DE69324509T2

DE69324509T2 - CENP-B peptid

Info

Publication number: DE69324509T2
Application number: DE69324509T
Authority: DE
Inventors: Waltherus Jacobus Van Venrooy; Ronald Verheyen
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1992-01-13
Filing date: 1993-01-12
Publication date: 1999-10-07
Anticipated expiration: 2013-01-13
Also published as: KR100296198B1; KR930016439A; GR3030727T3; EP0552829B1; FI109704B; ES2132171T3; DK0552829T3; FI930106A0; AU664063B2; JPH05310790A; AU3114993A; ATE179183T1; CA2087143A1; FI930106A; DE69324509D1; EP0552829A1; ZA93174B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Peptid oder Fragment davon, dass immunochemisch mit Anticentromer-Autoantikörpern. (ACA) reagiert.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis von Anticentromer-Autoantikörpern oder zum Nachweis von einem Centromer-Antigen in einer Testflüssigkeit und auch auf ein immunochemisches Reagenz und ein Test-Set zum Ausführen der genannten Nachweisverfahren.
Centromer-Komponente sind eines der Ziele einer hoch-selektiven Autoimmunantwort bei bestimmten Patienten mit rheumatischen Erkrankungen. Obwohl Anticentromer-Autoantikörper (ACA) primär in limitierter Sklerose oder CREST-Syndrom (Calcinose, Raynaud's Phänomen, ösophagaler Dysmotilität, Sclerodactylie, Telangiectasie) beobachtet wurden, wurden sie auch in Patienten mit verschiedenen anderen rheumatischen Erkrankungen und Vasculitis nachgewiesen. Earnshaw et al. zeigte 1985, dass ACA-positive Patientenseren drei immunologisch miteinander verwandte Centromerantigene, (CENP-A (17 kDa), CENP-B (80 kDa) und CENP-C (140 kDa) erkennen. Da hohe Antikörpertiter gegen CENP-B in allen ACA-positiven Patientenseren festgestellt wurden, wohingegen Antikörpertiter gegen CENP-A und CENP-C oft niedriger waren, wurde sich auf CENP-B als das hauptsächliche Centromer-Antigen bezogen. Es konnte gezeigt werden, dass ACA und Antitopoisomerase I-Antikörper bei Systemischer Sklerose als klinische Marker hilfreich sind. Earnshaw et al. gelang 1987 die Klonierung der cDNA von 95% der mRNA, die CENP-B codiert. Sie berichteten auch die erste Verwendung eines Proteins, d. h. CENP-B, in einem enzymgebundenen Immunadsorptionsessaysystem (ELISA) für den Nachweis von Autoantikörpern in Patientenseren. Das in ihren Experimenten verwendete Protein codiert für 147 Ami nosäurereste der carboxyterminalen Region von CENP-B, die mit 113 kDa der β-Galactosidase fusioniert ist. Für die Entwicklung eines spezifischen und empfindlichen Verfahrens, das die Feststellung einer verlässlichen Diagnose ermöglicht, ist es von grosser Bedeutung die immundominanten Epitope auf den genannten Proteinen zu identifizieren. Die letzten 60 C-terminalen Aminosäurereste von CENP-B bilden überraschenderweise eine wichtige und unerwartete autoantigene Domäne. Die Daten zeigen, dass alle Patientenseren, in denen ACA durch Immunfluoreszenz und Immunblotting nachgewiesen werden kann, Antikörper gegen dieses C-terminale CENP-B-Fragment aufweisen. Darüberhinaus ist das Expressionslevel dieses besonderen Teils von CENP-B als Fusionsprotein in E. coli viel höher als das Expressionslevel der letzten 157 C-terminalen Aminosäurereste des CENP-B, wohingegen seine Antigenität überraschenderweise mindestens so hoch ist, wie diejenige des längeren CENP-B-Fragments. Darüberhinaus ist dieses Material als Antigenquelle in einem ELISA-System zum Screenen von Patientenseren auf anti-CENP-B- Antikörper sehr geeignet.
Die Erfindung richtet sich auf ein Polypeptid mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder einem Fragment davon, worin das genannte Polypeptid oder Fragment davon immunochemisch mit Anticentromer-Autoantikörpern reagiert.
