CN113125745B

CN113125745B - 一种心脏功能检测试剂盒

Info

Publication number: CN113125745B
Application number: CN201911417414.3A
Authority: CN
Inventors: 吕志强; 胡守旺; 黄若磐
Original assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN113125745A

Abstract

本发明提供一种心脏功能检测试剂盒：包括检测芯片、被免疫标记物标记的检测抗体和抗原稀释液；抗体芯片包括固相载体和捕获抗体，捕获抗体被固定在固相载体的表面，捕获抗体包括抗CTnI捕获抗体，此外，捕获抗体还包括抗CKMB捕获抗体、抗MYO捕获抗体、抗NT‑proBNP捕获抗体、抗H‑FABP捕获抗体中的至少一种；检测抗体包括抗CTnI检测抗体；抗原稀释液中含有0.1％–1％多肽，多肽的氨基酸序列包括了TNC蛋白的全长序列或部分序列。本发明的心脏功能检测试剂盒能够在同一块检测芯片上实现CTnI和其它心脏功能相关的蛋白因子的定量检测，并且能够达到较高的灵敏度、准确率和可重复性。

Description

一种心脏功能检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外免疫分析技术领域，具体地，涉及一种心脏功能检测试剂盒。

背景技术

肌钙蛋白 I(CTnI)是肌钙蛋白中的一个亚型，为心肌细胞所特有，其特异性强，灵敏度高，发病后持续时间长，是一种十分敏感和高特异性的心肌标记物，CTnI 在急性心肌梗塞（AMI）患者胸痛发生后 1h～6h 开始升高，是 6h 内最特异的诊断指标，且诊断窗口期长达 4d～8d。有研究发现 CTnI 的升高不仅能检出急性心肌梗死，而且其含量与心肌受损面积成正比，还能检测出微小的心肌损伤。CTnI与TnC, TnT形成复合物。通常，检测患者血液中的CTnI时，有多种影响因素会影响抗体结合表位的可反应性，从而使 CTnI 的定量检测结果产生偏差。这些影响因素包括磷酸化作用、蛋白质降解作用或者自身抗体导致的表位阻挡，这些因素对于抗体与 CTnI 之间相互作用的影响是多方面的。

肌酸激酶同工酶（CK-MB）是一种心肌标志物中的一种，主要分布于心肌组织，在骨骼肌损伤时也会升高，是临床上诊断心肌损伤最常用的指标之一。一般认为 CK-MB 高于正常上限的两倍考虑心肌损伤的可能，CK-MB 水平在心肌损伤后 2h～12h 内急剧上升，一般持续 2d～3d。

心肌细胞首先合成108个氨基酸的BNP原，称之为proBNP（BNP 前体）。在受到心肌细胞的刺激后（例如，心肌细胞拉伸），proBNP 在蛋白酶作用下列解为NT-proBNP（即，氨基末端脑钠肽前体）和生物活性激素 BNP。NT-proBNP是BNP激素原分裂后没有活性的N-末端片段，与BNP相比，半衰期更长，更稳定，其浓度可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放，因此更能反映BNP通路的激活。血浆NT-proBNP水平随心衰程度加重而升高,同时，NT-proBNP水平有助于区分心源性和非心源性呼吸困难。在现有技术中，NT-proBNP的临床应用主要包括以下方面：早期发现心力衰竭病人、心衰患者的危险度分级、心源性猝死的预测、心衰患者的治疗疗效监测及预后评估、急性呼吸困难的鉴别诊断、急性冠脉综合症的预后评估、心外科手术治疗术前/术中/术后的监测。心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是心脏中富含的一种新型小分子蛋白，同时，具有较高的体外稳定性。H-FABP 为心肌细胞提供能量，当心肌细胞受损时可快速释放到血液中，作为标志物诊断早期 AMI 的敏感性为77.4%，特异性为 89.4%。此外，H-FABP 浓度能够估测心肌的受损面积，因此，H-FABP可作为AMI的代表成为急性冠症候群(ACS)的早期诊断标志物。在AMI发作后，H-FABPH-FABP通常在6-8小时左右达到浓度峰值，然后在24-30小时左右恢复至正常水平，能够如此迅速地返回到基线浓度，使它也可以用作AMI复发的标志物。H-FABP是一种心肌缺血的高敏早期标志物，缺血性发3分钟后即可检。另一方面，H–FABP 作为急性冠脉综合症（尤其是胸痛发作6小时内）的一个高敏的早期标志物，缺血性发作 30 分钟后即可检测。

