HUT55835A - Process for producing peptides binding to hiv-2 virus-specific antibodies, for diagnosting hiv-2 and in a given case hiv-1, and diagnostical kit for them - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás olyan peptidek előállítására, amelyek a 2-es tipusu humán immunhiány vírusra (HIV-2-re) specifikus antitestekhez képesek kötődni, eljárás a HIV-2 és adott esetben HIV-1 diagnosztizálására és az erre használható diagnosztikai készlet.

A HIV-2 felfedezése után szükségessé vált e vírus jelenlétének kimutatása. Az általunk előállított peptidekhez képesek a HIV-2-re specifikus antitestek kötődni, ezáltal kimutatható az ilyen antitestek, és ennek következtében a detektálandó vírus jelenléte. A fenti peptideket ezért az antitestek, vagy maga a HIV-2 vizsgálatára használhatjuk, valamint alkalmasak az antitest-szint növelésére is.

A találmány szerinti eljárás közelebbről az (I) általános képletü peptidek - a képletben

(i)	X	jelentése	KYLQBQARL és
	Y	jelentése	AFRQVC, vaSY
	X	jelentése	AIEKY1QDQARL és
	Y	jelentése	hidroxilcsoport, vagy
	X	jelentése	K és
	Y	jelentése	AFRQVCHITVPWVN;
(ii)	a	terminális '	karboxilcsoport adott esetben amidálva van;

és (iii) a C-ekben lévő merkaptocsoportok szabad formában vannak, vagy védettek.

Az aminosavmaradékokat az egybe tűs kóddal jelöljük /Éur. J. Biochem. 138, 9 - 37, (1984^7· A terminális karboxilcsoport előnyösen amid - azaz -CONH₂ - formában van, karboxil - azaz ,-COOH - forma helyett. Az oldalláncban lévő merkaptocsoport(ok) • · · « * · · « · · · · · · ···· · · · ·· · ·

- 3 előnyösen védettek. Ezzel megakadályozható a diszulfid-hidak kialakulása, megelőzhető a cisztein-maradékok oxidációja és megakadályozható a pepdidek hordozókhoz való nemkívánatos kötődése.

A merkapto-védőcsoport acetamido-metil-csoport lehet, vagy egy szerves higanyvegyületből, maleimidbői vagy diszulfid blokkolószerből származtatható. Diszulfid blokkolószerre példaként az Ellman-reagenst, ditio-dipiridilt említhetjük. A védőcsoport előnyösen N-etil-maleimidbői származó (a) képletü csoport, vagy (b) képletü acetamido-metil-csoport.

Az (i) általános képletü peptidek szintetikus peptidek. Ezeket kémiai szintézissel állíthatjuk elő. Szilárd fázisú vagy oldatban végbemenő peptidszintézist alkalmazhatunk. A peptidet igy az alábbi eljárással állíthatjuk elő:, (a) az egyes aminosavakat és/vagy két vagy több aminosavból álló aminosav-fragmentumokat az (i) általános képletnek megfelelő sorrendben kondenzáljuk, mimellett ha az aminósav cisztein, a merkaptocsoport szabad formában van, vagy blokkolt; ily módon egy (i) általános képletü vegyületet kapunk, amelynek terminális karboxilcsoportja szabad, vagy amid formában van; és (b) kívánt esetben a cisztein-maradék(ok) szabad merkaptocsoportját blokkoljuk.

Szilárd fázisú peptidszintézis esetén a kívánt peptid aminosav-szekvenciáját a C-terminális aminosavtól kezdve építjük fel, amelyet oldhatatlan gyantához kötünk. A kívánt peptid-szekvencia kialakítása után a peptidet a gyantáról lehasitjuk.

Ha a peptid-szintézist oldatban hajtjuk végre, a peptidet ismét a C-terminális aminosavból kiindulva építhetjük fel. A

- 4 fenti aminősav karboxilcsoportja a szintézis során végig blokkolt megfelelő védőcsoporttal, amelyet a szintézis végén eltávolítunk.

Bármelyik - szilárd fázisú vagy oldat-fázisú - eljárás esetén a reakció-rendszerbe beadagolt összes aminősav rendszerint védett «Χ-amino-c söpört tál és aktivált karboxilcsoporttal rendelkezik. Az aminocsoportot fluoren-9-il-metoxi-karbonil-csoporttal (Emoc) vagy terc-butoxi-karbonil-csoporttal (Boc) vedhetjük. A karboxilcsoportot pentafluor-fenil- vagy l-oxo-2-hidroxi-dihidro-benzotriazin-észter formájában aktiválhatjuk. Az egyes kondenzációs lépéseket diciklohexil-karbodiimid vagy 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében hajthatjuk végre.

Az oldalláncokban lévő funkciós csoportokat rendszerint szintén védjük, például a lizin oldalláncban lévő aminocsoportját, vagy a treonin oldalláncban lévő hidroxilcsoportját, vagy a cisztein cldalláncban lévő merkaptocsoportját.

Az o<-amino-vádőcsoportot minden egyes szintézis-lépés után eltávolítjuk. Az oldallánc-védőcsoportokat azonban rendszerint csak a szintézis befejezése után távolitjuk el, vagy kívánt esetben nem távolitjuk el azokat. Védettmerkaptocsoport esetén viszont kívánt esetben a védőcsoportot nem távolitjuk el, ha azzal blokkolni kívánjuk a merkaptocsopcrtot. Ha más blokkoló csoportot kívánunk bevinni a pepiidbe, vagy a peptidet szabad merkaptocsoporto(ka)t tartalmazó formában kívánjuk előállítani, a védőcsoportot eltávolítjuk.