Analoge oder Derivate des Peptids gemäss Fig. 1 sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Der Begriff "Analoge" bezieht sich zum Beispiel auf post-Expressionsmodifikationen eines Peptids, zum Beispiel Glykosilierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen, etc.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein immunochemisches Reagenz, das ein Polypeptid gemäss der Erfindung umfasst, das an einen festen Träger gebunden ist oder mit einer Markierungssubstanz zur Verfügung gestellt wird.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Nachweis von Anticentromer-Autoantikörpern in einer Testflüssigkeit, worin ein Polypeptid gemäss der Erfindung mit der Testflüssigkeit in Kontakt gebracht wird und die Anwesenheit von zwischen dem Peptid und den Antikörpern in der Testflüssigkeit gebildeten Immunkomplexen nach gewiesen wird, was ein Mass für die Anwesenheit von Centromer- Antigen in der Testflüssigkeit ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein in einem Immungssay zu verwendendes Test-Set, wobei dieses Test-Set ein Polypeptid gemäss der Erfindung umfasst, das an einen festen Träger gebunden, ist der aus der Gruppe bestehend aus einer Microtestplattenvertiefung, Partikeln und kolloiden Lösungen (Sol) ausgewählt wird oder der mit einer markierenden Substanz zur Verfügung gestellt wird. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die neue, die Aminosäuren gemäss Fig. 1 codierende Nukleinsäuresequenz als Basis für einen Test zu verwenden, in dem CENP-DNA oder RNA mittels einer Nukleinsäureamplifikationstechnik wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder die auf der Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA) nachgewiesen wird.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis einer CENP-B-DNA oder -RNA-Sequenz in einer Testflüssigkeit unter Verwendung einer Sequenz oder eines Fragments davon, das für die Aminosäuresequenz gemäss der Erfindung codiert, als Primer, um eine Nukleinsäureamplifikation der genannten CENP-B- DNA- oder RNA-Sequenz durchzuführen und nachzuweisen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Test-Set, das als Amplifikations-Test-Set zum Nachweis von CENP-B-DNA oder -RNA verwendet wird, welches eine Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon umfasst, das für ein Polypeptid gemäss der Erfindung als Primer codiert.
Die obengenannten Peptide werden für die Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, in dem die Anwesenheit von CENP-B oder ACA in einer Testflüssigkeit bestimmt werden soll, für besonders geeignet gehalten.
Die Herstellung der Peptide gemäss der Erfindung wird mittels eines der bekannten organisch-chemischen Verfahren zur Peptidsynthese oder mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken bewirkt. Die letztere Methode schliesst die Herstellung der gewünschten Peptide durch Expression eines rekombinanten Polynukleotids mit einer Polynukleotidsequenz in einem geeigneten Microorganismus als Wirt ein, wobei die genannte Polynukleotidsequenz eines oder mehrere der in Frage kommenden Peptide codiert.
Die organisch-chemischen Verfahren für die Peptidsynthese sollten das Koppeln der erforderlichen Aminosäuren mittels der Kondensationsreaktion entweder in der homogenen Phase oder mit Hilfe einer festen Phase einschliessen.
Wie bereits oben angezeigt, können die Peptide der vorliegenden Erfindung auch mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Möglichkeit ist besonders dann von Bedeutung, wenn das Peptid in eine wiederholende (repeating) Sequenz ("Im Tandem") eingebaut ist oder wenn das Peptid als Bestanteil eines (viel grösseren) Proteins oder Polypeptids hergestellt wird. Diese Art der Herstellung des Peptids fällt daher ebenfalls in den Rahmen der Erfindung.
Ein Polynukleotid dieser Art, das für das Peptid gemäss der Erfindung codiert und eine rekombinante DNA, in die dieses Polynukleotid eingebaut ist, fallen ebenfalls in den Rahmen dieser Erfindung.
Ohne speziell in den Ansprüchen mit aufgenommen zu sein, ist es selbstverständlich, dass eine oder mehrere Aminosäuren in den erfindungsgemässen Peptiden durch andere Aminosäuren oder Aminosäuren-Analoge oder Derivate ersetzt werden, ohne die immunochemische Reaktionsfähigkeit der in Frage kommenden Peptide zu beeinträchtigen.
