JPH02111791A - Ｈｉｖ抗体と免疫化学的に反応する合成ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗１１１Ｖ抗体と免疫化学的に反応する合成
ポリペプチドに係る。

本発明はまた、被検流体中のＨＴＶまたは抗１１１Ｖの
検出方法、並びに、該検出方法に使用される免疫化学的
試薬及び試験キットに係る。

ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）は一般に、「
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）Ｊの病原体と考えら
れている。

近年Ｈ［Ｖは非常な勢いで蔓延しており、その蔓延は今
後も更に拡大すると予想される。感染個体の治療は勿論
重要であるが、非感染個体への伝染を予防することはい
っそう重要である。ウィルス及び＾ＩＤＳ疾患の発生及
び蔓延（ｏｒｉｇｉｎ　ａｎｄ　５ｐｒｅａｄ）に関す
る調査が多数行なわれはしたが、多くの問題が未解決の
ままである。これらの問題の１つは、感染を早期診断で
きる特異性及び感度にすぐれた方法が存在しないことで
ある。

ＨＩＶの一般構造は、脂質含有被膜即ちエンベロープで
包囲されたリボ核タンパク質コアから成る。

この被膜即ちエンベロープは、感染宿主細胞の膜からウ
ィルスが出芽するときに今生する。このエンベロープ内
にウィルスをコードする糖タンパク質が存在する。ＨＩ
Ｖのこれらの糖タンパク質は感染細胞中で１６０キロダ
ルトンの前駆体タンパク質（ｇｐ１６０）から合成され
る。該タンパク質は１２０キロダルトンのタンパク質（
ｇｐ１２０）と４１キロダルトンのタンパク質（ｇｐ４
１）とに開裂される。

）１１Ｖ−１のｇｐ１２０及びｇｐ４１は多くの研究の
対象となったが、ｇｐ１２０及びｇｐ４１上の免疫優性
エピトープの所在はまだ完全には解明されていない。

しかしながら、ＨＩＶ感染を種々の感染間で確実に診断
できる特異性及び感度にすぐれた方法を開発するために
は、この型のウィルスの免疫優性エピトープを同定する
ことが極めて重要である。

夫々２０個及び１８個のアミノ酸から成り第１図及び第
２図に示すアミノ酸配列を有しＨＩＶ抗体と顕著な免疫
化学的反応性を示す２つの合成ポリペプチドがここに見
出された。

本発明はまた、１（ＩＶ抗体との免疫化学的反応性を維
持している前記エイコサペプチド及びオクタデカペプチ
ドのフラグメントに係り、また、ＨＩＶ抗体と免疫化学
的に反応する前記エイコサペプチドもしくはオクタデカ
ペプチドまたはそれらのフラグメントを必須構成成分と
して含む合成ポリペプチドに係る。

本発明はまた、本発明の合成へ１チドを少なくとも１つ
含有する免疫化学的試薬に係る。

本発明はまた、本発明の合成ペプチドの少なくとも１つ
を使用した、被検流体中の抗＋１ＴＶ抗体の検出方法に
係る。

本発明はまた、本発明の合成ペプチドの少なくとも１つ
を使用した、被検流体中のＨＩＶの検出方法に係る。

本発明はまた、本発明の免疫化学的試薬を少なくとも１
つ含有するイムノアッセイ用試験キットに係る。

前記合成ペプチドは、被検流体中の旧■または）ＩＴＶ
抗体の存在を判定する診断方法において特に適切に使用
できることが知見された。

天然１１１Ｖと対照的な本発明ペプチドの重要な利点は
、安全な非怒染性超速に由来していることである。

本発明の合成ペプチドは、公知の有機化学的ペプチド合
成方法の１つを用いるかまたは組換えＤＮＡ技術を用い
て製造され得る。後者の方法は、１種以上の該当ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する組換
えポリヌクレオチドを適当な微生物宿主中で発現させる
手段によって所望のポリペプチドを製造する方法である
。

有機化学的ペプチド合成方法は、均一相中でまたは所謂
固相を用いて、縮合反応によって所望アミノ酸を結合さ
せる方法である。

均一相中の縮合反応は以下のごとき処理によって行なわ
れる。

（ａ）１つの遊離カルボキシル基を含みその他の反応性
基が保護された化合物（アミノ酸、ペプチド）と、１つ
の遊離アミノ基を含みその他の反応性基が保護された化
合物（アミノ酸、ペプチド）とを縮合剤の存在下に縮合
させる。

ペプチド）と、１つの遊離アミノ基を含みその他の反応
性基が遊離のまたは保護された化合物（アミノ酸、ペプ
チド）とを縮合させる。

（ｃ）１つの遊離カルボキシル基を含みその他の反応性
基が保護された化合物（アミノ酸、ペプチド）と、１つ
の遊離アミン基を含みその他の反応性基が遊離のまたは
保護された化合物（アミノ酸、ペプチド）とを縮合させ
た後、必要に応じて保護基を除去する。

