KR20020089315A - 3차원 포맷 바이오칩 - Google Patents

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KR20020089315A
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한순갑
동시아오팡
피르쉐토니
마쯔모토산드라
친버그파벨
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바이오셉트 인코포레이티드
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Abstract

어레이 형태로 고체 기질의 상부 표면에 부착된 다수의 광학적으로 투명한 하이드로겔 셀로 형성되는 바이오칩. 각 셀은 활성 이소시아네이트 그룹을 가지는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 이들의 중합체의 하이드로겔로 형성된다. 비하이브리드화 결합 존재물은 이 셀에 고정되며, 이 존재물은 표적 단백질 또는 다른 필적할만한 분자를 선택적 격리하는데 효과적이다. 상이한 결합 존재물이 셀에 고정되어 다수의 표적 생체분자를 위한 분석에 사용되는 바이오칩을 생성한다.

Description

3차원 포맷 바이오칩{THREE DIMENSIONAL FORMAT BIOCHIPS}
현재, 단백질-리간드, 단백질-단백질, 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 데이용되는 다수의 공지된 방법이 있다. 이들 방법은 성가시고, 비용이 많이 들며, 다량의 단백질을 요구하며 또는 단백질 상호작용의 신속한 고처리량 분석에 적당하지 않다는 점에서 모두 중대한 한계를 가진다.
단백질 상호작용을 연구하는 데 이용된 초기 방법은 단백질-친화성 컬럼이다. 이 방법에서는, 포획 단백질은 아가로스 비드에 공유적으로 고정되고 친화성 크로마토그래피 이용을 통해 다수의 오염 단백질을 함유한 비균질 혼합물로부터 표적 단백질을 친화성-정제하는 데 사용된다. 이 방법은 아가로스 비드에의 적절한 고정을 위해 비교적 다량의 포획 단백질을 요구하며, 이는 단백질 상호작용의 신속한 고처리량 스크리닝에 적당하지 않다.
단백질 상호작용을 연구하는 데 이용되는 또다른 방법은 효모 2-하이브리드 시스템이다. 이 방법에서는, 표적 단백질 라이브러리가 효모 내에서 작제된다. 이 시스템은 각각이 전사 활성화 영역에 연결된 이러한 해당 단백질을 발현하도록 고안된다. 베이트(bait) 단백질(또는 기타 가능한 상호작용 단백질을 위해 검사되는 단백질)을 암호화하는 DNA는 DNA 결합 도메인에 융합되고 또한 동일 라이브러리 내에서 발현된다. 형광 단백질 또는 생물학적 활성을 쉽게 검출가능한 단백질과 같은, 검출 시스템을 위한 유전암호에 상응하는 DNA 서열을 운반하는 리포터 유전자 또한 포함된다. 베이트 단백질에 흥미 표적 단백질이 결합하면, 잇따른 둘간의 상호작용이 리포터 유전자의 활성화를 달성하고 시그널 발생을 초래한다. 비록 이 방법이 비교적 빈번히 이용되기는 하지만, 느리고 성가시며, 상당한 분자생물학 전문지식을 요구하고, 경제적인 단백질-단백질 상호작용의 신속한 고처리량 스크리닝을제공하지 못한다.
단백질 상호작용을 연구하는 데 보편적으로 채택되는 또다른 초기 방법은 포획 및 표적 단백질 모두를 면역침강시킨 다음, 생성 복합체를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분석하는 것이다. 이 방법에서, 포획 단백질은 표적에 결합되도록 단백질의 비균질 혼합물과 우선 배양된다. 생성 복합체는 이후 한 쌍 중 1 단백질에 대해 양성된 항체를 사용하여 면역침강되며, 복합체는 분석을 위해 겔 전기영동으로 분리되고 또한 염료에 의한 염색과 같은 검출 단계가 이어진다. 이 방법은 느리고 성가시며, 상당한 생화학적 전문지식을 요구하고, 또한 유사하게 단백질 상호작용의 신속한 고처리량 분석을 부여하지 못한다.
단백질 상호작용을 연구하는 데 이용되는 또다른 방법은 파지 디스플레이 방법이다. 이 방법에서, 단백질 라이브러리는 이러한 "디스플레이된" 단백질을 위한 친화성 지지체를 제공하기 위해서, 예를 들면 이.콜라이(E.coli)와 같은 숙주 박테리아의 표면에서 발현되는 특정 필라멘트형 파지 단백질의 편모상에서 발현된다. 파지 라이브러리는 이후 다수의 잠재적 표적 단백질에 노출된다. 디스플레이된 단백질의 표적 단백질로의 결합은 표적의 동정을 허용한다. 이 방법은 다수의 한계를 가지는데, 예를 들면 고분자량 단백질은 디스플레이하기 어렵고, 또한 단지 소수의 파지 필라멘트형 단백질만이 이러한 용도에 적당하다. 뿐만 아니라, 디스플레이된 단백질의 구조적 압축은 이의 친화성을 감소시킨다고 공지되어 있으며 결과적으로 이의 천연 리간드에 대한 결합능에 영향을 미치게 된다.
단백질과 같은 존재물의 결합에 적당한 고-처리량-가능 마이크로어레이 또는바이오칩의 제조는, 흔히 표적으로서 언급되는 기타 물질 또는 단백질과 같은 해당 분자와 쉽게 상호작용시킴으로써 이후에 검출을 위해 사용될 수 있는 방법으로 표면에 단백질을 부착하는 방법의 이용을 일반적으로 요구할 것이다. 예를 들면, 단백질은 Cu2+, Fe3+과 같은 2가 또는 3가 금속 이온으로 처리된 표면에 직접 결합할 수 있으며, 이 단백질은 친화도의 다양한 정도에 따라 자연히 결합할 것이다. 이후에 표적이 탐침에 결합하면, 이들은 미국 특허 5,719,060에서 기재한 바와 같이, 질량분석기와 병용하여 SELDITM(표면-강화 레이저 탈착/이온화)에 의해 검출되고 동정될 수 있다. G.MacBeath 및 S.Schreiber(Science 289:1760,2000)에 의해 기재된 대안적인 방법에서, 화학 결합이 또한 단백질을 기질 표면에 부착하는 데 사용되며, 반면 표적 리간드는 형광 태그로 표지된다; 따라서, 탐침과 표지된 표적간의 어떠한 상호작용이라도 형광-기초 슬라이드 스캐너를 이용하여 검출될 수 있다.
결합 존재물을 제공하기 위한 상기 단백질 고정 방법은 일반적으로 기질의 표면으로 단백질의 직접적인 화학 컨쥬게이션을 채택하기 때문에, 이 방법들은 활성 부위에서의 부적절한 화학 컨쥬게이션 또는 본래 구조의 손실로 인한 단백질 기능의 손실로 귀결되는 주요 한계로 구체화된다. 이러한 일이 발생할 때, 고정된 단백질의 소량만이 활성화된채로 잔존하며 검출 곤란과 낮은 분석 감수성을 초래한다. 뿐만 아니라, 이 방법들의 복잡성 및 정밀성의 결여는 일반적으로 고처리량 용도 고밀도 마이크로어레이 제조시 사용하기에는 부적당함을 부여한다.
미국 특허 번호 6,087,102는 폴리아크릴아미드 겔을 활용하여, 겔로 현장에서 차후 가교결합되어 바이오칩을 형성할 수 있는, 전기영동된 단백질 스폿으로 구성된 개별 셀을 생성하는 방법에 대해 기재하고 있다. 이 방법의 한계는 바이오칩상의 정교하고 작은 셀의 제조 및 가교결합 동안 포획 단백질에 대한 잠재적 파괴효과의 난관을 포함한다. 미국 특허 번호 5,847,019는 광-반응성 자유-래디칼 화학 을 이용하여, 광중합가능한 중합체를 활용함으로써 패턴화된 네트워크 층을 형성하여 바이오칩을 제조하는 또다른 접근을 기재하고 있다. 바이오칩에 단백질을 고정하기 위해 사용된 이 광활성화 접근은 아크릴아미드 중합체를 포함하는 특정 광활성화 화학물질로 한정되는 것으로 보이며, 그리고 또한 자유 래디칼 광화학의 사용은 이러한 방식으로 제조된 바이오칩에서 사용된 포획 단백질에 잠재적 자유 래디칼 손상을 유발할 수 있다.
이소시아네이트-캡핑 액체 폴리우레탄 프리폴리머를 단백질과 직접 반응시켜 폴리우레탄 폼안에 단백질을 고정시키는 용도는 미국 특허 번호 4,098,645 및 3,672,955에 기재되어 있으며, 이는 이소시아네이트-작용 하이드로겔 시스템의 아미노 및 하이드록실 부위를 통해 단백질로 직접 결합시켜 효소 반응기 및 친화성 컬럼에 기초한 항원/항체 반응을 형성하는 용도를 가르쳐 준다. 기재된 방법이 이러한 목적에 적당할 수 있는 반면, 이 방법들은 바이오칩 용도에 적당한 기하학적으로 제어된 광학적으로 투명한 하이드로겔을 형성하지 못한다. 또한, 단백질 잔기에 대한 잠재적 컨쥬게이션을 금하지 않고 이러한 방법을 사용하는 것은 중합체에 대한 단백질의 바람직하지 않은 가교결합을 매우 쉽게 유발할 수 있으며, 또한 과도한 가교결합은 단백질의 본래 구조를 감소시키거나 파괴할 수 있고 따라서 단백질의 생물학적 활성을 감소시키며 이는 바이오칩이 사용되는 고정밀 결합 분석에는 이러한 방법이 부적당함을 부여할 것이다.
이러한 기술적 장애에도 불구하고, 단백질-단백질 및 다른 필적할만한 생체분자와의 상호작용 이해의 중요성은 다수 상이한 비하이브리드화 결합 존재물의 혼입, 다양한 연구용으로 고안된 도구 및 생물과학에서의 상업적 적용에 적당한 실제적이며, 유연한 포맷 바이오칩을 달성하게 한다. 간단히, 최대의 결합 활성을 유지하는 방법으로 존재물을 위한 지지체를 제공하며 따라서 비핵산/하이브리드화에 기초한 마이크로어레이의 제작을 허용하는, 효율적인 고정 또는 지지 시스템을 위한 요구가 존재한다.
언급된 다른 방법에서, 단백질과 같은 결합 존재물이 표적을 격리하기에 자유로울 수 있도록 이들의 본래 구조 및 기능을 유지하도록 허용하는 방법으로 고정되거나 또는 캡슐화되도록 하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
원하는 고정 화학으로 적당한 겔을 제공함으로써, 생체분자 상호작용의 고처리량 분석 및 특징분석에 적당한 3차원 포맷내 어레이에 다수의 상이한 비하이브리드화 결합 존재물을 혼입하는 마이크로어레이 또는 바이오칩이 제공될 수 있음이 본 발명에 이르러 발견되었다.
본 발명은 고체 기질상에 배열된 광학적으로 투명한 PEG 또는 PPG계 중합체 마이크로소적의 어레이 형태인 바이오칩을 제공하며, 제곱 센티미터당 1,000개의 개별 반응 셀에 상당하는 형성능을 제공한다. 각 셀은 일반적으로 마이크로소적의용적 내부 또는 표면상에 고정된 적어도 하나의 결합 존재물을 전형적으로 함유할 것이다. 공지된 방식으로 어레이내 셀에서의 상이한 결합 존재물을 변경함으로써, 생물학적 샘플 또는 결합 상호작용을 위한 화합물 또는 활성의 효율적 스크리닝이 수행될 수 있고 정량분석될 수 있다. 이 셀들은 각 셀에 함유된 결합 존재물의 양을 최대화하고 따라서 검출 감수성을 최대화하는 형태로서, 바람직하게는 3차원이다.
이러한 바이오칩의 각 셀을 형성하는 중합체 마이크로소적은 예를 들면 단백질 또는 펩타이드와 같은 고정된 결합 존재물의 본래 구조를 유지하는 데 기여하는 환경을 제공하도록 선택된다. 이 생성 중합체는 바람직하게는 바이오칩의 제조 및 사용에 채택될 차후의 세척 및 기타 액체 처리 단계 및 취급을 허용하기에 물리적 및 화학적으로 안정한 하이드로겔이다. 이소시아네이트-작용 활성 그룹을 가지는 폴리에틸렌 글리콜계 프리폴리머가 바람직하게 활용되며, 중합되었을 때, 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔 네트워크가 형성되며, 강화되고, 우레탄 결합에 의해 가교결합된다. 중합 반응의 개시 후에, 프리폴리머는 마이크로스폿팅되어 3차원 반응 셀의 어레이를 형성하며 바이오칩 기질상으로 완전히 중합되게 한다. 셀을 위한 구체적인 중합체 화학이 미국 특허 번호 6,174,683 및 국제 특허 출원 공개, WO 00/65097에 기재되어 있으며, 여기에서는 하이브리드화 포획 탐침으로서 핵산 올리고머를 사용하는 바이오칩을 설명하고 있다. 기술적 발전이 더해진 결과로서, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의 공중합체가 단백질 및 펩타이드를 포함하는 다양한 비하이브리드화 결합 존재물을 함유하는데 적당한 3차원 바이오칩의 제조에 효율적으로 채택될 수 있음이 본 발명에 이르러 발견되었다.