A peptideket tetszés szerint C-terminális karboxilcsporttal vagy amid csoporttal állíthatjuk elő. Szilárd fázisú peptid-szintézis esetén ez attól függ, hogy a C-terminális aminősav • · *

- 5 hogyan kötődik a hordozó gyantához és/vagy a kész peptidet hogyan hasítjuk le a gyantáról. A gyanta általában egy sztirol és/vagy divinil-benzol polimer. A C-terminális aminosav a gyantához észter-kötéssel kapcsolódhat, amelyet erős savval, például trifluor-ecetsavban hidrogén-bromiddal, vagy hidrogén-fluoriddal hasíthatunk C-terminális karboxilcsoportót tartalmazó pepiiddé. Ammonolizissel megfelelő amidot állíthatunk elő szabad karboxilc söpör tót tartalamzó peptid helyett.

A peptid-amid szilárd fázisú szintézissel való előállításának másik módja az, hogy a peptid C-terminális aminosavját peptid amino-benzhidril-kötéssel kapcsoljuk a gyantához. Ezt úgy alakítjuk ki, hogy diciklohexil-karbodiimiddel végezzük a kapcsolást, és a kötést hidrogén-fluoriddal hasíthatjuk, rendszerint hidegen. Oldat-fázisú szintézis esetén attól függ, hogy C-terminális karboxil- vagy amid csoportot kapunk, hogy a C-terminális aminosav karboxilcsoportját hogyan blokkoljuk, és a szintézis befejezése után hogyan távolitjuk el a védőcsoportot.

A C-terminális karboxilcsoportót tartalmazó pepdidet C-terminális amid csoportot tartalmazó pepiiddé alakíthatjuk, és f ord i tva.

A peptideket rekombináns DNS-e1járásokkal is előállíthatjuk. így a peptidet kódoló DNS-szekvenciát állítjuk elő. Készítünk egy expressziós vektort, amely a DNS-szekvenciát magában foglalja, és amely képes megfelelő gazdasejtben a peptid kifejezésére .

A DNS-szekvencia a vektorban transzlációs start és stop jelek között helyezkedik el. Megfelelő transzkripciós szabályozó elemeket is alkalmazunk, különösen promotert a DNS-szek- 6 venciára, és egy transzkripciós terminációs helyet.

A DNS-szekvencia a helyes transzkripciós keretben van, igy a peptid kifejeződhet a vektorral összeférhető gazdaszerveze tbe n.

Bármely megfelelő gazda-vektor rendszert alkalmazhatunk. A vektor például plazmid lehet. Ebben az esetben bakteriális vagy élesztő gazdaszervezetet használhatunk. A vektor virális vektor is lehet. Ezt emlős sejtvonal sejtjeinek fertőzésére használhatjuk, a peptid kifejezésére.

A blokkolt merkaptocsoportokát tartalmazó peptideket kétféle módon állíthatjuk elő. Egyik módszer szerint védetu merkaptocsopor tokát tartalmazó cisztein-molekulákat használhatunk az (a) lépésben, amikor a peptidet az aminosav-prekurzorokból felépítjük. Másik módszer szerint szabad merkaptocsoporto(ka)t tartalmazó (I) általános képletü peptidet állítunk elő, amelyeket ezután blokkolunk. A merkaptocsoportot blokkoló szert vagy a szabad ciszteinnel, vagy az ( I) általános képletü pepiiddel reagáltatjuk, a módszertől függően.

Bármely megfelelő, merkaptocsoportot blokkoló szert alkalmazhatunk. Példaként az acetamido-metanolt és a szerves higany, malei-nid és diszulfid blokkolószereket említhetjük, Megfelelő diszulfid blokkolószer például az Ellman-reagens és a ditio-piridil. Előnyösen N-etil-maleimidet vagy acetamido-metanolt használunk.

Ha az (I) általános képletü peptidet szabad merkaptocsoporto(ka)t tartalmazó formában kapjuk, amelye(ke)t azután blokkolni kívánunk, a peptidet először redukáljuk. Rendszerint erős redukálószert, igy ditionitot, 2-merkapto-etanolt, ditio• · · · · · · *··· · ·· ·· ♦ ·

- 7 -treitolt vagy ditio-eriűritolt használunk. Előnyös a ditio-treitol használata. Ha a redukálószert csak kis feleslegben használjuk, a redukált peptidet nem szükséges szeparálni a merkaptocsoportot blokkoló szer hozzáadása előtt.

Rendszerint úgy járunk el, hogy a peptid 100 - 500 yumól/1 koncentrációjú oldatát pufferben (/*/ pH 7) közelítőleg kétszeres moláris feleslegben lévő redukálószerrel, például ditio-treitollal (azaz 200 - 1000 /umól/1 redukálószerrel) redukáljuk, legalább 20 percen keresztül, rendszerint 50 percen át. Ezután hozzáadjuk a blokkolószert, például N-etil-maleimidet, közelítőleg kétszeres moláris feleslegben az összes jelenlévő merkaptocsoportra számolva. A blokkolószert legalább 1 órán keresztül reagáltatjuk. A módosított pepxidet ezután megfelelő pufferoldattal gélszürhetjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a módosított peptidet továbbreagáltatjuk a kapcsolószerrel, például S-acetil-bioglikolsav N-hidroxi-szukcinimid-észteréve 1 (SATA) vagy 4-(N-maleimido-metil)-oiklohexán-l-karboxiláttal (SMCC) a gélszürés előtt.