カルボキシル基を活性化させる方法としては特に、カル
ボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダ
ゾリドまたは活性化エーテル例えばＮ−ヒドロキシ−コ
ハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールまた
はｐ−ニトロフェニルエステルに変換させる方法がある
。

アミン基の活性化は、アミノ基を亜リン酸アミドに変換
するかまたは「ホスホラゾ」法を用いて行なうことがで
きる。

上記縮合反応の最も一般的な方法は、カルボジイミド法
、アジド法、混合酸無水物法、及び、［ＴｈｅＰｅｐ　
Ｌ　１ｄｅｓ　」、ｖｏｌｕａ＋ｅ　Ｉ　、　１９６５
（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｅ、　５ｃｈｒ６
ｄｅｒ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｌｕｂｋｅに記載のごとき活性
エステルを使用する方法である。

しかしながら、Ｊ、＾ｍｅｒ　、　Ｃｈｅ＋１１．　Ｓ
ｏｃ　、　８５．２１４９（１９６３）に記載のＭｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄの「固相」法を用いて本発明の前記ペプ
チドを製造することも可能である。

製造すべきペプチドのアミノ酸の結合はカルボキシル末
端側から開始されるのが好ましい。この方法では、反応
性基が存在するかまたは反応性基を導入させ得る固相が
必要である。固相は、例えば反応性クロロメチル基を有
する、ベンゼンとジビニルベンゼンとのコポリマーであ
ってもよく、またはヒドロキシメチルもしくはベンジル
アミンによって反応性にされた重合体固相であってもよ
い。

特に適当な固相は、例えば、Ｈａｎｇ（１９７４）、Ｊ
。

＾Ｉ１．　Ｃｈｅｎ＋、　Ｓｏｃ、　９５．１３２８に
記載のｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒ
ドロキシメチル、フェノキシ−メチル−コポリスチレン
−１％ジビニルベンゼン樹脂）である、穏やかな条件下
に合成した後にペプチドを固相から分離し得る。

クロロメチル基を含有する樹脂も極めて適当な固相とし
て使用できる。この種の固相を使用するときは、最初の
α−アミノ−保護アミノ酸と樹脂との結合をエステル結
合によって行なう。

所望アミノ酸配列の合成後に、例えば液体フッ化水素、
トリフルオロメタンスルホン酸、またはトリフルオロ酢
酸に溶解したメタンスルホン酸を用いて樹脂からペプチ
ドを脱離する。また、低級アルコール好ましくはメタノ
ールまたはエタノールとのトランスエステル化によって
担体からペプチドを除去してもよい、この場合、ペプチ
ドの低級アルキルエステルが直接形成される。アンモニ
アを用いて同様に分離すると、本発明ペプチドのアミド
が得られる。

縮合反応に参加しない反応性基は、前記のごとく酸加水
分解または還元によって容易に除去できる基によって有
効に保護される。従って、カルボルー１−メチルビニル
のごとき基も使用し得る。特キシル基は、例えばメタノ
ール、エタノール、第トロベンジルアルコールでエステ
ル化されることによって有効に保護され得る。

アミノ基を有効に保護し得る基は通常は酸基、例えば酢
酸、安息香酸もしくはピリジンカルボン酸のごとき脂肪
族、芳香族、アリール脂肪族もしくは複素環カルボン酸
から誘導された酸基、または、エトキシカルボニル、ベ
ンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルもし
くはｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基のごとき
炭酸から誘導された酸基、または、ベンゼンスルホニル
もしくはｐ−トルエンスルホニル基のごときスルホン酸
から誘導された酸基であるが、ベンジル及びトＪフェニ
ルメチルのごとき置換もしくは未置換のアリールまたは
アリールアルキル基、またはオルト−ニトロフェニル−
スルフェニル及び２−ペンシイに適当なα−アミノ−保
護基は例えば、塩基感受性の９−フルオレニル−メトキ
シカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏ　　＆　
　Ｈａｎ（１９７０）Ｊ、　　＾ｍｅｒ、Ｃｈｅｗ、Ｓ
ｏｃ、９２．５７４８）である。

また、リジンのε−アミノ基及びアルギニンのグアニジ
ン基も保護するのが好ましい。このような保護に使用さ
れる保護基は通常、リジンの場合はｔＩｌｕ−またはト
シル基であり、アルギニンの場合はニトロ−１Ｐ…Ｓ−
またはＨｂｓ−基である。

個々の保護基の性質に応じて従来の種々の方法で保護基
を分離し得る０例えば、トリフルオロ酢酸を用いてもよ
く、または水素とパラジウムのごとき触媒とを用いる穏
やかな還元によってもよく、または氷酢酸中のＨＢｒを
用いてもよい。