Funktionelle Derivate der obengenannten Peptide sind:
(a) Säureadditionssalze der Peptide;
(b) Amide der Peptide und insbesondere die C-terminalen Amide;
(c) Ester und insbesondere C-terminale Ester und
(d) N-Acyl-Derivate, speziell N-terminale Acyl-Derivate und insbesondere N-Acetyl-Derivate werden ebenfalls als erfindungsgemässe Peptide betrachtet.
Die Bezeichnung "immunochemisches Reagenz" zeigt, dass die Peptide gemäss der Erfindung an einen geeigneten Träger gebunden werden oder mit einer markierenden Substanz zur Verfügung gestellt werden.
Die Träger, die verwendet werden können, sind zum Beispiel die innere Wand einer Microtestplattenvertiefung oder einer Küvette, ein Schlauch oder eine Kapillare, eine Membran, Filter, Teststreifen oder die Oberfläche eines Partikels wie zum Beispiel ein Latex- Partikel, ein Erythrocyt, ein Farbsol, ein Metallsol oder eine Metallverbindung als Solpartikel.
Markierende Substanzen, die verwendet werden können, sind unter anderem radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen, ein Enzym, ein Farbsol, Metallsol oder Metallverbindung als Solpartikel.
In einem Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, die gegen ein Zentromer-Antigen in einer Testflüssigkeit gerichtet sind, wird ein immunochemisches Reagenz gemäss der Erfindung mit der Testflüssigkeit in Kontakt gebracht. Danach ist die Anwesenheit von Immunkomplexen, die sich zwischen dem Peptid und den Antikörpern in der Testflüssigkeit gebildet haben, ein Mass für die Anwesenheit der genannten Antikörper in der Testflüssigkeit.
Die immunochemische Reaktion, die unter Verwendung dieser Nachweisverfahren stattfindet, ist vorzugsweise eine Sandwich- Reaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
Zum Nachweis eines Centromer-Antigens, zum Beispiel CENP-B, in einer Testflüssigkeit, wird ein immunochemisches Reagenz gemäss der Erfindung mit der Testflüssigkeit und ACA in Kontakt gebracht, wonach die Anwesenheit der gebildeten Immunkomplexe nachgewiesen wird und davon ausgehend kann die Anwesenheit von CENP-B-Antigen in einer Testflüssigkeit bestimmt werden.
Ein besonders geeignetes Verfahren zum Nachweis des CENP-B- Antigens in einer Testflüssigkeit, die verwendet werden kann, ist eine Kompetitionsreaktion zwischen einem Peptid gemäss der Erfindung, das mit einer markierenden Substanz ausgestattet ist und einem CENP-B-Antigen (in der Testflüssigkeit anwesend) um eine Bindungstelle auf dem Antikörper, der gegen CENP-B gerichtet ist, welches an einen festen Träger gebunden ist.
Ein erfindungsgemässes Test-Set umfasst ein wie oben beschriebenes immunochemisches Reagenz. Zum Ausführen einer Sandwich-Reaktion kann das Test-Set zum Beispiel ein erfindungsgemässes Peptid umfassen, das an einen festen Träger gebunden ist, zum Beispiel die innere Wand einer Microtestplattenvertiefung, sowie entweder an ein markiertes synthetisches Peptid gemäss der Erfindung oder an einen markierten anti-Antikörper.
Um die Kompetitionsreaktion durchzuführen, kann das Test-Set ein Peptid gemäss der Erfindung umfassen, das an einen festen Träger gebunden ist, einen markierten Antikörper, der gegen das CENP-B- Antigen gerichtet ist, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der gegen das genannte Peptid gerichtet ist und das dann verwendet wird, um mit ACA in einer Testflüssigkeit zu kompetitieren.
In einer Agglutinationsreaktion muss ein immunochemisches Reagenz, das ein erfindungsgemässes Peptid umfasst und an Partikel einschliesslich Sol gebunden vorliegt, in direkten Kontakt mit der Testflüssigkeit gebracht werden, in der sich die gegen das CENP-B- Antigen gerichteten Antikörper, die nachgewiesen werden sollen, befinden.
Eine andere Ausführungsform eines Test-Sets ist zum Beispiel die Verwendung eines markierten Peptids gemäss der Erfindung als immunochemisches Reagenz in einer Kompetitionsreaktion mit einem nachzuweisenden CENP-B-Antigen um eine Bindungsstelle auf den Antikörper, der gegen CENP-B gerichtet ist, das an einen festen Träger gebunden ist.