肌红蛋白（MYO）是一个具有 153 个氨基酸的多肽链和一个含铁血红素辅基组成的亚铁血红素蛋白，存在于骨骼肌和心肌等组织。MYO 的分子量小，可以很快地从破损的细胞中释放出来，在AMI发病后6–7小时达到峰值，12小时内几乎所有AMI患者的MYO都有升高，升高幅度大于各心肌酶，因此可以作为AMI的早期诊断标志物。MYO的半寿期较短（15分钟），胸痛发作后6–12小时不升高，有助于排除AMI的诊断，是筛查AMI很好的指标。由于在AMI后血中的MYO很快从肾脏清除，发病18–30小时内可完全恢复到正常水平。固MYO测定有助于在AMI病程中观察有无再梗塞或者梗塞再扩展。MYO水平频繁出现升高，提示原油心肌梗死仍在延续。

目前常用的细胞因子的检测方法主要包括：酶联免疫吸附法（ELISA），放射免疫分析（radio immunoassay, RIA），免疫印绩法（western blot），流式细胞仪（Flow-Cytometry）等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点。但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的细胞因子检测中，该方法存在明显的不足；放射免疫分析（RIA）虽然灵敏度高，是由于具有放射性污染，现在已很少采用；免疫印绩法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能检测单一指标，不适合运用于细胞因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平上检测细胞因子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。因此，本领域技术人员开始尝试用蛋白质芯片的方法克服上述技术方案中存在的不足，例如，现有技术中，采用液体芯片能够同时检测10至20类分子，但由于样品间容易发生相互作用，影响检测结果，很难发展成高通量方法，且此方法中采用的设备结构复杂，不易推广。

尽管蛋白芯片以其高通量、快速、简便等特点受到了各领域的广泛关注，但相对于只含有5种碱基所组成的基因芯片来说，成千上万种蛋白质结构的多样性，使得蛋白芯片在制作应用方面需要更多的步骤才能完成。蛋白芯片技术目前还存在着许多难于解决的问题和挑战。不同蛋白质的稳定性是不同的，其受诸多外界环境影响，如蛋白质的酶降解和非酶降解、蛋白质的氧化以及蛋白质的高低温损伤，例如，CTnI抗体难于在芯片中与其它抗体对共同孵育，这对蛋白芯片的检测CTnI灵敏度有相当大的影响。在蛋白质芯片的实际应用中，如何使蛋白质芯片能够全面、灵敏地反映患者的实际身体状况，仍然需要进行更深入的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种心脏功能检测试剂盒，以同时定量检测多个心脏功能标志物。

根据本发明的一个方面，提供一种心脏功能检测试剂盒：包括检测芯片、被免疫标记物标记的检测抗体和抗原稀释液；抗体芯片包括固相载体和捕获抗体，捕获抗体被固定在固相载体的表面，捕获抗体包括抗 CTnI 捕获抗体，此外，捕获抗体还包括抗 CKMB 捕获抗体、抗 MYO 捕获抗体、抗 NT-proBNP 捕获抗体、抗 H-FABP 捕获抗体中的至少一种；检测抗体包括抗 CTnI 检测抗体；抗原稀释液中含有 0.1% – 1%多肽，多肽的氨基酸序列包括了 TNC 蛋白的全长序列或部分序列。

