JPH02218693A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト免疫不全症ウィルス２型（ＨＩＶ−２）
に特異的な抗体に結合することができるペプチド、その
調製物及びその使用に関する。

ＨＩＶ−２（ＬＡＶ−２としても知られている）が発見
されてから、このウィルスの存在を検出する必要が出て
きた。ＨＩＶ−２特異抗体に結合できる一群のペプチド
が今合成されており、この抗体、従って検出すべきウィ
ルスの存在が証明できるようになってきている。従って
これらのペプチドは、抗体又はＨＩＶ自身の測定法に使
用できる。

これらはまた、抗体自身を産生させるのに使用すること
ができる。

従うて本発明は式（１）のペプチドを与える：Ｘ−Ｎ５
ＷＧＣ−Ｙ　　　　（Ｉ） （式中、（１）ＸはＫＹＬＱＤＱＡＲＬ　ｒ　Ｙは＾Ｆ
ＲＱＶＣｒあルカ、又はＸはＡ［ＥＫＹＬＱＤＱＡＩ？
ＬでＹは水ＩＩＭであり、又はＸ　Ｇｅｔ　Ｋ　ｒ　Ｙ
　ハＡｒＲＱＶＣＨＴＴＶＰＷＶＮテ（１５リ：にｉ）
末端カルボキシル基は随時アミド型であり；（２）各Ｃ
のメルカプト基は遊離であるか又は保護されている）。

アミノ酸残基は１文字コードで表示しである（ヨーロピ
ーアンジャーナルオンバイオケミストリ−（Ｅｕｒ、　
Ｊ、　８ｉ０Ｃｈ０１１．　）第１３８巻、９−３７頁
、１９８４年）。好ましくは、末端カルボキシル基は、
カルボキシル基型（即ち一〇〇〇Ｈ）ではなく、アミド
型（即ち・−ＣＯＮＨ２）である。

また好ましくは各側鎖のメルカプト基は保護されている
。これによりジスルフィド結合の形成を防ぐことができ
、システィン残基の酸化が防がれ、担体に対するペプチ
ドの好ましくない結合を防ぐことができる。

メルカプト保Ｉｌ基はアセトアミドメチルでもよく、有
機水銀由来でもよく、マレイミドやジスルフィド保護剤
でもよい。適当なジスルフィド保護剤の一例としてはエ
ルマン試薬（ジチオジピリジル）がある。好ましくは保
護基はＮ−エチルマレイミド又はアセトアミドメチル由
来であり、以下の式の構造を有する： 式（Ｉ）のペプチドは合成ペプチドである。これは化学
合成により１４ｇＡすることができ、ペプチド合成の固
相法又は液相法を用いることができる。

従って以下の段階よりなる方法によりペプチドを合成で
きる： （ａ）ここで末端カルボキシル基が１１１又はアミド型
である式（Ｉ）のべ！チドを得るため、単純なアミノ酸
類、及び／又は２つ以上のアミノ酸を式（Ｉ）で存在す
る順序であらかじめ作成したペプチド（アミノ酸がシス
ティンの時はそのメルカプト基は遊離か又は保護されて
いる）を縮合させる；そして （ｂ）必要な場合は、式（Ｉ）のペプチドの中で遊離の
メルカプト基を有する各システィン残塁のメルカプト基
を保ｉする。

固相合成では、目的のペプチドのアミノ酸配列は、不溶
性樹脂に結合したＣ−末端アミノ酸から順番に作られて
いく。目的のペプチドが合成されたら、＊ｉから切り１
ｌｌｌｆｌ“。液相合成を使用する場合もＣ−末端アミ
ノ酸からペプチドを合成していく。反応の間中この酸の
カルボキシル基は保護されたままであり、合成の最後に
切断する。

固相法、液相法のいずれの方法を用いるにせよ、反応系
に加えられる各アミノ酸は、代表的には保護されたα−
アミノ基と活性化されたカルボキシル基を有する。アミ
ン基はフルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ）又はｔ−ブトキシカルボニル（８ｏｃ）Ｂで保護
できる。カルボキシル基はペンタフルオロフェニル又は
１−オキソ−２−ヒドロキシ−ジヒドロベンゾトリアジ
ンエステルとして活性化できる。各縮合段階はジシクロ
ヘキシルカルボジイミド又は１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールの存在ドで実施できる。

代表的には側鎖官能基も保護される（例えばリジンの側
鎖アミノ基、トレオニンのｇ！４鎖水酸基、又はシステ
ィンのメルカプト基）。合成の各段階の後でα−アミノ
保護繕は除去される。ｒｌＡ鎖保護基は必要な場合には
そのまま保持されるが、一般的には合成の最後に除去さ
れるのみである。しかし保護されたメルカプト基の場合
、保′ｒ！１機能をはたすことが必要な場合には保護基
は保持される。

別の保護基又は遊離メルカプト基を持つペプチドが必要
な場合は、保ｒ！１基は除かれる。

ペプチドは必要に応じ、Ｃ−末端力ルボキシル基又はア
ミド基を用いて５Ｉ製される。固相ペプチド合成におい
ては、これはＣ−末端アミノ酸の樹脂指示体への結合の
仕方、及び／又は最終的にペプチドがいかに樹脂より切
断されるかにＪ：り決まる。代表的には樹脂はスチレン
及び／又はジビニルベンゼンポリマーである。Ｃ−末端
アミノ酸がエステル結合を介して樹脂に結合している場
合、トリフルオロ酢酸中のＨｅｒ又はＨＦなどの強酸で
切断されＣ−末端力ルボキシル基を有するペプチドが得
られる。アンモノリシスを使用すると代わりに、対応す
るアミドが得られる。