Beispiel I

Seren

Die meisten Patientenseren wurden von der Abteilung für Rheumatologie des Universitätskrankenhauses St. Radboud, Nijmegen, Niederlande erhalten. Einige zusätzliche Seren wurden von Krankenhäusern in Enschede, Deventer und Groningen, Niederlande erhalten.

Isolierung von cDNA-Klonen, die für CENP-B-Fragmente codieren

Eine Mischung aus zwei menschlichen Seren, die beide Anticentromer- Antikörper enthielten, wurde verwendet, um eine menschli che plazentale cDNA-Expressionbibliothek (Clontech HL100 8b) zu screenen, welche mit dem λgt11-Vektor konstruiert wurde. Jedes Serum wurde in einer Verdünnung von 1 : 1000 verwendet. Um spezifisch gebundenen Antikörper nachzuweisen, wurde ¹²&sup5;I-markiertes antimenschliches Schaf-Immunglobulin F(ab)&sub2; (Amersham, UK) verwendet. Mit diesem Verfahren wurden vier immunpositive Klone nachgewiesen. Diese Klone, als 23 (1009 bp), 7 (1210 bp), 15 (1306 bp) und 13 (970 bp) codieren 60, 125, 157 beziehungsweise 161 Aminosäurereste der carboxyterminalen Region von CENP-B.
Die cDNAs wurden in Plasmide des bakteriellen pGEX- Expressionssysten ligiert und mit genetischen Sequenzen, die für Glutathion S-Transferase (GST; 26 kDa) codieren, "in Phase" fusioniert. Klon 23 wurde in die BamHI-Stelle des pGEX-2T und Klon 15 in die EcoRI-Stelle des pGEX-3X inseriert. Die hergestellten Fusionsproteine wurden als GST-CENP-B/23 (33 kDa) und GST-CENP-B/15 (52 kDa) bezeichnet.
E. coli DH5α wurde als Wirt zur Aufrechterhaltung des Plasmids als auch zur Produktion des Fusionsproteins verwendet.

DNA-Sequenz-Analyse

cDNA-Fragmente wurde mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen verdaut. Die DNA-Fragmente wurden in die Polylinker-Region von M13mp18 ligiert. Sequenzanalyse der DNA-Fragmente wurde mit Hilfe der Didesoxy-Kettenterminationsmethode durchgeführt.

Gelelektrophorese, Protein-Blotting und Nachweis von Antigenen

SDS-PAGE und Transfer der Proteine von 13%-igen oder 18%-igen Polyacrylamidgelen auf Nitrocelulose-Filter (Schleicher & Schuell- Filter, BA85, Dassel, Deutschland) wurde durchgeführt. Die Immunblots wurden behandelt und weiterverarbeitet. Die Antikörper- Antigen-Komplexe wurden entweder mit an Rettich-Peroxidase konjugierte zweite Antikörpern oder mit ¹²&sup5;I-markiertem anti-menschlichem Ig (ganzer Antikörper) von Schafen (Amersham) nachgewiesen.

