PT92464A - Processo para a preparacao de peptidos e conjuntos para analise que os contem - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente de invenção de THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED , britânica, industrial e comercial, com sede em 183-193 Euston Road London NW1 2BP, Inglaterra, (inventor: Richard Julian Stuart Duncan,residente na Inglaterra), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PEPTIDOS E CONJUNTOS PARA ANÃLISE QUE OS CONTEM"

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a peptidos susceptiveis de se ligarem a anticorpos especificos para o Vírus do tipo (HIV) da Imunodeficiência Humana, a sua preparação e âs suas utilizações. A seguir a descoberta de HIV-2, também conhecido como LAV-2, houve necessidade de se detectar a presença deste virus. Actualmente, identificou-se um grupo de peptidos aos quais se podem ligar os anticorpos especificos para HIV-2, tornando possível.a presença de tal anticorpo e, como consequência, do virus que se pretende detectar. Podem, por isso utilizar-se esses peptidos em ensaios para o anticorpo ou para o próprio virus HIV-2, Podem também empregar-se para dar origem aos prõprios anticorpos.

De acordo com o anteriormente exposto, a presente invenção proporciona peptidos de fórmula (I): X-NSWGC-Y (I) em que (i) X ê KYLQDQARL e Y i AFROVC, X é AIEKYLQDQARL e Y ê Hidroxi, ou X é K e Y ê AFRQVCHTTVPWVN;

(ii) Opcionalmente, o grupo da extremidade carboxi, encontra-se sob a forma de uma amida; e (iii) 0 grupo sulfidrilo de cada G encontra--se livre ou bloqueado.

Os residuos aminoãcidos indicam-se por uma letra de cõdigo (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984) . De um modo preferencial o grupo da extremidade carboxi apresenta-se na forma de uma amida, isto ê, encontra-se presente como -C0NK2, de preferência a uma forma carboxi, isto ê, presente como -COOH. Também, de um modo preferencial, o grupo sulfidrilo de cadeia lateral ou cada grupo sulfidrilo de cadeia lateral encontra-se bloqueado. Isto evita a formação de pontes dissulfe-to, evita a oxidação dos residuos de eisteina. e evita a conjugação não adequada de peptidos a veículos. 0 grupo de bloqueio sulfidrilo pode ser acetalidometilo ou pode ser derivado de um mercúrio orgânico maleimida ou um agente de bloqueador de dissulfetos. 0 reagente de Ellman, di-tiodipiridilo, e um exemplo de agente bloquea dor de dissulfetos adequados. De um modo preferencial, o grupo bloqueador deriva de um N-etilmaleimida ou ê acetamidometi-lo e, possui a fõrmula:

Os peptidos de formula (I) são peptidos de sintese. Podem ser preparados por sintese quimica. Podem empregar-se métodos de fase sólida ou de solução de sintese peptidica. Por isso, pode produzir-se um peptido, segundo um processo que consiste em: (a) Condensar aminoãcidos simples e/ou peptidos representativos, de dois ou mais aminoãcidos, de tal maneira que os aminoãcidos surjam na fórmula (I), de modo que quando o aminoâcido for a eisteina o seu grupo sulfidrilo se 2

I

Λ encontre livre ou bloqueado, de modo a obter-se um peptido de fÔrmula (1) em que a extremidade carboxi se encontre livre ou sob a forma de uma amida; e (b) Se se desejar, bloquear o grupo sulfidrilo livre do ou de cada um dos residuos de cisteina que possuem um dito grupo no peptido resultante de formula (I).

Na sintese de fase sólida, a sequência aminoãcida do peptido desejado constroi-se sequencialmente a partir do aminoãcido de extremidade G que se liga a uma resina insolúvel. Depois de se produzir o peptido desejado, efectua-se a sua clivagem, a partir da resina. Quando se emprega a sintese de fase solúvel, pode construir-se novamente, o peptido, a partir do aminoãcido da extremidade N. 0 grupo carboxi deste acido mantêm-se bloqueado através de um grupo protector adequado, que se remove no fim da sintese.

Qualquer que seja a técnica empregue, de fase sólida ou de fase solúvel cada um dos aminoãcidos adicionados ao sistema de reacçao possui de um modo caracteristi-co, um grupo (X -amino protegido e um grupo carboxi activado. Pode proteger-se um grupo amino com um grupo fluoren-9-il-me-toxicarbonilo (Fmoc) ou t-butoxicarbonilo (Boc). Pode activar--se um grupo carboxi como um ester de pentafluorofenilo ou de l-oxo-2-hidroxi-di-tiidrobenzotriazina. Pode efectuar-se cada passo de condensação na presença de diciclo-hexilcarbo-di-imi-da ou de 1-hidroxibenzo-triazol.

Habitualmente, também se protegem os grupos’ funcionais de cadeia lateral, por exemplo o grupo amino da cadeia lateral da lisina, o grupo hidroxi de cadeia lateral de uma treonina ou o grupo sulfidrilo de cadeia lateral de uma cisteina. Apos cada um dos passos de sintese, remove--se o grupo de protecção -amino.

No entanto, quaisquer grupos prote-ctores de cadeia lateral são removidos apenas no fim da sintese emboram possam conservar-se se se desejar. Contudo, no caso de um grupo sulfidrilo protegido, pode conservar-se o grupo protector, quando este ê necessário para desempenhar uma 3

função de bloqueio.