일 특정 측면에서, 본 발명은 (a)표면을 지닌 고체 기질; (b)이소시아네이 트-작용 중합체로부터 형성되며, 기질의 표면에 부착된 적어도 하나의 광학적으로 투명한 하이드로겔 셀; (c)표적 단백질 또는 다른 필적하는 분자를 선택적으로 격리하는데 효율적인, 하이드로겔 셀 내부 또는 상에 고정된 비하이브리드화 결합 존재물을 포함하는, 광학적으로 투명한 하이드로겔 바이오칩을 제공한다.
다른 특정 측면에서, 본 발명은 (a)적어도 2 하이드로겔 셀이 결합된 표면을 지닌 기질을 가지는 광학적으로 투명한 하이드로겔 바이오칩을 제공하고, 각 셀은 적어도 약 30 ㎛의 두께를 가지며 우선적으로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 공중합체를 포함하고, 각 하이드로겔 셀은 이의 내부 또는 상에 고정된 상이한 단백질 결합 존재물을 포함하고, (b)결합 조건하에 표적 생체분자를 함유하는 분석 용액과 하이드로겔 바이오칩을 접촉시키며; (c)비선택적 결합 및 미결합 표적 생체분자를 제거하는 조건하에 하이드로겔 바이오칩을 세척하고; (d)상기 셀 중 하나에 결합된 표적 생체분자를 검출하는 단계를 포함하는, 생화학적 분석을 수행하기 위한 바이오칩의 사용 방법을 제공한다.
또다른 특정 측면에서, 본 발명은 (a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; (b)비하이브리드화 결합 존재물의 용액을 제공하며; (c)활성 이소시아네이트의 15% 이하와의 반응을 통해 상기 결합 존재물이 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머와 공유 결합하고; (d)광학적으로 투명한 하이드로겔을 생성할 조건하에 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의중합을 개시하고; (e)고체 기질에 중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머를 소적 형태로 분배하여, 상기 결합 존재물을 함유하는 광학적으로 투명한 하이드로겔 프리폴리머가 상기 기질에 부착되는 단계를 포함하는, 바이오칩 내부 또는 상에 고정되며 표적 단백질 또는 표적 생체분자를 선택적으로 격리하는데 효율적인 비하이드리드화 결합 존재물을 가지는 광학적으로 투명한 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩의 제조 방법을 제공한다.
또다른 특정 측면에서, 본 발명은 (a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; (b)목적한 단백질 포획제의 용액을 제공하며; (c)상기 단백질을 위한 매개 커플링제를 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머와 공유결합시키고; (d)상기 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하며; (e)중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 소적을 고체 기질상에 분배하여, 상기 중합체가 상기 기질로 부착되며; (f)각각의 하이드로겔 소적을 하나의 상기 목적한 단백질 용액에 노출시켜 바이오칩 내부 또는 상의 상기 단백질 포획제가 상기 커플링제와의 연결을 통해 고정되고, 그리하여 상기 소적이 중합하여 상이한 단백질 포획제와 함께 다수의 셀을 가지는 바이오칩을 생성하는 단계를 포함하는, 바이오칩 내부 또는 상에 고정되어 포획제로서 작용하도록 선택된 단백질을 가지는 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩의 제조 방법을 제공한다.
또다른 특정 측면에서, 본 발명은 (a)상부 표면을 지닌 고체 기질; (b)상기 기질의 상부 표면에 결합된 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의공중합체를 포함하는 다수의 하이드로겔 셀; (c)상기 셀의 하이드로겔 내부 또는 상에 고정된 매개제; (d)단백질 결합 존재물이 그의 본래 구조를 나타낼 수 있도록 하는 방법으로 상호작용하여 상이한 단백질 결합 존재물이 적어도 여러개의 하이드로겔셀 내부의 매개제에 결합되는 단계를 포함하는, 하이드로겔 바이오칩을 제공한다.
또다른 특정 측면에서, 본 발명은 (a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고; (b)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하며; (c)중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머를, 소적이 기질에 부착되고 다수의 셀을 형성할 수 있도록 고체 기질로 분배하며; (d)적어도 각 셀 중 2개의 내부 또는 상에, 특정 생체분자를 선택적으로 격리할 결합 제로서 작용하도록 선택되는 상이한 단백질을 물리적으로 고정시키는 단계를 포함하는, 바이오칩 내부 또는 상에 고정된 단백질을 가지는 다수의 셀을 지니는 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩의 제조 방법을 제공한다.
DNA와 같이 고정된 핵산으로 구성된 마이크로어레이는 생물학적 샘플의 고 처리량 분석 및 특징분석에서 굉장한 유용성을 증명해왔다. 핵산 바이오칩상에서 생물학적 탐침의 다중 조합을 사용하는 이러한 샘플의 분석을 통해, 샘플의 핵산 성분에 관한 정보가 획득된다. 이러한 바이오칩은 단순한 평면 플레이트, 예를 들어 유리 슬라이드, 또는 함몰 또는 웰이 형성된 플레이트를 사용한다. 전형적으로, 핵산 올리고머의 다양한 서열, DNA, 즉 싱글 스트랜드 DNA, RNA 또는 PNA는 이후에 샘플로부터의 상보적 서열에 하이브리드화될 수 있는 형태로 고정되며, 이는 U.S. 특허 번호 6,242,246을 참조하라. 이러한 하이브리드화의 특이성 및 핵산 서열의 다양한 조합을 신속하게 검사할 수 있는 능력 덕분에, 획득된 데이타는 샘플로부터의 유전자 발현 및 서열 특징을 결정하는 데 유용하다. 이러한 데이타는 질병 메카니즘의 유전적 토대 결정과 잠재적인 진단 및 치료 표적의 동정에 있어서 핵심 요소가 될 수 있다.
핵산 마이크로어레이 방법은 이용가능한 DNA 합성기, PCR 방법, 및 발전하는 유전자 표적 정보를 이용한다. 핵산 마이크로어레이의 사용으로부터는 쉽게 추론되지 않는 새로운 생물학적 통찰력을 향한 루트를 잠재적으로 제공할 수 있는, 비하이드리드화에 기초한 상호작용을 이용하는 다른 고처리량 분석을 허용하는 데 사용될 수 있는 예를 들면 항체 또는 기타 단백질과 같은 생물학적 관심사의 다른 결합 존재물의 고정에 이러한 마이크로어레이의 사용을 확장시키는 데 있어서 유망한 관심이 존재한다.
그러나, 핵산 바이오칩에 비해, 단백질 및 펩타이드와 같은 다수의 상이한 결합 존재물을 적절히 고정할 수 있는 바이오칩을 제작하는 데 있어 어려움에 직면할 것이 예상된다. 단백질과 같은 물질의 고정에 보통 사용되는 고정 화학은 고체 지지체 표면과 부착 또는 직접 접촉하기 때문에 빈번히 이들 물질의 변성을 유도한다. 또한, 부착 화학은 핵산과는 상관없는, 단백질과 같은 다수의 결합 존재물상에 존재하는 다중의 경쟁적으로 활성인 잔기 때문에 제한될 수 있고, 단백질과 같은 다수의 다른 결합 존재물의 구조는 이들의 생물학적 활성을 보존하는 데 핵심이며, 분자상 다중 잔기를 통해 고정됨에 따라 쉽게 파괴될 수 있는 것으로 익히 공지되어 있다.
활성의 이러한 잠재적 손실은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 DNA 증폭 방법의 비유용성으로 인하여 표적 단백질의 검출이 본질적으로 더욱 곤란하게 될 이와 같은 상황에서 한층 중요해진다. 즉, 다수의 경우, 조직 샘플로부터 분리된 단백질과 같은 결합 존재물의 매우 제한된 양만이 이용 가능하며, 쉽고 편리한 방식으로 이들 물질을 다량 생산해내는 능력의 부재는 핵산에서와 같이, 이러한 분석을 방해할 것이다.
도 1은 방법의 일환으로서 본 발명의 다양한 특징을 구체화하는, 하이드로겔 프리폴리머의 유기용매내 단백질과의 반응에 이은 하이드로겔 중합의 개략도이다.
도 2는 하이드로겔의 중합 동안에 하이드로겔 프리폴리머와 물내 단백질과의 대안적인 반응의 개략도이다.
도 3a와 3b는 하이드로겔 프리폴리머와 킬레이트화제와의 또다른 대안적인 반응의 개략도이며, 금속과의 킬레이팅 및 테일에 다중 히스티딘을 함유한 단백질과의 차후 결합이 이어진다.
도 4a는 실시예 4에서 기술된 실험의 개략도이다.
도 4b는 실시예 4에서 사용된 2 싱글 스트랜드 핵산의 설명이다.
도 5는 실시예 5에서 수행된 실험의 개략도이다.
도 6은 실시예 9에서 수행된 실험의 개략도이다.
하이드로겔은 바람직하게는 매트릭스 내부와 외부로 분자의 확산을 허용하는 적당한 세공 크기 및 높은 수분 함량, 유리 또는 유사체의 표면에 대한 결합능, 완전히 중합된 상태에서 형광 태그로 인한 어떠한 광학 간섭이라도 최소화하기에 충분한 광학적 투명도, 완전히 중합되었을 때 양호한 구조적 보전성, 및 보통의 연구 및 의학적 용도에 있어 적당한 저장 수명을 가지는 겔 매트릭스를 제공할 수 있는 중합체의 한 부류이다. 하이드로겔은 탈수 상태에서 유리와 같고, 물이 존재할 때는 탄성 겔을 형성하며 팽윤하는 친수성 네트워크 중합체이다. 이소시아네이트-작용 하이드로겔은 예를 들면 단백질과 같은 비하이브리드화 결합 존재물의 고정에 있어 이점으로 작용할 수 있는 다수의 특징을 가진다. 이소시아네이트-작용 하이드로겔은 목적한 부가 중합 및 또한 단백질 또는 유사체와 공유결합을 수행하도록 또는 단백질 부착의 경우 매개제로 작용할, 이소시아네이트 그룹으로 캡핑된 유기 중합체를 의미한다. 예를 들면, 당업계에 익히 공지되어 있고 디이소시아네이트와 폴리에테르 또는 폴리에스테르 폴리올간의 반응에 의해 형성될 수 있는 폴리우레탄 중합체는, 이러한 목적을 위해 적당한 하이드로겔을 제공할 수 있다.
프리폴리머는 바람직하게는 이 이소시아네이트-작용 하이드로겔을 사용하여 바이오칩을 형성하는데 있어 출발 물질로서 사용되며, 또한 바람직하게는 이 프리폴리머는 제형되어 수화된 폴리우레탄, 폴리우레아-우레탄 및/또는 폴리우레아 중합체 겔을 제공한다. 하이드로겔 중합체는 다양한 프리폴리머로부터 제조되어 왔으며, 폭넓은 다양한 응용에 사용된다. 전형적으로, 하이드로겔은 가볍게 가교결합된 프리폴리머가 농축된 형태의 겔인 3차원 중합체 네트워크를 가지며 초기에 형성되도록 하는 조건하에서, 수용액 중의 친수성 단량체를 중합시킴으로써 형성된다. 폴리우레탄 하이드로겔은 이소시아네이트-말단-캡핑된 프리폴리머를 중합시킴으로써 우레아의 생성 및 우레탄 결합을 통해 형성된다.