优选地，多肽的氨基酸序列包括以下片段：EEQKNEFKAAFDIFVLGAEDG。

优选地，抗CTnI捕获抗体选自第一CTnI抗体、第二CTnI抗体、第三CTnI抗体和第四CTnI抗体中的至少一种；抗CTnI检测抗体选自第一CTnI抗体、第二CTnI抗体、第三CTnI抗体和第四CTnI抗体中的至少一种；第一CTnI抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0977的抗体，第二CTnI抗体为购自广州万孚生物技术股份有限公司的、货号为A217的抗体，第三CTnI抗体为购自广州威佳科技有限公司的、货号为BF0362的抗体，第四CTnI抗体为购自Fitzgerald公司的、货号为10R-1833的抗体。

优选地，抗CTnI捕获抗体为第一CTnI抗体或第三CTnI抗体；若抗CTnI捕获抗体为第一CTnI抗体，则抗CTnI检测抗体为第三CTnI 抗体；若抗CTnI捕获抗体为第三CTnI抗体，则抗CTnI检测抗体为第一CTnI抗体。

优选地，捕获抗体包括抗CTnI捕获抗体、抗CKMB捕获抗体、抗MYO捕获抗体、抗NT-proBNP捕获抗体和抗H-FABP 捕获抗体。

优选地，抗CTnI捕获抗体为第三CTnI抗体，抗CTnI检测抗体为第一CTnI抗体。

优选地，检测抗体包括抗CTnI检测抗体、抗CKMB检测抗体、抗MYO检测抗体、抗NT-proBNP检测抗体和抗H-FABP检测抗体。

优选地，抗CKMB捕获抗体选自第一CKMB抗体、第二CKMB抗体中的至少一种，第一CKMB抗体为购自icllab公司的、货号为GCKB-80ALY的抗体，第二CKMB抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10054的抗体；抗MYO捕获抗体选自第一MYO抗体、第二MYO抗体中的至少一种，第一MYO抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-03395的抗体，第二MYO抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-17-0022的抗体；抗NT-proBNP捕获抗体为第一NT-proBNP抗体，第一NT-proBNP抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10043的抗体；抗H-FABP捕获抗体为第一H-FABP抗体，第一H-FABP抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0857的抗体。

优选地，抗CKMB检测抗体选自第一CKMB抗体、第三CKMB检测抗体中的至少一种，第一CKMB抗体为购自icllab公司的、货号为GCKB-80ALY的抗体，第三CKMB抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-01069的抗体；抗MYO检测抗体选自第一MYO抗体、第二MYO抗体中的至少一种，第一MYO抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-03395的抗体，第二MYO抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为 MD-17-0022 的抗体；抗 NT-proBNP 检测抗体为第二 NT-proBNP 抗体，第二NT-proBNP抗体为购自南京金斯瑞生物科技有限公司的、货号为V00701的抗体；抗 H-FABP-检测抗体为第二 H-FABP 抗体，第二 H-FABP 抗体为购自广州万孚生物技术股份有限公司的、货号为M101的抗体。

优选地，通过如下操作将捕获抗体固定在固相载体的表面：S1.将捕获抗体与pH=7.4±0.5磷酸盐缓冲液混合，形成捕获抗体混合物，磷酸盐缓冲液中含有0–10 %的糖类物质，糖类物质包括蔗糖、海藻糖中的至少一种；S2.将捕获抗体混合液点样固定于固相载体表面的点样孔。

本发明的心脏功能检测试剂盒能够在同一块检测芯片上实现CTnI和其它心脏功能相关的蛋白因子的定量检测。采用本发明的心脏功能检测试剂盒提供的抗原稀释液处理样品，稀释液中含有的多肽能够与抗原中的CTnI相结合，使待测样品中的CTnI在检测过程中不会被蛋白酶裂解，从而有效地提高了CTnI检测的灵敏度、准确率和可重复性。此外，发明人还发现，采用本发明提供的样品稀释液处理样品，还能够提高检测CKMB、MYO、NT-proBNP、H-FABP这四种心脏功能相关的蛋白因子的响应信号值，提高了CKMB、MYO、NT-proBNP、H-FABP检测的灵敏度。