Quando se pretende um grupo bloqueador alternativo ou um peptido com o(s) grupo(s) sulfidrilo Livre(s) remove-se o grupo protector.

Podem prepara-se os peptidos com grupos carboxi ou amido na extremidade C, conforme desejado. Na sintese de peptidos da fase sólida, esta decisão pode ser determinada pelo modo como o aminoâcido da extremidade N se liga â resina de suporte e/ou ao modo como se cliva o peptido final da resina. Habitualmente a resina consiste num estireno e/ou num polímero de divinilbenzeno. 0 aminoâcido da extremidade C pode encontrar-se ligado ã resina através de uma ligação ester que pode ser clivada por um acido forte tal como o HBr no ácido trifluoroacêtico ou HF para proporcionar o peptido com um grupo carboxi na extremidade C. No entanto a amonolise pode proporcionar a amida correspondente.

Um método alternativo para se obter uma amida peptidica por sintese de fase sólida consiste em fazer com que o aminoâcido da extremidade C do peptido se ligue â resina através de uma ligação peptidica aminobenzidrllo. Isto pode obter-se por acoplamento com diciclo-hexil-carbodi-imi-da e pode clivar-se com HF, habitualmente a frio. Para a sintese de fase solúvel, se a presença de um grupo carboxi ou amida na extremidade C pode depender do modo como o grupo carboxi do aminoâcido da extremidade C se encontra bloqueado e, no fim de sintese, não bloqueado.

Pode converter-se um peptido com um grupo carboxi na extremidade C num com um grupo amida na extremidade C e vice-versa.

Pode, também, preparar-se um peptido de acordo com metodologias de ADN recombinante. Por isso, se proporciona uma sequência de ADN que codifica o peptido. Prepara-se um vector de expressão que incorpora a sequência de ADN e que é capaz de expressar o peptido quando num hospedei-• ro adequado. 1 A sequeência de ADN localiza-se entre - 4 - ·

os sinais de iniciação e de terminus, no vector. Também se proporcionam elementos de controlo de transcrição, em especial um promotor para a sequência de ADH e um local de terminus de transcrição. Fornece-se a sequência de ADN na banda correcta de modo a tornar possivel a expressão do peptido num hospedeiro compativel com o vector.

Pode empregar-se qualquer sistema hospedeiro vector adequado. 0 vector pode ser um plasmido. Nestas circunstancias, pode utilizar-se um hospedeiro bacteriano ou uma levedura. Como alternativa, o vector pode ser um vector virico. Pode utilizar-se para transfectar células de uma linha de células de mamíferos no sentido de se obter a expressão do plasmido.

Podem prever-se os peptidos com grupos sulfidrilo bloqueados, segundo uma de duas vias. Em primeiro lugar, podem utilizar-se cisteinas com grupos sulfidrilo bloqueados, num passo (a) quando se constroi o peptido a partir de precursores aminoãcidos. Em segundo lugar, pode obter-se um peptido de formula (I) com grupo (s) sulfidrilo livres, que então se bloqueiam. Um agente de bloqueador de sulfidrilo reage com a cisteina livre ou o peptido de formula (I) dependendo da via.

Pode utilizar-se qualquer agente de bloqueio do grupo sulfidrilo, adequado. Exemplos destes agentes incluem acetamido-metanol e organomercurio, maleimida e agentes de bloqueio dissulfidico. 0 reagente de Ellman. diti-piridilo, ê um exemplo de um agente adequado de bloqueio dissulfidico, No entanto, dâ-se preferência a N-etilmaleimida ou acetamido-metanol.

Quando se obtem um peptido de formula (I) com grupo (s) sulfidrilo livres os quais se pretendem, depois bloquear, reduz-se, primeiro, o peptido. Utilizam-se de um modo caracteristico,um agente redutor poderoso tal como ditionite, 2-mercapto-etanol, ditiotreitol ou ditio-eritritol, Da-se preferência a ditiotreitol. Quando se utiliza apenas um pequeno excesso de agente redutor, não ê necessário separar o 5 i *

peptido reduzido antes de se adicionar o agente bloqueador do grupo sulfidrilo.

Numa sintese tipica, reduz-se uma solução áe peptido (100-500 /M) num tampão de pH 7, aproximada-mente. Com um excesso molar de aproximadamente 2 vezes, de um agente redutor tal como ditiotreitol (isto e, 200-1000 yU>M) durante, pelo menos, 20 minutos, habitualmente, durante cerca de 30 minutos. Decorrido este intervalo de tempo, adiciona-se o agente de blogieo tal como N-etil-maleimida, para proporcionar um excesso molar de aproximadamente duas vezes sobre o sulfidrilo total que se encontra presente, deixa-se ocor rér a reacção de bloqueio durante, pelo menos, uma hora. Pode então filtrar-se através de gel o peptido modificado, para qualquer solução tampão adequada. Como alternativa, pode rea-activar-se, posteriormente, o peptido modificado, com reagentes de conjugação tais como ácido S-acetil-tioglicõlico, ester de N-hidroxi-succinimida (SATA) ou 4-(N-maleimido-metil)-ci-clo-haxano-l-carboxilato (SMCC) antes da filtração em gel. Pode utilizar-se um peptido de formula (I) em ensaios para anti corpos específicos para HIV-2. Pode utilizar-se, no ensaio, uma mostra de ensaio de qualquer fluido fisiológico adequado, como por exemplo, urina, plasma, sangue-soro, semen, lágrimas saliva ou fluido cerebro-espinal. 0 método de ensaio consis-em fazer contactar uma amostra de ensaio com o peptido e determinar se qualquer anticorpo se liga ao peptido. Com este objectivo, pode fornecèr-se um conjunto de ensaio que compreende um peptido de formula (I) e meios para a determinar se qualquer anticorpo contra HIV-2 que pode encontrar-se presente na amostra de ensaio se liga ao peptido.

