-(X)n-A-Y (I),
wobei X Lysin ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, A ein Peptidfragment mit 6 bis 50 Aminosäureresten ist und Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe darstellt, wobei das Peptid an einen Antikörper spezifisch binden kann, der eine Spezifizität für ein mit der T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen assozuertes Antigen hat (nachstehend als "Peptid (I)" bezeichnet); ein Reagens zur Bestimmung des anti-ATLA-Antikörpers, umfassend das Peptid (I), und ein Adsorptionsmittel für den anti-ATLA-Antikörper, welches das an einen Träger immobilisierte Peptid (I) umfaßt, bereitgestellt.
In der Beschreibung wird jeder Aminosäurerest wie folgt abgekürzt:
Ala: L-Alaninrest
Arg: L-Argininrest
Asn: L-Asparaginrest
Asp: L-Asparaginsäurerest
Cys: L-Cysteinrest
Gln: L-Glutaminrest
Glu: L-Glutaminsäurerest
Gly: L-Glycinrest
His: L-Histidinrest
Ile: L-Isoleucinrest
Leu: L-Leucinrest
Lys: L-Lysinrest
Met: L-Methioninrest
Phe: L-Phenylalaninrest
Pro: L-Prolinrest
Ser: L-Serinrest
Thr: L-Threoninrest
Trp: L-Tryptophanrest
Tyr: L-Tyrosinrest
Val: L-Valinrest
Auch in der Beschreibung wird die Aminosäuresequenz in einer solchen Weise beschrieben, daß der Aminosäurerest am N-Terminus der Sequenz links und der Aminosäurerest am C-Terminus der Sequenz in üblicher Weise rechts ist.
Das Peptidfragment für A in der Formel (I) ist vorzugsweise ein Peptidfragment, das 5 bis 50 Aminosäurereste umfaßt, die von dem antigenischen Polypeptid stammen, das durch ein ATLV-Gen codiert wird. Unter diesen Fragmenten werden ein durch das gag-Gen codierte Peptidfragment mit der folgenden Aminosäuresequenz (A-1):
und durch das env-Gen codierte Peptidfragmente mit den folgenden Aminosäuresequenzen (A-2) und (A-3) insbesondere bevorzugt:
Ein fünf oder weniger Aminosäurereste umfassendes Peptidfragment zeigt keine spezifische Antigenität für den anti-ATLA-Antikörper. Es ist schwierig, ein fünf oder mehr Aminosäurereste umfassendes Peptidfragment mit der gewünschten spezifischen Antigenität für den anti-ATLA-Antikörper zu synthetisieren.
Als Peptidfragment für X in der Formel (I) werden ein Peptidfragment der Formel: -Lys-Lys-, ein Peptidfragment der Formel: -Lys-Lys-Lys- und ähnliche bevorzugt. Wenn das Peptidfragment von X elf oder mehr Lys-Reste umfaßt, neigt das Peptid der Formel (I) dazu, keine spezifische Antigenität für den anti-ATLA-Antikörper zu besitzen. Wenn das Peptidfragment von X einen anderen Aminosäurerest als Lys enthält, neigt das Peptid der Formel (1) dazu, daß es an den anti-ATLA-Antikörper nicht spezifisch binden kann oder daß es nicht effizient auf den Träger aufgebracht oder an den Träger immobilisiert werden kann.
Das Peptid (I) wird mit dem üblicherweise zur Peptidsynthese angewendete Verfahren synthetisiert umfassend ein Festphasenverfahren oder ein Flüssigphasenverfahren (z.B. schrittweises Verlängerungsverfahren, Fragmentfusionsverfahren, etc.). Das Festphasenverfahren wird vom Gesichtspunkt der einfachen Handhabung bevorzugt (Journal of the American Chemical Society 85(1963), 2149-2154; "Seikagaku Jikken Koza (Experimental Biochemistry), Bd. 1, Chemistry of Proteins IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis", Hrsg. Nippon Seikagakkai, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 15. November 1977, 207-495; "Zoku-Seikagaku Jikken Koza (Experimental Biochemistry, zweite Auflage), Bd. 2, Chemistry of Proteins, letzter Band", Hrsg. Nippon Seikagakkai. veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 20. Mai 1987, 641-649, und ähnliches).
Das Peptid (I) kann unter Anwendung des Festphasenverfahrens in der folgenden Weise hergestellt werden. Die Aminosäure, die dem C-Terminus des gewünschten Peptids entspricht oder das Amid davon wird zuerst an ein in einem Reaktionslösungsmittel (z.B. Styrol/Divinylbenzolcopolymer, etc.) unlösliches Polymer über eine α-COO-Gruppe oder eine α-CONH-Gruppe gebunden, die durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms aus der in der Aminosäure oder im Amid enthaltenen α-COOH-Gruppe oder α-CONH&sub2;-Gruppe gebildet wird. An die Aminosäure, welche an die feste Phase gebunden ist, oder das Amid wird weiter die nächste Aminosäure oder das nächste Peptidfragment in Richtung des N-Terminus des gewünschten Peptids durch Kondensation nach dem Schützen funktioneller Gruppen, ausgenommen die α-COOH-Gruppe (z.B. die α-Aminogruppe), gebunden und im Anschluß daran wird die Schutzgruppe für die Aminosäure, die zur Bildung der Peptidbindung verwendet werden soll, d.h. die α-Aminogruppe, in der Aminosäure oder im Peptidfragment entfernt. Die Peptidkette wird durch abwechselndes Wiederholen des ersteren Verfahrens zur Bindung der Aminosäure oder des Peptidfragments und dem letzteren Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe verlängert, auf diese Weise wird die Peptidkette entsprechend dem gewünschten Peptid gebildet. Die vorstehend hergestellte Peptidkette wird dann von dem Polymer abgelöst und jede Schutzgruppe wird von der geschützten funktionellen Gruppe entfernt, wobei das gewünschte Peptid erhalten wird, das im Anschluß daran weiter gereinigt wird. Vorzugsweise wird die Ablösung der Peptidkette von dem Polymer und die Entfernung der Schutzgruppen von der geschützten funktionellen Gruppe unter Verwendung von Fluorwasserstoff zum Zwecke der Unterdrückung von Nebenreaktionen gleichzeitig durchgeführt. Das erhaltene Peptid kann durch eine Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie wirksam gereinigt werden.
Das Peptid (I) kann an den anti-ATLA-Antikörper spezifisch binden und ist daher als Reagens zum Nachweis des nach der ATLV-Infektion gebildeten anti-ATLA-Antikörpers nützlich.
Das Peptid (I) kann zur Bestimmung des anti-ATLA-Antikörpers in herkömmlichen Verfahren, wie Immunfluoreszenzverfahren, passives Hämagglutinationsverfahren, Radioimmuntest, ELISA, etc., verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids zur Bestimmung des anti-ATLA- Antikörpers wird nachstehend im Fall des ELISAs ausführlicher erklärt.
Das System umfaßt einen Träger, das Peptid (I) als Reagens, ein Blockierungsmittel, eine zu untersuchende Probe, einen Antikörper zur Markierung, ein Enzym und ein Substrat. Der Träger wird mit dem Peptid (I) beschichtet und der peptidbeschichtete Träger wird anschließend mit dem Blockierungsmittel behandelt, um unspezifische Proteinbindungsstellen auf dem Träger zu blockieren. Dem peptidbeschichteten Träger wird die zu untersuchende Probe zugegeben und anschließend wird er inkubiert. Der Träger wird weiter mit einem Enzym-markierten Antikörper in Kontakt gebracht und inkubiert. Dem wie vorstehend behandelten Träger wird das Substrat zugegeben und das Gemisch wird inkubiert, gefolgt von der Bestimmung der Menge des produzierten Farbstoffträgers durch ein Absorptionsmeßgerät. Das Peptid (I), das zur Beschichtung des Trägers verwendet werden soll, kann ein einzelnes Peptid oder eine Kombination von mehr als einem Peptid sein. Der Träger ist vorzugsweise ein Röhrchen für ELISA oder aus Glas hergestellte Kügelchen oder ein Harz. Vor der Messung wird das Peptid (I) in 0,01 M Carbonatpuffer gelöst und die Lösung wird zum Beispiel einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA zugegeben, das man im Anschluß daran bei 4ºC über Nacht oder 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen läßt, so daß die Oberfläche des Trägers mit dem Peptid (I) beschichtet wird. Das Blockierungsmittel zur Blockierung unspezifischer Proteinbindungsstellen auf dem Träger umfaßt Rinderserumalbumin, Casein, entrahmte Milch, Serum, das von einem zur Gewinnung eines anti-Mensch- IgG-Antikörpers oder eines anti-Mensch-IgM-Antikörpers als Markierungsantikörper immunisierten Tier stammt, Gelatine und ähnliches. Der Markierungsantikörper umfaßt einen anti-Mensch-IgG-Antikörper, einen anti-Mensch-IgM-Antikörper und ähnliche. Das Enzym umfaßt zum Beispiel alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Peroxidase, β-Galactosidase und ähnliches. Vor der Messung wird das Enzym vorzugsweise unter Verwendung einer Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen (z.B. Glutaraldehyd, etc.) an den Markierungsantikörper gebunden, wobei ein Konjugat gebildet wird. Dieses vorgebildete Konjugat kann ein Teil der Komponenten des Systems sein. Das Substrat wird aus jenen ausgewählt, die für jedes verwendete Enzym geeignet sind. Beispielsweise werden dann, wenn das Enzym eine Peroxidase ist, Wasserstoffperoxid und o-Phenylendiamin und ähnliches bevorzugt verwendet.