固相合成法によりペプチドアミドを得る別の方法は、ペ
プチドのＣ−末端アミノ酸をペプチドアミノベンズヒド
リル結合を介して樹脂に結合させることである。これは
ジシクロヘキシルカルボジイミドで結合させＨＦで切断
（代表的には低温中で）させることにより可能である。

液相合成法の場合は、Ｃ−末端力ルボキシル基又はアミ
ド基が存在するか否かにより、Ｃ−末端アミノ酸のカル
ボキシル基の保護の仕方、そして合成の最後での保Ｆ［
のはザし方が変わる。Ｃ−末端力ルボキシル基を有する
ペプチドは、Ｃ−末端アミド基を有するペプチドに変換
できるし、その逆の可能である。

ペプチドはまた組換えＤＮＡ法によってもＷＪ製できる
。即ちペプチドをコードするＤＮＡ配列が与えられる。

ＤＮＡ配列を導入し、適当な宿主中でペプチドを発現で
きる発現ベクターが調製される。ＤＮＡ配列はベクター
の翻訳開始シグナルと停止シグナルの間に存在する。適
当な転写調節要素（特にＤＮＡ配列のプロモーター及び
転写停止部位）も与えられる。ＤＮＡ配列は、ベクター
と融和性のある宿主中で存在するペプチドの発現を可能
にするような正しいフレーム中で与えられる。

任意の宿主−ベクター系が使用できる。ベクターはプラ
スミツドでもよい。その場合細菌性又は酵母性宿主を使
用できる。またはベクターはウィルス性ベクターでもよ
い。これはペプチドを発現させるために、哺乳類の細胞
株を感染させるのに使用される。

ペプチドは２つの方法のいずれかでメルカプト基が保護
されて与えられる。まず、段階（ａ）、即ち前駆体アミ
ノ酸からペプチドを作成する時、メルカプト基の保護さ
れたシスティンが使用される。

第２に′ｒ１１１１のメルカプト基を有する式（Ｉ）の
ペプチドが得られ、次に遊離のメルカプト基を保護する
。メルカプト基保護剤は、合成経路に応じ遊離システィ
ン又は式（Ｉ）のペプチドと反応させられる。

任意のメルカプト基保護剤が使用可能である。

その例としてはアセトアミドメタノール、有機水銀、マ
レイミド及びジスルフィド保護剤がある。

エルマン試薬（ジチオピリジル）は適当なジスルフィド
保護剤である。しかし好適な保護剤はＮ−エチルマレイ
ミド又はアセトアミドメタノールである。

遊離のメルカプト基を有する式（Ｉ）のペプチドを得た
なら（これは次に保護することが好ましい）、まずペプ
チドを還元する。代表的にはジチオナイト、２−メルカ
プトエタノール、ジチオスレイトール又はジチオエリト
リオールのような強力な還元剤を使用する。ジチオスレ
イトールが好適である。わずかに過剰の還元剤を使用す
る場合は、メルカプト基保護剤を加える前に還元ペプチ
ドを分離する必要はない。

代表的な合成法では、ｐＨ約７の緩衝液中のペプチド溶
液（１００−５００μＭ）を、約２倍過剰屋のジチオス
レイトール（即ち２００−１０００μＭ）のような還元
剤で少なくとも２０分間（代表的には３０分間）還元す
る。次にずべてのメルカプト基に対し約２倍モル過剰量
のＮ−エチルマレイミドのような保護剤を加える。少な
くとも１時間保護反応をさせる。次に修飾されたペプチ
ドを適当なａｔｉ液中でゲル濾過する。または修飾した
ペプチドをゲル濾過前に、さらにＳ−７セチルチオグリ
コール酸、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＳＡ
ＴＡ）又は４−（Ｎ−マレイミド−メチル）−シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のような結
合試薬と反応させる。

式（Ｉ）のペプチドはｌ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−２に特異的な
抗体の測定に使用できる。適当な生理的試料、例えば尿
、血漿、血液、血清、精子、涙、唾液、又は髄液を測定
に使用する。測定法は、試料をペプチドと接触させ、ペ
プチドに結合する抗体があるか否かを調べる。このため
、式（Ｉ）のペプチドと、試料中に存在するかもしれな
い、ペプチドと結合するＨＩＶ−２に対する抗体を測定
する手段よりなる検査キットが与えられる。

いろいろな種類の測定様式が使用可能である。

溶液よりＨＩＶ−２に対する抗体を選択的に捕捉するた
めに、又は捕捉した抗体を選択的に標識するために、又
は捕捉と標識の両方のために、このペプチドが使用でき
る。さらにペプチドは多種類の均一系様式（このペプチ
ドと反応する抗体は相の分離をすることなく検出できる
）の中で使用できる。このペプチドはＨＩＶ−２抗原の
検出に使用することもできる。