적당한 이소시아네이트-작용 프리폴리머는 종종 2-작용성 또는 다-작용성 이소시아네이트 화합물과 반응하는 비교적 고분자량 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올로부터 제조되기도 한다. 바람직한 프리폴리머는 에틸렌 옥사이드 단위의 단일 폴리머 또는 에틸렌 옥사이드 단위 및 프로필렌 옥사이드 또는 부틸렌 옥사이드 단위를 함유하는 블록 또는 랜덤 공중합체를 포함할 수 있는 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올로부터 제조된다. 블록 또는 랜덤 공중합체의 경우, 바람직하게는 적어도 단위의 75%가 에틸렌 옥사이드 단위여야 한다. 대안적으로, 덜 바람직하기는 하지만 폴리프로필렌 옥사이드의 단일중합체 또한 사용될 수 있다. 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올 분자량은 바람직하게는 2,000 내지 30,000, 더욱 바람직하게는 5,000 내지 30,000이다. 적당한 프리폴리머는 예를 들면, 필수적으로 하이드록시 그룹의 모두가 폴리이소시아네이트로 캡핑되는 약 1.2 내지 약 2.2의 이소시아네이트 대 하이드록시 비율에서, 선택된 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올을 폴리이소시아네이트와 반응시켜 제조될 수 있다. 이소시아네이트-작용 프리폴리머는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.2 meq/g, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.8 meq/g의 활성 이소시아네이트 양을 함유해야 한다. 일반적으로, 예를 들면 3,000 MW 이하의 상당히 낮은 분자량 프리폴리머는, 바람직하게는 비교적 높은 이소시아네이트 함량(약 1 meq/g 또는 그 이상)을 함유해야 한다. 이러한 프리폴리머의 중합 속도는 효율적으로 마이크로스폿팅하기에 너무 빠르게 중합되지 않도록 제어되어야 하며, 이러한 관점에서, 비교적 낮은 이소시아네이트 함량을 함유하는 고분자량 프리폴리머가 보통 바람직하다.
이러한 고분자량 프리폴리머는 (1)적어도 2,000의 분자량을 가진 폴리올(트리올 또는 그 이상)을 이소포론 디이소시아네이트와 같은 폴리이소시아네이트와 반응시키고, 또는 (2)적어도 2,000의 분자량을 가진 디올을 폴리이소시아네이트 및 글리세롤, 트리메틸올프로판, 트리메틸올에탄, 트리에탄올아민 또는 유기 트리아민등과 같은 가교결합제와 반응시키는, 두 가지 일반적 방법 중 하나로 종종 제조되나, 당업계에서 공지되지 않은 다른 방법 또한 사용될 수 있다.
방향족, 지방족 또는 지환족 폴리이소시아네이트가 사용될 수 있다. 고분자량 지방족 이소시아네이트-캡핑 프리폴리머는 전형적으로 약 20 내지 90분내에 수화된 중합체 상태로 겔화되고, 반면 방향족 폴리이소시아네이트로 캡핑된 프리폴리머는 훨씬 더 신속하게 겔화된다. 적당한 2- 또는 다-작용성 이소시아네이트의 예는 다음과 같다: 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2,6-디이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트, 에틸렌 디이소시아네이트, 에틸리딘 디이소시아네이트, 프로필렌-1,2-디이소시아네이트, 사이클로베자일렌-1,2-디이소시아네이트, 사이클로헥실렌-1,4-디이소시아네이트, 페닐렌 디이소시아네이트, 3,3"-디페닐-4,4"-비페닐렌 디이소시아네이트, 1,6-헥사메틸렌 디이소시아네이트, 1,4-테트라메틸렌 디이소시아네이트, 1,10-데카메틸렌 디이소시아네이트, 큐멘-2,4-디이소시아네이트, 1,5-나프탈렌 디이소시아네이트, 메틸렌 디사이클로헥실 디이소시아네이트, 1,4-사이클로헥실렌 디이소시아네이트, p-테트라메틸 자일릴렌 디이소시아네이트, p-페닐렌 디이소시아네이트, 4-메톡시-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-클로로-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-브로모-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-에톡실-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 5,6-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 1,4-디이소시아나토디페닐에테르, 4,4'-디이소시아나토디-페닐에테르, 벤지딘 디이소시아네이트, 4,6-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 9,10-안트라센 디이소시아네이트, 4,4'-디이소시아나토디벤질, 3,3'-디메틸-4,4'-디이소시아나토디페닐메탄, 1,6-디메틸-4,4'-디이소시아나토디페닐, 2,4-디이소시아나토스티벤, 3,3'-디메톡시-4,4'-디이소시아나토디페닐, 1,4-안트라센디이소시아네이트, 2,5-플루오로네디이소시아네이트, 1,8-나프탈렌 디이소시아네이트, 2,6-디이소시아나토벤즐우란, 2,4,6-톨루엔 트리이소시아네이트, p,p',p"-트리페닐메탄 트리이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트의 삼작용성 삼량체(이소시아누레이트), 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용성 뷰렛, 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용성 삼량체(이소시아누레이트), 중합체 4,4'-디페닐메탄 디이소시아네이트, 자일릴렌 디이소시아네이트 및 m-테트라메틸 자일일렌 디이소시아네이트.
선택된 디올 또는 폴리올을 폴리이소시아네이트로 캡핑하여 프리폴리머를 형성하는 것은 반응물의 화학량론을 사용하여 달성될 수 있다. 이소시아네이트 대 하이드록시 그룹의 비는 당업계에 공지된 바와 같이 다양할 수 있으나, 바람직하게는 약 1 내지 약 3, 및 더욱 바람직하게는 약 1.2 내지 약 2.2이어야 한다. 캡핑 반응은 약 20 내지 약 150℃에서, 건조 질소하, 약 2시간 내지 약 14일 동안, 바람직하게는 촉매의 부재하와 같은 임의 적당한 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 온도는 약 60 내지 100℃이며, 반응은 이소시아네이트 농도가 이론치에 가까워질 때 종결된다.
바람직한 프리폴리머는 톨루엔 디이소시아네이트로 말단-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다: 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드(임의로는 트리메틸올프로판과 함께)의 공중합체 및 톨루엔 디이소시아네이트; 톨루엔 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜-트리메틸올프로판, 메틸렌 디이소시아네이트-메틸렌 단일중합체; 중합체 메틸렌 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜; 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드-트리메틸올프로판과 이소포론 디이소시아네이트, 및 폴리에틸렌 글리콜 트리락테이트와 톨루엔 디이소시아네이트의 중합체. 상기 유형의 적당한 프리폴리머는 미국 매사추세츠 렉싱턴 소재의 Hampshire Chemical Corp.로부터 HYPOL PreMARG-50, HYPOLR2000, HYPOLR3000, HYPOLR4000 및 HYPOLR5000으로서 입수가능하며, 이들 제형은 일반적으로 폴리에틸렌 옥사이드와 소량의 폴리프로필렌 옥사이드의 공중합체를 포함한다.
모든 것이 고려된 하이드로겔 중합체의 주쇄는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함한다. 어떠한 이론적 메카니즘에 구속되지 않고, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜 하이드로겔의 비이온성, 친수성 특징은 하이드로겔에 대한 분석물의 낮은 수준의 비특이적 결합 및 고정된 생체분자의 본래 구조 및 생물학적 반응성을 유지하기 위한 양호한 적합성을 제공한다. 이소시아네이트-작용 하이드로겔은 유리하게도 많은 양의 액체를 겔 물질의 기본적 전체 형상이 유지되도록 하는 비교적 일정한 방법으로 신속하게 흡수한다. 또한, 이 물질에 의해 흡수된 수분은 심지어 가해진 압력 하에서도 흡수 물질에서 그대로 유지된다. 이러한 일반형의 폴리우레탄계 이소시아네이트-작용 하이드로겔은 미국 특허 번호 3,939,123(Mathews, et al.), 4,110,286(Vandegaer, et al) 및 4,098,645(Hartdegan, et al)에 기재되어 있다. 이러한 폴리우레탄계 하이드로겔은 표면 코팅으로서 또한 유연하거나 견고한 형태로 널리 사용되어 왔으며; 또한 효소 반응기 시스템을 위한 폼을 형성하는데도 사용되어 왔다.
바람직한 양태에서, 바이오칩은 고분자량 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드의 디올 또는 트리올, 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리프로필렌 옥사이드의 공중합체에 기초하고, 수-활성 디이소시아네이트로 캡핑되며, 임의로는 가볍게 적당한 가교결합제로 가교결합될 수 있는 이소시아네이트-작용 하이드로겔을사용하여 제작된다. 프리폴리머내 존재하는 활성 이소시아네이트의 양은, 예를 들면 약 0.1 내지 1 meq/g, 그러나 0.8 meq/g보다는 많지 않은 양으로서 예측 가능한 것이 바람직하다. 일반적으로 바람직한 디이소시아네이트는 톨루엔 디이소시아네이트 또는 메틸렌 디페닐-이소시아네이트와 같은 방향족계 디이소시아네이트 및 이소포론 디이소시아네이트와 같은 지방족 디이소시아네이트를 포함한다. 바람직하게는, 중합체내 활성 이소시아네이트의 약 15% 내지 약 5%가 결합 존재물을 고정하기 위한 부위를 제공하는데 사용되며 더욱 바람직하게는 프리폴리머내 활성 이소시아네이트의 10% 또는 그 이하가 결합 존재물을 고정시키는데 사용된다. 수-혼화성 유기 용매에서 미리 제형될 수 있는 바이오칩 제작을 위한 프리폴리머의 중합은, 단순히 물의 첨가로 발생하는 우레아 결합의 형성에 의해 일어난다.
결합 존재물은 각 셀 또는 마이크로소적에 셀 물질의 중합 전, 도중, 또는 후에 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 간접 고정은 1차로 하이드로겔에 연결되고 또한 여기에 연결되는 2차 매개제로서 사용가능한 매개제의 채택을 예상케한다. 예를 들면 하이드로겔 매트릭스로 캡슐화된 1차 매개제는 칼모둘린에 대한 항체일 수 있다. 일단 칼모둘린이 항체에 결합하면, 칼모둘린은 칼슘/칼모둘린 의존 키나아제 Ⅱ와 같은 칼모둘린-결합-단백질을 격리하는데 사용될 때 2차 매개제로서 작용한다. 하이드로겔로 CaM 키나아제 Ⅱ(상용어)를 부착하는 이러한 접근은 자연발생적인 결합 모티프, 즉 칼모둘린 단백질을 통해 단백질을 고정하는 좋은 방법을 제공한다. CaM 키나아제 Ⅱ는 이제, 예를 들면 CaM 키나아제 Ⅱ의 조절 이벤트(인산화, 탈인산화)를 검사하거나 또는 가능한 도킹 단백질 또는 다른 세포내 트래피킹 단백질에 대한 조사를 목적으로 하는 탐침 분석 용액에 유리된다. CaM 키나아제 Ⅱ를 고정하는 대안적인 방법은 기능 손실이나 다른 해로운 효과를 유도할 수 있다.
결합 존재물이라는 용어는 하이브리드화가 아닌 다른 메카니즘에 의해 표적 물질을 물리적으로 격리시키기 위해 1 이상의 표적 물질과 특정 방법으로 상호작용 가능한 물질을 언급하는데 사용된다. 이 비하이브리드화 결합 존재물은 수용체, 펩타이드, 효소, 효소 억제제, 효소 기질, 항체와 같은 이뮤노글로불린, 항원, 렉틴, 변형된 단백질, 변형된 펩타이드, 더블-스트랜드 DNA, 생물기원 아민 및 복잡한 탄수화물과 같은 생물학적 물질을 포함하나 이에 한정되지는 않으며; 또한 예를 들면 이런 유형의 특정 결합 활성을 가지도록 디자인된 약제나 합성 리간드를 포함할 수 있다. "변형된" 단백질 또는 폴리펩타이드는 신규 화학 잔기의 첨가, 존재하는 화학 잔기의 제거 또는 제거 및 첨가 모두의 어떤 조합에 의해 변경된 물질내의 1 이상의 아미노산을 가지는 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 이 변경은 자연적 및 인공적 변형을 모두 포함할 수 있다. 자연 변형은 인산화, 황화, 당화, 핵산 첨가, 및 지질화를 포함하며 여기에 한정되지는 않는다. 인공 변경은 하이드로겔로의 결합을 용이하게 하기 위한 화학 링커, 및 형광 염료, 마이크로구조, 양자 도트와 같은 나노구조 또는 다른 인공물질의 첨가를 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 뿐만 아니라, 변형은 존재하는 기능기, 예를 들면 하이드록시, 설프히드릴 또는 페닐 그룹의 제거 또는 본래 측쇄 또는 폴리펩티드 아미드 백본의 제거 또는 변경을 포함할 수 있다. 복합 탄화수소는 천연 및 인공 직쇄 및 측쇄 올리고당, 글리코리피드, 펩타이도글리칸, 글리코사미노글리칸 또는 아세틸화된 종류와 같은 변형된 다당, 및 N-아세틸글루코사민 또는 황화된 종류와 같은 이형 올리고당을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 또한 약제, 리간드, 염료 또는 스크리닝 및 정량분석의 목적에 유용한 다른 제제와 같은 분자의 첨가와 같은 이들의 인공적 변형도 포함된다. 자연 발생적 복합 탄화수소의 예는 키틴, 히알루론 산, 케라탄 설페이트, 콘드로이탄 설페이트, 헤파린, 셀룰로스 및 알부민과 IgG와 같은 변형된 단백질상에서 발견되는 탄화수소 잔기를 들 수 있다. 이러한 존재물의 둘 이상의 조합은 마이크로칩 어레이상의 어떤 위치에서 고정될 것이며, 이 조합은 두 존재물의 1 혼합물로서 첨가되거나 또는 연속적으로 첨가될 수 있다.