Az (i) általános képletü peptidet HIV-2-re specifikus antitestek vizsgálatára használhatjuk. A vizsgálatot bármely arra alkalmas biológiai folyadékban - például vizeletben, plazmában, vérben, szérumban, ondóban, könnyben, nyálban vagy agy-gerincvelő-folyadékban - elvégezhetjük. A vizsgálati eljárás abból áll, hogy a vizsgálandó mintához hozzáadjuk a peptidet, és meghatározzuk, hogy kötődik-e antitest a peptidhez. Erre a célra készíthetünk egy teszt-készletet, amely egy (i) általános képletü vegyületet és olyan eszközöket tartalmaz, amelyek alkalmasak annak meghatározására, hogy a mintában esetleg jelenlévő, HIV-2• · · • 4 · · · · « • · · · · ·· ·· 4·

-8specifikus antitest kötődik-e a peptidhez.

Számos vizsgálati forma alkalmazható. A peptidet használhatjuk a HIV-2-re szelektív antitest oldatból való megkötésére, a már megkötött antitest jelölésére, vagy mind megkötésre, mind jelölésre. Ezenkívül a peptidet számos homogén vizsgálati formában is alkalmazhatjuk, amikor a peptiddel reagáló antitestet oldatban detektáljuk, a fázisok szétválasztása nélkül. A peptidet HIV-2 antigén detektálására is használhatjuk.

Az olyan vizsgálatban, amikor a peptidet az antitestek oldatból való megkötésére használjuk, a peptidet egy szilárd felületen immobilizáljuk. Ez a felület valamilyen módon mosható kell, hogy legyen. Az alkalmazható felületek például különféle tipusu polimerek (mikrotitrátor lemezzé préseltek; gyöngyök; különféle tipusu mérőpálcák; felszívó hegyek; elektródok és optikai eszközök), részecskék (például latex; stabilizált vár-, bakteriális vagy gombasejtek; spórák; arany vagy egyéb fém-szolok; és protein jellegű kolloidok; a részecskék átlagos mérete 0,1 - 5 mikron lehet), membránok (például nitro-cellulóz; papír; cellulóz-acetát; és nagyporczitásu vagy nagyfelületű, szerves 'vagy szervetlen anyagokból készült membránok) lehetnek.

A peptid felülethez való kötése történhet optimális összetételű oldatból való passzív adszorpcióval (az oldat felületaktív szereket, oldószereket, sókat, szuszpendálószereket tartalmazhat) vagy aktív kémiai kötéssel. Az aktív kötést különféle reakcióképes vagy aktiválható funkciós csoportokon keresztül alakíthatjuk ki, amelyeket a felülethez kapcsolhatunk (ilyenek például a kondenzálószerek} aktív észterek, halogenidek, anhidridek; amino-, hidroxil- vagy karbcxilcsoportok; merkaptocso• * · · · · · • « · · «·· • · · · · · · ···· · ·· ♦·

- 9 portok; karbonilcsoportok; diazocsöpörtek; telítetlen csoportok).

Az aktív kötést proteinen keresztül is kialakíthatjuk (oagát a proteint kapcsoljuk a felülethez passzívan vagy aktív kötéssel) vagy hordozó proteinen - például albuminon vagy kazeinen - keresztül, amelyhez a peptidet különféle eljárásokkal kémiailag köthetjük, és amely előnyöket biztosíthat izoelektromos pontja, töltése, hidrofil jellege vagy egyéb fizikai-kémiai tulajdonságai következtében. A peptidet is köthetjük a felülethez (rendszerint, de nem szükségszerűen membránhoz) a reakcióé légy, például immun-precipitációs elegy elektrofőretikus szétválasztása után.

A peptidet hordozó felületejt a vizsgálandó mintával val érintkeztetve (reagáltatva), majd a vizsgálandó minta feleslegét valamely arra alkalmas módszerrel (mosással, centrifugálással, szűréssel, mágnesességgel, kapilláris hatással) eltávolitva a megkötött antitestet valamilyen detektálható jelet szolgáltató módszerrel meghatározzuk. Például egy fent megadott jelzett molekulát vagy részecskét használunk, amely reagál a megkötött antitesttel (például protein A^-t vagy protein G-t vagy hasonló molekulát; anti-speciest vagy anti-immunglobulin altípust; reumatoid faktort; a peptidhez kompetitiv módon vagy irreverzibilisen kötődő antitestet; vagy bármely olyan molekulát, amely a peptidet felépítő részt vagy magát a peptidet tartalmazza; vagy a HIV-2-ből közvetlen vagy közvetett módon származó más proteineket és peptideket).

A detektálható jel optikai, radioaktív vagy fizikai-kémiai jellegű lehet, amelyet úgy nyerünk, hogy a kívánt molekulát közvetlenül például egy festékkel, radioaktivan, elektro • · • · · ·

- 10 aktívan, mágneses rezonanciásan vagy fluoreszcenciásan; vagy közvetve jelezzük, például úgy, hogy a molekulát vagy részecs-két egy enzimmel jelezzük, amely képes valamely mérhető változást okozni. A detektálható jel például agglutináció, diffrakciós hatás vagy kétszeres fénytörés következménye is lehet, amely, akkor lép fel, ha az említett felület részecske formában van.

Az olyan tipusu vizsgálatokban, amikor a peptidet arra használjuk, hogy azzal egy már megkötött antitestet jelezzünk, a peptidet valamilyen módon jelezni kell, amelynek segítségével azután detektálni tudjuk. A jelzés közvetlen lehet, amikor a pepiidhez kémiailag vagy passzívan például rádió-, mágneses rezonancia-, részecske- vagy enzim-jelzőt kötünk; vagy közvetett, amikor egy olyan molekulát jelzünk valamilyen formában, amely maga képes reagálni a peptiddel, ilyen molekula például a pepiiddel szembeni antitest, és a jelzett molekula ezt követően a peptiddel reagál.

