CN1156703C - 生物化学型蛋白质芯片及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物化学型蛋白质芯片及其制作方法，用于抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞的并行检测、识别和鉴定。主要由载体基片及固化在该载体基片上的稳定化点样物组成，特点是点样物中所含稳定剂是由海藻糖、C₂-C₁₀的烷基多元醇和防腐剂组成。具有结构简单、操作方便、稳定性高和灵敏、准确、特异的优点，且制备工艺简单，可大规模自动化生产。

Description

生物化学型蛋白质芯片及其制作方法

技术领域

本发明属于生命科学领域，涉及一种对蛋白质、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞进行并行检测、识别、鉴定的装置，特别是一种生物化学型蛋白质芯片。本发明还涉及该生物化学型蛋白质芯片的制作方法。

背景技术

现有的生物芯片，是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵。是利用生物大分子间具有特异相互识别的能力而将他们有序的排列在固相载体基片(膜、玻璃片、硅片等)上，与检测样品和标记的生物分子同时反应或杂交，经过自动阅读设备可获得大量有用的生物信息。

生物芯片中的DNA芯片，又称基因芯片，是一种高密度的寡聚核苷酸(DNA探针)微阵列。它采用原位组合合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者利用其他方法将大量特定序列的DNA片段(探针)有序地固化在玻璃或硅片上，从而构成储存有大量生命信息的DNA芯片。

生物芯片中的肽芯片是将肽或蛋白质固定到特定固相载体基质上，利用肽或蛋白质能特异性与配体分子(如抗原或抗体)结合的原理，与血清或样品液发生特异性反应，然后通过相应的标记分子，用来大规模检测抗原、抗体或蛋白质、多肽片段。

肽芯片又称为蛋白质芯片，其与基因芯片的基本原理相同，结合以免疫标记反应，在一种固相载体基片上，用不同的方法将不同来源的多种蛋白质(抗原或抗体)直接点样于其上，使之与载体基片牢固结合，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。抗原或抗体物质大部分都是蛋白质，抗原抗体的结合又是特异性的，在抗原或抗体上可以加上各种标记以检测相应的抗体或抗原。抗原抗体在蛋白质芯片上与带有特殊标记的蛋白质分子(抗体或抗原)进行特异性免疫反应，两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，用于检测相应的抗体或抗原。这种技术的特点是高通量、微型化、并行化和自动化，可广泛应用于临床疾病的检测、药物的筛选及蛋白质相互作用的研究等各领域。

Ciphergen Biosystems公司是世界上较早发展蛋白质芯片的公司，并提出蛋白质芯片可分为化学型和生物化学型蛋白质芯片两种类型(Merchant M etal.Electrophoresis，2000，21：1164-1177)。化学型蛋白质芯片的构想基于经典色谱介质(反相层析、离子交换层析、金属螯合层析等)，其基本原理是：铺有相关介质的蛋白质芯片可以通过介质的疏水力、静电力、共价键等结合样品中的蛋白质，然后经特定的洗脱液除去杂质蛋白质，而保留感兴趣的蛋白质进行分析。该类化学型蛋白质芯片特异性较差。生物化学型蛋白质芯片则是把生物活性分子(抗原或抗体、受体、配体等)结合到芯片表面，用于捕获样品中的靶蛋白。由于生物化学型蛋白质芯片具有高度的特异性及生物活性分子的多样性，其应用范围和应用前景都明显优于化学型蛋白质芯片。目前Ciphergen Biosystems公司所生产和推广的蛋白质芯片大多数还局限于化学型芯片。Arenkov等(Arenkov P et al.Anal Biochem，2000，289：123-131)把探针蛋白固定于微型聚丙烯酰胺凝胶块中构建蛋白质芯片，利用电泳原理捕获样品中与探针蛋白特异结合的靶蛋白。

由于蛋白质比DNA难合成，更难于在固相支持物表面合成，并且定位于固体表面的蛋白质易于改变空间构象而失去活性，难于保持固体表面蛋白质的生物活性，使得该类蛋白质芯片无论从制作还是应用方面都要比DNA芯片复杂得多，因此，蛋白质芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性，成为限制蛋白质芯片发展的瓶颈技术。

最近Macbearth等(Macbearth G et al.Science，2000，289：1760-1763)在蛋白质芯片制作方面获得突破性进展。他们首先在玻片表面覆盖一层牛血清白蛋白(牛血清白蛋白可以提供亲水性表面防止点样于其上的探针蛋白变性)，然后用机器人把探针蛋白点到玻片表面，形成直径约150-200微米高密度排列的点阵(1600点/cm²)；再利用化学反应把探针蛋白锚定于BSA膜表面。这一制作程序不仅引进了DNA芯片制作的机器人和普通商品化的玻片，而且较成功地解决了固体表面蛋白质活性的问题。