Das Peptid (I) wird auch als Adsorptionsmittel für den anti-ATLA-Antikörper verwendet, wenn es an einen Träger immobilisiert ist. In diesem Fall kann das Peptid (I) eine einzelne Art von Peptid sein oder es kann in einer Kombination von mehr als einer Peptidart verwendet werden.
Der zur Immobilisierung des Peptids (I) verwendete Träger ist vorzugsweise ein Träger, der eine hydrophile Oberfläche besitzt und der zur Bildung der kovalenten Bindung mit dem Peptid reaktive funktionale Gruppen aufweist, wie eine Amino-, Carboxyl-, Hydroxylgruppe, etc. Wenn das Peptid (I) als Adsorptionsmittel zur Adsorption des anti- ATLA-Antikörpers in einer Körperflüssigkeit von Patienten mit ATLV-assoziierten Krankheiten verwendet wird, weist es vorzugsweise zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Eigenschaften keine Löslichkeit in der Körperflüssigkeit auf. Der Träger kann in jeder Form vorliegen, z.B. als Kugel, Granulum, Membran, Hohlfaser, Faser und ähnliches. Der Träger in der Partikelform, wie eine Kugel und ein Granulum, weist einen größeren Oberflächenbereich auf; der mit dem Ziel-anti-ATLA-Antikörper in Kontakt treten kann, als ein Träger in der Form einer Membran, Hohifaser und einer Faser, wenn er in eine Säule mit gleichem Volumen gepackt wird, und daher ist er im Hinblick auf die Adsorptionseffizienz des anti-ATLA- Antikörpers vorzuziehen. Der Träger in der Partikelform weist vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 50 bis 2000 µm auf Wenn die Teilchengröße kleiner als 50 um ist, nähern sich die Teilchen enger aneinander an, und als Ergebnis neigen die Zellen in der Körperflüssigkeit dazu durch die Teilchen zusammengeballt zu werden. Wenn die Teilchengröße größer als 2000 µm ist, wird der Bereich, der mit dem anti-ATLA-Antikörper in Kontakt treten kann, kleiner, obwohl die Zellen nicht dazu neigen durch die Teilchen zusammengeballt zu werden. Beide Teilchengrößen, die außerhalb des vorstehenden Bereichs liegen, sind nicht vorzuziehen. Ein spezifischer Träger umfaßt einen organischen Träger, wie einen aus Cellulose hergestellten Träger [z.B. CM-Cellulofine CL (erhältlich von Seikagaku Kogyo Co., Ltd.), etc.], einen aus Polyvinylalkohol hergestellten Träger [z.B. TSK-Gel CM- Toyopearl 650C (hergestellt von Toson Corporation), etc.], einen aus Agarose hergestellten Träger [Sepharose 48, CM-Sepharose CL-68 (hergestellt von Pharmacia-LKB, Schweden), etc.] und ähnliche, sowie einen anorganischen Träger, wie poröses Glas [z.B. CPG-10-1000 (hergestellt von Electronucleonics, USA), etc.].
Das Peptid (I) kann an den Träger gemäß dem herkömmlichen Verfahren zur Immobilisierung von Peptiden oder Proteinen an einen Träger immobilisiert werden. Ein solches Immobilisierungsverfahren umfaßt beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung eines aktivierten Esters, bei dem die Carboxylgruppe auf dem Träger durch die Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid in eine Succinimidoxycarbonylgruppe umgewandelt wird, und im Anschluß daran wird die erhaltene Succinimidoxycarbonylgruppe mit einer Aminogruppe des Peptids (I) umgesetzt; ein Kondensationsverfahren, bei dem der Träger mit dem Peptid (I) durch die Reaktion einer Aminogruppe (oder Carboxylgruppe) auf dem Träger mit einer Carboxylgruppe (oder Aminogruppe) des Peptids (I) in Gegenwart eines Kondensationsmittels (z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, etc.) kondensiert wird; ein Vernetzungsverfahren, bei dem der Träger und das Peptid (I) unter Verwendung einer Verbindung mit zwei oder mehr funktionellen Gruppen (z.B. Glutaraldehyd, etc.) miteinander vernetzt werden, und ähnliche. Ein Adsorptionsmittel, das durch die Immobilisierung des Peptids (I) an den Träger gemäß dem Verfahren unter Verwendung eines aktivierten Esters hergestellt wurde, kann den anti- ATLA-Antikörper mit der höchsten Effizienz adsorbieren.
Das Peptid (I) wird an den Träger in einer Menge von etwa 1 x 10&supmin;&sup9; Molig (Träger) oder mehr immobilisiert, so daß das erhaltene Adsorptionsmittel eine bedeutende Menge des anti-ATLA-Antikörpers adsorbieren kann, und vorzugsweise in einer Menge im Bereich von etwa 1 x 10&supmin;&sup7; bis 5 x 10&supmin;&sup4; Mol/g (Träger), so daß das an den Träger immobilisierte Peptid (I) wirksam zur Adsorption des anti-ATLA-Antikörpers verwendet werden kann.
Die Entfernung des anti-ATLA-Antikörpers aus der Körperflüssigkeit kann durch Inkontaktbringen des durch die Immobilisierung des Peptids (I) an den Träger hergestellten Adsorptionsmittels mit anti-ATLA-Antikörper enthaltendem Blut, Lymphe, Rückenmarksflüssigkeit und ähnlichem ausgeführt werden, wobei der anti-ATLA-Antikörper an das Adsorptionsmittel adsorbiert wird. Das Adsorptionsmittel wird verwendet, indem es beispielsweise in eine Säule gepackt wird. Die für diesen Zweck verwendete Säule besitzt vorzugsweise einen Einlaß und einen Auslaß mit einer solchen Form, daß sie einfach an einen Blutkreislauf angeschlossen werden können, und sie weist sowohl zwischen dem Einlaß und der Adsorptionsschicht als auch zwischen dem Auslaß und der Adsorptionsschicht aus Polyester, etc. hergestellte Filter auf Die Säule ist vorzugsweise aus Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polyester, Polymethacrylat und ähnlichem hergestellt. Unter diesen Substanzen werden Polypropylen und Polycarbonat besonders bevorzugt, da sie durch einen Autoklaven, γ-Strahlungssterilisation und ähnliches sterilisiert werden können.
Die Entfernung des anti-ATLA-Antikörpers aus der Körperflüssigkeit unter Verwendung der mit dem vorstehend hergestellten Adsorptionsmittel gefüllten Säule kann zum Beispiel mit einem extrakorporalen Blutzirkulationssystem durchgeführt werden, bei dem Blut oder Plasma. das aus einem Blutgefäß des Patienten entnommen wurde, über die mit dem Adsorptionsmittel gefüllte Säule geleitet wird, wobei der anti-ATLA-Antikörper aus dem Blut oder Plasma durch Adsorption entfernt und das über die Säule geleitete Blut oder Plasma im Anschluß daran in das Blutgefäß zurückgeführt wird.
Erfindungsgemäß wird ein Peptid (I) bereitgestellt, das an den anti-ATLA-Antikörper spezifisch binden kann. Das Peptid (I) kann ein Reagens zur Bestimmung des anti- ATLA-Antikörpers bereitstellen und ein Adsorptionsmittel, das den anti-ATLA-Antikörper wirksam adsorbieren kann.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Referenzbeispiele, welche die Erfindung nicht begrenzen, ausführlicher erläutert.