Pode empregar-se uma diversidade de formatações de ensaio. Pode utilizar-se o peptido para capturar de modo selectivo um anticorpo contra HIV-2 a partir da solução, marcar radioactiva e seleetivamente tal anticorpo já capturado ou capturã-lo e marcã-lo. Para além disso pode utilizar-se o peptido numa diversidade de formatações de ensaios homogéneos nos quais os anticorpos que reagem com o peptido são detectados numa solução sem separação de fases. 6 k

L

Pode também, utilizar~se o peptido para a detecção do antigeno HIV-2.

Os tipos de ensaios nos quais se utiliza o peptido para se capturarem anticorpos a partir de uma solução, envolve a imobilização do peptido sobre uma superfície solida. Esta superfície deverá ser capaz de ser levada de algum modo. As espécies de superfícies que se podem utilizar são polímeros de diversos tipos (moldados em recipientes de micro-titulação; gotas; varetas de fixação de diversos tipos; varetas de aspiração; eléctrodos; e dispositivos õpticos), partículas (por exemplo, latex, sangue estabilizado, células bacte-rianas e fúngicas; esporos; ouro ou outras soluções soloidais metálicas; e coloidessproteináceos; sendo o tamanho usual das partículas de 0,1 a 5 microns), as membranas (por exemplo ni-trocelulose; papel; acetato de celulose; e membranas de elevada porosidade e de áreas elevadas de um material orgânico ou inorgânico. A ligação do peptido às superfícies pode ser por adsorçao passiva a partir de uma solução de uma composição óptima que pode incluir surfactantes, solventes, sais caotropes; ou por ligação quimica activa. A ligação activa pode fazer-se através de uma diversidade de grupos funcionais reactivos ou activâveis que se podem ligar â superfície (por exemplo agentes condensantes; esteres activos, halogenetos; ani dridos; grupos amino, hidroxilo ou carboxilo; grupos sulfidri-lo; grupos carboxilo; grupos diazo; grupos não saturados).

De um modo alternativo a ligação activa pode efectuar-se através de uma proteína (ela própria ligada â superfície, de um modo passivo ou^através de uma ligação activa) ou através de uma proteína de transporte tal como a albumina ou a caseina, âs quais se pode ligar quimicamente o peptido, segundo qualquer um dos diversos métodos e que pode conferir vantagens devido ao ponto isoelêctrico, carga, hidro-filicidade ou outras propriedades fisico-quimicas, Pode, também ligar-se o peptido â superficie (usualmente mas não necessariamente uma membrana) a seguir â separação electroforê-tica de uma mistura de reacção, por exemplo uma precipitação imunolÓgica, 7

Após contacto dasuperficie que suporta o peptido com uma amostra de ensaio e remoção do excesso de amostra, quando necessário, segundo uma diversidade de métodos (lavagem, filtração, magnetismo, acção da capilaridade), dete-cta-se o anticorpo capturado segundo qualquer dos meios que proporcionem um sinal detectável. Isto pode ser conseguido, por exemplo, utilizando uma molécula ouparticula marcada, conforme anteriormente definido que reagirá com o anticorpo capturado (por exemplo uma proteina A ou uma proteina G e similares? anti-espécies ou anti-sub-tipo de imunoglobulina; factor reu-latoide; anticorpo para o peptido utilizado de. uma forma competitiva ou bloqueante; ou qualquer molécula contendo o. epitope do peptido incluindo, o próprio peptido e outras proteínas e peptidos derivados directamente ou indirectamente de HIV-2). 0 sinal detectável pode ser õptico ou radioactivo ou fisico quimico, obtido por marcação directa da referida molécula com, por exemplo, um corante, um marcador, radioactivo, espécies eleetroactivas, espécies de ressonância magnética ou fluoroforo; ou indirecta por marcação da molécula ou particula com um enzima susceptivel de proporcionar uma alteração mensurável de qualquer espécie. Gomo alternativa, o sinal detectável pode dever-se, por exemplo, a glutinação, efei to de difracção ou efeito birefringente que ocorre se alguma das restantes superfícies forem partículas.

Esses tipos de ensaios nos quais se utiliza o peptido para marear um anticorpo já capturado, requer a marcação do peptido de algum modo que permita a sua detecçáo. A marcação pode ser directa, ligando quimica ou passivamente, por exemplo uma particula radio de ressonância magnética, ou enzima marcado ao peptido; ou indirecta por ligação de qualquer forma de marcador a uma molécula que reage, ela própria com o peptido, por exemplo, anticorpo para o peptido, com subsequente reacção de molécula marcada com o peptido. A técnica quimica de ligar um marcador a um peptido pode efectuar-se directamente através de uma • porção ainda presente no peptido, tal como um grupo amino ou ] através de um grupo inserido tal como uma maleimida. A captura 8

— do anticorpo pode efectuar-se sobre qualquer das superficies jã mencionadas, por qualquer reagente, incluindo adsorção passiva ou activa, que originara a ligação de anticorpos especifi-cos ou complexos imunolõgicos. Pode efectuar-se uma captura especial do anticorpo por anti-espêcies ou anti-subtipos de imunoglobulina, factor reumatoide, proteínas A, G e similares, ou, por qualquer molécula contendo o epitope que compõe o pepti do, conforme anteriormente descrito.