蛋白质芯片要解决的问题不外有三：一是保持蛋白的活性，二是保证蛋白质正确定位，三是与现存的mRNA微型芯片研究工具要相兼容。Gavin MacBearth and StuartSchreiber的解决方案是：首先在点样的纳升级溶液中加入40％甘油，以防止蛋白变性。在膜表面覆盖一层与氨基反应的试剂。这样，蛋白质的氨基末端或赖氨酸残基就会与此试剂反应而固定于膜上。每一种蛋白质都会以多种不同的方向进行定位，保证有正确的定位。然后用BSA进行封闭，降低膜上的背景，这样就可以与待测蛋白质进行杂交了。Gavin MacBearth and Stuart Schreiber利用上述手段制成了每平方厘米有1600个点的蛋白质微型方阵，用来研究蛋白质间的相互作用及其与小分子作用的研究(MacBearth，G.Schreiber，S.L.Printing proteins as microarrays for high-throughputfunction determination.Science，2000，289：1760-1763 PubMed)。

上述生物化学型蛋白质芯片制备方法虽然简便实用，但由于蛋白质探针溶液中加入40％甘油，导致溶液粘稠度增高，很难真正实现纳升级定量吸样，且甘油溶液对蛋白质活性的保护作用不全面。甘油仅能在溶液状态下对蛋白质的活性具有一定的保护作用，在干燥状态下就失去其保护作用，且存在含有甘油的点样物难于干燥的弊端。蛋白质芯片制备过程中的关键环节是保持蛋白的活性，尤其是在干燥状态下保持蛋白质的活性不变，仅靠40％甘油很难担此重任。在蛋白质探针微点阵的干燥过程中和干燥状态下常会造成蛋白质探针发生不可逆的变性或活性的损失，从而影响了蛋白质芯片的检测灵敏度和特异性，甚至影响了蛋白质芯片的稳定性和保存期。

发明内容

本发明的任务是：提供一种灵敏度和准确度高并可稳定存放且制备方法简便、适合批量生产的生物化学型蛋白质芯片。

本发明还涉及上述生物化学型蛋白质芯片的制作方法。

本发明是这样实现的：

一种生物化学型蛋白质芯片，用于检测待测样品中的抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞的存在与否，主要由载体基片及固化在该载体基片上的点样物组成，在载体基片上的点样物中还同时含有靶探针和稳定剂，其特征在于：上述点样物中所含稳定剂是由海藻糖、C₂-C₁₀的烷基多元醇和防腐剂组成；所述防腐剂是叠氮钠、硫柳汞、洗必泰、新洁尔灭中的任一种；上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30；靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1；烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。

根据本发明，上述点样物中所含靶探针用于捕获待检样品中的待测物；稳定剂即上述靶探针的稳定剂，用于稳定点样物中的靶探针；上述靶探针为抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞。

根据本发明，其制作方法主要是将已合成或纯化好的不同类型的靶探针和上述稳定剂按比例混合即成为点样物，然后取上述点样物打印或点样于载体基片上的相应位点上，再用小牛血清封闭载体基片上没结合点样物的活性基团。

本发明制作方法的特征是：将上述已合成或纯化好的靶探针用上述稳定剂进行稳定化处理，其制作方法是：取1-10mg干重的靶探针和30-100mg海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇混合后再加蒸馏水至1ml溶解即为稳定化点样物；或向含有1-10mg/ml靶探针的溶液500-900μl中加入30-100mg的海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇。

根据本发明，上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30，靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1，烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。

据此可制备成不同类型靶探针的稳定化点样物，其中烷基多元醇和防腐剂在液体状态下稳定靶探针的生物活性，海藻糖在干燥过程中甚至在干燥状态下稳定靶探针的生物活性，三者联合发挥作用，无论在溶液中还是在干燥状态，均可避免靶探针发生不可逆的变性或活性的损失，从而提高了本发明的检测灵敏度和特异性及其稳定性和保存期，以达到特异性、微量化、并行化检测多种抗原或抗体及多种疾病的目的。