本发明通过对捕获抗体和检测抗体进行限定，能够在同一块固相载体表面同时实现对CKMB、CTnI、MYO、NT-proBNP、H-FABP 这5种心脏功能相关抗原蛋白的检测，并且可达到较高的稳定性、灵敏度以及特异性。与分别单独以上述5种蛋白为标志物的单指标检测芯片相比，本发明提供的心脏功能检测试剂盒达到的灵敏度甚至更高。此外，上述心脏功能检测试剂盒的样品用量少，仅需50–100微升的样品，即可完成对样品中的上述5种蛋白的高效检测。

在制备本发明的心脏功能检测试剂盒中的检测芯片时，采用含有一定糖类物质的磷酸盐缓冲液配制捕获抗体混合物，具有以下有益效果：在缓冲液提供的液体环境中，针对CKMB、CTnI、MYO、NT-proBNP、H-FABP的多种特异性抗体能够稳定共存，避免和排除非特异性吸附，防止假阳性的出现，有效提高了检测芯片的准确性；针对CKMB、CTnI、MYO、NT-proBNP、H-FABP的多种特异性抗体能够在磷酸盐缓冲液提供的液体反应环境中保持较高的活性，因此，特异性抗体与其各自对应的目标蛋白具有较高的结合能力，有效提高了检测芯片的灵敏度。

附图说明

图 1 为实施例 4 的心脏功能检测试剂盒测试以 CTnI 为测试对象时，CTnI 浓度和响应信号的对应关系；

图 2 为实施例 4 的心脏功能检测试剂盒测试以 CKMB 为测试对象时，CKMB浓度和响应信号的对应关系；

图 3 为实施例 4 的心脏功能检测试剂盒测试以 MYO 为测试对象时，MYO浓度和响应信号的对应关系；

图 4 为实施例 4 的心脏功能检测试剂盒测试以 NT-proBNP 为测试对象时，NT-proBNP 浓度和响应信号的对应关系；

图 5 为实施例 4 的心脏功能检测试剂盒测试以 H-FABP 为测试对象时，H-FABP浓度和响应信号的对应关系。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例 1

1.实验设置方式

本实施例所采用的参试抗体如表 1 所示，其中所涉及的供应商如下：广州瑞博奥生物科技有限公司（瑞博奥）、广州万孚生物技术股份有限公司（万孚）、广州威佳科技有限公司（威佳）、Fitzgerald 公司（Fitzgerald）、icllab 公司（icllab）、南京金斯瑞生物科技有限公司（金斯瑞）。在 37℃下，采用 Thermo Scientific™ Wellwash™洗板机，使各参试抗体分别与 CTnI、CKMB、MYO、NT-proBNP、H-FABP 发生免疫反应，以开展参试抗体与抗原的配对性检测。

配对性检测实验的实验参数为：载体，96 微孔板；抗原稀释液，PBS；封闭液，5%脱脂奶粉+PBS；抗体稀释液，PBS；洗涤液，0.1%tween -20 +Tris.Cl。

2.检测结果

本实施例部分参试抗体的配对性检测结果如表 2 – 6 所示。

根据表 2 – 表 6 展示的数据，本实施例所选用的特异性抗体都不会与各自对应的非目标抗原发生交叉反应。其中，第一 CTnI 抗体、第二 CTnI 抗体、第三 CTnI 抗体和第四 CTnI 抗体都具有较强的 CTnI 蛋白结合能力，第一 CKMB 抗体、第二 CKMB 抗体和第三 CKMB 抗体都具有较强的 CKMB 蛋白结合能力，第一 MYO 抗体和第二 MYO 抗体都具有较强的MYO 蛋白结合能力，第一 NT-proBNP 抗体、第二 NT-proBNP 抗体和第三 NT-proBNP 抗体都具有较强的 NT-proBNP蛋白结合能力，第一 H-FABP 抗体、第二 H-FABP 抗体和第三 H-FABP 抗体都具有较强的 H-FABP 蛋白结合能力。