Para esses ensaios, nos quais se utiliza o peptido para se obter uma medição do antigeno HIV-2 numa. amostra, pode marcãr-se o peptido de acordo com qualquer dos métodos anteriormente descritos e, utilizar-se quer numa forma de ligação competitiva de tal modo que a sua ligação por qualquer molécula especifica sobre qualquer das superficies anteriprmente exemplificadas ê bloqueada pelo antigeno na amostra, quer de um modo não competitivo quando o antigeno na amos tra se liga especificamente ou não especificamente a qualquer das superficies anteriormente' referidas, em vez de se ligar a uma molécula bi- ou polivalente (por exemplo um anticorpo) e se utilizam as restantes valências da molécula para capturar o peptido marcado.

Geralmente, nos ensaios homogéneos marcam-se o peptido e o anticorpo, pelo que, quando o anticorpo reage com o peptido em solução: livre, os dois marcadores interferem, por exemplo para permitir a transferência não radioa-ctivada energia capturada por um marcador para outro marcador, com detecçao adequada do segundo marcador excitado ou do primeiro marcador extinto (por exemplo, por fluorimetria, ressonância magnética ou medição enzimâtica). A adição de antigeno ou anticorpo a uma amostra origina a restrição da interacção do par marcado e, por isso, a um nivel diferente de sinal no detector.

Um ensaio adequado para detectar o anticorpo para HIV~2 é o ensaio imunologico directa de inter-calamento enzimâtico (EIA). Revestem-se recipientes de micro-• titulação com um peptido de formula (1). Adicionam-se simultâ- 9 * k k

neamente, uma amostra de ensaio e um peptido de formula (I) ao qual se encontra ligado um enzima (peptido conjugado).

Qualquer anticorpo especifico se liga ao peptido que reveste o recipiente e ao peptido conjugado. De um modo caracteristico utiliza-se o mesmo peptido de fõrmula (I) em ambos os lados da "sandwich". Apõs lavagem, detecta-se o enzima que se ligou utilizando um substrato especifico que envolve uma alteração de coloração. Um conjunto de ensaio para utilização num tal EIA, compreende? (1) um peptido de fõrmula (I) marcado com um enzima? (2) um substrato para o enzima? (3) meios que proporcionem uma superfície na qual um peptido de fõrmula (1) seja imobilizado? e (4) por opção, soluções de lavagem e/ou tampões,

Podem utilizar-se os peptidos de fõrmula (I) num ensaio combinado para a detecção dos anticorpos especificos para HIV-1 e HIV-2. Um tal ensaio consiste em fazer contactar uma amostra de ensaio com um peptido de fõrmula (I) e com um polipeptido que apresenta um epitope ao qual o anticorpo HIV-l se liga e, na determinação da ligação de qualquer anticorpo ao peptido de fõrmula (X) e/ou ao polipetido que apresenta um epitope ao qual o anticorpo HIV-1 se liga. Podem adaptar-se quaisquer dos ensaios anteriormente definidos.

Um conjunto de ensaio adequado para utilização num ensaio combinado para detecção dos anticorpos especificos para HIV-1 e HIV-2, compreende um peptido de formula (X), um polipeptido que apresenta um epitope ao qual se liga o anticorpo para HIV-1 e, meios para determinar se qualquer anticorpo contra HÍV-1 ou HIV-2 que pode existir numa a-mostra de ensaio se liga, respectivamente, ao referido polipe-ptido de fõrmula (I), 0 ensaio EIA anteriormente descrito • ê adequado para ser utilizado num ensaio combinado. Reveste-se 10

um recipiente de microtitulaçio com um polipeptido que apresente um epitope ao qual o anticorpo para HIV-1 se ligue.

Adiciona-se o dito polipeptido, por xem-plo, o mesmo polipetido, marcado com um enzima, simultaneamente com a amostra de ensaio e o peptido conjugado de fõrmula (I). 0 marcador enzimãtico no polipeptido pode ser o mesmo ou diferente do do peptido de fõrmula (I) . Bem como componentes de (1) a (4), conforme anteriormente descrito, pelo que um conjunto de ensaio para utilização num ensaio EIA compreende: (5) um polipeptido que apresenta um epi-tope ao qual o anticorpo HIV-1 se liga e que ê marcado com um enzima; (6) um substrato para o enzima, se o enzima for diferente do que marca o peptido de fõrmula (I)? e (7) meios que proporcionam uma superfície sobre a qual um polipeptido que apresenta um epitope ao qual se liga o anticorpo para HIV-1, se encontra imobilizado.

Quando o peptido de fõrmula (I) e o polipeptido ao qual o anticorpo para HIV-1 se liga se encontram imobilizados na mesma superficie, os meios referidos em (3) e (7) são os mesmos. t 0 polipeptido ao qual se liga o anticorpo para HIV-1 pode ser um polipeptido preparado por sintese quimica, De um modo alternativo, pode ser um peptido recombi-nante.