溶液から抗体を捕捉するためにペプチドを使用するよう
な測定法のタイプでは、ペプチドを固相へ固定化する。

固相表面はなんらかの方法で洗浄できる。使用される表
面の種類としては、種々のタイプのポリマー（マイクロ
タイターウェルにしたちの；ビーズ：種々の型のデイツ
プスティック；吸引チップ；電極；そして光学装置）、
粒子（例えばラテックス；安定化血液、細菌細胞又は真
菌細胞；金粒子又は他の金属粒子；そして蛋白性コロイ
ド；粒子の大きさは通常０．１から５ミクロンである）
、１ｔＡ（例えばニトロセルロース；紙；酢酸セルロー
ス：そして有機又は無機材料の多孔性／表面積の大きい
膜）などがある。

上記表面へのペプチドの結合は、適当な組成物（例えば
界面活性剤、溶媒、塩、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｅｓ）　）の溶液からの受動的吸着、又は能動的な化
学結合による。能動的結合は、表面に結合する種々の反
応性又は活性化可能な官能基（例えば縮合剤二活性エス
テル、ハロゲン化物、無水物；アミノ基、水ｓ２ｍ、又
はカルボキシル基：メルカブト基；カルボニル基；ジア
ゾ基；不飽和基）による。又は能動的結合は、蛋白（そ
れ自身が受動的に又は能動的結合により表面に結合）、
又はアルブミンやカゼインなどの担体蛋白による。

担体蛋白にはペプチドは種々の方法で化学的に結合し、
等電点、電荷、親水性又は他の物理化学的性質により利
点を与える。ペプチドはまた、反応混合液の電気泳動的
分離により表面（必ずしも膜ではない）に結合すること
もある（例えば免疫沈降）。

ペプチドを有する表面に試料を接触（反応）させて、必
要な場合は任意の方法（例えば洗浄、遠心分離、濾過、
磁力、毛細管作用など）により過剰の試料を除去し、捕
捉した抗体を、検出可能なシグナルを与える任意の方法
で検出する。例えばこれは、Ｆ４ｉ捉された抗体と反応
する前述した標識分子又は粒子を使用することにより可
能である（例えばプロティンＡ又はプロティンＧなど；
抗種又は抗免疫グロブリンナブタイブ；リウマチ因子；
競合的に又は妨害的に使用するペプチドに対する抗体；
ペプチド自身、又はＨＩＶ−２から直接的又は間接的に
得られる他の蛋白やペプチドなどのペプチドを構成する
エピトープ（抗原決定基）を含有する分子）。

前記の分子を例えば色素、放射能、電気的に活性な物質
、磁気的に共鳴する物質又は蛍光性物質で直接標識する
か；又は分子又は粒子をある種の測定可能な変化を与え
ることのできる酵素で間接的に標識ずれば、検出可能な
シグナルは、光学的、放射能又は物理化学的なものであ
る。あるいは表面は粒子である場合、検出可能なシグナ
ルは、例えばＮ集、屈折効果又は複層１ｆｒ効果でもよ
い。

捕捉された抗体を標識するのにペプチドを使用するよう
なタイプの測定法は、ペプチドが検出できるようになん
らかの標識を必要とする。標識は直接的（例えばペプチ
ドの放射能標識、磁気共鳴標識、粒子標識、酵素標識）
でも、ペプチドを反応する分子を標識するという間接的
なもの（例えばペプチドに対する抗体があり、標識分子
をあとでペプチドに反応させる）でもよい。

ペプチドに対する標識物の結合は、すでにペプチド中に
存在づる成分を使用する直接的なものであり、アミン基
やマレイミドなどの挿入された基がある。抗体の捕捉は
、受動的又は活性化吸着による任意の試薬による、前述
した表面で起き、特異的抗体又は免疫複合体が結合され
る。特に抗体の捕捉は、抗種又は抗免疫グロブリンサブ
タイプ、リウマチ因子、プロティンＡ１プロテインＧな
ど、又は竹述したペプチドを構成するエピトープを含有
する分子による。

試料中のＨＩＶ−２の尺度を与えるようにこのペプチド
を使用するような調定法では、前述の任意の方法でペプ
チドを標識し、競合的な方法（表面に対する特異的分子
の結合は、試料中の抗原により妨害される）、非競合的
な方法（試料中の抗原は、特異的又は非特異的に表面に
結合し、これが２価又は多価分子（例えば抗体）に結合
し、残存している結合価は標識ペプチドの捕捉に使用さ
れる）で、ペプチドを使用する。

一般的に均−測定系ではペプチドと抗体が標識され、そ
の結果、試験物質の存在しない溶液中で抗体はペプチド
と反応し、２つの標識物が相互作用をして（例えば１つ
の標識物に捕捉されたエネルギーが非放射能的に別の標
識物に移動し、励起された第２の標識物又は減弱したＩ
’１１の標識物を適当に検出する（例えば蛍光法、磁気
共鳴又は酵素の測定）ことが可能となる。試料中に抗原
又は抗体を添加すると、標識物対の相互作用が制限され
、検出器中のシグナルの層が変わる。

ＨＩＶ−２抗体を検出する適当な測定様式は、直接サン
ドインチ酵素免疫測定法（Ｅ　ＩＡ）である。式（Ｉ）
のペプチドをマイクロタイターウェルの表面に被覆する
。試料と酵素の結合した式（Ｉ）のペプチド（複合ペプ
チド）を同時に添加する。特異的抗体が存在する場合は
、ウェルを被覆しているペプチドと複合ペプチドに結合
づる。