격리 또는 비하이브리드화 결합시 고정된 존재물와 표적간의 상호작용을 묘사하는 것은, 2 이상의 물질을 특정 선택적 방법으로, 전형적으로는 공유 또는 비공유결합(예를 들면, 반 데르 발스 힘 및/또는 이온 상호작용을 통해)에 의해 부착 또는 결합시키는 것을 의미한다. 특정 표적은 생물학적 또는 합성 물질의 복합 혼합물내 존재할 수 있는 단순한 물질일 수 있다. 격리 또는 결합은 예를 들면 공유적 변형 또는 항원-항체 반응과 같은 확장된 천연 반응, 또는 예를 들면 인산화 이벤트 동안에 발생할 수 있는 일시적인 것일 수 있다.
DNA 결합 존재물은 데옥시리보뉴클레오타이드의 합성 및 천연 더블-스트랜드 중합체, 합성 및 천연 폴리리보뉴클레오타이드, 앱타머, 하나 이상의 변형된 또는 비자연 발생적 화학 존재물을 가지는 합성 폴리뉴클레오타이드를 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 결합제/격리제로서 DNA의 이러한 사용은 표적 DNA가 하이브리드화하는 DNA의 싱글 스트랜드(올리고뉴클레오타이드 또는 cDNA)를 전형적으로 사용하는 통상의 뉴클레오타이드 하이브리드 어레이에서와 배치된다. 더블-스트랜드 DNA는 DNA 결합 단백질, 에스트로겐 수용체와 같은 전사 인자와 같은 적당한 생체분자, 또는 생체분자와 결합 또는 격리하기 위한 합성 약제 또는 분자와 상호작용하기 위해(하이브리드화는 반대) 사용될 수 있다. 예를 들면, TBP 또는 SP1과 같은 일반적 전사 인자, 또는 핵 호르몬 수용체와 같은 특정 전사 인자가 유인될 수 있고 나선, 더블 스트랜드 DNA에 의해 격리될 수 있다. 앱타머(Aptamer)는 모노클로날 항체처럼 작용하는 것으로 보이는 미국 특허 번호 5,840,867에 기재되어 있다.
대안적으로, 일 양태는 겔 매트릭스 내에 물리적으로 공중합된 선택적 항체 또는 앱타머와 같은 다른 선택적 결합제와 같은 초기 결합 존재물을 사용할 수 있으며, 여기에서 1 이상의 상이한 항체가 어레이의 각 셀에 고정될 것이다. 이러한 어레이에 생물학적 물질의 복합 혼합물을 후속 적용시, 각 셀에 포함된 이들 고정된 항체의 고유한 결합 속성은 이러한 복합 혼합물을 "스스로-분류"하고 "스스로-조립"하는 새로운 어레이를 생성할 것이며; 새로운 어레이는 초기 결합 존재물에 상보적일 것이다. 예를 들면, 특정 항원에 대한 항체는 중합 동안에 각 겔 마이크로소적에 고정되며; 이후에, 이러한 어레이에 단백질 또는 펩타이드 항원의 혼합물을 노출시킴으로써, 특정 단백질 또는 펩타이드 항원이 각 코그네이트 항체에 결합하도록 제공된다. 이러한 매개 항체 어레이의 용도의 한 예는 각 단백질의 개별 분리의 필요성 없이 세포 추출물로부터 단백질의 복합 혼합물을 스스로-분류하는 것이다. 그리하여 형성된 어레이는 이후에 첨가된 단백질 키나아제 또는 다른단백질-변형 잔기에, 각 노출 부위에 대한 어떤 효과를 미치는지 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 개념은 이러한 변형 활성이 약제 또는 다른 첨가된 화학 화합물에 의해 영향받을 수 있는지 검사하기 위해 확장될 수 있다.
추가 대안으로서, 다른 결합 존재물이 초기에 고정될 매개제의 사용을 통해 중합 후에 바이오칩 어레이의 각 셀에 위치하거나 고정될 수 있다. 예를 들면, 단백질 A와 같은 적당한 매개제는 중합 동안에 고정되며, 이후에 목적한 이뮤노글로불린 포획제가 용액에서 이뮤노글로불린에 대한 제어된 노출을 통해 고정된 단백질 A로 결합된다.
다른 양태에서, 초기 고정된 결합 존재물은 차후에 변형될 수 있다. 이러한 변형은 (a)예를 들어 인산화, 당화, 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화, 지질 변형 및 ADP-리보실화와 같은 생물학적 변형, 또는 (b)예를 들어 형광염료 변형, 비오틴화, 알킬화 및 비정상적 잔기 혼입 및 어레이의 변형된 최종 형태를 생성하는 단백질 또는 효소와의 컨쥬게이션 등의 비생물학적 변형을 포함할 수 있다. 또다른 양태에서, 더블-스트랜드 핵산 올리고뉴클레오타이드(또는 중합체)는 중합 동안에 고정되는데; 이후에, 목적한 단백질은 핵산 서열-특이적 단백질 상호작용에 의해 이러한 핵산으로 결합되며, 자가-조립된 단백질-핵산 복합 어레이를 생산한다.
비양성자성 용매에서 프리폴리머를 결합 존재물과 1차 반응시킴으로써, 결합 존재물은 프리폴리머에 효과적으로 고정되며, 이러한 과정은 하이드로겔의 제조에 있어 다수의 이점을 가질 수 있다. 이는 물에서 프리폴리머의 균질 용액을 차후에생성시키는 것을 도울 수 있으며 또한 CO2가 느리게 거품을 일으키며 생기는 것을 허용하도록 중합 혼합물의 점도를 낮춤으로써 중합 단계 동안 이산화탄소의 발생을 낮추는데도 기여한다. 폴리우레탄계 하이드로겔의 중합 단계에서, 예를 들면 약간의 기체 이산화탄소가 하이드로겔 프리폴리머의 이소시아네이트 그룹과 물의 반응에 의해 생성된다. 이러한 반응은 도 1 및 도 2에 도해되며, 이는 프리폴리머로부터 바이오칩이 제조될 때 이산화탄소 기체의 생성 및 이의 겔로부터의 탈출을 제어하는데 유리할 수 있다. 중합이 고점도 혼합물에서 너무 빠르게 일어나면, 생성되는 이산화탄소가 빠져나올 수 없고 겔에 갇히게 될 수 있다. 이는 겔 매트릭스의 연속성에 문제가 될 수 있는 불규칙한 폼 매트릭스를 초래하고, 또한 광학적 투명도도 방해할 수 있다. 바이오칩 디자인에서, 광학적 투명도가 클수록, 성공적인 표적으로의 결합의 지표일 수 있는 형광의 검출이 더욱 정확해진다. 이산화탄소 발생을 제어하는 일 방법은 pH를 약 8.5 또는 그 이하로 유지하여 반응 속도 및 따라서 중합 용액내 이산화탄소의 확산을 조절하는 것이다.
비양성자성 용매에서 하이드로겔을 유도체화 하는 것의 추가 이점은 프리폴리머의 침전을 최소화하여 하이드로겔의 광학적 투명성 또는 투명도를 향상시키는 것이다. 그러므로 겔의 느린 중합 및 연속적이며 투명한 겔 매트릭스를 제공하기 위한 CO2의 느린 생성을 달성하는 또다른 방법은 비양성자성 용매 대 물의 비를 적어도 약 0.25 대 1 및 더욱 바람직하게는 그 이상, 예를 들어 0.3 - 0.35 대 1로 유지하는 것이다. 하이드로겔의 유도체화 및 중합은 일반적으로 이러한 비로 약 30분 동안에 완성된다. 임의 셀의 프리폴리머에 결합된 결합 존재물의 양은 반응에 첨가되는 결합 존재물의 양을 단순히 다양화함(예를 들면, 각 마이크로소적에 대해 약 10 fmol 내지 약 1 pmol의 단백질)으로써 조정될 수 있어, 각 하이드로겔 마이크로소적내 고정된 결합 존재물의 양에 대한 정밀한 제어를 허용한다.
겔을 통해 유망한 표적 분자 또는 다른 2차 결합 존재물이 겔 매트릭스내 고정된 매개제 또는 1차 결합 존재물과 반응하게 하는 확산의 용이함은 일부에서는, 사용된 용액내 하이드로겔 프리폴리머의 %에 의해 결정될 수 있다. '683 특허는 하이드로겔 소적을 제형하기 위해 프리폴리머의 5% 용액의 채택을 설명하고 있는데; 그러나 5% 수준에서는, 단백질과 같은 더욱 큰 물질의 중합된 하이드로겔로의 확산은 소망하는 것 보다는 느리다. 프리폴리머의 %가 낮을수록, 예를 들어 3.5%가 하이드로겔로 큰 물질의 통과를 용이하게 하는 데 바람직하다는 것이 발견되었다. 그러나, 약 3% 이하의 프리폴리머 용액에서는, 생성 겔이 충분한 구조적 보전성 및/또는 유용하기에 적절한 중합을 결여할 수 있다. 그러므로, 가시화 도구로서 항체를 사용하는 다양한 적용을 위해, 중합체의 바람직한 범위는 약 3% 내지 5%라 생각된다. 예를 들면 IgG(또는 예를 들면 겔이 마이크로스피어를 봉입 또는 고정할 때 더욱 큰)와 같은 전형적 항체보다 작은 크기의 물질을 시험하기 위한 다른 적용 또는 용도는 용액내 중합체의 높은 또는 낮은 %를 각각 채택할 수 있다.
하이드로겔이 단백질로 1차 유도체화 될 때 및 고체 기질로 침착될 때, 중합의 개시 후 및 완료 전에, 운반이 임의 편리한 방법에 의해 수행될 수 있다; 예를 들면, 겔을 침착시켜 마이크로소적의 어레이를 형성하는 통상의 마이크로스폿팅기가 사용될 수 있다. 이러한 겔은 본질적으로 비공유적으로 일부 기질로 부착되는 반면, 기질 표면은 하이드로겔의 첨가에 앞서 기질로의 겔의 단단한 부착을 달성하기 위해 일반적으로 유도체화된다. 예를 들면, 유리가 기질로서 사용되는 일 바람직한 양태에서, 유리는 중합 하이드로겔의 침착전에 아민으로 유도체화된다. 단백질로 유도체화된 중합 하이드로겔은 이후 유도체화된 유리 기질로 침착될 때 활성 이소시아네이트 그룹의 일부와 현재 유리의 표면에 위치한 아민과의 반응을 통해 기질로 강하게 결합한다. 이는 기질로의 하이드로겔의 공유 부착을 제공하며, 바람직하게는 프리폴리머내 본래 활성 이소시아네이트 그룹의 약 5% 또는 그 이하가 이러한 작용을 위해 사용된다.
특정 양태에서, 결합 존재물의 부분적 초기 블록킹은 결합 존재물의 효율적인 고정을 최대화하기 위해 바람직할 수 있다. 이소시아네이트 프리폴리머와 예를 들면 1차 아민을 포함할 수 있는 특정 화학 잔기인 특정 결합 존재물의 반응성은 결합 존재물과 중합체간의 과도한 가교결합을 초래할 수 있으며, 또한 결합 존재물의 변성을 유도할 수 있거나 표적 화합물에 대한 결합 존재물의 결합 친화도를 떨어트릴 수 있다. 이는 중합 동안에 이들 잔기의 적어도 일부를 보호하여 피하거나 제한할 수 있으며; 중합 후 탈보호는 어레이내 결합 존재물의 기능성 및 유용성을 되살릴 것이다. 즉, 중합후 탈-블록킹은 결합 존재물로 하여금 이의 본래 구조를 띠도록 허용한다. 이러한 블록킹/탈-블록킹은 공유 또는 비공유 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 결합 존재물로서 항체를 사용하였을 때, 중합체로 가교결합되는데 민감한 항원 인지 부위는, 프리폴리머와의 혼합에 앞서 비가교결합 펩타이드(또는 다른 에피토프 유사체)와 배양된다. 이러한 펩타이드 또는 에피토프 유사체는 중합 과정 동안에 활성 이소시아네이트 그룹과 컨쥬게이션되는 것으로부터 항원 인지 부위를 보호할 것이다. 중합 후에, 이러한 펩타이드는 예를 들면 pH 3.0의 산에 잠시 노출시켜, 항체의 항원 인지 부위를 재-노출시킴으로써 항체로부터 유리될 것이다. 유사 기술이 결합 존재물상의 선택 설프히드릴 잔기 또는 아민을 보호하는데 이용될 수 있으며; 이는 중합 과정동안에 이들 작용기를 보호하기 위해 익히 공지된 가역적 화학 유도체화를 이용할 수 있다.