Quando se proporcionam polipeptidos re-combinantes em qualquer um dos lados da "sandwich", podem ser os expressos em organismos de unr genero diferente. Um peptido recombinante pode expressar-se num organismo procariota enquanto o outro se pode expressar num organismo eucariota. Exemplos de de hospedeiros adequados são o B.subtilis, a E. coli, Stre-ptomyces, células de insectos, células de mamíferos e de leveduras. HIV-1 provoca, em especial dois tipos de anticorpos. São o anti-p24 contra a proteina gag e anti-gp41 contra a proteína env, Actualmente preparaou-se, uma construção de fusão 11 especifica â qual anti-p24 e anti-gp41 se ligam. Pode por isso, utilizar-se esta proteina como o polipeptido que apresenta um epitope ao qual se liga o anticorpo HIV-1. A proteina possui a sequência: 20 10

MetAsnSerTroAspThrGlyHisSerSerGlnValSerGlnAsntyrTroIleValGln pl8 p24 40 30

AsnlleGlnGlyGlnMetValHisGlnAlalleSerProArgThrLeuAsnAlaTrpVal 50 60

LysValValGluGluLysAlaPheSerProGluValIleProMetPheSerAlaLeuSer 70 80

GluGlyAlaThrProGlnAspLeuAsnThrMetLeuAsnThrValGlyGlyHisGlnAla 90 100

AlaMetGlnMetLeuLysGluThrlleAsnGluGluAlaAlaGluTrtAspArgValHis 110 120

ProValHisAlaGlyProIleAlaProGlyGlnMetArgGluProArgGlySerAspIle 130 140

AlaGlyPhrThrSerThrLeuGlnGluGlnlleGlyTrpMetThrAsnAsnProProIle 150 160

ProValGlyGlulleTyrLysArgTrpIlelleLeuGlyLeuAsnLysIleValArgMet 170 180

TyrSerProThrSerlleLeuAsplleArgGlnGlyProLysGluProPheArgAspTyr 190 200

ValAspArgPheTyrLysThrLeuArgAlaGluGlnAlaSerGlnGluValLysAsnTrp 210 22o

MetThrGluPhrLeuLeuValGlnAsnAlaAsnProAspSysLysThrlleLeuLysAla 230 240

LeuGlyProAlaAlaThrLeuGluGluMetMetThrAlaSysGlnGlyValGlyGlyPro - 12 25ο 260

AsnSer ProArgGlnLeuLeuSerGlyIleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAla gp41 280 270

IleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlylleLysGlnLeuGlnAla 290 300

ArglleLeuAlaVelGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlylleTrpGlySys 310 320

SerGlyLysLeuIleCysThrThyAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSer 330 340

LeuGluGlnlleTrpAsnAsnMetPhrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyr 350 360

ThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln 370

GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpTheAsnGlyAspPro.

Designa-se esta proteína como DM26. A sua preparação encontra-se descrita no Pedido de Patente Europeu N9. 88308170.5, dos mesmos investigadores. Pode modificar-~se a sequência da proteína por substituição de um ou mais ami-noãcidos, inserções e/ou eliminações e/ou por uma extensão numa ou em ambas as extremidades, demonstrando que uma proteína que possua um tal sequência modificada ê capaz de se ligar a anti-p24 e a anti-gp41 e que existe um grau de homologia de, pelo menos, 75% entre as sequências modificadas e não modificadas. A sequência não modificada e basicamente, uma fusão de porções de proteínas p24 e g41 de CBL-1 isolado de HIV-1 (W0 86/04423). Estas porções correspondem, respe-ctivamente, aos aminoãcidos de 121 a 356 e de 542 a 674, seguindo um dsistema de numeração idênticco ao de Meusing e outros, Nature, 313, 450-458 (1985). 0 inicio destas porções indica-se anteriormente nos aminoãcidos 17 e 244, respectivamente. Os aminoãcidos de 5 a 16 anteriores derivam da proteína pl8. Os amino- 13 ácidos de 1 a 4, de 241 a 243 e de 377 a 379 anteriores, derivam do vector de expressão a partir do qual se obteve a construção de fusão e a partir de manipulações de ADN.

Pode modificar-se a sequência por uma ou mais substituições aminoãcidas e/óu eliminações. Isto pode a-contecer em qualquer local da sequência, mas especialmente, nas porções da sequência que não são derivadas das proteínas p24 e gp41. No caso de substituições, podem substituir-se um ou mais dos aminoâcidos da sequência nao modificada por um ou mais outros aminoãcidos que conservem o carácter fisico-quimico da sequência, isto ê, em termos de densidade de carga, hidrofilici-dade/hidrofobicidade, tamanho e configuração. Por exemplo, a Ser pode ser substituída por Thr e vice-versa, a glu pode ser substituída por Asp e vice-versa e Gin pode ser substituída por Asn e vice -versa. 0 residuo de ser no aminoacido 10 pode ser substituido por Asn. A sequência pode também estender-se numa ou emambas as extremidades. Isto pode não ser mais do que a provisão de um residuo adicional de Cys na extremidade carbo-xi, No entanto, pode prolongar-se a sequência para mais de 50 resíduos aminoãcidos numa ou em ambas as extremidades. Podem, contudo, adicionar-se mais do que 40 aminoãcidos, por exemplo mais do que 20 aminoãcidos, â extremidade amino e/ou extremidade carboxi da sequência não modificada. Contudo,.o aminoãcido da extremidade amino, será, normalmente Met, devido ao eodão de inciação de transferência da sequência de ácido nucleico a partir do qual se expressa a proteína. . Isto passa-se, a menos que a proteí na tenha sido expressa fundida nas suas extremidades amino a uma proteína veículo, e que a proteína de fusão tenha sido clivada para libertar a proteína da presente invenção.