代表的には式（１）のペプチドと同じペプチドをサンド
イッチの両側で使用する。洗浄後、色の変化する特異的
基質を用いて、結合した酵素を検出する。このようなＥ
ＩＡに使用される検査キットは下記のものより構成され
る： （１）　　酵素で標識した式（１）のベブブード；（２
）　　酵素の基質； （３）　　式（Ｉ＞のペプチドの固定化された表面を与
える手段：そして （４）　　ＩＩＩＫ浄液７Ａヒ／又ハ緩ＩＬ式（Ｉ）の
べ７チドＬｔＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に特異的な抗体を
検出する、組合せ測定法に使用可ＩＩ！である。このよ
うな測定は、試料を式（１）のペプチドをＨＩＶ−１の
エピトープを示すポリペプチドに接触させ、式（ｒ）の
ペプチドに結合する抗体、及び／又は）−１１Ｖ−１の
エピトープを示すポリペプチドに結合する抗体があるか
否かを検出することよりなる。前述した任意の測定様式
が使用可能である。

）−１１Ｖ−１とＨＩＶ−２に対する特異的抗体を検出
する組合せ測定法に使用される検査キットは、式（Ｉ）
のペプチド、ＨＩ　Ｖ　−１抗体に対する工ごトープを
示すポリペプチド、そして上記ポリペプチド又は式（Ｔ
）のペプチドに結合するＨＩＶ−１特異的抗体又はＨＩ
Ｖ−２特異的抗体が試料中にあるか否かを測定する１段
よりなる。

前述したｆＩＡ法は組合せ測定法に適している。

ＨＩＶ−１抗体が結合するエピトープを示すポリペプチ
ドは、マイクロタイターウェルに被覆される。酵素でａ
ｌｌされた１つのポリペプチド（例えば同じポリペプチ
ド）を、試料と式（１）の複合ペプチドと一緒に添加す
る。ポリペプチド状の酵ｊＩＩ標識物は、式（１）のペ
プチド上のものと同じでも異なっていてもよい。従って
このようなＥＩＡの検査キットは、前述した（１）から
（４）以外に以下の物を含む： （５）　　ＨＩＶ−１抗体に対するエピトープを示す酵
素で標識したポリペプチド： （６）　　式（Ｉ）のペプチドの８！！識した酵素と奴
なる酵素を使用している場合はその酵素の基質；（γ）
　　ＨＩＶ−１抗体が結合するエピトープを示すポリペ
プチドが固定されている表面を与える手段。

式（Ｉ）のペプチドとＨＩ　Ｖ　−１抗体が結合するポ
リペプチドが同じ表面に固定されている場合は、（３）
と（７）の手段は同じである。ＨＩＶ−１抗体が結合す
るポリペプチドは化学合成により作成したものでもよい
。あるいはそれは組換えポリペプチドでもよい。