A jelzésnek a peptidhez való kötése kémiailag közvetlen lehet olyan csoporton keresztül, amely eredetileg is jelen van a pepiidben, ilyen például egy aminocsoport; vagy egy, a pepiidbe utólagosan bevitt csoporton, például maleimidcsoporton keresztül. Az antitestek megkötése lejátszódhat valamely fent említett felületen, bármilyen módon, például passzív vagy aktivált adszorpcióval, amelynek eredményeként specifikus antitest vagy kötött immun-komplexek keletkeznek. Az antitest megkötése közelebbről anti-speciesek vagy anti-immunglobulin-altipusok, reumatoid faktorok, protein A, G és hasonlók által; vagy bármely, a peptid antigén-szakaszát tartalmazó molekula által történhet.

Az olyan tipusu vizsgálatokban, amikor a peptidet a min- • · ♦ « ♦ 9· • · · ··· 9 • · · · · · · • · · 9 * ·« ··9·

- 11 tában lévő HIV-2 antitest mérésére használjuk, a peptidet valamely fent ismertetett módon jelezhetjük, és vagy kompetitiv módon való kötésre használjuk, amikoris a pepiidnek a fent ismertetett felületen lévő specifikus molekulákhoz való kötődését gátolja a mintában lévő antigén; vagy nem-kompetitiv módon való kötésre, amikoris a mintában lévő antigént kötjük specifikusan vagy nem-specifikusan egy fenti felülethez, ami/, viszont egy specifikus két vagy több vegyértékű molekulához - például antitesthez kötődik, és a molekula fennmaradó vegyértékét használjuk fel a jelzett peptid megkötésére.

Homogén vizsgálati módszer alkalmazása esetén általában a peptidet és az antitestet jelezzük, úgy, hogy amikor az antitest a peptiddel szabad oldatban reagál, a két jelzés kölcsönhatása következtében például az egyik jelzéssel kapcsolódó energia a másik jelzésre nem-sugárzásos módon áttevődik, és a gerjesztett második jel vagy kioltott első jel megfelelően mérhető (például fluorimetriásan, mágneses rezonanciásan vagy enzimatikusan). Antigén vagy antitest hozzáadása a mintában a jelzett párok közötti kölcsönhatást gyengíti, igy a detektálás során eltérő nagyságú jelet kapunk.

A HlV-2 antitest detektálására alkalmas módszer a közvetlen szendvics enzim immunvizsgálati módszer (EIA). Égy (i) általános képletü peptiddel bevonjuk.a mikrotitrátor lemez bemélyedéseit. Ezzel egyidejűleg hozzáadjuk a vizsgálandó mintát és egy, valamely enzimmel kapcsolt (i) általános képletü peptidet (konjugált peptidet).

A specifikus antitestek mind a mélyedést bevonó pepiidhez, mind a konjugált peptidhez kötődnek. Rendszerint ugyan* · t «·**<·*· • · · « ··· • · · · « « · •··· · ·« ·· «·

- 12 azt az (I) általános képletü peptidet alkalmazzuk a szendvics mindkét oldalán. Mosás után a megkötött enzimet színváltozást okozó specifikus szubsztráttal detektáljuk. A fenti EIA kivitelezésére alkalmas készlet összetétele az alábbi:

(1) egy enzimmel jelzett (i) általános képletü vegyület;

(2) az enzim egy szubsztrátja;

(3) olyan eszköz, amely megfelelő felülettel rendelkezik az (i) általános képletü peptid immobilizálására; és (4) kívánt esetben mosóoldatok és/vagy pufferek.

Az (i) általános képletü peptideket kombinált vizsgálatokban is használhatjuk mind HIV-l-re, mind HIV-2-re specifikus antitestek kimutatására. Ebben a vizsgálatban a vizsgálandó mintát egy (I) általános képletü peptiddel és egy olyan polipeptiddel hozzuk érintkezésbe, amely a HIV-l-re specifikus antitestet megkötő antigén-részletet tartalmazza és meghatározzuk, hogy kötődik-e antitest az (i) általános képletü pepiidhez és/vagy ahhoz a polipé ptid hez , amelyben a HÍV- 1-an ti testet megkötő antigén-molekularész j&en van. Bármely fent említett vizsgálati módszert alkalmazhatjuk erre a célra, megfelelő módosításokkal.

A HIV-l-re és HIV-2-re specifikus antitestek kimutatására alkalmas kombinált vizsgálatra megfelelő készlet tartalmaz egy (I) általános képletü peptidet, egy olyan polipeptidet, amely egy, a HIV-1 antitesteket megkötő antigén-molekularészt tartalma^ és olyan eszközöket, amelyekkel kimutatható, hogy a vizsgálati mintában esetleg jelenlévő HIV-1 vagy HIV-2 elleni antitestek kötődtek-e a fenti polipéptidhez vagy (i) általános kepletü peptid hez.

A fent említett EIA módszer alkalmas a kombinált vizs··« • · « » · ·· ·· ··

- 13 gálatra is. A HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt tartalmazó polipeptiddel vonjuk be a mikrotitrátor lemez bemélyedéseit.

A fenti polipeptidet, például egy enzimmel jelzett azonos polipeptidet a vizsgálandó mintával és az (I) általános képletü konjugált peptiddel együtt hozzáadjuk. A polipeptiden lévő enzim-jelzés az (i) általános képletü peptiden levővel azonos, vagy attól eltérő lehet. így a fenti (1) - (4) komponenseken kívül az ilyen EIA vizsgálatra alkalmas készletek az alábbi komponenseket tartalmazzák:

(5) ^egy, ^a HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt képviselő polipeptidet, amely egy enzimmel van jelezve;

(6) abban az esetben, ha az enzim az (i) általános képletü peptid jelzésére használt enzimtől eltérő, egy szubsztrátot az enzim számára; és (7) a HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt képviselő polipeptíd immobilizálására alkalmas felületet biztositó eszközökét.