实施例 2

1.参试抗体

选取实施例 1 中的以下抗体作为本实施例的参试抗体：

第一 CTnI 抗体、第二 CTnI 抗体、第三 CTnI 抗体、第四 CTnI 抗体；

第一 CKMB 抗体、第二 CKMB 抗体、第三 CKMB 抗体；

第一 MYO 抗体、第二 MYO 抗体；

第一 NT-proBNP 抗体、第二 NT-proBNP 抗体、第三 NT-proBNP 抗体；

第一 H-FABP 抗体、第二 H-FABP 抗体、第三 H-FABP 抗体。

2.实验设置方式

使以同一种蛋白因子作为特异性抗原的参试抗体分别作为捕获抗体（一抗）和检测抗体（二抗），一一对应组合，开展抗体间的配对实验，抗体间的配对实验的实验参数为：载体，96 微孔板；一抗稀释液，PBS；封闭液，5%脱脂奶粉+PBS；抗原稀释液，0.5%脱脂奶粉+PBS；二抗稀释液，PBS；洗涤液，0.1%tween-20 +Tris.Cl。

3.检测结果

抗体间的配对实验结果如表 7 – 11 所示。针对 CTnI 蛋白，适合于组成用于ELISA 双抗体夹心法的抗体对有：以第三 CTnI 抗体作为一抗，以第一 CTnI 抗体作为二抗；以第一 CTnI 抗体作为一抗，以第三 CTnI 抗体作为二抗。针对 CKMB蛋白，适合于组成用于 ELISA 双抗体夹心法的抗体对有：以第二 CKMB 抗体作为一抗，以第一 CKMB 抗体作为二抗；以第一 CKMB 抗体作为一抗，以第三CKMB 抗体作为二抗。针对 MYO 蛋白，适合于组成用于 ELISA 双抗体夹心法的抗体对有：以第一 MYO 抗体作为一抗，以第二 MYO 抗体作为二抗；以第二MYO 抗体作为一抗，以第一 MYO 抗体作为二抗。针对 NT-PROBNP 蛋白，适合于组成用于 ELISA 双抗体夹心法的抗体对有：以第一 NT-PROBNP 抗体作为一抗，以第二 NT-PROBNP 抗体作为二抗。针对 H-FABP 蛋白，适合于组成用于ELISA 双抗体夹心法的抗体对有：以第二 H-FABP 抗体作为一抗，以第一 H-FABP抗体作为二抗。抗体对构建依据 ELISA 双抗体夹心法设计的心脏功能检测试剂盒。

实施例 3

本实施例根据实施例 2 的抗体对配对性实验结果，选取实施例 2 中所有适合于组成用于 ELISA 双抗体夹心法的抗体对开展同时针对 CTnI、CKMB、MYO、NT-proBNP、H-FABP 这五种蛋白因子的 ELISA 双抗体夹心法实验。

1.实验设置方式

实施例以配制捕获抗体混合物的缓冲液的组成作为变量设置两组处理组，处理组设置方式：处理 A，以 pH=7.4 磷酸盐缓冲液作为参试缓冲液；处理 B，以含有 5 %海藻糖的 pH=7.4 磷酸盐缓冲液作为参试缓冲液。

本实施例采用的一抗组合为实施例 1 中的：第三 CTnI 抗体、第一 CTnI 抗体、第一 CKMB 抗体、第二 CKMB 抗体、第二 MYO 抗体、第一 MYO 抗体、第一 NT-proBNP 抗体和第二 H-FABP 抗体。

本实施例采用的二抗组合为实施例 1 中的：第一 CTnI 抗体、第三 CTnI 抗体、第三 CKMB 抗体、第一 CKMB 抗体、第一 MYO 抗体、第二 MYO 抗体、第二 NT-proBNP 抗体和第一H-FABP 抗体。

将一抗组合所包括的抗体分别溶于处理 A 和处理 B 的参试缓冲液中形成抗体混合物；采用全自动点样仪（铂金艾尔默公司），于抗体混合物中将每个抗体含量以 0.01至 0.5 ng 固定于氨基化玻片的点样孔中，生物素标记的牛 IgG 作为阳性对照。每种抗体还有两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。