'683 특허에서 폴리에틸렌 글리콜이 증점제로서 중합 동안에 더한 선형 팽창을 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 다른 화합물이 중합 동안에 단백질과 같은 결합 존재물의 안정성과 본래 활성을 유지하기 위해 첨가될 수 있음이 발견되었다. 비결합 첨가제는 결합 존재물의 안정을 위해 프리폴리머 혼합물에 임의로 포함될 수 있다. 이 첨가제는 글리세롤, Ficoll 및 에틸렌 글리콜 및 만니톨, 수크로스 및 트레할로스와 같은 당을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 소 혈청 알부민과 같은 비특이적(비결합) 단백질을 포함하는 다른 벌크제 또한 하이드로겔로의 가교결합되는 정도를 제한하고자 할 때 단백질과 같은 존재물의 활성을 돕기 위해 사용될 수 있다.
첨가제의 또다른 임의 용도는 중합 하이드로겔내 지역 또는 도메인을 생성하는 물질을 사용하는 것이다. 중합 완료시, 이들 물질은 수용액에 용해되거나 확산되어, 이들 물질의 부재하에서는 존재하지 않을 큰 세공, 소포 또는 채널을 하이드로겔 중합체내에 남긴다. 이러한 큰 세공의 존재는 하이드로겔 내부 또는 상에 큰표면적을 생성하며, 하이드로겔 매트릭스를 통해 쉽게 확산되기에는 너무 클 수 있는 결합 생체분자 등을 위한 증가된 용량을 제공한다.
하이드로겔 중합체는 또한 합성 분자, 약제, 비펩티드 수용체 리간드, 금속 포피린과 같은 혼합된 유기/무기 종류, 제올라이트와 같은 무기 물질 등의 물질을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다른 결합 존재물에 적당하다. 일 바람직한 양태에서, 이 존재물은 결합 존재물과 분석 종간의 특이적 상호작용에 기초하여 용액으로부터 화합물을 격리하는데 사용된다. 또다른 바람직한 양태에서, 이 결합 존재물은 용액 내 종류와 일시적으로 상호작용한다. 이는 결합 존재물이 반응성 과정, 예를 들어 인산화, 메틸화, 절단 또는 다른 형태의 변형을 위한 선택적 기질로서 작용할 때의 경우이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 혼입된 물질은 촉매 반응에 관여할 수 있다. 이러한 촉매 물질은 생물학적 반응기에서 유용하다. 대안적으로, 상이한 촉매 존재물의 어레이는 최상의 효율적 촉매 존재물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 하이드로겔은 결합 존재물이 생물학적 분석, 물질 스크리닝 및 센서를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 임무에 유용하도록 제형된다.
대안적으로, 트리덴테이트 또는 테트라덴테이트 금속 킬레이트화제와 같은 비생물학적 화합물, 예를 들어 아민-유도체화 C4-C8의 적절한 링커를 가지는 이미노디아세트산 또는 니트릴로트리아세트산은 도 3a에서 개략적으로 묘사된대로 중합 이전 또는 도중에 매개 결합제로서 하이드로겔로 고정될 수 있다. 단백질과 같은 목적한 결합 존재물은, 바람직하게는 예를 들어 단백질의 테일 또는 헤드 말단으로서 다중 히스티딘-함유 서열을 가지도록 합성되거나 변형되며, 이는 도 3b에서 개략적으로 묘사된 바와 같이, 고정된 킬레이트화제와 연결함으로써 하이드로겔내에 단백질을 물리적으로 고정시키도록 이러한 말단 잔기와의 킬레이션을 허용하기 위해, Cu2+또는 Fe3+와 같은 2가 또는 3가 금속 이온과 함께 노출시킴으로써 바이오칩의 각 셀에 고정될 수 있다. 각 셀을 예를 들면 상이한 단백질 포획제와 같은 특정 결합 존재물에 노출시킴으로써, 분석 용도에 안정한 단백질 칩이 형성된다. 이러한 중합체 마이크로소적을 생성하는데 매개제를 사용하는 것의 일 이점은 최후 결합 존재물 단백질의 구조 및 배열이 변경되지 않고 남아 있도록, 특히 민감한 단백질의 잠재적 변성의 회피에 대한 뛰어난 확신이다. 또한, 제조는 특정 단백질 마이크로어레이내 각 마이크로소적 또는 셀을 생성하기 위해 동일한 킬레이트화제를 사용하고 이후에 거기에 결합제를 차후 연결 시킴으로써 단순화될 수 있다.
바이오칩 기질은 결합 분석 및 각 셀에 결합하는 표적 분자의 후 검출 동안에 자동화 처리에 기여하는 다양한 물질 및 포맷으로 구성될 수 있다. 비록 유리 슬라이드와 같은 고체 평면 플레이트가 적당하긴 하지만, 각 셀을 보유하기 위해 형성된 함몰 또는 웰을 가지는 플레이트도 사용될 수 있다. 유리 또는 투명한 폴리스티렌과 같은 광학적으로 투명한 기질은 셀을 통과하는 투과 광 검출을 허용할 것이며 형광 또는 광학적 흡수를 이용하는 검출 양식을 위해 편리하다. 3차원 하이드로겔 셀의 높은 결합능으로 인하여, 반사 광학적 방법 또한 가능하며 불투명 기질의 사용도 허용한다. 견고한 기질의 사용은 바이오칩을 사용하는 분석의 검출 기동안에 배열의 정밀성을 허용하나, 이는 적절한 배열이 검출을 용이하게 하기 위해 셀로 혼입된 경우, 불필요하다. 예를 들어 테잎 또는 필라멘트와 같은 유연한 포맷은 자기 테잎의 사용과 유사한 스캐닝 방식으로 정밀 검출될 수 있을 것이다. 광학적 방법 및 적당한 기질이 그의 단순성으로 인하여 바람직하긴 하지만, 방사능 제제의 검출과 같은 다른 생화학적 검출 방법 또한 대안적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 예를 들어 1 내지 1000의 어떠한 수의 세포라도 바이오칩 상에 제공될 수 있다. 자동화 처리를 보조하기 위하여, 종종 96 셀의 멀티플이 사용될 수 있다; 예를 들면, 384 셀은 3 인치(7.6 ㎝) x 5 인치(12.7 ㎝) 플레이트 상의 어레이에 제공될 수 있다. 바람직하게는 멀티플 셀이 사용되지만, 특정 상황에서는 단지 단일 셀을 사용하는 바이오칩이 만족스러울 수 있다.
특정 양태에서, 하이드로겔 셀의 중합 후에 하이드로겔 셀로 결합 존재물을 로딩하는 것이 바람직할 수 있다. 단순 확산은 이를 달성하기 위해서는 비효율적인 도구일 수 있다. 차후 용도의 코스에서, 하이드로겔로 신속히 확산되는 작은 분자는 하이드로겔의 바깥으로 신속히 확산되며, 따라서 이 결합 존재물의 손실을 유발한다. 그러므로 작은 물질 및 펩타이드와 같이 이렇게 쉽게 확산되는 제제의 경우 매트릭스로의 확산 후에 중합체 매트릭스로 이들 제제를 공유 컨쥬게이트 하기 위한 메카니즘을 가지는 것이 바람직하다. 이를 달성하기 위한 일 바람직한 수단은 성분의 부분으로서 중합체내에 함유되거나 또는 중합체로 확산되는 작은 분자에 연결된, 광활성 또는 화학적 가교결합 반응물과 같은 가교결합을 수행하기에 적당한 잔기를 활용하는 것이다.
대조적으로, 단백질 또는 DNA의 큰 절편과 같은 좀더 큰 결합 존재물은 수동 확산을 통해 하이드로겔 매트릭스로 이동하기에는 비효율적일 수 있다. 큰 종류의 매트릭스로의 확산을 용이하게 하기 위해, 단백질과 같이 전체 전하를 가지는 종류의 제어된 이동을 유발하도록 하는 방법으로, 단백질의 등전점과 상이한 pH값을 가지는 용액내에서 전기장을 적용한다. 이 방법은 "전기영동"이라 한다. 하이드로겔 셀이 대전된 종류의 이동 경로에 있는 경우, 대전된 종류는 수동 확산력 뿐만 아니라 적용된 전기장에 의해 제공되는 추가력을 겪으며, 그리하여 하이드로겔 셀로의 삽입을 가속화한다. 이 전기장-촉진 확산의 이점은 좀더 큰 결합 존재물이 차후의 분석 단계 동안에 하이드로겔 매트릭스 밖으로 쉽게, 수동적으로 확산되지 않는다는데 있다.
하이드로겔 셀의 중합에 이어, 하이드로겔 셀에 의해 점유되지 않은 기질 표면은 분석 반응물, 표적 물질 또는 기타 물질의 차후 비특이적 또는 원하지 않은 부착을 감소시키기 위해 제제 또는 물질로 처리될 수 있다. 이는 분석 반응물이 표면에 잠재적으로 비특이적 결합하는 적용에서 특히 유용하며, 따라서 용액내 분석 반응물 또는 표적 물질의 유효 농도를 실질적으로 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 이러한 처리는 표면으로부터 관찰되는 백그라운드 시그널의 양을 감소시키는데 채택될 수 있으며 또한 그리하여 분석 목적용 하이드로겔 셀의 효율성을 증대시킨다.
노출된 표면 영역에 대한 처리는 기질 표면상의 초기 층 또는 코팅으로서 존재하는 1차 아민과 반응하는 반응물의 적용을 포함한다. 이 반응물은 1차 아민에 공유결합할 이소시아네이트와 같은 활성 잔기를 함유하는 적어도 하나의 말단을 가진 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 중합체; 및 석시닐 에스테르와 같은 작은 친핵-반응성 잔기로 작용화된 비중합 분자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 분자생물학 당업자에게 익히 공지된, 관습적으로 백그라운드 시그널을 감소시키기 위해 채택되는 유리의 실란화 또는 소 혈청 알부민과 같은 표준 블록킹 반응물의 예가 대안적으로 사용될 수 있다.
유리하게는, 이 시스템에 수반된 모든 반응, 즉 (1)단백질 탐침으로 직접 또는 매개제로 하이드로겔 프리폴리머를 유도체화, (2)하이드로겔의 중합, (3)유도체화된 하이드로겔의 기질 표면으로의 결합은 강한 우레아 또는 우레탄(카바메이트) 결합의 형성을 수반한다. 이 결합은 마이크로소적 어레이에 기계적 보전성을 부여하고 바이오칩의 반감기를 상당히 증가시킨다.
이하에서 설명할 특정 바람직한 양태에서, 기질상에서 중합된 후 하이드로겔 마이크로소적은 바람직하게는 적어도 약 30 ㎛ 두께, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50 ㎛ 두께 및 가장 바람직하게는 약 50 내지 100 ㎛ 두께이다. 또한, 마이크로 소적은 일부 시스템에서 이전에 사용된 사각형 셀과 반대로 일반적으로 타원형이다. 겔 마이크로소적(또는 셀)의 전체의 더욱 커진 크기는 거기에 고정된 결합 존재물의 양을 상당히 증가시키는 것을 허용하여, 바이오칩의 낮은 검출 한계를 줄이고 이의 사용을 용이하게 한다. 중합체 용액의 점도를 줄이고 바이오칩 기질상으로 마이크로스폿팅하기 위해 사용될 분배 메카니즘으로 적당히 변형함으로써, 보다 작은 각 셀도 매우 고밀도 바이오칩 어레이를 생성할 수 있게한다. 웰을 가지는 기질이 사용된 경우, 마이크로소적은 웰의 바닥상으로 침착되어야 한다.
하기 실시예는 단백질 칩에 관한 몇몇 적용을 설명한다. 단백질-단백질 상호작용 연구에 적당한 대표적 바이오칩은 칼슘-의존 방법으로 칼모둘린을 칼시네린에 결합시킴으로써 설명된다. 단백질-DNA 상호작용에 적당한 바이오칩은 람다 리프레서 단백질을 DNA에 결합시킴으로써 설명된다. 이 바이오칩은 항원-항체 상호작용 및 실시예에서 상세히 설명되지 않을 수 있는 이전에 언급된 바와 같은 상호작용에 적당한 바이오칩을 이해하는 경로가 될 것이다.
실시예 1. 생물학적 활성을 증대시키기 위한 첨가제(글리세롤/트레할로스)의 사용
하기 실시예는 비활성 단백질, 단순 탄수화물 및 희석제가, 전체 시그널 및 분석 수행을 증진시키며 이 바이오칩의 하이드로겔에 고정된 항체 활성에서 보호 효과를 가지는 것을 보인다.