本发明由于在载体基片上含有稳定化的靶探针点样物，只需一次加入血清或待检样品，靶探针与待检血清或样品中的抗体或抗原发生特异性的免疫反应，然后洗涤掉未发生反应的物质，进一步与加入的标记物反应，再洗涤除去多余的标记物，然后通过显色或发光反应观察结果。如果待检血清或样品中有相应的抗体或抗原，就能被载体基片上含有的靶探针捕获，而后再特异性地结合标记物而发生显色或发光反应，结果为阳性；如果待检血清或样品中没有相应的抗体或抗原，就不能被载体基片上含有的靶探针捕获，就不能特异性地结合标记物，标记物被洗涤除去，就不能发生显色或发光反应，结果为阴性。本发明由于采用稳定剂对靶探针进行稳定化处理，使操作简便快速，结果准确可靠，灵敏度和特异性高，并可稳定存放。其室温稳定性可与金标渗滤法相媲美，适用于以三明治夹心法、双位点一步法、间接法和捕获法为原理的免疫标记法对抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞进行并行检测、识别和鉴定。具有结构简单、操作方便、稳定性高和灵敏、准确、特异的优点，且制备工艺简单，可大规模自动化生产。

具体实施方式

下面就对本发明作进一步的详细描述。

本发明为一种生物化学型蛋白质芯片，主要由载体基片及固化在该载体基片上的点样物组成，在载体基片上的点样物中还同时含有靶探针和稳定剂，其特征在于：上述点样物中所含稳定剂是由海藻糖、C₂-C₁₀的烷基多元醇和防腐剂组成；所述防腐剂是叠氮钠、硫柳汞、洗必泰、新洁尔灭中的任一种；上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30；靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1；烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。

上述点样物中所含靶探针用于捕获待检样品中的待测物；稳定剂即上述靶探针的稳定剂，用于稳定点样物中的靶探针。

所述的靶探针是抗原、抗体、药物受体、多糖凝集素、细胞或组织中的任一种；上述抗体包括不同位点的单克隆抗体、抗人IgM捕获抗体、抗人IgG抗体、二抗抗体及蛋黄抗体IgY。

本发明的另一特征为点样物中还同时含有蛋黄抗体IgY靶探针和稳定剂。由于蛋黄抗体IgY性质稳定、耐酸、耐热，且不激活内源性补体，也不与补体和类风湿因子结合，不会引起内源性干扰，能满足稳定性、灵敏度和准确度的要求。纯化好的特异性蛋黄抗体IgY在室温中保存6个月，其抗体活性不变。在本发明所述稳定剂的存在下，本发明点样物中的蛋黄抗体IgY靶探针的生物活性可稳定1-2年不发生变化。

本发明的制作方法主要是将已合成或纯化好的不同类型的靶探针和上述稳定剂按比例混合即成为点样物，然后取上述点样物打印或点样子载体基片上的相应位点上，再用小牛血清封闭载体基片上没结合点样物的活性基团。

上述载体基片，是通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体基片表面键合上各种各样的活性基团，以便与点样物共价结合，形成具有不同生物特异性的亲和型载体基片，用来固定和检测各种不同的活性生物分子，如蛋白质、多肽、酶、抗原、抗体、药物和受体、多糖或凝集素、组织或细胞等。不同的载体基片可以用不同的活化试剂把载体基片表面活化，如表面为羧基的载体基片，用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)把表面变成活泼酯，然后再同点样物中各种不同的生物分子偶联；如此采用类似公知共用的方法，可以分别把含有羟基、氨基、醛基、肼基、巯基等基团的载体基片表面活化成活性基团，然后再与点样物进行不同的键和反应，从而把点样物中的生物活性分子以共价结合的方式固定于载体基片上。

本发明制作方法的特征是：将上述已合成或纯化好的靶探针用上述稳定剂进行稳定化处理，其制作方法是：取1-10mg干重的靶探针和30-100mg海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇混合后再加蒸馏水至1ml溶解即为稳定化点样物；或向含有1--10mg/ml靶探针的溶液500-900μl中加入30-100mg的海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇。

上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30，靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1，烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。

所述的靶探针是抗原、抗体、药物受体、多糖凝集素、细胞或组织中的任一种；上述抗体包括不同位点的单克隆抗体、抗人IgM捕获抗体、抗人IgG抗体、二抗抗体以及蛋黄抗体IgY。