Produktion und Reinigung des Fusionsproteins

Übernachtkulturen aus E. coli DH5α, die mit pGEX-2T/23 oder pGEX- 3X/15 transformiert wurden, wurden 1 : 29 in 100 ml frischer L-Brühe verdünnt, die 100 ul/ml Ampicillin enthielt und 1 Stunde bei 37ºC mit intensiver Belüftung wachsen gelassen, bevor IPTG (Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid: Research Organics, Cleveland, USA) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben wurde. Nach drei weiteren Stunden Wachstum, wurden die Zellen pelletiert und in 2 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert, die 0,5 mM des Proteaseinhibitors Phenylmethylsulfonyl-Chlorid (PMSC) enthielt.
Die Zellen wurden durch dreimaligen Gefrieren/Tauen lysiert, dem eine 20 minütige Inkubation bei 37ºC mit 50 ug/ml Desoxyribonuklease I (Dnase I) (Sigma) folgte.
Anschliessend wurde 0,1 mg Lysozym in 0,4 ml 50% (G/V) Saccharose, 10 mM Tris. HCl pH 8,0, 1 mM Na-EDTA pH 8,0 und 100 mM NaCl zugegeben. Die Inkubation wurde 30 Minuten auf Eis durchgeführt. Nach Zugabe von 0,2 ml 10%igen (V/V) Nonidet P-40 und 0,2 ml Na-EDTA pH 7,5, wurde die Suspension weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 3,5 mg/ml Zwittergent-Detergens 3-14 (Calbiochem, San Diego, USA) wurde die Suspension dreimal 1 Minute auf Eis unter Verwendung eines Branson-Ultraschallgeräts B-12 mit Microspitze Ultraschall-behandelt. Die Suspension wurde auf 1 ml einer 40% (G/V)-Saccharose-Lösung in PBS gegeben und 30 Minuten bei 10'000 g und 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde anschliessend in 0,5 ml 8 M Harnstoff resuspendiert. Dieses Material wurde 1 : 20'000 in "Coating"-Puffer (Na-Carbonat-Puffer pH 9,6 : 35 mM NaHCO&sub3;/15mM Na&sub2;CO&sub3;) zur Verwendung in dem ELISA verdünnt.

Beipiel II

Enzym-gebunder Immunadsorptionsassay (ELISA)