サンドイッチの両側に組換えポリペプチドを使用してい
る場合は、それらは異なる属の生物で発現したものでも
よい。１つの組換え、ポリペプチドを原核生物で発現し
、別の相換えポリペプチドは真核生物中で発現したもの
でもよい。適当な宿主の例は、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　）　、大賜菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　、スト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｇ＋ｙｃｅｓ）　、ｆｌ
、虫細胞、酵母及び哺乳動物細胞がある。ｌ−１１Ｖ−
１は特に２つの抗体をＭ導する。これらは、ｇａｇ蛋白
に対する抗−ｐ２４とｅｎｖ＠白に対する抗−ｃ＞ｐ４
１である。われわれは抗−ｐ２４と抗−０ｐ４１の両方
に結合する特異的融合構成体をＩＩ製した。従ってこの
蛋白はＨＩＶ−１抗体の結合するエピトープを有するポ
リペ１チドとして使用できる。その蛋白配列は以下の通
りである： ＡｓｎＸＩＡＧ１ｎＧ１ｙｃ１ｎＭ＊　ｅＶａｌＨｌｓ
ＧｌｎＡｌａ　１１＊ＳａｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＬａｕ
ＡｓｎＡＬａτｒｐＶａｌＬｙｇＶａｌＶ ｕＶｉ１１１＠Ｐｒｏ＋４＠ｔ、Ｐｈ＠５ｅｒＡＬａＬ
ａｕＳａｒＧ１ｕＧ１ｙＡ１ａＴｈｒＰｒｏＧ１ｎＡｓ
ｐＬａｕＡｓｎＴｈｔＭａｔＬａｕＡｓｎＴｈｒＶＪＬ
ＩＧ１ｙＧ１ｙＨ１ｓＧ１ｎＡｌａ０Ａｌａ＊ｔＧ１ｎ
Ｍａ　ｔＬａｕＬｙｓＧｌｕＴｈｒｌｌａＡｓｎＧｌｕ
ＧｌｕＡｌａＡｌａＧｌｕＴｒｐＡｓｐＡｒｇＶａｌＨ
ｌｓｌｌｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１２０ＰｒｏＶａｌＨ１ｓＡｌａＧ１ｙＰｒｏ工１　ｅ
ＡｌａＰｒｏＧｌｙＧＬｎＭｅ　ｔＡｒｇＧ１ｕＥ’ｒ
ｏＡｒｇＧ１ｙｓａ　ｒｋｓｐＸ　１ａＡｌａＧ１ｙＴ
ｈｒＴｈｒＳ＠ｒＴｈｒＬａｕＧｌｎＧ１ｕＧｉｎ　Ｉ
　１ａＧ　ＬｙＴｒｐＭｅ　ｅＴｈｒＡｓｎＡｓｎＰ　
ｒｏＰｒｏ　Ｉ　１ａＰｒｏＶａｌｃ１ｙＣ１ｕＩ　１
＊ＴｙｒＬｙｓＡｒｇＴｒｐＸｌｅＩｌａＬａｕＧｌｙ
ＬａｕＡｓｎＬｙｓ１１ｅＶａＬ＾ｒｇＭａｅＸ１ａＧ
１ｕＡｌａＧＬｎＧ１ｎＨ１ｉ　ＬａｕＬａｕＧｌｎＬ
ｅｕＴｈｒＶａｌＴｒｐＣｌｙＩ　１ａＬｙｓＧ１ｎＬ
ａｕＧ１ｎＡ１ａＴｙｒＳａｒＰｒｏＴｈｒ５ａｒ１１
ａＬａｕＡｓｐＸ１ａＡｒｇＧ１ｎＧｌｙＰｒｏＬｙｉ
に１ｕＰｒｏＰｈａＡｒｇＡｓｐＴｙｒＡｒｇ１１ｅＬ
ａｕＡ１ｍＶｉＬＧ１ｕＡｒｇＴｙｒＬａｕＬｙｓｋｓ
ｐＧ１ｎＧ　１ｎＬａｕＬａｕＧ　ｌｙ　Ｉ　１　ａＴ
ｒｐＧ１ｙＣｙｓＶａＩＡｓｐＡｒｇＰｈ＠ＴｙｒＬｙ
ｓＴｈｒＬａｕＡｒｇＡ１ａｃ１ｕＧ１ｎＡ１ａｓ＊ｒ
（ｉ１ｎＧｌｕＶａｌＬｙｓＡｓｎτｒｐＳ　ｅ　ｆＧ
ｌｙＬｙｓＬｅｕＸ　ｌａＣｙｓＴｈｒＴｈｒＡｌｍＶ
ａＬＰｒｏＴｒｐＡｓｎＡｌａＳ　ａ　ｒＴｒｐｓ　ｅ
　ｒＡｓ　ｎＬｙｓ　Ｓ　ａ　ｒＭ＠　ｔＴｈｔＣｌｕ
ＴｈｒＬａｕＬａｕＶａ　ＩＣ１ｎＡ５ｎＡ１ａＡ５ｎ
ＰｒＯＡＥｐＣｙ５　Ｌ７ｊｔｒｈｊＩ　１　ｅ　Ｌａ
ｕＬｙＥＡｌ　ａＬａｕＧ１ｕＧｌｎ１１ｅＴｒｐＡｓ
ｎＡｎｎＭａｅＴｈｒＴｒｐＭｅｅＧ１ｕＴｒｐＡｓｐ
ＡｒｇＣ１ｕ１１ｅＡｓｎＡｓｎＴｙｒＬａｕＧ１ｙＰ
ｒｏＡ１ａＡｌａ丁ｈｒＬａｕｃ１ｕＧｌｕＭａｅＭａ
仁ＴｈｒＡ１ａ（：ｙｓＧｌｎＧｌｙＶａＩＣｌｙＧｌ
ｙＰｒ。

ＴｈｒＳａｒＬａｕ１１ｅＨＬｓ　Ｓ　ａ　ｒＬａｕＩ
　１ａＧ１ｕＧ１ｕＳ　ａ　ｒＧｌｎＡｉｎＧ　１ｎＣ
１ｎＣ１ｕＬｙｓＡｓｎＧ　１ｕＧ　１ｎ２ｓＯ２６０ ＡｓｎＳａｒＰｒｏＡｒｇＧ１ｎＬａｕＬｅｕｓｅｒＧ
１ｙｌｌａＶｉｌＧ１ｎＣ１ｎＧ１ｎＡｓｎＡｓｒｄａ
ｕｌａｕＡｒｇＡ１ａｇｐ４１＞ Ｃ；１ｕＬａｕＬａｕＧ１ｕＬｅｕＡｓｐＬｙｓＴｒｐ
Ａ１ａｓａ　ｒＬａｕＴｒｐＡｇｎＴｒｐＰｈｅＡｓｎ
ＧｌｙＡｓｐＰｒｏ。

この蛋白は０Ｍ６２６と指定されている。その調製物は
ヨーＯツバ特許出願第 ８８３０８１７０．５号に記載されている。この蛋白の
修飾した配列が抗−ｐ２４及び抗−ｇｐ４１に結合可能
であり、修飾した蛋白と非修飾蛋白との間で少なくとも
７５％の相同性があれば、この蛋白の配列Ａｔ１つ以上
のアミノ酸で置換、挿入及び／又は欠失又は両端に伸長
させて、修飾することができる。