然后加入二抗及底物进行检测。将分别采用处理 A、处理 B 的固相载体制备的芯片一一对应地编号为芯片 A、芯片 B。

2.测试结果

芯片 A 和芯片 B 的测试结果分别如表 12 和表 13 所示，当第一 CTnI 抗体作为二抗时，会与第一 CTnI 抗体会与作为一抗的第二 MYO 抗体发生交叉反应，因此，在同一检测芯片上，不适宜使一抗包括第二 MYO 抗体的同时使二抗包括第一 CTnI 抗体。对比芯片 A 和芯片 B 的抗体对响应信号值，大部分的抗体对在芯片 B 提供的反应环境中的响应信号值均高于其在芯片 A 提供的反应环境中的响应信号值。据此可以得出结论：制作检测芯片时，采用含有 5 %海藻糖的 pH=7.4磷酸盐缓冲液作为溶解一抗的缓冲液，能够有效提高特异性抗体间匹配的响应信号值，由此制得的检测芯片具有更高的灵敏度。

综合各抗体对间的交叉反应情况以及响应信号值大小，得出最佳的抗体组合形式如下：

一抗组合：第一 CTnI 抗体、第一 CKMB 抗体、第二 MYO 抗体、第一NT-proBNP 抗体和第二 H-FABP 抗体。

二抗组合：第三 CTnI 抗体、第三 CKMB 抗体、第一 MYO 抗体、第二NT-proBNP 抗体和第一 H-FABP 抗体。

实施例 4

心脏功能检测试剂盒的构建

本实施例提供的心脏功能检测试剂盒包括表面固定有捕获抗体的固相载体、生物素标记的检测抗体、试剂组、软质硅胶垫、硬质框架和 U 形框夹。

本实施例所采用的捕获抗体包括实施例 1 中的第一 CTnI 抗体、第一 CKMB抗体、第二 MYO 抗体、第一 NT-proBNP 抗体和第二 H-FABP 抗体，所采用的的检测抗体包括实施例 1 中的第三 CTnI 抗体、第三 CKMB 抗体、第一 MYO 抗体、第二 NT-proBNP 抗体和第一 H-FABP 抗体。

试剂组包括如下试剂：

1X 封闭缓冲液（Blocking Buffer 8ml) ---5%海藻糖+5%脱脂奶粉+磷酸盐缓冲液（PBS）；

抗原稀释液（1 管）---0.5%多肽+PBS，其中，所涉及的多肽的氨基酸序列为EEQKNEFKAAFDIFVLGAEDG（SEQ ID NO.1）;

20X 的洗液 I（20X Wash Buffer I，30 ml)；

20X 的洗液 II（20X Wash Buffer II, 30 ml)；

2X RIPA 细胞裂解液（2X Cell Lysis Buffer，5ml）；

蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitor，1 管)；

磷酸酶抑制剂 (Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，1 管)；

荧光标记链霉亲和素（Cy3 equivalent，1 张玻片配 1 管）。

本实施例采用的固相载体为玻片，玻片上设有阳性对照孔和阴性对照孔，在使用前，采用含有 0.01 – 0.1%烷基糖苷的亲水试剂对玻片进行表面处理。在其他实施例中，也可以直接采用氨基化玻片或者膜片作为固相载体。利用全自动点样仪，将本实施例所采用的捕获抗体固定在固相载体表面，具体的点样操作包括如下步骤：

1）将捕获抗体与含有 5 %海藻糖的 pH=7.4 磷酸盐缓冲液混合形成捕获抗体混合物；

2）于捕获抗体混合物中将每种抗体含量以 0.01 – 2 ng 固定于点样孔，每个抗体设置 2 至 4 个重复孔，抗体点阵排布于固相载体表面，固相载体表面每平方厘米点 5种特异性抗体。

使用时，使 U 形框夹从两侧将由下至上放置的尺寸对应的硬质框架、软质硅胶垫和固相载体夹紧，硬质框架表面被 U 形框夹划分为 16 或 64 孔每个小孔形成一个反应槽，固相载体被 U 形框夹夹紧而贴紧反应槽的底部，由此，构建的试剂盒能实现多通量的检测。