Pode modificar-se a sequência por introdução de alterações correspondentes nasequência de ADN que codifica a proteína não modificada. Pode conseguir-se isto, de acordo com qualquer técnica adequada, incluindo restrição da sequência com uma endonuclease, inserção de ligantes, utiliza- - 14 <4? *

ção de uma exonuclease e/ou de uma polimerase e técnicas de muta genese comandada de um sítio. Pode determinar-se facilmente se a sequência de ADN modificada codifica uma proteina modificada ã qual anti-p24 e anti-gp41 sio capazes de se ligar. Efe-ctua-se a clonagem da sequência modificada num plasmido adequado, transforma-se uma célula hospedeira com o plasmido e ensaia-se a proteina expressa quando a sua capacidade para ligar a anti-p24 e anti-gp41. Também deve existir um grau de hu-mologia de, pelo menos 75%, por exemplo 85% ou mais ou 90% ou mais, entre as sequências aminoãcidas das proteinas modificadas ou não modificadas.

Pode conseguir-se o anticorpo especifico para um peptido de formula (I), utilizando o referido peptido. 0 anticorpo pode ser policonal ou monoclonal. Pode utilizar-se ou monoclonal. Pode utilizar-se o anticorpo em ensaios de controlo de qualidade de lotes de peptido; purificação da proteina recombinante, lisatos peptidicos ou viricos; localização de epitopes; quando marcados, como um conjugado num ensaio de tipo competitivo para detecçio de anticorpos; e em ensaios de detecção de antigehos.

Podem obter-se os anticorpos policlo-nais por injecção de um peptido de fórmula (I) acoplado a um veículo num mamifero ou noutro animal tal como um rato, uma ratazana, uma cabra ou um coelho e recuperando o anticorpo contra o peptido, assim produzido. O conjugado peptido-veiculo, administra-se, geralmente, como uma formulação injectãvel compreendendo também um diluente fisiolégicamente aceitável. Podem incluir-se navformulação adjuvantes tal como o adjuvante completo de Freund (FCA) ou o adjuvante incompleto de Freund (FIA). Imuniza-se os animais durante um periodo de tempo adequado. Sangram-se os animais a intervalos de tempo adequados para se ensaiar a aetividade antipeptidica. Quando se atinge o nível de aetividade adequada, sacrificam-se os animais, extrai em- se e purificam-se os anticorpos, por exemplo por precipitação com sais e cromatografia de afinidade utilizando peptidos de sintese imobilizados.

Podem preparar-se um hibridoma que - 15 - *

produz anticorpos monoclonais, fundindo células perpétuas com células que produzem anticorpos contra um peptido de fórmula (I). De um modo caracteristico, imuniza-se um hospedeiro animal tal como um rato, em relação ao peptido. Remove-se o baço do hos pedeiro imunizado. Fundem-se as células esplénicas com células de uma linha celular pérpêtua tal como a linha celular de um mieloma, por exemplo de um rato. Deste modo, produz-se um hi-bridoma que segrega um anticorpo amonoclonal especifico para a o peptido. Pode purificar-se o anticorpo, conforme anteriormen-te referido.

Os exemplos que se seguem ilustram a in· venção.

Exemplo 1: Preparação do peptido KYLQDQARLNSWGGCAFRQVC com um gruponde amida na extremidade carboxi

Sintetizou-se o peptido utilizando uma adaptação do método de Merrifield (merrifield, JACS, 85 , 2149--2154, 1963) descrito por Houghten (Houghten, Proc.Natl.Acad. Sei. USA, j32 , 5131-5135, 1985). Sintetizou-se o peptido numa resina de p-metilbenzidrilamina divinibenzeno. 0 grupo prote-ctor OC-amino de cada um dos aminoâcidos foi t.-butoxi~carboni-lo (Boc). Cada ciclo de acoplamento efectuou-se conforme se segue: 1. lavagem de resina com diclorometano - 10 minutos. 2. lavagem com di-isopropiletilamina a 5% em diclorometano -2 minutos X 3, 3, lavagem com diclorometano -1 minuto X 2. 4. Acoplamento aminoãcido, t-butoxicarbonilo, em diclorometano, di--isopropilcarbo-di-imida 0,3M - 60 minutos. 5. idêntico a 3.6. Desprotecção com ãcido trifluoroacético a 50% em diclorometano 20 minutos. 7. Lavagem com diclorometano - 1 minuto6. 8. Volta ao 2,

Quando se completarem aos ciclos de acoplamento, cliva-se o peptido da resina, utilizando fluore-to de hidrogénio, durante 1 hora com um anisol de limpeza a 10%. Obteve-se assim o peptido com um grupo amida na extremidade carboxi. Depois, lavou-se com éter, secou-se, dissolveu-se em ãcido acético a 15% e liofilizou-se.

Exemplo 2; Preparação dos peptidos AIEKYLQDQARLNSWGC e - 16 -

KNSWGCAFRQVCHTIVPWVN cada um deles com grupos amida na extremi-dade carboxi

Preparaou-se cada um dos peptidos conforme descrito no Exemplo 1. -

Por esse motivo, cada um dos peptidos possuia um grupo amida na extremidade carboxi.