非修飾配列は基本的には、ＨＩＶ−１（ＷＯ８６１０４
４２３）のＣＢＬ−１単離株のｐ２４とｇｐ４１蛋白の
部分が融合したものである。ミューシングら（Ｈｅｕｓ
ｉｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）　、ネーチャー第３３３巻、４
５０−４５８頁（１９８５年）の番号系を使用すれば、
これらの部分はアミノ酸１２１から３５６と、５４２か
ら６７４にそれぞれ対応する。上記の７ミノＡ！２５か
ら１６はｐ１８蛋白由来である。アミノＦ１１から４．
２４１から２４３、そして３７７から３７９は、融合構
成体を得たベクターとＤＮＡ操作に由来Ｊる。

１つ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失により
、この配列を変えることができる。これらは配列のどこ
でもよいが、特にｐ２４と（ＪＤ４１からは誘導されな
い配列の部分がよい。置換の場合は非修１配列の１つ以
−りのアミノ酸が、配列の物理化学的性質（例えばｉ！
荷重密度親水性／疎水性、大きさ及び配置）を保持して
いる１つ以上のアミノ酸で置換することができる。例え
ばＳｅｒをＴｈｒで置換することができるし、その逆も
できるゆＧｌｕをＡＳＤｔ’ｌ換することができるし、
その逆もできる。アミノＩｔ！１０のＳｅｒをＡＳｎで
置換することもできる。

配列は両端に伸長することもできる。これはＣ−末端Ｃ
ｙＳ残基を１つ余分に結合させることと同じかもしれな
い。しかし片方又は両端に５０個までのアミノ酸残基を
伸長させることができる。

従って４０個までのアミノ酸、例えば２０個までのアミ
ノ酸は、非修飾配列のアミノ末端及び／又はカルボキシ
末端に加えることができる。しかし普通アミノ末端アミ
ノ酸は、蛋白の発現される核酸配列の翻訳開始コドンで
あるためＭｅｔであるこれは蛋白がアミノ末端で担体蛋
白に融合して発現されたり、融合蛋白が切断されて本発
明の蛋白を放出することがない場合のことである。

被修筒蛋白をコードするＤＮＡ配列の中に対応する変化
を加えることができる。これはエンドヌクレアーぜによ
る配列の切断、リンカ−の挿入、エンドヌクレアービ及
び／又はポリメラーゼの使用、部位指令変異原性法など
の適当な方法で実現できる。、修ｆｌｉｉＤＮＡ配列が
抗−ｐ２４と抗−Ｑρ４１の両方が結合できる修飾蛋白
をコードするか否かは容易に決定できる。修飾配列を適
当なプラスミツドにクローン化し、宿主細胞をプラスミ
ツドで形質転換させ発現される蛋白について抗−ｐ２４
と抗−０１）４１に結合するか否かを試験する。また修
飾蛋白と非修飾蛋白のアミノ酸配列には少なくとも７５
％、例えば８５％以上又は９０％以上の相同性がなけれ
ばならない。

式（Ｉ）のペプチドに特異的な抗体は、上記ペプチドを
用いて作成できる。抗体はポリクローナル抗体でもモノ
クローナル抗体でもよい。この抗体はペプチドのバッチ
の精度管理試験に使用できる二組換え蛋白、ペプチド又
はウィルス溶解液の精製；エピトープマツピング；標識
した場合は、抗体検出に対する競合定聞法での複合体と
して；そして抗原検出測定法に使用できる。

担体に結合させた式（Ｉ）のペプチドを畦乳動物や他の
動物（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ウサギ）に注射
し、こうして産生されたペプチドに対する抗体を回収す
ることにより、ポリクローナル抗体が作成できる。ペプ
チド−担体複合体は通常、生理学的に許容できる希釈剤
を含む注射製剤として投与される。フロイント完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）や７０イント不完全アジｌバント（
ＦｌΔ）などのアジュバントを製剤の中に含めることが
できる。動物は適当な１１１間免疫される。

抗−ペプチド活性の測定のため適当な間隔で動物の血を
とる。適当な濃度の活性が得られたら、動物を出血させ
る。塩沈澱や固定化合成ペプチドを用いるアフィニティ
クロマトグラフイーなどの方法で抗体を抽出し精製する
。モノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ、不滅
化ｍ胞を式（Ｉ）のペプチドに対する抗体を産生ずる細
胞と融合させて１０１する。代表的にはマウスのような
動物宿主をペプチドに対して免疫する。免疫した宿主か
らＭｌを取る。牌臓細砲を、例えばマウスのミエローマ
細胞株のような不滅化細胞株と融合させる。

こうしてペプチド持具的モノクローナル抗体を分泌する
ハイプリドーマを産生ずることができる。

抗体は前述した方法で精製する。

以下の例で本発明を説明する。

ツーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）　（ブＯシーデイングズ
オブナショナルアカデミーオプサイエンシーズ、ニーニ
スニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ）第８２巻、５１３１−５１３５頁、（１９
８５年）の記載するメリフィールド法（メリフィールド
（Ｈｅｒｒｉｒｉｅｌｄ）　、ジャー大ルオブアメリカ
ンケミカルササエティ（ＪＡＣ８）第８５巻、２１４９
−２１５４頁、１９６３年）の応用法を適用して、ペプ
チドを合成した。このペプチドはｐ−メチルベンズヒド
リルアミンジビニルベンゼン樹脂上で合成した。各アミ
ノ酸のα−アミノ保ｉ！基は１−ブトキシカルボニル（
Ｂｏｃ）であった。各結合サイクルは以下のようである
： １、ジクロロメタンで４！１ｍを洗浄−１０分間２、ジ
クロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミンで洗
浄−２分間×３ ３、ジクロロメタンで洗浄−１分間×２４、ジク［］［
］メタン中の、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸、０，
３Ｍジインプロピルカルボジイミド ５、３と同じ Ｓ．ジクロロメタン中５０％のトリフルオロ酢酸で保ｒ
！１基をはずす一２０分間 ７、ジクロロメタンで洗浄−１分間×６８、２にもどる
。