패널 A- 트레할로스. 이 실험에서, 트레할로스 스톡 용액의 분취액, pH 8의 50 mM 나트륨 보레이트 완충액중의 50% w/v D(+)트레할로스 디하이드레이트가 최종 하이드로겔 제형물이 50 ㎕ 용적이 되도록 첨가된다. 제형물은 또한 최종 농도 3.5 wt% HYPOL PreMARG-50 하이드로겔 프리폴리머(HYPOL, 아세토니트릴, N-메틸-2-피롤리디논을 각각 1:3:3의 w/w/w 비로 함유하는 미리 혼합된 스톡 용액), 항-트랜스페린(4 mg/ml 포스페이트 생리식염수 1X (PBS), 2 ㎕ 소 IgG(PBS 및 1.25% 글리세롤에서 50/mg/ml)을 포함한다. 트레할로스의 양은 0, 1%, 2%, 5% 및 10% 트레할로스의 최종 w/v %에 상응하여 0 내지 10 ㎕로서 다양하다. 어떠한 단백질도 함유하지 않은 블랭크 하이드로겔 스폿 또한 포함된다. 이 시험 용액은 샘플당 3 핀으로서 아민으로 코팅된 유리 슬라이드상에 핀당 2 스폿으로 스폿팅된다. 캡슐화된 시험 단백질은 항-트랜스페린이며, 시스템은 Cy3 형광염료로 표지된 트랜스페린(Amersham, 1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1 % Triton X100을 함유하는 PBS(PBST)에서 약 0.1 ㎍/ml)과 45 ℃에서 지정된 시간에 흔들어가며 배양된다. 배양 후, 슬라이드를 PBST에서 10분 동안 2회 세척하며 이후 ScanArray Lite 슬라이드 스캐너를 사용하여 이미징한다. 블랭크 하이드로겔 스폿은 검출 시그널이 없고, 0% 트레할로스는 약한 시그널을 가진다. 1% 및 2% 트레할로스는 약간 강한, 5%는 강한 시그널을, 10%는 가장 강한 시그널을 가진다. 이 결과는 트레할로스의 첨가가 하이드로겔에서 시험 항체의 생물학적 활성에 포지티브 효과를 가진다는 것을 보인다.
패널 B - 글리세롤. pH 8.0 나트륨 보레이트 완충액에서 20% 스톡으로서 용해된 글리세롤은 3.5% 최종 HYPOL PreMARG-50, 항-트랜스페린, 소 IgG, 5% 트레할로스를 함유하는 상기 하이드로겔 제형물에 최종 농도가 0%, 0.5% 및 1%가 되도록, 예를 들면 0, 1.25 ㎕ 및 2.5 ㎕의 스톡 글리세롤이 첨가된다. 상기 분석에서와 같이, Cy3 형광 염료로 표지된 트랜스페린 시스템이 분석에 사용된다. 각각 글리세롤이 50%씩 증가하는 패널 B에서, 항체 활성에 포지티브 효과를 증명하며 시그널 강도가 증가한다.
실시예 2. 확산(% 하이드로겔 3% 대 5%)
하기 실시예는 하이드로겔의 %가 하이드로겔 매트릭스로의 결합 존재물의 확산에 미치는 영향을 보여준다.
실시예 1에서 기재된 방법론을 사용하여, 마우스 IgG가 각각 3%, 4% 및 5% 하이드로겔에 고정된다. BSA는 비특이적 결합 대조군으로서 차별 스폿으로 포함된다. 중합체의 경화에 이어, 어레이는 로다민으로 표지된 토끼 항-마우스 항체 용액과 1시간 동안 배양되며, 이후 세척된다. 토끼 항-마우스 항체는 마우스 IgG 항체에 결합되고, 결합의 정도는 ScanArray Lite 슬라이드 스캐너를 사용하여 각 위치에서 형광에 의해 측정된다. 동일한 결합 조건 및 결합 시간하에서, 낮은 % 하이드로겔 스폿은 강한 결합 시그널을 나타내며; 이는 이 낮은 %에서 하이드로겔 매트릭스로의 로다민-토끼-항-마우스 IgG의 빠른 확산 속도의 지표이다.
실시예 3. 비특이적 결합/슬라이드의 낮은 백그라운드에 대한 코팅의 용도
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체로 활성화된 N-하이드록시석시니미딜 활성 에스테르(NHS), mPEG-SPA-NHS 5K(Shearwater Corporation)는 최종 PEG 농도가 50 mg/ml가 되도록 완충되는 pH 8.25의 0.05 M 나트륨 비카보네이트에서 용해된다. 코닝 아미노실란 슬라이드는 중합체의 표면 그래프팅에 사용된다. Grace-Biolabs 하이브리드화 챔버(SA500-3LCLR)가 반응 챔버로서 사용된다. 표면을 코팅하기 위해, 3 슬라이드는 PEG 용액으로 실온(NSH 실온)에서 3시간 동안 진탕기상에서 처리되며, 3 슬라이드는 45℃(NSH 45)에서 3시간 동안 처리되고, 추가 슬라이드가 대조군으로서 45℃에서 3시간 동안 탈이온수에서 처리된다.
PEG 처리 후에, 하이브리드화 챔버를 제거하고, 슬라이드를 PBS에서 10분 동안 세척하며, 이후 10분 동안 증류수로 세척하고, 공기 건조한다. Cy3으로 표지된 글리알-유래 뉴로트로픽 인자는 PBST에 용해된다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양한다. 이어서 PBS에서 10분 동안 세척하며, 증류수에서 10분 동안 세척한다. 슬라이드를 이후에 ScanArray Lite 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캐닝한다. 일련의 조건하 처리에 이은 5-10배 낮은 백그라운드 강도 시그널은 표면으로의 형광 물질의 비특이적 흡수의 감소에 있어서 PEG 코팅의 효력을 나타낸다.
실시예 4. 바이오칩상의 단백질-DNA 상호작용
다음 실시예에서, 싱글 스트랜드 DNA는 하이드로겔에 1차 연결되며 이후에 하이브리드되어, 도 4a에서 대략적으로 보이는 바와 같이 표적 단백질을 격리하는데 효과적인 더블-스트랜드 결합 존재물을 생성한다.
5'아미노-변형 싱글-스트랜드 박테리아 λ리프레서 결합 서열 OR2OR1(wt) 및 결합 사이트에서 단일 염기 돌연변이를 운반하는 이의 돌연변이(mut)(서열은, 결합 사이트가 밑줄로 표현되어 4b에서 보인다)는 3.75% HYPOLTM중 130 μM에서 아미노-실란화 슬라이드상에 프린트된다. 프린트된 스폿은 개개의 하이브리드화 챔버에 봉입되고 3X SSC, 0.1% Triton X-100, 5 mM MgCl2중 1 μM에서 이와 상응하는 상보적 서열과 45℃에서 18시간 동안 하이브리드되도록 허용한다. 생성된 더블-스트랜드 DNA는 이후 결합 완충액(50 mM Tris.HCl(pH 7.6), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 0.1 mg/ml BSA, 2.5 ㎍/ml 폴리(dA-dT), 0.05% Tween 20, 1 mM DTT)에서 1.5㎍/ml Cy3으로 표지된 박테리아 파지 람다 리프레서 λCI와 실온에서 2시간 동안 배양된다. Cy3-표지된 λCI는 결합 반응의 말기에서 제거되며, 슬라이드를 결합 완충액으로 이후에 탈이온화된 H2O(dH2O)로 간단히 세정하고 GSI 레이저 스캐너에 의해 이미징한다. 분리된 슬라이드에서, 더블-스트랜드 DNA를 SYBR Gold(Molecular Probe)로 제조자의 프로토콜에 따라 염색하며 이의 총 DNA 함량에 대해 GSI 스캐너로 가시화한다.
Cy3으로 표지된 λ리프레서의 네이티브 오페론 dsDNA 서열로의 결합은 상응하는 스폿에서 형광 시그널의 획득에 의해 보여진다. 돌연변이 스폿에서 강한 형광의 부재는 상호작용이 서열-특이적임을 나타낸다. 프린트된 슬라이드의 형광으로 염색된 SYBR Gold(더블-스트랜드 DNA 스트레인)의, 람다 리프레서로부터의 Cy3 형광과의 비교는 야생형 OR2OR1 서열과 관련된 Cy3 시그널을 생성하는 불균일 프린티드 DNA에 대한 어떤 비특이적 단백질 결합보다는 서열-특이적 람다 리프레서-람다 오페론 상호작용임을 확증한다. 돌연변이 서열에 비해 야생형 서열 연결간 시그널 강도의 100배 차이는 하이드로겔 매트릭스에 고정된 더블-스트랜드 DNA에 대한 반응의 특이성을 확증한다.
실시예 5. 바이오칩상에서의 단백질-DNA 상호작용
이 실험에서, 더블 스트랜드 DNA는 중합 및 고정 전에 미리 하이브리드되며, 이후에 표적 단백질 결합이 일어난다.
더블-스트랜드(ds) DNA 바이오칩은 5'아미노-변형 전(Pre)하이브리드화 dsDNA를 직접 프린팅하여 또한 제작될 수 있다. 이 방법은 싱글-스트랜드 DNA가 프린트되고, 코그네이트 올리고뉴클레오타이드가 이 프린트된 올리고뉴클레오타이드에 차후 하이브리드되어 결합 존재물을 형성하는 이전의 실시예와 대조된다.
이 실시예에서, 53 kD 단백질인 에스트로겐 수용체(ER)는 호모다이머로서 이의 컨센서스 에스트로겐 반응 인자(ERE)에 결합한다. 야생형 ERE 서열은 수용체에 의해 결합하는데 중요하다고 공지된 영역에서 4 뉴클레오타이드가 돌연변이 서열과 다르다. 야생형 서열은 서열 5'-tttacggtagaggtcactgtgacctctacccg-3'으로 이루어진 32-서열 올리고머이다. 돌연변이 서열은 서열 5'-tttacggtagaggtcactgtatggtctacccg-3'을 가지며 4 올리고뉴클레오타이드(밑줄)가 다르다. 프린팅을 위한 dsDNA를 생산하기 위해, 흥미있는 아민-연결 올리고뉴클레오타이드의 각각의 650 μM 스톡 중 5 ㎕ 및 이의 상보적 뉴클레오타이드가 pH 8의 40 ㎕ DNA 하이브리드화 완충액(3X SSC, 5 mM MgCl2)에서 최종 반응물 용적이 50 ㎕가 되도록 1:650(65 μM 최종농도)로 희석된다. 반응 산물은 95℃에서 10분 동안 배양되고 이후 얼음위에서 3분 동안 냉각된다. 이 더블-스트랜드 DNA의 10 ㎕는 3.75% 중합체, 0.5% 글리세롤 및 pH 8.0의 50 mM 나트륨 보레이트 완충액으로 이루어진 용액을 사용하여 450 μM 하이드로겔 스폿에 프린팅된다. PBST 용액에서 1% BSA로 1시간 동안 블록킹된 후, ER 농도 1.153 μM의 형태인 1 ㎕의 전사인자가 적당한 결합 완충액(10% 글리세롤, 10 mM HEPES, 30 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.25 mM DTT, 1 mM Na2HPO4, pH 7.9)에서 희석되고 실온에서 1시간 동안 dsDNA로 결합되도록허용되며; 이후에 PBST로 10분간 세척된다. ER-ERE 복합체는 실온에서 1시간 동안 토끼 항-ERβ항체의 1:100 희석액과 차후 배양되며, PBST로 30분간 세척된다. 이후에 염소 항-토끼 IgG-Cy3 컨쥬게이트의 1:1000 희석액과 실온에서 1시간 동안 배양되며 PBST로 30분 세척된다. 전체 실험은 도 5에서 대략적으로 묘사된다. 슬라이드를 dH2O로 세정하고 ScanArray Lite 스캐너로 이미징하기 전에 공기 건조한다. 시그널 분석은 ArrayPro 4.0 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 돌연변이 서열 시그널에 비하여 야생형 서열을 함유하는 스폿으로부터 관찰된 증가된 시그널은, 대조군과 비슷하며, 하이드로겔 매트릭스에서 표적서열에 대한 에스트로겐 수용체에 의한 결합 특이성의 유지를 나타낸다.
실시예 6. 항원-바이오칩
이 실험은 하이드로겔 플랫폼이 항원과 같은 다른 결합 존재물을 고정하는 데 매트릭스로서 사용될 수 있음을 보인다. 항체-항원 반응은 다양한 생물학적 검정에서 흔히 사용되며, 성분(항체 또는 항원)을 고정하는 능력은 지지체에서 바람직한 특질이다. 이 실험에서 항원은 하이드로겔 매트릭스에 고정된다.