Exemplo 3: Bloqueio dos grupos' sulfidrilo

Bloquear.am-se os grupos sulfidrilo de cada um dos peptidos sintetizados nos Exemplos 1 e 2, conforme se segue; reduziu-se uma solução de peptido (100-500 Am) em tampao HEPES 25 nM, a pH7,0, por reacção com duas vezes um excesso molar de ditiotreitol (isto ê, 200-1000 AM) durante 30 minutos. No entanto, no caso do peptido AIEKYLQDQARLNSWGC; UTILIZOU_SE um excesso molar de 1 vez de ditiotreitol (100-500 AM) uma vez que o peptido possuia apenas um resíduo de cisteina.

Adicionou-se N-etilmaleimida para proporcionar um excesso molar de dobro sobre todos os grupos sul-fidrilos presentes. Permitiu-se que ocorresse a reacção de bloqueio, durante 1 hora. Depois, filtrou-se o peptido modificado com gel numa solução tampão.

Exemplo 4; EIA-intercalado flirecto utilizando o peptido KYLQDQARLNSWGCAFRQVC com 'grupos' sulfidrilo bloqueados.

Revestiram-se recipientes de microtitu-laçao com o peptido, passivamente. Adicionaram-se, então amostras de soros aos recipientes preparados conjuntamente com o peptido conjugado, 0 enzima do peptido conjugado era a fosfa-tase alcalina, Apôs um período de incubação de 1 hora, lavaram--se os recipientes e adicionou-se substrato para o enzima. Este foi nicotinamida-adenina-dinucleotido-fosfatase (NADP) com um sistema de amplificação ciclica. Averiguou-se o anti-HIV-2 nas amostras de ensaio por comparação com um padrão tomado ao longo do procedimento. Indicam-se os resultados no Quadro 1. 17

QUADRO 1

Amostras que se Amostras que se Amostras que sabem ser HIV-2 sabem ser HIV-1 se sabem ser +ve -t-ve HIV -ve +ve em ensaio 115 0 0 •ve em ensaio 2 15 170

Exemplo 5; Ensaio imunologico para detecção de anticorpos para o Virus da Imunodeficiencia Humana Tipo 1+2 (IIIV-I e HIV-2 utilizando o peptido de HIV-2KYLQDQARLNSWGCAFRQVC e a construção de fusão HVI-1 da sequência referida nas paginas 14-16, da presente invenção

Revestiram-se as placas de microtitu-lação com os peptidos. Depois, adicionaram-se as amostras de soros aos recipientes preparados, conjuntamente com os peptidos conjugados. Os conjugados eram constituídos por uma mistura dos mesmos antigenos que tinham sido marcados cora fosfatase alcalina. Apõs um período de incubação de cerca de 1 hora, lavaram--se os recipientes e, adicionou-se o substrato para o enzima. Este foi nicotinamida-adenina-dinucleotido-fosfatase (NADP) com um sistema de amplificação ciclico que origina a formação de um produto colorido. Apôs incubação, pôs-se termos âs reacções enzimâticas e leu-se a eôr espectrofotomêtricamente. A quantidade de conjugado e, por isso, da cSr, nos recipientes estava directamente relacionada com a concentração de anticorpo para HIV na Amostra. Indicam-se os resultados nos Quadros 2, 3 e 4.

QUADRO 2

Detecção do Anticorpo para HXV-l e HXV-2 em Amostras de Soro (Cenros A, C, D e E ) e Amostras de Plasma (Centro B) a partir do "European Blòod Donors"

Centro N9. de Amostras Testadas Não Reactivas Inicialmente Reactivas Repetidamente. Reactivas A 2064 2055 9 3 B 1842 1836 6 1 c 1897 1893 4 2 D 1757 1756 1 0 E 1557 1553 4 1 TOTAIS 9117 9093 14(0.26%) 7(0.08%)

QUADRO 3

Amostras Clínicas Europeias

Reactividade de Soros de Pacientes com AIDS, Situações Associadas a AIDS, Grupos de Alto Risco e Com Outras Doenças

Grupo Clínico

Anticorpos possi-tivos a HIV-1 Confirmados N9. de Anticorpos pos-Amostras sitivoè a HIV-1 e 2 AIDS 117 117 117 ARG 107 107 107 Alto Risco 304 219 219 Λ C Miscelânea 15 13 13 Doenças não relacionadas com AIDSd 140 1 1 a Confirmação efectuada por mancha Western e/ou, pelo menos dois imuno-ensaios alternativos. b Pacientes em grupos de risco estabelecido c Pacientes com situações associadas a AIDS (por exemplo, Linfadenopatia Persistent Generalizada). d Inclui os pacientes com doenças viricas agudas, doenças de autoimunidade e neoplasias

Amostras do Oeste Africano 20

Claims (1)

1. Ji Estabeleceu-se a reactividade dos antico:: pos HIV-1 e HIV-2 de Wellcozyme por ensaio de 368 Amostras do Oeste Africano. 0 ensaio de HIV-1 e HIV-2 detectou todas as a-mostras classificadas como positivas por ensaios imunolõgicos para o anticorpo HIV-2. QUADRO 4 Reactividade de Soros de Pacientes do Oeste Africano N9. de Amostras Anticorpos possitivos Pelo Ensaio 1+2 Anticorpos possitivos por um Imuno-Ensaio HIV-2 386 261 259 a Duas amostras proporcionaram resultados discordantes. Um era negativa nos testes alternativos para anti-HIV-1 e an-ti-HIV-2, apresentou apenas p24 na Mancha Western de HIV-1, mas não se encontrou disponível qualquer resultado de Mancha Western para HIV-2. A outra amostra indicou ser negativa ao ensaio anti-HIV, equivoca num ensaio anti-Hiv-2 e indeterminada pelas manchas Western de HIV-1 e de HIV-2. b Todas as amostras foram positivas num ensaio imunolõgico anti-HIV-2.Efectuaramyse manchas Western de HiV-2, nestas amostras, 26 foram claramente positivas e 3 proporcionaram resultados indeterminados. REIVINDICA Ç 5 E S - ia- Processo para a preparação de um pe- • ptido da formula (I) 1 X-NSWGC-Y (I) 21