Zum Nachweis von Antikörpern gegen CENP-B wurde ein Enzym-Assay zusammengestellt, der mit Zwittergent-gereinigtes Fusionsprotein GST-CENP-NB/23 verwendet. Optimale Konzentrationen an Antigen, Patientenseren und Konjugaten wurden nach geeigneten Schachbrett- Titrationen hergestellt.
Polystyrol-Microtiterplatten (Greiner; 96 Vertiefungen) wurden mit 100 ul/Vertiefung einer Verdünnung aus GST-CENP-B/23 (0,5 ug/ml) in "Coating"-Puffer überzogen und über Nacht bei 4ºC gehalten. Die Antigen-Lösung wurde dann entfernt und die Platten 5 mal mit PBS/0,5% (V/V) Tween-20 gewaschen. Die übriggebliebenen freien Bindungsstellen wurden durch Zugabe von 150 ul/Vertiefung 0,1%- igen (GIV) Rinderserumalbumin (BSA), das in "Coating-Puffer" verdünnt wurde, blockiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden die Platten 5 mal mit PBS/Tween gewaschen. Der Assay wurde mit 50 ul Serum/Vertiefung durchgeführt, das 1 : 100, 1 : 200 und 1 : 400 in RIA-Puffer (0,3% (G/V) BSA, 350 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,6, 1% (V/V) Triton X-100, 0,5% (G/V) Na- Desoxycholat, 0,1% (G/V) Na-dodecylsulfat), das mit 10% (V/V) normalem Hasenserum ergänzt wurde, durchgeführt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 6 mal mit PBS/Tween gewaschen.
In jede Vertiefung wurden 50 ul der folgenden Hasen-anti-Mensch Peroxidase-kongierten Antikörper gegeben:
- IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, (DAKOpatts, Glostrup, Dänemark: P- 212), 1 : 1000 in RIA-Puffer verdünnt.
- IgG (γ-Ketten) (DAKOpatts: P-214, 1 : 5000 in RIA-Puffer verdünnt,
- IgA (α-Ketten) (DAKOpatts: P-216), 1 : 2000 in RIA-Puffer verdünnt.
- IgM (u-Ketten) (DAKOpatts: P-215), 1 : 2000 in RIA-Puffer verdünnt.
Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 6 mal mit PBS/Tween gewaschen.
Gebundene Antikörper wurden mit 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Sigma) gemäss Standardverfahren visualisiert. Die Farbreaktion wurde nach 10 Minuten durch Zugabe von 100 ul 2M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Platten wurden auf einem BioRad Model 2550 ELISA-Leser bei 450 nm abgelesen. Alle Seren wurden vierfach getestet und von den Ergebnissen das Mittel gebildet. Werte, die höher als das dop pelte Level von gepooltem normalem menschlichem Serum waren, wurden als positiv betrachtet.
Die 81 Seren, positiv sowohl für Anti-CENP-A und Anti-CENP-B- Antikörper in der Immunblot-Analyse, ergaben alle positive Immunreaktionen mit dem GST-CENP-B/23-Protein. Sehr starke Immunreaktionen (OD-Werte > 2) wurden mit 65 der 81 Seren erhalten. Die OD- Werte der anderen 16 Seren in dieser Gruppe rangierten von 0,6 bis 2,0.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der ELISA mit dem CENP-B- Peptid gemäss der Erfindung als ein Fortschritt beim Screenen von Patientenseren auf die Anwesenheit von ACA angesehen werden kann.

Claims

1. Polypeptid mit einer wie in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, worin genanntes Polypeptid oder Fragment davon mit Anticentromer-Autoantikörpern immunochemisch reagiert.

2. Immunochemisches Reagenz, welches ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 umfasst, das an einen festen Träger gebunden ist oder mit einer Markierungssubstanz zur Verfügung gestellt wird.

3. Verfahren zum Nachweis von Anticentromer-Autoantikörpern in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 mit der Testflüssigkeit in Kontakt gebracht wird und die Anwesenheit von Immunkomplexen, die sich zwischen dem Peptid und den Antikörpern in der Testflüssigkeit gebildet haben, nachgewiesen wird, was ein Mass für die Anwesenheit von Anticentromer-Autoantikörpern in der Testflüssigkeit ist.

4. Verfahren zu Nachweis von Centromer-Antigen in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 mit der Testflüssigkeit und Anticentromer- Autoantikörpern in Kontakt gebracht wird, wonach die Anwesenheit von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen wird, was ein Mass für die Anwesenheit von Centromer-Antigen in der Testflüssigkeit ist.

5. Verfahren für die Amplifikation und den Nachweis einer CENP-B DNA- oder RNA-Sequenz in einer Testflüssigkeit unter Verwendung einer Sequenz oder eines Fragments davon, welche(s) die Aminosäuresequenz gemäss Anspruch 1 als Primer codiert, um eine Amplifikation der Nukleinsäure der genannten CENP-B DNA- oder RNA-Sequenz durchzuführen und nachzuweisen.

6. Test-Set, welches ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 umfasst, das an einen festen Träger gebunden ist, der aus der Gruppe bestehend aus Microtestplattenvertiefungen, Partikeln oder kolloiden Lösungen (Sol) ausgewählt wird oder der mit einer Markierungssubstanz zur Verfügung gestellt wird.

7. Amplifikationstest-Set zum Nachweis von CENP-B DNA oder RNA, der eine Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon umfasst, das ein Polypeptid von Anspruch 1 als Primer codiert.