Ha az (i) általános képletü peptidet és a HIV-1 antitestet megkötő polipeptidet ugyanazon felületen immobilizáljuk, a (3) és (7) pontban megadott eszközök azonosak.

A HIV-1 antitestet megkötő polipeptidet kémiai utón is előállíthatjuk. A fenti polipeptíd- azonban rekombináns polipeptid is lehet.

Ha a szendvics mindkét oldalán rekombináns polipeptidek vannak, azok eltérő fajokba tartozó organizmusokban kifejeződött polipeptidek. Az egyik rekombináns polipeptíd például egy prokariota szervezetben, míg a másik egy eukariota szervezet-

ben fejeződhet ki. Megfelelő gazdaszervezetként emlithetük a B. subtilist, E. colit, Streptomyceseket, ízeltlábúak sejtjeit, élesztőse j teke t és emlős sejteket. A HIV-1 különösen kétféle tipusu antitestet provokál. Ezek a gag protein elleni anti-p24 és az env protein elleni anti-gp41. Előállítottunk egy olyan speciális fúziós peptidet, amelyhez mind az anti-p24, mind az anti-gp41 kötődik. Ez a protein ezért a HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt képviselő polipéptidként használható. A fenti protein szekvenciája az alábbi:

MetAsnSerProAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsnTyrProIleValGln pl8>

p24>

AsnlleGlnGlyGlnMetValHisGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal

LysValValGluGluLysAlaPheSerProGluValIleProMetPheSerAlaLeuSer

GluGlyAlaThrProGlnAspLeuAsnThrMetLeuAsnThrValGlyGlyHisGlnAla

100

AlaMetGlnMetLeuLysGluThrlleAsnGluGluAlaAlaGluTrpAspArgValHis

110

120

ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAspIle

130

140

AlaGlyThrThrSerThrLeuGlnGluGlnlleGlyTrpMetThrAsnAsnProProIle

150

160

ProValGlyGluIleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet •••ι

- 15 170180

TyrSerProThrSerlleLeuAspIleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr

190200

ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp

210220

MetThrGluThrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspCysLysThrlleLeuLysAla

230240

LeuGlyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaCysGlnGlyValGlyGlyPro

250260

AsnSerProArgGlnLeuLeuSerGlylleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41>

270280

IleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla

290300

ArglleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCys

310320

SerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer

330340

LeuGluGlnlleTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr

350360

ThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln

370

GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnGlyAspPro.

A fenti proteint DM626 jelzéssel láttuk el. Előállítását 8830170.5 számú európai szabadalmi bejelentésünkben ismertettük. A protein szekvenciája egy vagy több aminosav helyettesítésével, inzerciójával és/vagy deléciójával és/vagy egyik vagy mindkét vég meghosszabitásával módosítható, feltéve, hogy az ilyen módosított szekvenciáju protein képes megkötni az anti-p24-et és az anti-gp41-et, és legalább 75 % homológia van a módosított és módosítatlan szekvencia között.

A módosítatlan szekvencia alapvetően a HIV-l-ből izolált CBL-1 p24 és gp41 protein részeinek fuzionálásából származik (WO 86/04423). Ezek a részek a 121 - 356. és 542 - 674. aminosavaknak felelnek meg, Meusing és munkatársai számozási rendszere szerint /Natúré 313, 450 - 458 (1985)/. A fenti részek kezdete a fenti aminosavszekvencia 17. és 244. aminosavjánál van. Az 5 - 16. aminosavak a pl8 proteinből származnak. Az 1-4·, 241 - 243.és 377 - 379. aminosavak abból az expressziós vektorból származnak, amelyből a fúziós proteint kaptuk, illetve a DNS-manipuláclókból.

A szekvencia egy vagy több aminosav helyettesítésével, inzerciójával és/vagy deléciójával módosítható. Ezek a módosítások a szekvenciában bárhol előfordulhatnak, de különösen a szekvencia azon részeiben, amelyek nem a p24 és gp41 proteinből származnak. Szubsztitúció esetén a módosítatlan szekvencia egy vagy több aminosavját egy vagy több olyan amínosavval helyettesítjük, amelyek megőrzik a szekvencia fizikai-kémiai tulajdonságait, például nem változik a töltés-sürüség, hidrof il/hidr of ob jelleg, méret és konfiguráció. így például a Ser-t Thr-nal helyettesíthetjük, és megfordítva; a Glu-at Asp-val, és megfordítva; mig a

- 17 Gln-t Asn-nal, és megfordítva. A 10. aminosavat képviselő Ser-t Asn-nal helyettesíthetjük.

A szekvenciát egyik vagy mindkét végén meg is nyújthatjuk. Ez adott esetben legfeljebb egy további karboxil-terminális Cys-maradék hozzáadását jelenti. Az aminosav-szekvenciát azonban 50 aminosav-maradék hozzáadásával is meghosszabithatjuk, egyik vagy mindkét végén. A módosítatlan szekvenciához igy legfeljebb 40 aminosavat, például 20 aminosavat adhatunk az atnino-terminális és/vagy karboxil-terminális végen. Az amino-terminális aminosav azonban rendszerint Met, a proteint kifejező nukleinsav-szekvencia transzlációs start-kod ónja következtében.

Ez a helyzet, hacsak a protein nem úgy fejeződik ki, hogy amino-terminálisán egy hordozó-proteinnel van fuzionálva, és a fúziós proteint hasítva kapjuk a találmány szerinti proteint.