실시예 1에서 기재된 방법론을 사용하여 단백질 항원, 인간 트랜스페린(0.2 mg/ml)은 5% 트레할로스, 2 mg/ml BSA와 함께 3.3% 하이드로겔중의 상이한 희석 농도에서 아민-코팅 유리 슬라이드 상으로 직접 고정된다. 5% 탈지 건조 분유로 블로킹 한 후, 슬라이드는 항-인간 트랜스페린을 함유하는 마우스 ascites fluid와 1시간 동안 다양한 농도에서 배양된다. 배양 후, 슬라이드를 PBST로 10분 동안 3회 세척한다. 결합된 마우스 항-트랜스페린 항체는 Cy3-표지 당나귀 항-마우스 IgG로 슬라이드를 배양한 후 레이저 스캐너 이미징에 의해 가시화된다. 3단계의 희석 정도 즉, 0.1 내지 0.001에 걸쳐서 선형 투입 반응이 관찰된다. 이 투입-반응 관계는 하이드로겔 매트릭스에 고정된 항원의 기능 및 전체 분석 방법론의 일환으로서, 매트릭스로의 항체의 순차적 확산을 지원하는 하이드로겔 매트릭스의 투과도를 나타낸다.
실시예 7. 항체-바이오칩
이전의 실시예에서 언급하였듯이, 항원-항체 반응은 생물학적 분석에서 흔히 채택된다. 이 실시예에서는, 실시예 6에서 항원을 고정하는 것과는 반대로 항체가 하이드로겔 매트릭스에 고정된다.
항-인간 트랜스페린, 항-BSA 및 항-PSA 항체(0.4-0.8 mg/ml)는 실시예 1의 방법론에 따라 아미노-실란화 유리 슬라이드 상에 5% 트레할로스, 2 mg/ml 소 IgG 및 0.5% 글리세롤의 존재시 3.3% 하이드로겔에 고정된다. 슬라이드는 이후 1% BSA를 함유하는 PBST에서 1 mg/ml의 농도에서 Cy3 표지 개별 항원과 실온에서 밤새 배양된다. 결합된 단백질은 PBST로 강력히 세척한 이후 레이저 스캐너 이미징에 의해 가시화된다. 마이크로어레이상의 상응하는 항체 부위에서 표지된 표적 단백질의 존재물은 하이드로겔 매트릭스에서 항체 기능의 유지를 나타낸다.
실시예 8. 다중층 ELISA 분석
복잡한 결합 상호작용을 지지하기 위한 능력은 또한 하이드로겔 매트릭스를 위한 바람직한 특질일 수 있다. 본 실시예에서, 1차 결합 존재물로서 항체를 고정하는 하이드로겔이 사용된다. 이의 항원의 후속 특이적 위치선정은 가시화 목적을 위한 추가 결합 이벤트에 의해 일어나고, 이는 단백질 및 단백질 기능의 확고한 유지에 의한 다중 결합 이벤트에 관한 하이드로겔의 생물학적 적합성을 보여준다.
래트 항-마우스 IL-2 모노클로날 포획 항체(BD, Pharmingen)는 실시예 1에서 대략 나타낸 방법론에 의해 아미노-실란화 유리 슬라이드 상에 5% 트레할로스, 2 mg/ml 소 IgG로 3.3% 하이드로겔에 직접 고정된다. 슬라이드는 피토헤마글루티닌-자극 마우스 LBRM-33 4A1 세포 또는 비자극 세포로부터 희석된 배양 배지와 실온에서 1시간 동안 적당히 혼합하며 배양된다. PBST 세척액으로 15분간 2회 세척 후에, 슬라이드는 실온에서 1시간 동안 비오틴화 래트 모노클로날 항-마우스 IL-2 검출 항체(BD, Pharmingen)와 배양된다. 유리 항체는 각 15분 간의 3회 PBST 세척에 의해 제거된다. 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트 스트렙타비딘은 실온에서 1시간 더 배양되는 동안 슬라이드로 첨가된다. TSA 반응물 시스템으로부터의 Cy3-티라미드 기질은 권장되는 프로토콜에 따라 스트렙타비딘-HRP의 강력한 세척 후에, 모든 프린트된 스폿을 완전히 커버하기 위해 슬라이드로 첨가된다. 미반응 기질을 세척한 후에, 슬라이드는 레이저 스캐너 이미징에 의해 분석된다. 형광 시그널의 8배 증가는 하이드로겔에서 항체를 고정함으로써 결합된 항원의 존재를 나타낸다.
실시예 9. 다중층 작은 분자 매개(CaM/칼시뉴린)
여러 단백질간의 복잡한 상호작용은 지지체 표면 상에서 달성하는데 빈번히 어려움을 겪는다; 그러나 다음 예는 도 6에서 대략적으로 도해되며, 작은 분자에 의해 매개되는 다중 단백질 상호작용의 용도를 증명한다.
마우스 항-소 뇌 칼시뉴린 모노클로날 항체(0.4 mg/ml, Sigma), 양 항-소 칼모둘린 항체(0.2 mg/ml, Chemicon) 및 대조군 소 IgG(0.4 mg/ml)는 각각 실시예 1의 방법론에 의해 아민-코팅 유리 슬라이드 상으로 5% 트레할로스 및 2 mg/ml 소 IgG으로 3.3% 하이드로겔에 직접 고정된다. 슬라이드는 5% 건조 분유 블록킹 이후에, 20 mM HEPES(pH 7.6), 130 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 10 ㎍/ml 폴리글루타민 산에서 0.1 mg/ml 소 칼시뉴린과 밤새 차후 배양된다. Cy3-표지 치킨 칼모둘린은 실온에서 1시간 동안 PBST, 1% BSA에서 1 mM CaCl2또는 5 mM EGTA의 존재하에 칼시뉴린-처리 슬라이드로 결합되도록 한다. 결합된 칼모둘린은 레이저 스캐너 이미징을 사용하여 Cy3 여기 및 방출 파장에서 가시화된다. 시그널 강도의 6배 증가는 칼슘의 부재(즉, EGTA의 존재시)에 비해 칼슘의 존재시, 항칼시뉴린 항체 위치에서 단백질 및 작은 분자 모두를 포함하는 복잡한 생체분자 상호작용을 지지하기 위한 하이드로겔 매트릭스의 능력을 나타낸다.
실시예 10. 바이오칩상의 티로신 인산화 펩타이드의 특이적 검출
하이드로겔 매트릭스는 다양한 결합 존재물 및 분석 포맷에서 유용하다. 이 실시예에서, 펩타이드 결합 존재물내 인산화된 아미노산의 용도가 보여진다.
각 펩타이드는 40 μM 농도 옆에 2 쿼드러플 페어로서 슬라이드상에 프린팅되며; 펩타이드는 실시예 1의 방법론에 의해, 0.5% 글리세롤을 함유하는 3.5% HYPOLTM에 고정된다. 이후에 슬라이드 상에 프린팅되는 펩타이드가 표 1에 기재되었다.
표 1
pTry=포스포티로신 및 pSer=포스포세린인 관용적 약어가 사용되었다.
다음의 모든 배양단계에서, 유리 슬라이드는 유리 슬라이드-염색 디쉬내 록커상에서 배양된다. 펩타이드 바이오칩은 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 1% BSA로 실온에서 60분 동안 블록킹되고, 1% BSA를 함유하는 PBST에서 1:2000 희석비의 비오틴화 항-포스포티로신 항체와 4℃에서 밤새 배양된다. PBST로 실온에서 10분간 2회 세척된 후, 슬라이드는 1% BSA를 함유하는 PBST에서 1:2000 희석비의 Cy3-표지 스트렙타비딘과 배양된다. 이후 슬라이드는 PBST에서 15분간 3회 세척된다. 증류수로 간단히 세정한 후, 슬라이드를 공기중에서 건조시키고 GSI Lumonics 스캐너를 사용하여 스캐닝한다. 결과는 포스포티로신을 함유하는 위치 또는 그렇지 않은 위치에서 포스포세린을 포함하는 형광 시그널의 존재을 보이며, 포스포펩타이드는 하이드로겔로의 이소시아네이트 결합에도 불구하고 항체에 의해 인지되도록 적절한 네이티브 구조를 유지하는 것을 나타낸다.
실시예 11. 티로신 포스파타제에 의한 바이오칩상의 티로신 인산화 단백질의 탈인산화
이전의 실시예는 확장된 네이처(수분 또는 수시간의)의 결합 상호작용을 지지하기 위한 하이드로겔 매트릭스의 용도를 증명하였다. 하기 실시예는 매트릭스가 또한 효소 활성 등을 포함하는 일시적 결합 상호작용을 지지함을 보인다. 이 실시예에서, 포스포펩타이드 기질은 하이드로겔 매트릭스에 고정되며, 이는 이후에 인산 그룹을 제거하는 효소에 대한 기질로서 작용한다. 잔존하는 인산은 이후에 실시예 10에서의 방법론을 사용하여 검출된다.
실시예 10에서 기재된 바와 동일한 실험 방법을 사용하여, 프린트된 슬라이드는 반응 완충액(1 X LAR 완충액: 25 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM Na2EDTA, 5 mM 디티오트레이톨, 0.01% Brij-35, 25℃에서 pH 7.0; 1 X YOB 완충액: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM Na2EDTA, 5 mM 디티오트레이톨, 0.01% Brij-35, 25℃에서 pH 7.0)이 공급된 430 ㎕ 챔버에서 6 단위 백혈구 항원 관련(LAR) 단백질 티로신 포스파타제 또는 6 단위 Yersinia enterocolitica(YOP) 단백질 티로신 포스파타제와 실온에서 10분 동안 배양된다. 이후에, 챔버는 제거되고 유리 슬라이드는 유리 슬라이드-염색 디쉬로 옮겨진다. 반응은 PBST에서 1 mM 나트륨 퍼바나데이트(보편적 티로신 포스파타제 억제제)로 실온에서 10분간 2번 슬라이드를 세척함으로써 중지된다. 이후에 슬라이드는 1% BSA로 블록킹되고, 비오틴화 항-포스포티로신 항체와 배양된 후 실시예 10에서 기재된 바와 같이 Cy3-스트렙타비딘 결합이 이어진다. 실시예 10에서 이미 관찰된 형광 시그널의 손실은, 하이드로겔로 들어가고 생물학적 활성을 유지하며 1 이상의 기질, 즉 고정된 포스포펩타이드와 일시적으로 상호작용하는 포스포릴라제 효소의 능력을 암시한다. 더욱 상세히는, 결과는 LAR-PTPase가 펩타이드 No.1으로부터 포스페이트 그룹을 실질적으로 완전히, 그리고 pTyr 잔기를 함유하는 잔존하는 펩타이드를 낮은 수준으로 선택적 제거함을 보여준다. YOB-PTase 효소는 펩타이드 No.1, 3, 6, 8 및 13으로부터 인산 그룹을 실질적으로 완전히 제거하며; 펩타이드 No.2, 7, 10, 14 및 15로부터 인산 그룹을 상당히 제거하는, 즉 같은 펩티드를 제거하는데 있어 LAR-PTPase보다 더욱 큰 정도를 나타낸다. 그러므로, 다양한 포스포펩타이드와 함께 형광의 결과는 포스포펩타이드 서열의 일부를 향한 2 포스포릴라제 효소의 부분에 선호적인 특이성을 나타낸다.
실시예 12. 금속 킬레이터
결합 존재물은 오리진에서 생물학적 존재물일 필요는 없으나, 다양한 합성 분자가 채택될 수 있다. 이 실시예에서 금속 킬레이터는 단백질 분자내에 존재하는 다중 히스티딘 잔기에 결합하도록 기여하는 하이드로겔 매트릭스내 금속 이온을 고정하는 데 사용된다.
Ni++또는 Cu++NTA 하이드로겔은 HYPOLTM과 다양한 양의 니트릴로트리아세트 산을 혼합함으로써 생성되며 유리 슬라이드 상에 스폿팅된다. 중합된 겔 스폿은 dH2O에서 50 mM 아세트산으로 세척되며, 50 mM Cu(NO3)2또는 Ni(NO3)2로 대전된다; 이는 0.1 M KNO3(pH 4.0)을 함유한 dH2O에서 50 mM 아세트산으로 세척되며 dH2O로 최종 세정된다. 1% BSA를 함유하는 PBST에서 10 ㎍/ml의 6 X His 태그드(tagged) 그린 형광 단백질이 슬라이드에 첨가되며, 이는 유리된 미결합 6 X His-GFP의 제거후에 적절한 여기 및 방출 필터하에서 홈-빌트 CCD 카메라를 사용하여 PBS에서 이미징된다. 증가된 킬레이터와 상응하는 증가된 형광 시그널이 관찰되며, 이는 하이드로겔 매트릭스가 매개 결합제로서 작은 분자의 사용을 지지함을 암시한다.