2.心脏功能检测试剂盒的使用方法

本实施例提供的心脏功能检测试剂盒的使用方法如下：

S1. 样本的预处理

利用 RIPA 细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和抗原稀释液配制样本处理液，采用样本处理液对样本进行稀释，血浆、血清均适用于作为本实施例的心脏功能检测试剂盒的待测样本。

S2.固相载体的完全干燥

将固相载体从盒子中取出来，在室温平衡 20 – 30 分钟后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥 1-2 小时。

S3.封闭和孵育

S3.1.

每个芯片孔中加入 100 µL 的封闭缓冲液，室温摇床上孵育 30 分钟，避免产生气泡；抽去封闭缓冲液，每个孔中添加 100 µL 稀释后的样本，一个阵列一个样品，4 ℃振荡过夜孵育。

S3.2.

使用 Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用 1×洗液 I 进行清洗，每孔 250µl 的 1×洗液 I，清洗 8 次，每次震荡 30s，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 I。然后换用 1×洗液 II 通道进行清洗，每孔 250µL 的 1×洗液 II，清洗 6 次，每次震荡 30 秒，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 II。

S3.3.

抽去 1×洗液 II，配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，小管加入 65 µL 的 1×封闭液，混合均匀后，将生物素标记抗体小管中 30 µL 的液体转移至含 570 µL 封闭液的离心管中，混匀后分别每孔加入 100 µL，室温孵育 2 小时。

S3.4.

抽去 1×洗液 II，配制荧光标记链霉亲和素，快速离心荧光标记链霉亲和素的小管，小管加入 50 µL 的 1×封闭缓冲液，混合均匀后，将荧光标记链霉亲和素小管中 10 µL 的液体转移至含 1000 µL 封闭缓冲液的离心管中，混匀后分别每孔加入 100 µL，室温避光孵育 2 小时。

S4. 荧光检测

采用 GenePix 4000B Microarray Scanner 激光扫描仪（Molecular Devices,LLC；1311 Orleans Drive Sunnyvale, CA 94089-1136 United States）扫描信号，利用Genepix Pro 6.1 软件获取芯片上所有点的信号强度，利用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上 2 倍标准偏差（SD）进行统计，表达水平高于背景加上 2xSD 的蛋白用于校正的 T 检验分析。

3.心脏功能检测试剂盒的定性定量效果

3.1 处理方式

按照本实施例提供的方法使用本实施例构建的心脏功能检测试剂盒，并对试剂盒进行灵敏度、特异性以及稳定性的测试。

标准曲线的绘制方式：添加500 µL 的样本处理液到肿瘤标志物标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为 Std1；分别标记 4 个干净的离心管为 Std2、Std3、Std4、Std5，添加 200 µL 的样本处理液到每个小管中；从 Std1 中抽取 100µL 稀释样品加入到 Std2 中轻轻混合，然后从Std2 中抽取 100 µL 加入到 Std3 中，如此梯度稀释至Std5；抽取100 µL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。因为肿瘤标志物的起始浓度是不同的，所以 Std1 到 Std5 的梯度稀释后，每个肿瘤标志物的系列浓度是不同的，具体见表 14。

3.2 测试结果

本实施例构建的心脏功能检测试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性测试结果如表15 所示。

各蛋白标志物的浓度与荧光信号的对应关系如表 16 – 20 以及图 1 – 5 所示，具体地，表 16 和图 1 对应 CTnI 的检测结果，表 17 和图 2 对应 CKMB 的检测结果，表18 和图 3 对应 MYO 的检测结果，表 19 和图 4 对应 NT-proBNP 的检测结果，表 20 和图 5 对应 H-FABP 的检测结果。