A szekvenciát úgy módosíthatjuk, hogy a módosítatlan proteint kódoló DNS-szekvenciában végrehajtjuk a megfelelő változtatásokat. Ezt bármely arra alkalmas módszerrel végrehajthatjuk, például a szekvenciát egy endonukleázzal megrövidítjük, beillesztünk. egy kötő-szekvenciát, exonukleázokat és/vagy polimerázokat és hely-irányitott mutagenezis technikát alkalmazunk. Azt, hogy a módosított DNS-szekvencia olyan módosított proteint kódol-e, amelyhez mind az anti-p24, mind az anti-gp-41 képes kötődni, egyszerűen megállapíthatjuk. A módosított szekvenciát egy megfelelő plazmidba klónozzuk, a plazmiddal egy gazdasejtet transzformálunk, és a kifejeződött proteint megvizsgáljuk, hogy képes-e kötődni az anti-p24-gyel és az anti-gp41-gye1. Tehát lég alább 75 %, például 85 %, vagy több, vagy 90 % vagy több kell, • · · hogy legyen a homológia mértéke a módosított és módosítatlan proteinek aminosav-szekveneiájóban.

Az (i) általános képletü pepiidre specifikus antitestek termelődését egy fenti peptid alkalmazásával válthatjuk ki. Az antitest monoklonális vagy poliklonális lehet. Az antitestet a peptid-sarzsok minőségi kontroli-vizsgálatára; a rekombináns protein, peptid vagy virális lizátum tisztítására; antigén-molekularész ’ feltérképezésére ; és ha jelzett, antitest-detektálási kompetitiv tipusu vizsgálatban konjugátumként; valamint antigén-detektálási vizsgálatokban használhatjuk.

Poliklonális antitest előállítására a hordozóhoz kapcsolt (I) általános képletü peptidet egy emlős vagy egyéb állati szervezetbe injektáljuk, például egérbe, patkányba, birkába vagy nyulba, és a peptiddel szemben termelődött antitestet kinyerjük. A peptid-bord ózó konjugátumot rendszerint injektálható készítmény formájában adagoljuk, amely fiziológiailag elfogadható higitószert is tartalmaz. A készítmény adjuvánst - például Freund-féle adjuvánst (FCA-t) vagy Freund-féle nem teljes adjuvánst (FIA-t) is tartalmazhat. Az állatokat megfelelő időtartamon keresztül immunizáljuk. Az állatoktól megfelelő időközökben vért veszünk a peptid-ellenes aktivitás meghatározására. Ha az aktivitás megfelelő szintet ér el, az állatokat elvéreztetjük. Az antitestet extraháljuk és például sóval kicsapva és affinitási kromatográfiás eljárással tisztítjuk, immobilizált szintetikus peptidet alkalmazva.

A monoklonális antitestet termelő hibridómát úgy állíthatjuk elő, hogy a szaporodást biztositó sejteket az (i) általános képletü peptiddel szembeni antitestet termelő sejtekkel fu

- 19 zionáljuk. Jellegzetes módon egy állati gazdaszervezetet, például egeret immunizálunk a peptiddel szemben. A lépet eltávolítjuk az immunizált állatból. A lépsejteket egy fenntartó sejtvonallal, például egérből származó myeloma-sejtvonallal fuzionáljuk. Ily módon peptid-specifikus monoklonális antitestet kiválasztó hibridomát kapunk. Az antitestet a fent ismertetett módon tisztíthatjuk.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni, a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

Karboxil-terminálisán amidcsoportot tartalmazó KYLQDQARINSWGrCAFRQVC peptid előállítása

A peptidet Merrifield módszerének /Merrifield, JACS,

85, 2149 - 2154 (196317 Houghten által leírt módosításával szintetizáljuk /Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5131 - 5135 (1985)J.

A peptidet p-metil-benzhidril-amin-divinil-benzol gyantán szintetizáljuk. Az egyes aminosavak ©<-amino-csoportját terc-butoxi-karbonil-csopcrttal (Boc) védjük. Az egyes kapcsolási lépések az alábbiak:

1. a gyantát diklór-metánnal mossuk - 10 perc

2. mosás 5 % diizopropil-etil-amint tartalmazó diklór-metánnal - perc, háromszor

5. mosás diklór-metánnal - 1 perc, kétszer

4. terc-butoxi-karbonil-aminosav kapcsolása diklór-metánban,

0,3 mól/1 diizopropil-karbodiimid jelenlétében - 60 perc

5. azonos a 3. lépéssel • · ·

6. védőcsoport eltávolítása 50 % trifluor-ecesavat tartalmazó diklór-metánnal - 20 perc

7. mosás diklór-metánnal - 1 perc, hatszor

8. folytatni a 2. lépéstől.

A kapcsolási ciklusok befejezése után a peptidet a gyantáról lehasitjuk, hidrogén-fluoriddal 1 órán keresztül kezelve, 10 % anizol (scavenger) jelenlétében. A peptidet a fenti módon C-terminálisán amid csoportot tartalmazó formában kapjuk. A terméket ezután éterrel mossuk, szárítjuk, 15 %-os ecetsavban oldjuk és liofilizáljuk.

2. példa

Karboxil-terminálisán amid csoportot tartalmazó ΑΙΕΚΎ1QDQAR1NSWGC és_KNSWGCAFRQVCHTTVPWVN peptidek előállítása

A cim szerinti peptideket az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Ezért mindkét peptid C-terminálisán amidcsoportot tartalmaz.

5. példa

Merkaptocsoportok blokkolása

Az 1. és 2. példa szerint előállított egyes peptidek merkaptocsoportjait az alábbiak szerint blokkoljuk.

A peptid 25 mmól/1 koncentrációjú HEPES pufferxel (pH

7,0) készült mólfeleslegü

100 - 150 zumól/l koncentrációjú oldatát kétszeres (azaz 200 - 1000 umól/1) ditio-treitollal redukáljuk 50 percen keresztül. Az AIEKY1QDQARLNSWGC peptid esetén azon ban csak egyszeres mólfeleslegü (azaz 100 - 500 ^umól/1) ditio-treitolt használunk, mivel a peptid csak egyetlen cisztein-ma • · · · rád ékot tartalmaz.