前記のごとく、本発明ペプチドはまた、ｍ換えＤＮＡ技
術によって製造され得る。ペプチドが繰り返し配列（「
縦列をなして」）で組み込まれているとき、またはペプ
チドを（より大きい）タンパク質またはポリペプチドの
構成成分として製造するときはこの技術の可能性が特に
重要である。従ってこの技術によるペプチド製造方法も
本発明の範囲に包含される。この場合、組換えＤＮへの
構成成分としては、本発明のペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドであって、更に天然１１１Ｖゲノム中の前
記ポリヌクレオチド配列に接続した（ｆｌｉｎｋ）ポリ
ヌクレオヂドセグメントを実質的に含まないポリヌクレ
オチドを使用する。

本発明のペプチドをコードする前記のごときポリヌクレ
オチド及びこのポリヌクレオチドを取り込んだ組換えＤ
ＮＡも本発明の範囲に包含される。

特許請求の範囲に特に記載はしていないが、本発明のペ
プチド中の１つ以上のアミノ酸がＬｏｓ八ｌへｍｏｓ　
Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＡＩＤＳＩＤＳライｌレスータベ
ース）に示されたような別のアミノ酸で置換されてもよ
いことは自明である。

更に、主として、 （ａ）ペプチドの酸付加塩、 （ｂ）ペプチドのアミド及び特にＣ末端アミド、（ｅ）
エステル及び特にＣ末端エステル、及び、（ｄ）ドアシ
ル誘導体、特定的にはＮ末端アシル誘導体及び特にＮ−
アセチル誘導体 を意味するこれらのペプチドの官能性誘導体も本発明の
ペプチドと考えてよい。

「免疫化学的試薬」なる用語は、本発明の合成ペプチド
が適当な担体に結合しているかまたは標識物質で標識さ
れていることを意味する。

使用可能な担体の例は、マイクロテストウェルの内壁、
試験管の内壁もしくは毛細管の内壁、膜、フィルター、
試験片の内壁、または、ラテックス粒子、赤血球、色素
ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒子の形態の金属化合物の
ごとき粒子の表面である。

使用可能な標識物質の例は特に、放射性同位体、蛍光化
合物、酵素、色素ゾル、金属ゾルまたはゾル粒子の形態
の金属化合物である。

本発明の免疫化学的試薬を使用して行なう被検流体中の
抗ＨＩＶ抗体の検出方法においては、本発明の該試薬を
被検流体と接触させ、ペプチドと該ペプチドに反応性の
被検流体中の抗体との間に形成された免疫複合体の存在
を検出し、この検出に基づいて被検流体中のＨＩＶ抗体
の存在を判定する。

これらの検出方法を使用して生じさせる免疫化学的に反
応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集反応、競合反
応または阻害反応である。

抗ＨＩＶ抗体を使用して被検流体中のＨＩＶを検出する
ために本発明の免疫化学的試薬を使用するときは、本発
明の該試薬を被検流体と接触させ、ペプチドと抗１（Ｅ
Ｖとの間に形成された免疫複合体の存在を検出し、この
検出に基づいて被検流体中のＨＩＶの存在を判定する。

被検流体中のＨＩＶの検出に特に適した方法は、固体担
体に結合した抗ＨＩＶ抗体上の結合部位に対して、標識
物質で標識された本発明の合成ペプチドとく被検流体中
に存在する）ＨＩＶ抗原とを競合させる競合反応を利用
する方法である。

本発明の試験キットは、前記の免疫化学的試薬を必須成
分として含有する必要がある。サンドイッチ反応を行な
うためには、試＠キットは例えば、マイクロテストウェ
ルの内壁のごとき固体担体に結合した本発明の合成ペプ
チドから構成され得るが、標識された本発明の合成ペプ
チドまたは標識抗体を使用することも可能である。

競合反応を行なうためには、本発明の合成ペプチドが固
体担体に結合された試験キットを使用し、標識された抗
１１１Ｖ抗体を被検流体中の抗１１１Ｖと８合させる。

凝集反応においては、粒子またはゾルに結合した本発明
の合成ペプチドから成る免疫化学的試薬を、検出すべき
抗ＨＩＶ抗体が存在している被検流体と直接接触させる
必要がある。

試験キットの別の具体例では例えば、本発明の標識合成
ペプチドを免疫化学的試薬として使用し、固体担体に結
合した抗ＨＩＶ抗体の結合部位に対して検出すべきＨＩ
Ｖ抗原との競合反応を行なわせる。

支１匠り 第１図の合成エイコサペプチドをこの種のペプチドの常
用の有機化学的合成法によって製造した。

ここではＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法を使用した。

支１匠ｌ 第２図の合成オクタデカペプチドをこの種のペプチドの
常用の有機化学的合成法によって製造した。ここではＭ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法を使用した。