所述的烷基多元醇是C₂-C₁₀的烷基多元醇；所述的防腐剂是叠氮钠、硫柳汞、洗必泰、新洁尔灭中的任一种。

上述稳定剂稳定点样物中生物活性分子的机理：海藻糖是一种非还原性二糖，其化学性质极为稳定，无毒无害，不会焦糖化。它具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。其对抗脱水的高效力生物保护作用与海藻糖的玻璃态形成有关，生物活性分子可通过海藻糖玻璃化转变的趋势，形成无定型连续相，在结构上与玻璃态的冰相似，在这种结构中生物活性分子的运动或变性反应非常微弱，从而稳定生物分子的活性。另外海藻糖和烷基多元醇的羟基同生物分子以氢键的形式结合，提高了生物分子的热变性温度，增加了生物分子的热稳定性。再者海藻糖和烷基多元醇分子可包裹在生物分子周围，或填充在生物分子的空间结构内，特别是生物分子的活性部位附近，并形成玻璃态，将生物分子的空间结构固定，从而避免生物分子的失活。在另一方面，通常认为生物体中的蛋白质、糖、脂类和其他生物大分子物质的周围均包围着一层水膜，这层水膜对维持生物分子的结构和功能是必不可少的，当生物分子失去维持其结构和功能特性的水膜时，海藻糖和烷基多元醇能在生物分子的失水部位以氢键形式联接，形成一层保护膜以代替失去的结构水膜，从而稳定生物分子的空间结构和生物活性。防腐剂尤其是叠氮钠可抑制点样物中细菌的生长。

上述海藻糖、烷基多元醇和防腐剂共同组成靶探针的稳定剂，其中烷基多元醇和防腐剂在液体状态下稳定靶探针的生物活性，海藻糖和防腐剂在干燥过程中甚至在干燥状态下稳定靶探针的生物活性，三者联合发挥作用，无论在溶液中还是在干燥状态，均可避免靶探针发生不可逆的变性或活性的损失，从而提高了本发明的检测灵敏度和特异性及其稳定性和保存期，以达到特异性、微量化、并行化检测多种抗原或抗体及多种疾病的目的。

本发明由于在载体基片上含有稳定化的靶探针点样物，只需一次加入血清或待检样品，靶探针与待检血清或样品中的抗体或抗原发生特异性的免疫反应，然后洗涤掉未发生反应的物质，进一步与加入的标记物反应，再洗涤除去多余的标记物，然后通过显色或发光反应观察结果。如果待检血清或样品中有相应的抗体或抗原，就能被载体基片上含有的靶探针捕获，而后再特异性地结合标记物而发生显色或发光反应，结果为阳性；如果待检血清或样品中没有相应的抗体或抗原，就不能被载体基片上含有的靶探针捕获，就不能特异性地结合标记物，标记物被洗涤除去，就不能发生显色或发光反应，结果为阴性。本发明由于采用稳定剂对靶探针进行稳定化处理，使操作简便快速，结果准确可靠，灵敏度和特异性高，并可稳定存放。其室温稳定性可与金标渗滤法相媲美，适用于以三明治夹心法、双位点一步法、间接法和捕获法为原理的免疫标记法对抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞进行并行检测、识别和鉴定。具有结构简单、操作方便、稳定性高和灵敏、准确、特异的优点，且制备工艺简单，可大规模自动化生产。

Claims (5)

1、一种生物化学型蛋白质芯片，主要由含有活性基团的载体基片及固化在该载体基片上的点样物组成，载体基片上的点样物中还同时含有靶探针和稳定剂，其特征在于：上述点样物中所含稳定剂是由海藻糖、C₂-C₁₀的烷基多元醇和防腐剂组成；所述防腐剂是叠氮钠、硫柳汞、洗必泰、新洁尔灭中的任一种；上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30；靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1；烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。

2、根据权利要求1所述的生物化学型蛋白质芯片，其特征在于：上述点样物中的靶探针是抗原、抗体、药物受体、多糖凝集素、细胞或组织中的任一种；上述抗体包括不同位点的单克隆抗体、抗人IgM捕获抗体、抗人IgG抗体、二抗抗体以及蛋黄抗体IgY。

3、根据权利要求1所述的生物化学型蛋白质芯片，其特征在于：适用于对抗原或抗体、药物或受体、多糖或凝集素、组织或细胞进行并行检测、识别、鉴定及蛋白质组学研究。

4、一种制造权利要求1所述的生物化学型蛋白质芯片的方法，主要是将已合成或纯化好的不同类型的靶探针和上述稳定剂按比例混合即成为点样物，然后取上述点样物打印或点样于载体基片上的相应位点上，再用小牛血清封闭载体基片上没结合点样物的活性基团，其特征是：取1-10mg干重的靶探针和30-100mg海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇混合后再加蒸馏水至1ml溶解即为稳定化点样物；或向含有1-10mg/ml靶探针的溶液500-900μl中加入30-100mg的海藻糖、0.01-1.0mg防腐剂和100-500μl烷基多元醇。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：上述稳定化点样物中靶探针与海藻糖的重量比为1∶10-30；靶探针与防腐剂的重量比为1∶0.01-1；烷基多元醇在上述稳定化点样物溶液中的体积比是10-50∶100。