Az összes jelenlévő merkaptocsoportra számítva kétszeres moláris feleslegben N-etil-maleimidet adunk az elegyhez. A blokkolási reakciót 1 órán keresztül hagyjuk végbemenni. A módosított peptidet ezután pufferoldatba gélszürjük.

4. példa

Blokkolt merkaptocsoportokát tartalmazó KYLQDQARBNSWG-GAFRQVG pepiiddel végzett közvetlen szendvics ΞΙΑ A pepiiddel passzívan bevonjuk a mikrotitrátor lemez lyukait. A lyukakba a szérum-mintákkal együtt bemérjük a konjugált peptidet. A peptid-konjugátűm enzim-komponense lúgos foszfatáz. A lemezt kb. 1 órán keresztül lnkubáljuk, majd a lyukakat kimossuk és bemérjük az enzim szubsztrátját. A szubsztrát ciklusos eró'sitési rendszerrel nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) . Az anti-HIV-2 jelenlétét a mintában hasonló módon kezelt standarddal összehasonlítva mutatjuk ki. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.

1. táblázat

Ismerten HIV-2 Ismerten HIV-1 Ismerten HÍV pozitív minták pozitív minták negatív minták vizsgálatban + vizsgálatban 115

170

5.__péld a

Enzim__immunvizsgálat 1-es és 2-es tipusu humán immunhiány vírus (HIV-1 és HIV-2) kimutatására, KYp^DQAHENSWGCAERQVC HIV-2 peptid__és a 14 - 15. oldalakon_hivatkozott szekvenciáju HIV-1 fúziós peptid felhasználásával

A peptidekkel bevonjuk a mikrotitrátor lemez lyukait.

A konjugált peptidekkel együtt bemérjük a szérum-mintákat az igy előkészített lyukakba. A konjugátumok ugyanezen antigének elegyei, amelyeket előzőleg lúgos foszfatázzal jeleztünk. A lemezeket kb.

órán keresztül inkubáljuk, majd a lyukakat kimossuk és az enzim szubsztrátját bemérjük. Szubsztrátként ciklusos erősítő rendszerrel nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot (NADP) használunk, amely színes reakcióterméket eredményez. Az enzimreakciót megfelelő inkubálás után leállítjuk, és a szint spektrofotometriásán meghatározzuk. A konjugátum mennyisége, és ennek következtében a szín a lyukakban egyenesen arányos a HIV-vel szembeni antitest koncentrációjával a mintában. Az eredményeket a 2., 3. és

4. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat: HIV-l-re és HIV-2-re specifikus antitest kimutatása szérum-mintákban (A, C, D és E csoport) és plazma-mintában (B csoport) európai véradók esetén • · · ·

Csoport	Vizsgált minta száma	Nem reagáló	Kezdetben reagáló	Ismételten reagáló
A	2064	2055	9	3
B	1842	1836	6	1
C	1897	1893	4	2
D	1757	1756	1	0
E	1557	1553	4	1
Összesen	9117	9093	14 (0,26%) 7 (0,08%)

3. táblázat: AIDS-es, AlDS-szel kapcsolatos betegségben szenvedő, erősen veszélyezte tett csoportba tartozó és egyéb betegségben szenvedő egyedekből vett szérum reaktivitása, európai klinikai minták esetén

Klinikai Minták	HIV-1 és HIV-2 antitestre pozitív	Ismételten HIV-1 anti· testre pozitiva
csoport s	zárna
AIDS	117	117	117
ARC	107	107	107
erősen veszélyezte tett*5	304	219	219
c vegyes	15	13	13
AIDS-sel nem kapcsolatos beteg ségek	140	1	1
a; Western	biot	és/vagy legalább két	másik immunológiai vizs-

gálattal megerősítve • ··· • · ·· ·· ···

- 24 b: meghatározott veszélyeztetett csoportba tartozó betegek c; AIDS-szel kapcsolatos betegségekben szenvedő betegek (például állandósult és általános nyirokcsomómegbetegedés) d: akut virális fertőzésben, autoimmun betegségben és daganatos betegségben szenvedő betegek

4. táblázat: A Wellcozyme HIV-1 és HIV-2 antitest reaktivitását

386 nyugat-afrikai mintában vizsgáltuk. Az összes HIV-l-re és HIV-2-re detektált mintát pozitívnak találtuk HIV-2 antitest immunológiai vizsgálatban. Nyugat-afrikai betegek szérumának reaktivitása

Minták	Anti test-pozitív	Anti test-pozitív
száma	HIV-l-re és HIV-2-re	HIV-2-re végzett
	vizsgálva	immunológiai vizsgálatban
386	26 la	259b

a: két minta ellentmondó eredményt adott; az egyik anti-HIV-1 és anti-HIV-2 alternatív kimutatására szolgáló vizsgálatokbán negatív volt, csak p24^_et lehetett kimutatni HIV-1 Western Biot módszerrel, és néni kaptunk HIV-2 Western Biot eredményeket; a másik minta anti-HIV vizsgálatban negatív volt, egyértelműen az anti-HIV-2 vizsgálatban, és határozatlan az együttes HIV-1 és HIV-2 Western Biot vizsgálatban b: az összes minta pozitív volt anti-HIV-2 immunvizsgálatban;

a mintákat HIV-2 Western Biot vizsgálatnak alávetve 26 egyértelműen pozitív volt, mig 3 nem adott határozott eredményt.