割１匠ｌ 第１図のアミノ酸配列を有する合成エイコサペプチド（
ｅｎｖ−ペプチドＨＩＶ−１、ＢＲＵ、６５３−６７２
：Ｌｏｓ＾１ａｍｏｓ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（＾ＩＤＳ
ウィルス配列データベース）のアミノ酸番号、Ｌｏｓ　
八ｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ＋Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ＋Ｌｏｓ＾ｌａｍｏｓ）を、ｐＨ９，６の０．０５
ＭのＮａＨＣＯｌにＩＢｇ／ｚｌで溶解した。マイクロ
タイタープレー１・にペプチドを結合させるために、こ
の溶液を８×１２のマイクロタイタープレートに１３５
μｌ／ウエルの量で導入し、４℃で１晩インキユベート
した０次にウェルを吸引して空にし、５％粉末スキムミ
ルクと４％正常ヤギ血清とを加えた２５０μｌ／ウエル
のリン酸＃１衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を用い、室
温に１時間維持して残存する結合部位をブロックした０
次にプレートを空にし、シリカゲルにのせて室温で１晩
乾燥した。

抗１１１Ｖ抗体を定量するために、試験すべき血清サン
プルをＰＢＳで希釈し、ピペットで注入しく１００μｐ
／ウエル）、３７℃で３０分間インキュベートした。次
にプレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登
録油源）で４回洗浄した。ペルオキシダーゼで標識した
ヤギ抗ヒト免疫グロブリン溶液をピペットで注入しく１
００μｌ／ウエル）、３７℃で３０分間インキュベート
した。

次にプレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｕ＋ｅｅｎ−２０
で４回洗浄した。過酸化尿素（０，５Ｂ／ａ１）とオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ；１．６ｚｙ＃Ｎ）との
溶液（１００ｕｔ’／ウエル）をペルオキシダーゼの基
質としてウェルに導入し、光を遮断して室温でインキュ
ベートした。３０分後に１００μｍ／ウェルの１ＭＨ２
ＳＯ，を添加して反応を停止させた。Ｏｒｇａｎｏｎ　
Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｈｉｃｒｏｅｌｉｓａ　ｒｅａｄｅｒ
を用い４９２　ｎ　＋ｎに黄色を読み取った。抗１１１
Ｖ陽性血清では０．２〜１，２の吸光度が測定されたが
、対照正常ヒト血清を使用した場合の吸光度は０．１で
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＩＶ抗体と免疫化学的に反応する合成エイコ
サペプチドのアミノ酸配列を示す。 第２図はｌ（［Ｖ抗体と免疫化学的に反応する合成オク
タデカペプチドのアミノ酸配列を示す。 Ｌ註曵（Ｌユ Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｌ＋ｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐ−Ａｌａ。 Ｌ−旦ΩＢ２ Ａｌａ−工１８−Ａｒｑ−Ｈ１５−Ｉ　ｌｅ−Ｐｒｏ−
Ａｒｑ−Ａｒｑ　−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ　
１ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ。 代理人弁理士　月ａ　　山　　　　武

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＩＶ抗体と免疫化学的に反応する、式：【遺伝
   子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有する合成エイコサペプチド
   及びそのフラグメント、並びに、必須構成成分として前
   記エイコサペプチドを含む合成ポリペプチドまたは、Ｈ
   ＩＶ抗体と免疫化学的に反応する前記合成ポリペプチド
   のフラグメント。
2. （２）請求項１の合成ペプチドを含有する免疫化学的試
   薬。
3. （３）ＨＩＶ抗体と免疫化学的に反応する、式：【遺伝
   子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有する合成オクタデカペプチ
   ド及びそのフラグメント、並びに、必須構成成分として
   前記オクタデカペプチドを含む合成ポリペプチドまたは
   、ＨＩＶ抗体と免疫化学的に反応する前記合成ポリペプ
   チドのフラグメント。
4. （４）請求項３の合成ペプチドを含有する免疫化学的試
   薬。
5. （５）請求項２または４の免疫化学的試薬を用い、前記
   試薬を被検流体と接触させ、前記ペプチドと反応する被
   検流体中の抗体と前記ペプチドとの間に形成された免疫
   複合体の存在を検出し、その結果に基づいて被検流体中
   のＨＩＶ抗体の存在を判定することを特徴とする被検流
   体中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法。
6. （６）請求項２または４の免疫化学的試薬を用い、前記
   試薬を被検流体と接触させ、前記ペプチドと抗ＨＩＶと
   の間に形成された免疫複合体の存在を検出し、その結果
   に基づいて被検流体中のＨＩＶの存在を判定することを
   特徴とする被検流体中のＨＩＶの検出方法。
7. （７）請求項２または４の免疫化学的試薬を少なくとも
   １種含有することを特徴とするイムノアッセイ用試験キ
   ット。