Beispiel 1

Ein Peptid (I), wobei X -Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-1) darstellt, mit der folgenden Aminosäuresequenz:
wurde durch ein Festphasenverfahren unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers (Modell 430A, hergestellt von Applied Biosystems, USA) synthetisiert. Als feste Phase wurde ein aus einem Styrol/Divinylbenzolcopolymer hergestelltes granuläres Harz verwendet (154 mg; Molverhältnis von Styrol/Divinylbenzol = 99:1) [PAM-Leucin, t-Boc-L-Leu, hergestellt von Applied Biosystems, USA], das 0,65 mMol/g (Harz) der 4-[Na- (t-Butoxycarbonyl)-L-leucylphenylacetomethyl]-Gruppe der Formel:
enthält. Unter Anwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Verfahren wurden die entsprechenden Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparaginsäure, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Lysin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin und L-Valin) aufeinanderfolgend in Richtung des N-Terminus des gewünschten Peptids an das Harz gebunden. Bei der Kondensationsreaktion wurden die vorstehenden Aminosäuren in der Form von wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanin, wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-O-benzyl-L-asparaginsäure, N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-glutamin-(1-benzotriazolyl)ester, wasserfreiem N- (tert-Butoxycarbonyl)-O-benzyl-L-glutaminsäure, Na-(tert-Botoxycarbonyl)-Nim-dinitrophenyl-L-histidin-(1-benzotriazolyl)ester, wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-isoleucin, wasserfreiem Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N&epsi;-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin, wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-prolin, wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin, wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)-O-benzyl-L-threonin, wasserfreiem Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-O-brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin und wasserfreiem N-(tert-Butoxycarbonyl)- L-valin in einer Menge von etwa der zehnfachen Molmenge des Substrats verwendet. Die Kondensationsreaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionszeit variierte abhängig von der Art der zu kondensierenden Aminosäure, lag jedoch in einem Bereich von 10 bis 20 Minuten. Nach der Beendigung der Kondensationsreaktion für alle Aminosäure wurde das erhaltene Harz nacheinander mit Diethylether, Dichlormethan und Methanol auf einem Glasfilter gewaschen und im Anschluß daran unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein wasserfreies Harz (0,25 g) erhalten wurde. Das wasserfreie Harz (0,25 g) wurde dann mit Thiophenol (2 ml) und N,N-Dimethylformamid (48 ml) in einem Glaskolben gemischt und das Gemisch wurde mit einem Rührer bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Der Überstand wurde abgetrennt und das gleiche Verfahren wurde dreimal wiederholt. Das erhaltene Gemisch wurde mit Dichlormethan und Methanol gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet, wobei ein Harz (0,2 g) erhalten wurde. Das erhaltene wasserfreie Harz (0,2 g) wurde mit Anisol (0,3 ml) und Ethylmethylsulfid (0,05 ml) in einem aus Poly(trifluormonochlorethylen) hergestellten Reaktionsgefäß (HF-Reaktionsgerät Typ 1, hergestellt von Peptide Kenkyusho K.K.) gemischt und dem Gemisch wurde bei -20ºC Fluorwasserstoff (10 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 30 Minuten gerührt und im Anschluß daran 30 Minuten bei 0ºC. Fluorwasserstof, Anisol und Ethylmethylfluorid wurden aus dem Reaktionsgemisch unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde ausreichend mit Diethylether auf einem Glasfilter gewaschen. Der erhaltene Rückstand wurde mit einer wäßrigen 2N Essigsäurelösung extrahiert und der Extrakt wurde gefriergetrocknet, wobei ein Rohpeptid (120 mg) erhalten wurde. Das erhaltene Rohpeptid wurde durch eine präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, [Säule: eine mit Silicagel (Teilchengröße: 15 µm) gefüllte Säule (φ: 50 mm, Länge: 300 mm), hergestellt von Nippon Waters K.K., µ BONDASPHERE 15 µ C18-100 Å; mobile Phase; ein 0,05 Vol.-% Trifluoressigsäure enthatendes Lösungsmittelgemisch aus Wasser/Acetonitril, die Konzentration des Acetonitrils wurde innerhalb von 18 Minuten allmähnlich von 24 Vol.-% auf 30 Vol.-% veändert], wobei ein gereinigtes Peptid (50 mg) erhalten wurde. Das erhaltene gereinigte Peptid wurde einer analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen [Säule: eine mit octadecyliertem Silicagel (Teilchengröße: 5 µm) gefüllte Säule (φ: 4 mm, Länge: 150 mm), TSK-Gel ODS-80TM, hergestellt von Toso K.K; mobile Phase: ein 0,05 Vol.-% Trifluoressigsäure enthaltendes Lösungsmittelgemisch aus Wasser/Acetonitril, die Konzentration des Acetonitrus wurde innerhalb von 30 Minuten allmählich von 5 Vol.-% auf 50 Vol.-% verändert; Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektor: Absorption bei 210 nm), wobei nach 18 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das durch ein schnelles Atombeschußverfahren ("fast atomic bombardment method", nachstehend als "FAB-Verfahren" bezeichnet) erhaltene Massenspektrum ergab ein Molekulargewicht des gereinigten Peptids von 3527 (theoretischer Wert: 3526,88). Tabelle 1 Verfahren verwendetes Lösungsmittel und/oder Reagens Zeit (sec) Häufigkeit Entfernen von tert-Butoxycarbonyl Waschen Neutralisation Kondensationsreaktion Trifluoressigsäure (6,6 ml) N,N-Dimethylformamid 20 Vol.-% Diisopropylethylamin enthaltende N,N-Dimethyformamidlösung eine Aminosäure enthaltende N,N-Dimethylformamidlösung (10 bis 25 ml)

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-1) darstellt, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 18,2 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2363 (theoretischer Wert: 2362,56).

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2239 (theoretischer Wert: 2238,72).

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,8 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3814 (theoretischer Wert: 3813,40).

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 18,2 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3512 (theoretischer Wert: 3512,03).

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I) in dem X -Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 16,5 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2933 (theoretischer Wert: 2932,48).

Beispiel 7

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 21,5 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3359 (theoretischer Wert: 3358,77).

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 16,8 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3355 (theoretischer Wert: 3354,78).

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-3) darstellt, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 20,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3261 (theoretischer Wert: 3261,74).

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 21,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3944 (theoretischer Wert: 3844,60.

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,8 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3426 (theoretischer Wert: 3426,04).