실시예 13. 바이오칩상의 알파-2-마크로글로불린-트립신 상호작용(전기장 기본 로딩)
알파-2-마크로글로불린은 필수적으로 신체가 스스로 "다이제스팅"되는 것으로부터 방지하는, 과량의 프로티아제 활성으로부터 신체를 보호하는 메카니즘으로 혈액내에서 프로티아제에 특이적으로 결합하고 이를 무효화하기 위해 순환하는 큰 혈장 단백질(분자량 800,000)이다. 알파-2-마크로글로불린 및 트립신과 같은 프로티아제 간의 관계는 매우 긴밀하며, 아가로스 비드에 고정된 알파-2-마크로글로불린은 트립신 및 다른 프로티아제를 친화성-정제하는데 사용된다.
하이드로겔 마이크로소적 3 세트가 아민-유도체화 유리로 스폿팅된다. 유리 슬라이드는 pH 7.4의 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액 및 150 mM NaCl(PBS)에서 1%BSA 용액으로 실온에서 2시간 동안 비특이적 결합 부위를 블록킹하기 위해 1차 처리된다. 이렇게 하는데 있어서 실패는 비특이적으로 결합하는 일부 형광-표지 단백질을 만들고, 시그널 대 노이즈 비를 증가시킨다. 하이드로겔은 이소시아네이트-작용 HYPOLTM을 포함하는 프리폴리머로 구성된다. 중합은 수용액으로 개시되며, 중합 카이네틱은 pH 및 온도에 의해 제어된다. 각 하이드로겔 마이크로소적은 마이크로어레이의 1 셀을 형성하며, 이산화탄소 기체 생성으로 인한 불투명을 방지하기 위한 제어된 속도에서 중합을 유발시킨다. 이러한 하이드로겔의 첫번째 세트는 5 mg/ml PBS 농도에서 50 ㎕용액을 사용하여 알파-2-마크로글로불린과 로딩된다. 알파-2-마크로글로불린의 고분자량은 하이드로겔 소적으로의 신속한 확산을 제한하며, 확산 속도는 소형 전극 시스템에 의해 운반되는 마일드 전류(2.5-5 mV)를 사용하여 증가시킬 수 있다. 일단 알파-2-마크로글로불린이 하이드로겔 소적으로 확산되면, 이의 고분자량은 소적으로부터의 차후 확산을 상당히 방해한다. 페리틴(Ferritin)은 트립신이 결합하지 않는다고 공지된 바와 같이 음성 대조군으로서 제공된다. 페리틴은 동일 전극 시스템 및 동일 조건하에서 마일드 전류를 사용하여 하이드로겔 소적의 두번째 세트로 유사하게 확산된다. 소적의 세번째 세트는 어떤 단백질으로도 처리되지 않고 다만 부가적 음성 대조군으로서 기여한다. 소적의 3 세트 모두는 이후에 약 15분간 FITC-표지 트립신에 노출되고, 약 5 내지 20분간 pH 7.4의 1% BSA-PBS로 세척된다. 형광 강도는 CCD 카메라로 측정되며, 결과는 표 2에 보여진다.
표 2. 알파-2-마크로글로불린에 대한 FITC-트립신의 특이적 결합
고정된 단백질 형광 강도(au)
알파-2-마크로글로불린 800
페리틴 20
단백질 없음 10
결과는 FITC-표지 트립신이 하이드로겔 소적에서 이의 천연 리간드인 알파-2-마크로글로불린에 특이적으로 결합하며, 음성 대조군 단백질 페리틴 또는 하이드로겔에 대해서는 적은 검출가능 결합 활성이 존재함을 암시한다.
비록 본 발명이 현재 발명자에 의해 고려되는 최상의 모드를 포함하는 다수의 상이한 양태에 관해 기재되었지만, 당업자에게 명백한 변화 또는 변형이 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 범위로부터 일탈함이 없이 일어날 수 있다고 생각된다. 예를 들면, FITC 및 Cy3과 같은 특정 플루오로포어가 사용됨에도 불구하고, 다른 플루오로포어 또는 다른 리포터 또한 대안적으로 사용될 수 있다. 상이한 비하이브리드화 결합 존재물을 옮기는 다수 셀을 가지는 바이오칩의 용도가 유리함에도 불구하고, 특정 경우에는 싱글-셀 바이오칩이 적당할 수 있다.
본 발명의 특정 양상은 다음 청구범위에서 강조된다.

Claims (37)

  1. a)표면을 가지는 고체 기질;
    b)이소시아네이트-작용 중합체로부터 형성되는, 기질의 표면에 부착된 적어도 하나의 광학적으로 투명한 하이드로겔 셀; 및
    c)표적 단백질 또는 다른 필적할만한 분자를 선택적 격리하는데 효과적인 하이드로겔 셀 내부 또는 상에 고정된 비하이브리드화 결합 존재물을 포함하는, 광학적으로 투명한 하이드로겔 바이오칩.
  2. 제 1 항에 있어서, 하이드로겔이 우레탄 결합을 가진 중합체를 포함하는 바이오칩.
  3. 제 1 항에 있어서, 하이드로겔이 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의 중합체를 포함하는 바이오칩.
  4. 제 1 항에 있어서, 하이드로겔 셀이 적어도 30 ㎛ 두께인 바이오칩.
  5. 제 4 항에 있어서, 하이드로겔 셀이 약 30 내지 약 100 ㎛ 두께인 바이오칩.
  6. 제 1 항에 있어서, 결합 존재물이 이소시아네이트 그룹과의 반응을 통해 하이드로겔 셀 상으로 및 내부로 공유결합되는 바이오칩.
  7. 제 5 항에 있어서, 셀의 중합체내 활성 이소시아네이트의 약 15% 이하가 결합 존재물과 반응하는 바이오칩.
  8. 제 6 항에 있어서, 셀의 중합체내 활성 이소시아네이트의 약 10% 이하가 결합 존재물과 반응하는 바이오칩.
  9. 제 1 항에 있어서, 결합 존재물이 이뮤노글로불린, 효소, 수용체, 효소 억제제, 효소 기질, 또는 펩타이드를 포함하는 바이오칩.
  10. 제 1 항에 있어서, 결합 존재물이 매개제와의 반응을 통해 하이드로겔 내부에 고정되는 바이오칩.
  11. 제 9 항에 있어서, 결합 존재물이 하이드로겔에 고정된 금속 킬레이트에 결합되고 또한 매개제를 구성하는 단백질인 바이오칩.
  12. 제 10 항에 있어서, 단백질이 이의 1 말단에서 히스티딘-함유 폴리펩타이드를 통해 금속 킬레이트에 결합되는 바이오칩.
  13. 제 10 항에 있어서, 하이드로겔에 연결된 1차 매개제 및 1차 매개제에 연결된 2차 매개제를 통해 결합 존재물이 고정되는 바이오칩.
  14. 제 13 항에 있어서, 1차 매개제가 항체이며 2차 매개제가 단백질인 바이오칩.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질은 표면에 부착된 다수의 하이드로겔 셀을 가지며 여기에서 상이한 결합 존재물이 상이한 하이드로겔 셀에 고정되는 바이오칩.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 광학적으로 투명한 바이오칩.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 상부 표면에 하이드로겔이 공유결합하도록 하는 활성 물질을 가지는 바이오칩.
  18. 제 17 항에 있어서, 하이드로겔 셀이 중합체의 일부 이소시아네이트 그룹을 통해 기질에 공유결합되는 바이오칩.
  19. a)상부 표면을 가지는 고체 기질;
    b)기질의 상부 표면에 결합된 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이들의 공중합체를 포함하는 다수의 하이드로겔 셀;
    c)하이드로겔 셀의 내부 또는 상에 고정된 매개제; 및
    d)단백질의 본래 구조를 나타내도록 하는 방법으로 상호작용하여 적어도 여러 하이드로겔 셀내에서 매개제에 결합된 상이한 단백질 결합 존재물을 포함하는, 하이드로겔 바이오칩.
  20. (a)적어도 2 하이드로겔 셀이 결합된 표면을 지닌 기질을 가지는 광학적으로 투명한 하이드로겔 바이오칩을 제공하며, 각 셀은 적어도 약 30 ㎛ 두께를 가지며 주로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 공중합체로 구성되고, 각 하이드로겔 셀은 이의 내부 또는 상에 고정된 상이한 단백질 결합 존재물을 포함하며;
    (b)결합 조건하에서 표적 생체분자를 함유하는 분석물 용액과 하이드로겔 바이오칩을 접촉시키고;
    (c)비선택적 결합 및 미결합 표적 생체분자를 제거하는 조건하에 하이드로겔 바이오칩을 세척하고;
    (d)상기 1 셀에 결합된 표적 생체분자를 검출하는 단계를 포함하는, 생화학적 분석을 수행하기 위해 바이오칩을 사용하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 표적 생체분자가 결합 존재물의 조성적 변화를 초래하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 조성적 변화가 인산화 이벤트인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 조성적 변화가 탈인산화 이벤트인 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성적 변화를 겪는 결합 존재물이 1 이상의 매개제에 의해 하이드로겔에 결합되는 방법.
  25. (a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고;
    (b)비하이브리드화 결합 존재물의 용액을 제공하고;
    (c)활성 이소시아네이트의 15% 이하와의 반응을 통해 결합 존재물이 이소시아네이트-작용 하이드로겔 플리폴리머에 공유결합하고;
    (d)광학적으로 투명한 하이드로겔을 생성하도록 하는 조건하에 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하며;
    (e)고체 기질상으로 중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머를 소적 형태로 분배하여, 결합 존재물을 함유하는 광학적으로 투명한 하이드로겔 중합체가 기질에 부착되는 단계를 포함하는, 바이오칩의 내부 또는 상에 표적 단백질 또는 표적 생체분자를 선택적 격리하는데 효과적인 비하이브리드화 결합 존재물을 가지는 광학적으로 투명한 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩을 제조하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 존재물의 결합이 중합과 동시에 수행되는 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성 하이드로겔의 투명성을 보장하기 위해 이산화탄소의 발생을 제어하도록 점도 및 pH가 선택되는 방법.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합 하이드로겔이 기질로 공유결합할 상부 표면의 활성 잔기를 제공하기 위해 기질이 처리되는 방법.
  29. a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 플리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고;
    b)목적한 단백질 포획제의 용액을 제공하고;
    c)단백질을 위한 매개 커플링제가 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머로 공유 결합하고;
    d)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하며;
    e)고체 기질로 중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 소적을분배하여, 중합체가 기질에 부착되게 하며;
    f)각 하이드로겔 소적을 하나의 목적한 단백질 용액으로 노출시켜 커플링제로 내부 또는 상의 연결을 통해 단백질 포획제를 고정시켜, 소적이 중합되어 상이한 단백질 포획제와 함께 다수의 셀을 가지는 바이오칩을 생성하는 단계를 포함하는, 포획제로 작용하도록 선택되며 바이오칩 내부 또는 상에 고정된 단백질을 가지는 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩의 제조 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 단백질의 커플링제로의 연결이 중합과 동시에 수행되는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 단백질의 커플링제로의 연결이 중합 이후에 수행되는 방법.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 커플링제가 킬레이트화제인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 단백질이 각각 히스티딘-함유 말단 펩타이드 서열을 포함하는 방법.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합 동안의 반응 조건이이산화탄소 발생의 속도를 늦추도록 조절되어 생성 하이드로겔의 광학적 투명도를 보장하는 방법.
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔이 기질로 공유 결합할 상부 표면의 활성 잔기를 제공하기 위해 기질이 처리되는 방법.
  36. a)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 유기 용매 용액을 제공하고;
    b)이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 중합을 개시하고;
    c)소적이 기질에 결합하고 다수의 셀을 형성하도록 고체 기질로 중합 이소시아네이트-작용 하이드로겔 프리폴리머의 소적을 분배하고;
    d)각 셀의 내부 또는 상에 특정 생체 분자를 선택적 격리할 결합 존재물로서 작용하도록 선택되는 상이한 단백질을 물리적으로 고정시키는 단계를 포함하는, 바이오칩 내부 또는 상에 고정된 단백질을 가지는 다수의 셀을 가지는 이소시아네이트-작용 하이드로겔 바이오칩의 제조 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 고정 단계가 단백질이 셀로 확산되는 것을 유발하기 위한 전류의 사용을 통해 약 100,000 또는 이상의 분자량을 가진 단백질의 인트랩먼트를 포함하는 방법.
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