   em que i) xé KYLQDQARL e Y i AFRQVC, X ê AIEKYLQDQARL e Y é hidroxi, ou X ê K e Y é AFRQVCHTTVPWVN; ii) o grupo carboxi terminal está opcionalmente na forma de amida ? e iii) o grupo sulfidrilo de cada C estã livre ou bloqueado caracterizado por a) se condensar aminoacidos simples e/ou peptidos formados de dois ou mais aminoacidos na ordem necessária/ em que, quando o aminoãcido é eisteína, o seu grupo sulfidrilo está livre ou bloqueado; e b) se desejado, se converter o grupo carboxi terminal na forma amida desejada e, se desejado, se bloquear o grupo sulfidrilo livre da ou de cada resíduo cisteina. - 2a- Processo para a preparação de um pepti-do de fórmula (1) caracterizado por se transformar um célula hospedeira com um vector que incorpora um gene que codifica um peptido de fórmula (1) e que ê susceptível, na célula hospedeira, de expressar o peptido. ii) se cultivar a célula hospedeira transformada de forma a que o peptido seja expressado; e iii) se recuperar o peptido. - 3a- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o grupo carboxi terminal estar sob a forma de amida. - 4a- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado por o grupo sulfidrilo de cada C ser bloqueado utilizando um agente bloqueador. - 5a- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o grupo bloqueador ser acetamido-metilo, - 22 - ditiodipiridilo, ou ser derivado a partir do reagente de Ellman ou um composto organomercurio ou maleimida. - 6a- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente bloqueador ser derivado a partir de N-etil-maleimida. - 7a- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um peptido com a sequência de aminoãcidos seguintes KYLQDQARLNSWGCAFRQVC. - 8a- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um peptido possuindo a seguinte sequência de aminoãcidos KYLQDQARLNSWGCAFRQVC, estando o grupo carboxi terminal na forma amida e estando bloqueado o grupo sulfidrilo de cada 0. - 9a- Processo para a determinação da presença de anticorpos de HIV-2 num fluido corporal, caracterizado por compreender a) fazer-se contactar uma fase solida na qual se imobiliza um peptido obtido de acordo com as reivindicações anteriores, com uma amostra de ensaio; b) englobar utilizar meios para determinar se a amostra de en, saio continha algum dos referidos anticorpos. - 10a- Processo para determinar a presença de anticorpos de HIV-1 ou HIV-2 num fluido do corpo, caracterizado por; a) se fazer contactar uma fase solida, na qual se imobiliza um peptido obtido de acordo com as reivindicações anteriores e um polipeptido que apresenta um epítope ao qual se liga o anticorpo de HIV-1, com uma amostra de teste; - 23 -

   'Λ 1 ' '•U. r crjn b) englobar meios para determinar se a amostra de teste continha qualquer dos referidos anticorpos. - 11a- Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 9 e 10, caracterizado por os meios serem uma molécula ou partícula marcada. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a molécula ou partícula marcada ser fos-fatase alcalina, proteína A, proteína G, um sub-tipo de anti--espicie ou antiimunoglobulina, factor reumatõide, anticorpo ao peptido, ou qualquer molécula contendo o epítope que constitui o peptido. - 13a- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as moléculas ou partículas marcadas para a detecção de HIV-1 e HIV-2 serem iguais ou diferentes. - 14a- Conjunto de analise adequado para utilização na determinação da presença de anticorpos de HIV-2, caracterizado por se incorporar: a) um peptido preparado de acordo com as reivindicações de 1 a 8, marcado com um enzima, b) um substrato para o enzima c) meios para proporcionar uma superfície sobre qual se imobiliza um peptido preparado de acordo com as reivindicações de 1 a 8 e; d) eventualmente, soluções e/ou tampões de lavagem. - 15a- Conjunto de analise adequado para utilização num ensaio combinado para HIV-1 e HIV-2, caracterizado por incorporar: a) um peptido de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 8, marcado com um enzima; 24 b) um polipeptido que apresenta um epítope ao qual se liga o anticorpo de HIV-1 e que esta marcado com um enzima; c) substratos para as referidas enzimas para ambos; d) meios para proporcionar superfícies sobre as quais se imobiliza o peptido preparado de acordo com as reivindicações de 1 a 8/ e o polipeptido que apresenta um epítope ao qual se liga o anticorpo de HIV-1; e e) eventualmente, soluções e/ou tampões de lavagem. a 16 Conjunto de análise de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido peptido HIV-1 ser uma sequência gag de HIV-1 constituída pelos aminoãcidos 121 a 136 e uma sequência env ser uma sequência env de HIV-1 constituído pelos aminoãcidos de 542 a 674. A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 1 de Dezembro de 1988, sob ο N9. 8828098.7. Lisboa, 3o de Novembro de 1989 © AfiSSES ΦΜδϋΜι BL MBUEEMZJL·

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