結合サイクルが終了したところで、アニソールスカベン
ジャー１０％を含むフッ化水素で１時間反応させペプチ
ドを樹脂から切断させた。こうしてカルボキシ−末端ア
ミド基を有するペプチドが得られた。次にエーテルで洗
浄し、乾燥し、１５％酢酸中に溶解し、凍結乾燥した。

した。

Ｎ−エチルマレイミドを、存在するメルカプト基の２倍
モル過剰量になるように加えた。保護反応は１時間行っ
た。次に修飾ペプチドは！！衝液液中ゲル濾過した。

各ペプチドは実施例１の方法に従いＩｗＪした。

従って各ペプチドはカルボキシ−末端アミド基を有する
。

実施例３：メルカプト基の保護 実施例１および実施例２で合成した各ペプチドのメルカ
プト基は以下のようにして保護した．、２５　ｓＨ　Ｉ
ＩＥＰＥＳ緩衝液、ｌｌＨ７．０中のペプチド溶液（１
００−５００μＭ）を２倍モル過剰量のジチオスレイト
ール（叩ち２００−１　０００μＭ）と３０分間反応さ
せて還元した。ペプチドＡＩＥにＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳ
詩ＧＣの場合は、システィン残基が１つのみしか存在し
ないため１倍モル過剰揄のジチオスレイトール（１００
−５００μＭ）を使用ペプチドを受動的にマイクロタイ
ターウェル中に被覆させた。血清試料を複合ペプチドと
一緒に、ｍ製したウェルに加えた。ペプチド複合体の酵
素はアルカリ性ホスファターゼである。約１時間のイン
キュベーションの後、ウェルを洗浄し、酵素の基質を加
えた。これはサイクリック増幅系を有するニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）で
ある。試料中の抗−Ｈ　Ｉ　Ｖ−２を、標準物質と比較
して確認した。モの結果を表１に示ず。

表　　１ 測定で陽性 測定で陰性 エル中の複合体の猷（即ち着色の強さ）は、試料中のＨ
Ｉ　Ｖに封する抗体の濃度に正比例していた。

その結果を表２．３そして４に示す。

表　　２ ペプチドをマイクロタイターウェル上に被覆させた。血
清試料を複合ペプチドと一緒に、ｖＡ製したウェルに加
えた。複合体はアルカリ性ホスファターゼで標識したも
のと同じ抗原の混合物である。

約１時間のインキュベーションの後ウェルを洗浄し、酵
素の基質を加えた。これは着色産物を生成するサイクリ
ック増幅系を有するニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドフォスフェート（ＮＡＤＰ）であル。インキュベー
ションの後酵素反応を停止させ、色を分光光学的に読ん
だ。ラセンター　試験した　陽 試料の数 合　　計 １７５′６ １−ユ ヨーロッパの臨・ エイズ、°エイズ関連症状、高危険性グループ及び伯の
疾患の患者の血清の反応性 エイズ　　　１１７　　　　１１７　　　　　１１７西
アフリカの検体 ３８６例の西アフリカの検体を試験して、ウェルコブイ
ム（Ｗｅｌｌｃｏｚｙｍｅ）ト１１Ｖ−１とＦ−ＮＶ−
２抗体の反応性を評価した。）ＩＩＶ−２抗体の免疫測
定法で陽性と分類されたすべての試料は、ＨＩＶ−１と
ＨＩＶ−２試験で検出された。

表　　４ 高危険性ｂ３０４　　　　２１９　　　　　２１９その
他　　　１り　　　　　　１３　　　　　　１３ａウエ
スタンプロツト及び／又は少なくとも２種類の他の免疫
測定法により確認 す危険グループと確認された患者 ＣエイズＩａｌ達症状（例えば持続性全身性リンパ腺ｌ
り患者 ｄ：急性ウィルス疾患、自己免疫疾患及び新生物疾患を
含む ２つの試料で結果が一致しなかった。１つは抗ＨＩ　Ｖ
　−１と抗１１１　Ｖ　−２の別の試験で陰性であり、
ＩＩＶ−１ウエスタンプロツトでｐ２４のみが証明され
、ＨＩＶ−２ウエスタンプロツトでは結果は得られなか
った。もう１つの試料は抗−ＨＩＶ、ｉｔ験で陰性であ
り、抗−ＨＩＶ−２試験では中間の値であり、１−１１
Ｖ−１と）ＩＩＶ−２ウェスタンプロットでは判定不能
であった。

ｂ　すべでの試料は抗−）−１１Ｖ−２免８２測定法で
陽性であった。これらの試料についてｌ−１１Ｖ−２ウ
エスタンプロツトを実施し、２６検体は明らかに陽性で
あり、３検体は判定不能であった。