1.实验设计

设置本实施例作为实施例 4 的对比实施例，本实施例以抗原稀释液的组分作为变量，以探究抗原稀释液的组分对于心脏功能检测试剂盒的性能的影响。本实施例采用PBS 作为抗原稀释液构建心脏功能检测试剂盒，抗原稀释液中不含有实施例 4 所采用的多肽（SEQ ID NO.1）。除了抗原稀释液的组分之外，本实施例所采用的用于构建心脏功能检测试剂盒的捕获抗体、生物素标记的检测抗体、固相载体的材质、试剂组组成（抗原稀释液除外）、软质硅胶垫、硬质框架和 U形框夹都与实施例 4 严格保持一致，本实施例对上述物料的处理方式或使用方式也与实施例 4 严格保持一致。

本实施例所构建的心脏功能检测试剂盒的使用方法与实施例 4 的心脏功能检测试剂盒的使用方法一致。按照实施例 4 提供的方法使用本实施例构建的心脏功能检测试剂盒，并对试剂盒进行灵敏度、特异性以及稳定性的测试。

2.测试结果

本实施例构建的心脏功能检测试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性测试结果如表21 所示。对比表 15 和表 21 的数据可知，抗原稀释液的组分对 CTnI 的检测产生了不可忽视的影响，与本实施例构建的心脏功能检测试剂盒相比，实施例 4构建的心脏功能检测试剂盒明显具有更高的特异性、灵敏度以及稳定性。使用实施例 4 构建的心脏功能检测试剂盒的过程中，采用含有氨基酸序列为 SEQ IDNO.1 的多肽的抗原稀释液处理样品，多肽与样品中的 CTnI 相结合，避免了 CTnI被降解，从而有效地优化了对 CTnI 的检测效果。另外，对于 CKMB、MYO、NT-proBNP、H-FABP 这四种蛋白因子的检测，相对于实施例 4 构建的心脏功能检测试剂盒，采用本实施例构建的心脏功能检测试剂盒所能达到的灵敏度相对较低。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州瑞博奥生物科技有限公司

<120> 一种心脏功能检测试剂盒

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Glu Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu

1 5 10 15

Gly Ala Glu Asp Gly

20

Claims

1.一种心脏功能检测试剂盒，其特征在于：包括检测芯片、被免疫标记物标记的检测抗体和抗原稀释液；

所述检测芯片包括固相载体和捕获抗体，所述捕获抗体被固定在所述固相载体的表面，所述捕获抗体包括抗CTnI捕获抗体、抗CKMB捕获抗体、抗MYO捕获抗体、抗NT-proBNP捕获抗体和抗H-FABP捕获抗体；

所述检测抗体包括抗CTnI检测抗体、抗CKMB检测抗体、抗MYO检测抗体、抗NT-proBNP检测抗体和抗H-FABP检测抗体；

所述抗原稀释液中含有0.1% – 1%多肽，所述多肽的氨基酸序列为EEQKNEFKAAFDIFVLGAEDG；

所述抗CTnI捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0977的抗体，所述抗CTnI检测抗体为购自广州威佳科技有限公司的、货号为BF0362的抗体；

所述抗CKMB捕获抗体为购自icllab公司的、货号为GCKB-80ALY的抗体，所述抗CKMB检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-01069的抗体；

所述抗MYO捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-17-0022的抗体，所述抗MYO检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-03395的抗体；

所述抗NT-proBNP捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10043的抗体，所述抗NT-proBNP检测抗体为为购自南京金斯瑞生物科技有限公司的、货号为V00701的抗体；

所述抗H-FABP捕获抗体为购自广州万孚生物技术股份有限公司的、货号为M101的抗体，所述抗H-FABP检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0857的抗体。

2.如权利要求1所述心脏功能检测试剂盒，其特征在于，通过如下操作将所述捕获抗体固定在所述固相载体的表面：

S1. 将所述捕获抗体与pH=7.4±0.5磷酸盐缓冲液混合，形成捕获抗体混合物，所述磷酸盐缓冲液中含有0 – 10 %的糖类物质，所述糖类物质包括蔗糖、海藻糖中的至少一种；

S2.将所述捕获抗体混合液点样固定于所述固相载体表面的点样孔。