Beispiel 12

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,4 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein. Molekulargewicht des Peptids von 4260 (theoretischer Wert: 4261,41).

Beispiel 13

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 20,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3714 (theoretischer Wert: 3714,27).

Beispiel 14

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 17,1 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3986 (theoretischer Wert: 3985,76).

Beispiel 15

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-2) darstellt, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 21,6 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2464 (theoretischer Wert: 2463,78).

Beispiel 16

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys- bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 17,6 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2581 (theoretischer Wert: 2581,00).

Beispiel 17

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-2) darstellt, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,8 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2720 (theoretischer Wert: 2720,12).

Beispiel 18

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X -Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- bedeutet und A das Peptidfragment (A-2) darstellt, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 18,0 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2977 (theoretischer Wert: 2976,46).

Referenzbeispiel 1

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X deletiert ist und A das Peptidfragment (A-1) bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 3271 (theoretischer Wert: 3270,54).

Referenzbeispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X deletiert ist, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 19,4 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2289 (theoretischer Wert: 2289,00).

Referenzbeispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X deletiert ist und A das Peptidfragment (A-2) bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 23,3 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2208 (theoretischer Wert: 2207,44).

Referenzbeispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 für die Synthese an einer festen Phase und die Reinigung des Peptids wurde erneut ausgeführt, wobei ein Peptid (I), in dem X deletiert ist und A das Peptidfragment (A-3) bedeutet, der folgenden Aminosäuresequenz erhalten wird:
Das erhaltene Peptid wurde der gleichen analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie in Beispiel 1 unterzogen, wobei nach 15,6 Minuten ein einzelner scharfer Peak nachgewiesen wird. Das Massenspektrum mit dem FAB-Verfahren ergab ein Molekulargewicht des Peptids von 2824 (theoretischer Wert: 2823,74).

Beispiel 19

Proben:

ATLV-Trägerserum (20 Proben)
Normales Humanserum (10 Proben)

ELISA:

Jede Serumprobe wurde auf das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers durch den folgenden ELISA untersucht, wobei eine Extinktion gemessen wurde.
Das in Beispiel 1 hergestellte Peptid oder das in Referenzbeispiel 1 hergestellte Peptid wurden jeweils in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) gelöst. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösung wurden einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA (hergestellt von Dainatech) zugegeben und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 37ºC stehen, so daß das Peptid an das Röhrchen anlagert wurde. Die Röhrchen wurden dann mit einer 0,01 M phosphatgepufferten Kochsalzlösung (nachstehend bezeichnet als "PBS") gewaschen (x 4), die 0,05 Vol.-% Tween 20 enthielt. Anschließend wurde jedem Röhrchen 20 Vol.-% Ziegenserum enthaltendes PBS (150 µl) zugegeben und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 4).
Nachdem jedem Röhrchen 100 µl PBS mit 10 Vol.-% normalem Ziegenserum als Verdünnungsmittel für das Serum zugegeben wurde, wurde jede Serumprobe (20 Proben des ATLV-Trägerserums und 10 Proben des normalen Humanserums) in einem Verhältnis von 8:1 (Verdünnungsmittel: Probe; Vol./Vol.) zugegeben. Die Gemische wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und die Röhrchen wurden mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 4).
Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde PBS zugegeben, das einen Meerrettich- Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper enthielt (in einer optimalen Konzentration mit 10 Vol.-% normales Ziegenserum enthaltendem PBS verdünnt; 100 µl). Nach der Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten wurden diese Röhrchen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 4). Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde ein Substrat zugegeben (o-Phenylendiamin gelöst in einem 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer, der 0,02 Vol.-% Wasserstoffperoxid (pH 5,6) in einer Konzentration von 0,3 Gew.-% enthielt; 100 µl). Nachdem man die Gemische 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen ließ, wurde jedem Gemisch 1 N Schwefelsäure (100 µl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und es wurde eine Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse für das in Beispiel 1 hergestellte Peptid bzw. das in Referenzbeispiel 1 hergestellte Peptid sind in Tabelle 2a bzw. Tabelle 2b aufgeführt. Die Figuren 1a und 1b zeigen die Verteilungen der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte in Tabelle 2a bzw. Tabelle 2b, wobei die von dem ATLV-Träger erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als ausgefüllter Kreis und die von dem normalen Humanserum erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als nicht ausgefüllter Kreis dargestellt wurden. Der Grenzwert wurde mit den OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werten der zehn normalen Humanseren bestimmt und zur Beurteilung verwendet, ob die Proben für den anti-ATLA-Antikörper positiv oder negativ sind. Der Grenzwert wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Grenzwert=((Mittelwert der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte des normalen Humanserums) + 2SD). Wurde das Vorhandensein des anti- ATLA-Antikörpers in jeder Serumprobe mit diesem Grenzwert untersucht, wurden alle ATLV-Trägerseren als positiv und alle normalen Humanseren als negativ beurteilt.
Aus den in den Tabellen 2a und 2b sowie in den Figuren 1a und 1b dargestellten Ergebnissen kann man erkennen, daß die Extinktion bei 492 nm der Reaktionslösung im Fall des in Beispiel 1 hergestellten Peptids im Durchschnitt kleiner ist als die Absorption des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids, wenn es sich bei der Probe um das normale Humanserum handelt. Dies beweist das Fehlen der Reaktion, die durch eine unspezifische Extinktion von anderen Antikörpern als dem anti-ATLA-Antikörper im Serum (z.B. menschlicher IgG- Antikörper) induziert wurde, für den Fall, daß der mit dem in Beispiel 1 hergestellten Peptid beschichtete Träger verwendet wird. Tabelle 2a Normales Humanserum ATLV-Trägerserum Serum Nr. Mittelwert Grenzwert Tabelle 2b Normales Humanserum ATLV-Trägerserum Serum Nr. Mittelwert Grenzwert

Beispiel 20

Proben:

ATLV-Trägerserum (5 Proben)
Normales Humanserum (2 Proben)

ELISA:

Unter Verwendung von 5 Proben ATLV-Trägerserum, die gegebenenfalls aus den in Beispiel 19 als positiv beurteilten zehn Proben ausgewählt werden, und zwei Proben normalem Humanserum, die gegebenenfalls aus den in Beispiel 19 als negativ beurteilten zehn Proben ausgewählt werden, wurde mit dem folgenden ELISA eine Extinktion gemessen, um eine optimale Beschichtungsmenge des Peptids zum Nachweis des Vorhandenseins des anti-ATLA-Antikörpers zu bestimmen.
Das in Beispiel 1 hergestellte Peptid oder das in Referenzbeispiel 1 hergestellte Peptid wurden jeweils in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) in einer Konzentration von 0 bis 320 µg/ml gelöst. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösung wurden einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA (das gleiche wie vorstehend erwähnt) zugegeben und man ließ das Gemisch über Nacht bei 4ºC stehen, so daß das Röhrchen mit dem Peptid beschichtet wird. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1). Im Anschluß daran wurde jedem Röhrchen PBS (150 µl) zugegeben, das 20 Vol.-% normales Ziegenserum enthielt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 4) und dann mit PBS (x 1).
Nachdem jedem Röhrchen 100 µl PBS mit 10 Vol.-% normalem Ziegenserum als Verdünnungsmittel zugegeben worden waren, wurde jede Serumprobe (5 Proben ATLV- Trägerserum und 2 Proben normales Humanserum; nachstehend gegebenenfalls bezeichnet als "Serum Nr.1" bis "Serum Nr.7") in einem Verhältnis von 8:1 (Verdünnungsmittel: Probe; Vol./Vol.) zugegeben. Die Gemische wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert und die Röhrchen wurden mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1).
Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde PBS zugegeben, das einen Meerrettich- Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper enthielt (in einer optimalen Konzentration mit PBS verdünnt, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum enthielt; 100 µl). Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37ºC wurden diese Röhrchen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1). Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde ein Substrat zugegeben (o-Phenylendiamin gelöst in einem 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer, der 0,02 Vol.-% Wasserstoffperoxid (pH 5,6) in einer Konzentration von 0,3 Gew.-% enthält; 100 µl). Nachdem man die Gemische bei Raumtemperatur 20 Minuten stehen ließ, wurde jedem Gemisch 1 N Schwefelsäure (100 µl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und es wurde eine Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse für die Seren Nr.1 bis Nr.7 sind in den Figuren 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f bzw. 2g dargestellt. Diese Figuren zeigen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte bei variierenden Beschichtungsmengen des Peptids in jeder Serumprobe, wobei die OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte für jede Serumprobe unter Verwendung des in Beispiel 1 hergestellten Peptids als ausgefüllter Kreis und die OD&sub4;&sub9;&sub2;- Werte für jede Serumprobe unter Verwendung des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids als nicht ausgefüllter Kreis dargestellt wurden. Beim ELISA unter Verwendung des in Beispiel 1 hergestellten Peptids für fünf Serumproben, die in Beispiel 19 als positiv beurteilt wurden (Seren Nr.1 bis Nr.5), ergab die Peptidmenge von mehr als 0,2 ng/Vertiefung den OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert, bei dem die Probe positiv beurteilt werden kann. Die Peptidmenge von 1 ng/Vertiefung ergab einen maximalen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert. Andererseits war beim ELISA unter Verwendung des in Referenzbeispiel 1 hergestellten Peptids für die gleichen Serumproben die Peptidmenge von mehr als 1 ng/Vertiefung für die Probe notwendig, um sie positiv zu beurteilen. Die Peptidmenge von mehr als 10 ng/Vertiefung war für das Erhalten eines maximalen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werts erforderlich. Bei den zwei in Beispiel 19 als negativ beurteilten Proben (Seren Nr. 6 bis Nr. 7) wurde der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert, bei dem die Probe als negativ beurteilt werden kann, bei beiden Peptiden mit jeder Beschichtungsmenge des Peptids erhalten. Dies zeigt, daß durch Zugabe des durch X dargestellten Peptidfragments zur viralen antigenischen Polypeptideinheit, die in der allgemeinen Formel (I) durch A dargestellt wurde, die Empfindlichkeit des ELISA unter Verwendung des viralen antigenischen Polypeptids um mehr als das Zehnfache erhöht wurde.

Beispiel 21

Proben:

ATLV-Trägerserum (5 Proben)
ATLV-falsch-positives Serum (5 Proben)
Normales Humanserum (10 Proben)

ELISA:

Jede Serumprobe wurde auf das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers mit dem folgenden ELISA getestet, wobei eine Extinktion gemessen wurde.
Das in Beispiel 1 hergestellte Peptid wurde mit 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) verdünnt. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösung wurden in ein aus Polystyrol hergestelltes Röhrchen für ELISA (das gleiche wie vorstehend erwähnt) gegeben und man ließ das Gemisch bei. Raumtemperatur 3 Stunden stehen, so daß das Röhrchen mit dem Peptid beschichtet wird. Nach dem Entfernen der Peptidlösung aus den Röhrchen wurde jedem Röhrchen PBS (200 µl) mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum zugegeben und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 3 Stunden stehen, um unspezifische Proteinbindungsstellen auf dem Träger zu blockieren. Danach wurde der erste Teil der erhaltenen Teströhrchen unmittelbar dem ELISA-Verfahren unterzogen. Der zweite Teil der Teströhrchen wurde versiegelt, während die zur Blockierung verwendete Blockierungslösung im Röhrchen verblieb, und bei 4ºC gelagert. Bei dem verbleibenden Teil der Teströhrchen wurde die zur Blockierung verwendete Blockierungslösung entfernt. Man ließ das Röhrchen zum Trocknen bei Raumtemperatur stehen, versiegelte es auf die gleiche Weise und lagerte es dann bei 4ºC.
Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt. Das Teströhrchen, das unmittelbar nach der Blockierung einer Messung unterzogen werden soll, und das unter Verbleiben der Blockierungslösung bei 4ºC gelagerte Teströhrchen, wurden nach dem Entfernen der Blockierungslösung mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS (x 3) und dann mit PBS (1 x) gewaschen und mit jeder Serumprobe umgesetzt. Das Teströhrchen, das nach dem Entfernen der Blockierungslösung und dem Trocknen bei 4ºC gelagerte wurde, wurde ohne Waschschritt auf die folgende Weise direkt mit jeder Serumprobe umgesetzt.
Nachdem jedem Röhrchen 100 µl PBS mit 10 Vol.-% normalem Ziegenserum als Verdünnungsmittel zugegeben wurden, wurde jede Serumprobe (5 Proben des ATLV-Trägerserums, 5 Proben ATLV-falsch-positives Serum und 5 Proben des normalen Humanserums) in einem Verhältnis von 20:1 (Verdünnungsmittel : Probe; Vol./Vol.) zugegeben. Die Gemische wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS (3 x) und dann mit PBS ohne Tween 20 (1 x) gewaschen.
Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde PBS zugegeben, das einen Meerrettich- Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper enthielt (verdünnt in einer optimalen Konzentration mit PBS, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum enthielt; 100 µl). Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37ºC wurden diese Röhrchen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS (x 3) und dann mit PBS (x 1) gewaschen. Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde ein Substrat zugegeben (o-Phenylendiamin gelöst in einem 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer, der 0,02 Vol-% Wasserstoffperoxid pH 5,6) in einer Konzentration von 0,3 Gew.-% enthielt; 100 µl). Nachdem man die Gemische 20 Minuten bei Raumtemperatur hatte stehen lassen, wurde jedem Gemisch 1 N Schwefelsäure (100 µl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und es wurde eine Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in den Figuren 3a, 3b und 3c als eine Verteilung der Werte dargestellt. In Figur 3a sind die Ergebnisse als eine Verteilung der Werte unter Verwendung der mit dem in Beispiel 1 hergestellten Peptid beschichteten Röhrchen dargestellt, die unmittelbar nach der Blockierung gemessen wurden. Figur 3b stellt die Ergebnisse als eine Verteilung der Werte unter Verwendung der mit dem Peptid beschichteten Teströhrchen dar, die bei 4ºC gelagert wurden, wobei die Blockierungslösung nach der Blockierung verblieb. Figur 3c stellt die Ergebnisse als eine Verteilung der Werte unter Verwendung der mit dem Peptid beschichteten Teströhrchen dar, die nach dem Entfernen der Blockierungslösung und dem Trocknen bei 4ºC gelagert wurden. In den Figuren 3a, 3b und 3c wurden die von dem ATLV- Träger erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als ausgefüllter Kreis dargestellt. Die von dem falsch-positiven Serum erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte wurden als nicht ausgefüllter Kreis und die von dem normalen Humanserum erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als Kreuz dargestellt. Der Grenzwert wurde mit den OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werten der fünf normalen Humanseren bestimmt und zur Beurteilung verwendet, ob die Proben positiv oder negativ für den anti-ATLA-Antikörper sind. Der Grenzwert wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Grenzwert = ((Mittelwert der OD&sub4;&sub9;&sub2;- Werte des normalen Humanserums) + 2SD). Wenn das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers in jeder Serumprobe mit diesem Grenzwert bestimmt wurde, wurden alle ATLV- Trägerseren als positiv und alle ATLV-falsch-positiven Seren sowie die normalen Humanseren als negativ beurteilt.
Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, daß der ELISA unter Verwendung des erfindungsgemaßen Peptids mit dem indirekten Immunfluoreszenzverfahren, das gegenwärtig als zuverlässigstes Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins des anti-ATLA-Antikörpers bekannt ist, eine Korrelation von 100% aufweist.