手続補正書（自発） 平成２年１１７２日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（１）： Ｘ−ＮＳＷＧＣ−Ｙ（１） ［式中、（ｉ）ＸがＫＹＬＱＤＱＡＲＬでＹがＡＦＲＱ
   ＶＣ；ＸがＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬでＹがヒドロキシ
   ；またはＸがＫでＹがＡＦＲＱＶＣＨＴＴＶＰＷＶＮで
   あり（ｉｉ）末端のカルボキシ基が任意にアミド型であ
   り；そして （ｉｉｉ）それぞれのＣのスルフヒドリル基がフリーま
   たはブロックされている］ で表わされるペプチド。
2. （２）末端のカルボキシ基がアミド型である請求項１の
   ペプチド。
3. （３）それぞれのＣのスルフヒドリル基がブロッキング
   試薬を用いてブロックされている請求項１又は２のペプ
   チド。
4. （４）ブロッキング基がアセトアミドメチル又はジチオ
   ピリジル、あるいはエルマン試薬である有機水銀もしく
   はマレイミド化合物から得られるものである請求項３の
   ペプチド。
5. （５）ブロッキング試薬がＮ−エチルマレイミドから得
   られるものである請求項３のペプチド。
6. （６）下記のアミノ酸配列： ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣを有する請
   求項１のペプチド。
7. （７）下記のアミノ酸配列： ＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣを有し、末
   端のカルボキシ基がアミド型でありそれぞれのＣのスル
   フヒドリル基がブロックされている請求項１のペプチド
   。
8. （８）請求項１−７のいずれかのペプチドを調製する方
   法であって、 （ａ）単一アミノ酸及び／又は２つもしくはそれ以上の
   アミノ酸であらかじめ形成されたペプチドを必要な順序
   で縮合し、ここでアミノ酸がシステインの場合にはその
   スルフヒドリル基はフリーまたはブロックされている；
   次いで （ｂ）必要により末端のカルボキシ基をアミド型に変換
   し、そして必要によりシステイン残基あるいはそれぞれ
   のシステイン残基のフリーのスルフヒドリル基をブロッ
   クする； ことを含む上記方法。
9. （９）請求項１−７のいずれかのペプチドを調製する方
   法であって、 （ｉ）請求項１−７のいずれかのペプチドをコードする
   遺伝子を有し且つ宿主細胞中にて該ペプチドを発現する
   ことのできるベクターで宿主細胞を形質転換し； （ｉｉ）得られる形質転換宿主細胞を培養してペプチド
   を発現せしめ；次いで （ｉｉｉ）該ペプチドを回収する； ことを含む上記方法。
10. （１０）生体液中のＨＩＶ−２抗体の存在を測定する方
    法であって、 （ａ）請求項１−７のいずれかのペプチドが固定化され
    た固相とテストサンプルとを接触すること；及び （ｂ）テストサンプルがいずれかの抗体を含んでいるか
    否かを測定するための手段； を含む上記方法。
11. （１１）生体液中のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２抗体の
    存在を測定する方法であって、 （ａ）請求項１−７のいずれかのペプチドが固定化され
    た固相と、ＨＩＶ−１抗体が結合するエピトープを有す
    るポリペプチドとを、テストサンプルと接触せしめるこ
    と；及び （ｂ）テストサンプルがいずれかの抗体を含有している
    か否かを測定する手段； を含む上記方法。
12. （１２）該手段がラベル化分子もしくは粒子を用いるこ
    とによるものである請求項１０又は１１の方法。
13. （１３）ラベル化分子もしくは粒子が、アルカリホスフ
    ァターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、抗スピーシイ
    ズもしくは抗イムノグロブリンサブタイプ、リウマトイ
    ド因子、ペプチドに対する抗体、あるいは該ペプチドを
    構成するエピトープを含む分子である請求項１２の方法
    。
14. （１４）ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の検出のためのラベ
    ル化分子もしくは粒子が同じまたは相違する請求項１３
    の方法。
15. （１５）ＨＩＶ−２抗体の存在を測定するのに用いるテ
    ストキットであって、 （ａ）酵素でラベル化された請求項１−７のいずれかの
    ペプチド； （ｂ）該酵素の基質； （ｃ）請求項１−７のいずれかのペプチドが固定化され
    る表面を提供するための手段；及び、（ｄ）任意の洗浄
    溶液及び／又はバッファー；を含む上記テストキット。
16. （１６）ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のコンバインドアッセ
    イに用いるテストキットであつて、 （ａ）酵素でラベル化された請求項１−７のいずれかの
    ペプチド； （ｂ）ＨＩＶ−１抗体が結合するエピトープを有し酵素
    でラベル化されたポリペプチド； （ｃ）上記両者の酵素の基質； （ｄ）請求項１−７のいずれかのペプチドが固定化され
    る表面を提供する手段と、ＨＩＶ−１抗体が結合するエ
    ピトープを有するポリペプチド；及び （ｅ）任意の洗浄溶液及び／又はバッファー；を含む上
    記テストキット。
17. （１７）ＨＩＶ−１ペプチドがアミノ酸１２１−３５６
    を含むＨＩＶ−１のｇａｇ配列であり、ｅｎｖ配列がア
    ミノ酸５４２−６７４を含むＨＩＶ−１のｅｎｖ配列で
    ある請求項１６のテストキット。