Claims (15)

1. Szabadalmi i g é-n y ρ ο n t o k ···»

   1. Eljárás az /1/ általános képletüpeptidek - a képletben (i) X jelentése KY1QDQAP.L és

   Y jelentése AFRQVC, vagy

   X jelentése AIEKYIQDQARL és

   Y jelentése bidroxilcsoport, vagy

   X jelentése X és

   Y jelentése AFRQVCHT1VPWVN;

   (ii) a terminális karboxilcsoport adott esetben amid formában van; és (iii) a C aminosav-maradékok merkaptocsoportja szabad vagy blokkolt - előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) - az egyes aminosavakat és/vagy két vagy több aminosavból álló aminosav-fragmentumokat az (i) általános képletnek megfelelő sorrendben kondenzáljuk, mimellett ha az aminosav cisztein, annak merkaptocsoportja szabad vagy blokkolt formában van; és

   - kívánt esetben a kapott peptid terminális karboxilcsopcrtját amid csoporttá alakítjuk, és kívánt esetben egy vagy több cisztein-maradék szabad merkaptocsoportját blokkoljuk, vagy (b) - egy gazdasejtet egy olyan vektorral transzformálunk, amely tartalmazza az (i) általános képletü peptidet kódoló gént, és amely képes a gazdasejtben a peptidet expresszálni;

   • · · * · · · • * · · ··· • · · · · « 4 ···· · ·« ·· ··

   - a transzformált gazdasejtet tenyésztjük; és

   - a kifejeződött peptidet kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (i) általános képletü peptidek előállítására, amelyeknek terminális karboxilcsoportja amid formában van, azzal jelle mezv e , hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (i) általános képletü peptidek előállítására, amelyekben minden cisztein-maradék merkaptocsoportja blokkolt, azzal jellemezve , hogy a megfelelő blokkolószereket használjuk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletü peptidek előállítására, amelyekben a merkaptocsöpörtök acetamido-metil-, ditio-piridil- vagy Ellman-reagensből, szerves higanyvegyületből vagy maleimid-vegyületből származó csoporttal vannak blokkolva, azzal jellemezve, hogy a megfelelő blokkolószereket használjuk.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás olyan (i) általános képletü vegyületek előállítására, amelyekben a merkaptocsoportok N-eti1-maleimidbői származó csoporttal vannak blokkolva, azzal jellemezve, hegy a megfelelő blokkolószert használjuk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás a

   KILQDQARLNSWGCAFRQVC aminosav-szekvenciáju peptid előállítására, azzal jellemezve , hegy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk .

   » « Λ · ♦ * » · ··· • · · · · ·· · · ··
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás a

   KYIQBQARLNSWGCAFRQVO aminosav-szekvenciáju peptid előállítására, amelynek terminális karboxilcsoportja amid formában van, és minden cisztein-maradéka blokkolt, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
8. 8. Eljárás HIV-2-re specifikus antitestek jelenlétének kimutatására testfolyadékokban, azzal jellemezv e , hogy (a) a vizsgálati mintát egy szilárd fázison immobilizált, az

   1-7· igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptiddel hozzuk érintkezésbe, és (b) megfelelő eszközökkel meghatározzuk, hogy a vizsgálati minta tartalmaz-e antitestet.
9. 9. Eljárás HIV-l-re vagy HIV-2-re specifikus antitestek jelenlétének kimutatására testfolyadékokban, azzal jellemezve , hogy (a) a vizsgálati mintát egy olyan szilárd fázissal hozzuk érintkezésbe, amelyen egy, az 1 - 7· igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptidet és egy, a HIV-l-re specifikus antitestet megkötő antigén-molekularészt tartalmazó peptidet immobilizáltunk, és (b) megfelelő eszközökkel meghatározzuk, hogy a vizsgálati minta tartalmaz-e antitestet.
10. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy eszközként jelzett molekulát vagy ré• · · · · · « * · · · ·4· • · · · · · * ··»· 4 «· ·«

    - 28 szecskát használunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy jelzett molekulaként vagy részecskeként lúgos foszfatázt, protein A-t, protein G-t, anti-speciest, vagy anti-immunglobulin altípusokat, reumatoid faktort, vagy a peptidre, vagy a peptid antigén-szakaszát tartalmazó bármely molekulára specifikus antitestet használunk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1-1 e m e z v e , hogy a HIV-1 és HIV-2 detektálására azonos vagy eltérő jelzett molekulákat vagy részecskéket használunk.
13. 13. Teszt-készlet HIV-2-re specifikus antitestek jelenlétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy (a) egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerint előállított, enzimmel jelzett peptidet, (b) az enzim egy szubsztrátját, (c) az 1-7· igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptid immobilizálására alkalmas felületet biztosító eszközöket, és (d) kívánt esetben mosóoldatokat és/vagy puffereket tartalmaz.
14. 14. Teszt-készlet a HIV-1 és HIV-2 együttes detektálására, azzal jellemezve, hogy (a) egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított, enzimmel jelzett peptidet, (b) egy, a HIV-1 antitestet megkötő antigén-molekularészt képvi* 9

    999 » · · · ·· ·· ···· * ·· selő, enzimmel jelzett polipeptidet, (c) a fenti enzimek szubsztrátjait, (d) az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított peptid, és a HIV-1 antitestet megkötő antigér-molekularészt képviselő peptid immobilizálására alkalmas felületet biztositó eszközöket, és (e) kívánt esetben mosóoldatokat és/vagy puffereket tartalmaz.
15. 15. A 14. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve , hogy a HIV-1 peptid a HIV-1 gag szekvenciája, amely a 121 - 356. aminosavakat tartalmazza, és egy env szekvencia, amely a HIV-1 env szekvenciája, gs az 542 - 674. aminosavakat tartalmazza.