Beispiel 22

Proben:

ATLV-Trägerserum (20 Proben)
Normales Humanserum (10 Proben)

ELISA:

Jede Serumprobe wurde auf das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers mit dem folgenden ELISA untersucht, wobei eine Extinktion gemessen wurde.
Das in Beispiel 15 hergestellte Peptid oder das in Beispiel 16 hergestellte Peptid wurden jeweils mit 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) verdünnt. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösung wurden einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA (das gleiche wie vorstehend erwähnt) zugegeben und man ließ das Gemisch bei 4ºC über Nacht stehen, so daß das Röhrchen mit dem Peptid beschichtet wird. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x 4). Im Anschluß daran wurde jedem Röhrchen PBS (200 µl) mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum zugegeben und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 3 Stunden stehen, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen (x4).
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 19 erneut durchgeführt und es wurde eine Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse für das in Beispiel 15 hergestellte Peptid und das in Beispiel 16 hergestellte Peptid sind in Tabelle 3a bzw. Tabelle 3b aufgeführt. Die Figuren 4a und 4b zeigen die Verteilung der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte in Tabelle 3a bzw. Tabelle 3b, wobei die von dem ATLV-Träger erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als ausgefüllter Kreis und die von dem normalen Humanserum erhaltenen OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte als nicht ausgefüllter Kreis dargestellt wurden. Der Grenzwert wurde mit den OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werten der zehn normalen Humanseren bestimmt und zur Beurteilung verwendet, ob die Proben für den anti-ATLA-Antikörper positiv oder negativ sind. Der Grenzwert wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Grenzwert = ((Mittelwert der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte des normalen Humanserums) + 2SD). Wenn das Vorhandensein des anti- ATLA-Antikörpers in jeder Seruniprobe mit diesem Grenzwert bestimmt wurde, wurden alle ATLV-Trägerseren als positiv und alle normalen Humanseren als negativ beurteilt.
Aus den in den Tabellen 3a und 3b bzw. in den Figuren 4a und 4b aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, daß der ELISA für den anti-ATLA-Antikörper unter Verwendung des in Beispiel 15 hergestellten Peptids oder des in Beispiel 16 der vorliegenden Erfindung hergestellten Peptids die unspezifische Reaktion unterdrückt und daß er mit einer hohen Empfindlichkeit die Beurteilung der Probe ermöglicht, ob sie positiv oder negativ ist. Tabelle 3a Normales Humanserum ATLV-Trägerserum Serum Nr. Mittelwert Grenzwert Tabelle 3b Normales Humanserum ATLV-Trägerserum Serum Nr. Mittelwert Grenzwert

Beispiel 23

Proben:

ATLV-Trägerserum (22 Proben)
Normales Humanserum (2 Proben)

ELISA:

Jede Serumprobe wurde auf das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers mit dem folgenden ELISA untersucht, wobei eine Extinktion gemessen wurde.
Das in Beispiel 1 hergestellte Peptid oder das in Beispiel 15 hergestellte Peptid wurden in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) gelöst, wobei eine das jeweilige Peptid enthaltende Lösung hergestellt wurde. Zusätzlich wurde durch Mischen der vorstehenden zwei Peptidlösungen in einem Verhältnis von 1:10 (erstere Lösung : letztere Lösung) eine Lösung hergestellt, die beide Peptide enthielt. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösungen wurden einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA (das gleiche wie vorstehend erwähnt) zugegeben und man ließ das Gemisch bei 4ºC über Nacht stehen, so daß das Röhrchen mit dem Peptid beschichtet wird. Nach dem Entfernen der Peptidlösung aus den Röhrchen wurde jedem Röhrchen PBS zugegeben (200 µl), das 20 Vol.-% normales Ziegenserum enthielt, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 3 Stunden stehen, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Röhrchen wurden dann mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS (x 3) gewaschen und anschließend mit PBS (x 1).
Unter Verwendung von PBS als Verdünnungsmittel, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum und 0,05 Vol.-% Tween 20 enthielt, wurden das Verdünnungsmittel und jede Serumprobe (22 Proben des ATLV-Trägerserums und 2 Proben des normalen Humanserums) in einem Verhältnis von 20:1 (Verdünnungsmittel : Probe; Vol./Vol.) gemischt und je 100 ul des erhaltenen verdünnten Serums wurden dann dem vorstehenden Röhrchen zugegeben. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37ºC wurden die Röhrchen mit 0,05 Vol.-% enthaltendem PBS gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1).
Jedem erhaltenem Teströhrchen wurde PBS zugegeben, das einen Meerrettich- Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper (in einer optimalen Konzentration mit PBS verdünnt, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum und 0,2 Vol.-% Tween 20 enthielt; 100 µl) Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37ºC wurden diese Röhrchen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS (x 3) gewaschen und dann mit PBS (x 1). Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde ein Substrat zugegeben (o-Phenylendiamin gelöst in einem 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer mit 0,02 Vol.-% Wasserstoffperoxid (pH 5,6) in einer Konzentration von 3 Gew.-%; 100 µl) Nachdem man die Gemische 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen ließ, wurde jedem Gemisch 1 N Schwefelsäure (100 µl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) wurde gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Der Grenzwert wurde mit den OD&sub4;&sub9;&sub2;- Werten der zwei normalen Humanseren ermittelt und zur Beurteilung verwendet, ob die Proben für den anti-ATLA-Antikörper positiv oder negativ sind. Der Grenzwert wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: ((Mittelwert der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte des normalen Humanserums) + 2 SD). Wenn das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers in jeder Probe mit diesem Grenzwert bestimmt wurde, wurden alle ATLV-Trägerseren als positiv beurteilt.
Aus den in Tabelle 4 aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, daß der Test unter Verwendung des Gemisches des in Beispiel 1 hergestellten Peptids und des in Beispiel 15 hergestellten Peptids eine höhere Extinktion ergibt, als der Test unter Verwendung jedes einzelnen Peptids, wenn das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers durch die Bestimmung der Extinktion in einem ELISA für jene Serumproben bestimmt wird, die einen verhältnismaßig niedrigen anti-ATLA-Antikörper-Wert zeigen, dadurch werden falsche Negativbeurteilungen der Probe vermieden. Tabelle 4 Peptid In Beispiel hergestelltes Peptid Gemisch der Peptide Serum Nr. ATLV-Trägerserum Normales Humanserum Grenzwert Mittelwert

Beispiel 24

Proben:

ATLV-Trägerserum (15 Proben)
Normales Humanserum (15 Proben)

ELISA:

Jede Serumprobe wurde auf das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörper mit dem folgenden ELISA untersucht, wobei eine Extinktion gemessen wurde.
Das in Beispiel 1 hergestellte Peptid oder das in Referenzbeispiel 9 hergestellte Peptid wurden in 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5) gelöst, wobei eine das jeweilige Peptid enthaltende Lösung hergestellt wird. Ergänzend hierzu wurde durch Mischen der vorstehenden zwei Peptidlösungen in einem Konzentrationsverhältnis von 1:1 (erstere Lösung : letztere Lösung) eine Lösung hergestellt, die beide Peptide enthielt. Je 100 µl der erhaltenen Peptidlösungen wurden einem aus Polystyrol hergestellten Röhrchen für ELISA (der gleiche wie vorstehend erwähnt) zugegeben und man ließ das Gemisch bei 4ºC über Nacht stehen, so daß das Röhrchen mit dem Peptid beschichtet wird. Nach dem Entfernen der Peptidlösung aus diesen Röhrchen wurde jedem Röhrchen PBS mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum zugegeben (200 µl) und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 3 Stunden stehen, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Nach dem Entfernen der Blockierungslösung in den Röhrchen wurden die Röhrchen getrocknet und bei 4ºC gelagert.
PBS, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum und 0,05 Vol.-% Tween 20 enthielt, wurde als Verdünnungsmittel verwendet. Das Verdünnungsmittel und jede Serumprobe (15 Proben des ATLV- Trägerserums und 15 Proben normales Humanserum) wurden in einem Verhältnis von 20:1 (Verdünnungsmittel : Proben; Vol./Vol.) gemischt und jedem Teströhrchen wurden 100 µl der erhaltenen verdünnten Seren zugegeben. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37ºC wurden die Röhrchen mit PBS mit 0,05 Vol.-% Tween 20 gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1).
Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde PBS zugegeben, das einen Meerrettich- Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper enthielt (verdünnt in einer optimalen Konzentration mit PBS, das 10 Vol.-% normales Ziegenserum und 0,2 Vol.-% Tween 20 enthielt; 100 µl). Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37ºC wurden diese Röhrchen mit PBS mit 0,05 Vol.-% Tween 20 gewaschen (x 3) und dann mit PBS (x 1).
Jedem erhaltenen Teströhrchen wurde ein Substrat zugegeben (o-Phenylendiamin gelöst in einem 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer mit 0,02 Vol.-% Wasserstoffperoxid (pH 5,6) in einer Konzentration von 0,3 Gew.-%; 100 µl). Nachdem man die Gemische 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen ließ, wurde jedem Gemisch 1 N Schwefelsäure (100 µl) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und es wurde eine Extinktion jeder Reaktionslösung bei 492 um (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Der Grenzwert wurde mit den OD&sub4;&sub9;&sub2;- Werten der fünfzehn normalen Humanseren bestimmt und zur Beurteilung verwendet, ob die Proben für den anti-ATLA-Antikörper positiv oder negativ sind. Der Grenzwert wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Grenzwert = ((Mittelwert der OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werte des normalen Humanserums) + 2 SD). Wenn das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers in jeder Serumprobe mit diesem Grenzwert untersucht wurde, wurden alle ATLV-Trägerseren als positiv und alle normale Humanseren als negativ beurteilt.
Aus den in Tabelle 5 aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, daß jene Proben, die im ELISA unter Verwendung eines der in Beispiel 1 und Beispiel 9 hergestellten Peptide als negativ bestimmt wurden, die aber im ELISA mit dem anderen Peptid als positiv eingestuft wurden, im ELISA unter Verwendung des Gemisches dieser zwei Peptide mit hoher Empfindlichkeit als positiv bestimmt wurden. Tabelle 5 Peptid In Beispiel hergestelltes Peptid Gemisch der Peptide Serum Nr. ATLV-Trägerserum Normales Humanserum Grenzwert Mittelwert

Beispiel 25

Zu einer Lösung (10 ml) von Agarosepartikeln (Sepharose 4B, hergestellt von Pharmacia), die mit Cyanbromid aktiviert und mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gepuffert wurden, wurde das in Beispiel 1 hergestellte Peptid (100 mg) gegeben und das Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt, damit die Reaktion voranschreitet, um ein Adsorptionsmittel (etwa 10 ml) zu erhalten, wobei das in Beispiel 1 hergestellte Peptid immobilisiert wurde.

Beispiel 26

Zu einer Lösung (10 ml) von Agarosepartikeln (die gleichen wie vorstehend erwähnt), die mit Cyanbromid aktiviert und mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gepuffert wurden, wurde das in Beispiel 15 hergestellte Peptid (100 mg) gegeben und das Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt, damit die Reaktion voranschreitet, um ein Adsorptionsmittel (etwa 10 ml) zu erhalten, wobei das in Beispiel 15 hergestellte Peptid immobilisiert wurde.

Beispiel 27

Zu einer Lösung (10 ml) von Agarosepartikeln (die gleichen wie vorstehend erwahnt), die mit Cyanbromid aktiviert und mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gepuffert wurden, wurde das in Beispiel 16 hergestellte Peptid (100 mg) gegeben und das Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt, damit die Reaktion voranschreitet, um ein Adsorptionsmittel (etwa 10 ml) zu erhalten, wobei das in Beispiel 16 hergestellte Peptid immobilisiert wurde.

Beispiel 28

Cellulosepartikel (CM-Cellulofine CL, erhältlich von Seikagaku Kogyo K.K.; 10 g) wurden in wasserfreiem Dioxan (hergestellt durch die Destillation von im Handel erhältlichem Dioxan in Gegenwart von metallischem Natrium; 50 ml) suspendiert. Dieser erhaltenen Suspension wurden N-Hydroxysuccinimid (0,5 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die erhaltenen Partikel wurden mit 0,02 M Phosphatpuffer (1,H 7,4) (20 ml) gemischt, der das in Beispiel 1 hergestellte Peptid enthielt, und das Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde durch Absaugen filtriert. Das Filtrat wurde einer analytischen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen (die gleiche wie vorstehend erwähnt), bei der kein weiteres nicht umgesetztes Peptid nachgewiesen wurde (Immobilisierungsanteil des Peptids an den Träger: etwa 100%). Auf diese Weise wurde ein Adsorptionsmittel (etwa 10 g) hergestellt, an welchem das in Beispiel 1 hergestellte Peptid (20 mg) immobilisiert wurde.

Beispiele 29 bis 39

Unter Verwendung von jeweils 20 mg der in den Beispielen 4 bis 14 hergestellten Peptide wurde das Verfahren von Beispiel 28 erneut durchgeführt, wobei jeweils etwa 10 g der Adsorptionsmittel erhalten wurden, an die je 20 mg dieser Peptide immobilisiert wurden (Immobilisierungsanteil jedes Peptids an den Träger: etwa 100%).

Beispiel 40

Das Verfahren von Beispiel 28 wurde erneut ausgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle der Cellulosepartikel (10 g) Polyvinylalkoholpartikel (TSK-Gel CM-Toyopearl 650C, hergestellt von Toso K.K.; 10 g) verwendet wurden, wobei etwa 10 mg Polyvinylalkoholpartikel erhalten wurden, an die 20 mg des in Beispiel 1 hergestellten Peptids immobilisiert wurden (Immobilisierungsanteil des Peptids an den Träger: etwa 93%).

Beispiele 41 bis 51

Unter Verwendung der in den Beispielen 4 bis 14 hergestellten Peptide wurde das Verfahren von Beispiel 40 erneut ausgeführt, wobei jeweils etwa 10 g der Adsorptionsmittel erhalten wurden, an die je 20 mg dieser Peptide immobilisiert wurden. Tabelle 6 zeigt jeden Immobilisierungsanteil der erhaltenen Adsorptionsmittel an den Träger. Tabelle 6 Beispiel Beispiel, das die Synthese des zur Immobilisierung verwendeten Peptids zeigt Immobilisierungsverhältnis (%)

Beispiel 52

Poröse Glaspartikel (CPG-10-1000, hergestellt von Electro-Nucleonics, USA; 10 g) wurden in einer γ-Aminopropyltriethoxysilan (5 ml) enthaltenden Toluollösung (100 ml) 24 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das erhaltene Gemisch wurde mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und durch Absaugen flitriert. Die erhaltenen Partikel wurden in wasserfreiem Dioxan (100 ml) suspendiert. Dieser Suspension wurde wasserfreie Bernsteinsäure (3 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und durch Absaugen filtriert. Die erhaltenen Partikel wurden in wasserfreiem Dioxan (50 ml) suspendiert und der Suspension wurden N-Hydroxysuccinimid (0,5 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 g) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde mit 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen und durch Absaugen flitriert. Die erhaltenen Partikel wurden mit 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,4) (20 ml) gemischt, der das in Beispiel 1 hergestellte Peptid (20 mg) enthielt, und das Gemisch wurde bei 4ºC über Nacht gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde durch Absaugen filtriert, wobei etwa 10 g eines Adsorptionsmittels erhalten wurden, an das 20 mg des in Beispiel 1 hergestellten Peptids immobilisiert wurden (Immobilisierungsanteil: etwa 100%).

Beispiel 53

Unter Verwendung des in Beispiel 15 hergestellten Peptids (20 mg) wurde das Verfahren von Beispiel 52 erneut ausgeführt, wobei etwa 10 g eines Adsorptionsmittels erhalten wurden, an das 20 mg des Peptids immobilisiert wurden (Immobilisierungsanteil: etwa 100%).

Experiment 1

Das in Beispiel 25 hergestellte Adsorptionsmittel wurde in eine Säule (hergestellt von Amicon; 10 mm φ x 150 mm) gefüllt, um eine Säule für eine Affinitätschromatographie herzustellen. Die Säule wurde mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und dann mit 0,5 M Tris-HCl-Puffer. Die Säule wurde im Anschluß daran mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer äquilibriert. Ein anti-ATLA-Antikörper-positives Serum (10 ml) wurde gegen 0,1 M Tris-HCl-Puffer über Nacht dialysiert und über die äquilibrierte Säule geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer wurde der an das auf Sepharose 4B immobilisierte Peptid gebundene anti-ATLA-Antikörper mit 0,5 M Tris-HCl-Puffer eluiert. Das Vorhandensein des anti-ATLA-Antikörpers wurde für jede Fraktion mit dem Verfahren von Beispiel 21 untersucht. Beinahe 100% des Serum-anti- ATLA-Antikörpers wurden in der eluierten Fraktion nachgewiesen. Der anti-ATLA-Antikörper konnte aber nicht in der über die Säule geleiteten Fraktion nachgewiesen werden.

Experiment 2

Das in Beispiel 26 hergestellte Adsorptionsmittel wurde auf die gleiche Weise wie in Experiment 1 in eine Säule (die gleiche wie vorstehend erwälmt) gefüllt, um eine Säule für eine Affinitätschromatographie herzustellen. Ein anti-ATLA-Antikörper-positives Serum (10 ml) wurde gegen 0,1 M Tris-HCl-Puffer über Nacht dialysiert und über die Säule geleitet. Der Serum-anti-ATLA-Antikörper wurde gesammelt und das Vorhandensein des anti-ATLA- Antikörpers wurde für jede Fraktion mit dem Verfahren von Beispiel 21 untersucht. Beinahe 100% des Serum-anti-ATLA-Antikörpers wurden in der eluierten Fraktion nachgewiesen. Der anti-ATLA-Antikörper konnte aber nicht in der über die Säule geleiteten Fraktion nachgewiesen werden.

Experiment 3

Das in Beispiel 27 hergestellte Adsorptionsmittel wurde auf die gleiche Weise wie in Experiment 1 in eine Säule (die gleiche wie vorstehend erwähnt) gefüllt, um eine Säule für eine Affinitätschromatographie herzustellen. Ein anti-ATLA-Antikörper-positives Serum (10 ml) wurde gegen 0,1 M Tris-HCl-Puffer über Nacht dialysiert und über die Säule geleitet. Der Serum-anti-ATLA-Antikörper wurde gesammelt und das Vorhandensein des anti-ATLA- Antikörpers wurde für jede Fraktion mit dem Verfahren von Beispiel 21 untersucht. Beinahe 100% des Serum-anti-ATLA-Antikörpers wurden in der eluierten Fraktion nachgewiesen. Der anti-ATLA-Antikörper konnte aber nicht in der über die Säule geleiteten Fraktion nachgewiesen werden.

Experiment 4

Ein anti-ATLA-Antikörper-positives Serum (10 ml) wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, bei 4ºC über Nacht dialysiert. Diesem Serum (1 ml) wurde das in Beispiel 28 hergestellte Adsorptionsmittel (1 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC geschüttelt und im Anschluß daran mit dem vorstehenden Phosphatpuffer (30 ml) gewaschen. Die Menge des anti-ATLA-Antikörpers im Serum nach der Dialyse und in einer Waschlösung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 21 durch die Messung jedes OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werts bestimmt, aus dem der Anteil des an das Adsorptionsmittel absorbierten anti-ATLA-Antikörpers berechnet wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß etwa 100% des Serum-anti-ATLA-Antikörpers durch das Adsorptionsmittel adsorbiert wurden.

Experimente 5 bis 9

Um ein Experiment hinsichtlich der Adsorption des anti-ATLA-Antikörpers im Serum durchzuführen, wurde unter Verwendung der in den Beispielen 29 bis 33 hergestellten Adsorptionsmittel das Experiment 4 erneut durchgeführt. Die Menge des anti-ATLA-Antiköpers im Serum nach der Dialyse und in einer Waschlösung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 21 durch die Messung jedes OD&sub4;&sub9;&sub2;-Werts bestimmt, aus dem der Anteil des durch das Adsorptionsmittel adsorbierten anti-ATLA-Antikörpers berechnet wurde. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, daß etwa 100% des anti-ATLA-Antikörpers im Serum durch das Adsorptionsmittel adsorbiert wurden.

Experiment 10

Nach der Dialyse eines anti-ATLA-Antikörper-positiven Serums (10 ml), wie in Experiment 4, wurde das in Beispiel 40 hergestellte Adsorptionsmittel dem Serum zugegeben und es wurde ein Experiment hinsichtlich der Adsorption des anti-ATLA-Antikörpers im Serum durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, daß etwa 100% des anti-ATLA- Antikörpers im Serum durch das Adsorptionsmittel adsorbiert wurden.

Experiment 11

Nach der Dialyse eines anti-ATLA-Antikörper-positiven Serums (10 ml), wie in Experiment 4 ausgeführt wurde, wurde das in Beispiel 38 hergestellte Adsorptionsmittel dem Serum zugegeben und es wurde ein Experiment hinsichtlich der Adsorption des anti-ATLA- Antikörpers im Serum durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, daß etwa 100% des anti-ATLA-Antikörpers im Serum durch das Adsorptionsmittel adsorbiert wurden.

Claims

1. Peptid mit der allgemeinen Formel:

H-(X)n-A-Y

wobei X Lysin ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, A ein Peptidfragment mit 6 bis 50 Aminosäureresten ist und Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe dar stellt, wobei das Peptid an einen Antikörper spezifisch binden kann, der eine Spezifität für ein mit der T-Zell- Leukämie bei Erwachsenen assoziiertes Antigen hat.

2. Peptid nach Anspruch 1, wobei A ein Peptidfragment mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

3. Peptid nach Anspruch 1, wobei A ein Peptidfragment mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

4. Peptid nach Anspruch 1, wobei A ein Peptidfragment mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

5. Reagens zur Bestimmung eines Antikörpers mit einer Spezifität für ein mit T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen assoziiertes Antigen, umfassend das Peptid nach Anspruch 1.

6. Adsorptionsmittel für einen Antikörper mit einer Spezifität für ein mit T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen assozuertes Antigen, umfassend das an einem Träger immobilisierte Peptid nach Anspruch 1.

7. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1 unter Verwendung eines Festphasenverfahrens, umfassend

(a) Bindung der Aminosäure, die dem C-Terminus des gewünschten Peptids entspricht, oder des Amids davon an ein in einem Reaktionslösungsmittel unlösliches Polymer und Verlängerung der Peptidkette durch abwechselnde Bindung der nächsten Aminosäure oder des nächsten Peptidfragments in Richtung des N-Terminus des gewünschten Peptids durch Kondensation nach dem Schützen funktioneller Gruppen, ausgenommen die α- COOH-Gruppe, und im Anschluß daran Entfernung der Schutzgruppe für die Aminosäure, die zur Bildung der Peptidbindung verwendet werden soll;

(b) Ablösung der erhaltenen Peptidkette von dem Polymer und Entfernung jeder Schutzgruppe von der geschützten funktionalen Gruppe; und

(c) weitere Reinigung des gewünschten Peptids.