DE10332849A1

DE10332849A1 - Arrays immobilisierter Biomoleküle auf Hydrogel-bildenden Oberflächen, deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10332849A1
Application number: DE2003132849
Authority: DE
Inventors: Haitao Rong; Stefano Levi; Jürgen GROLL; Thomas Ameringer; Claudia Mourran; Martin Möller
Original assignee: Sustech GmbH and Co KG
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-02-17
Also published as: WO2005014695A1; EP1646672A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflächenschicht gekoppelt sind, welche im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, wobei die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und Vorrichtungen, die derartige Arrays aufweisen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung derartiger Arrays und die Verwendung derartiger Arrays und Vorrichtungen für diagnostisch/analytische Zwecke.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle auf Hydrogelbildenden Oberflächen, deren Herstellung und Verwendung. Ebenfalls betrifft die vorliegende Erfindung Vorrichtungen auf Basis der Arrays, insbesondere Chips, Microfluid-Vorrichtungen und Dipsticks.

Mit der zunehmenden praktischen Bedeutung der molekularbiologischen Analytik stoßen die mit einem sehr hohen Arbeits- und Kostenaufwand verknüpften, oft Tage oder Wochen dauernden etablierten Standardtechniken an Grenzen. Neue Testformate wie Biochips sollen eine enorme Zeit und Kostenersparnis ermöglichen. Da mit dieser Technik sehr viele verschiedene auf engstem Raum immobilisierte Substanzen gleichzeitig mit einer einzigen zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht werden können, ist der pro Messung aus einem Chip gewonnene Informationsgehalt sehr hoch.

Eine Übersicht über die bekanntesten Biochip-Systeme findet man beispielsweise in Bowtell D. D. L. Nature Genetics Supplement 21 (1999) 25–32; Lockhart et al, Nature Biotechnology 14 (1996) 1675. Eine Übersicht über Protein- und Antikörper Arrays gibt Cahill, D. J. Immunol. Methods, 250 (2001) 81–91.

Ein typisches Beispiel eines sogenannten „high density array" ist der GeneChip von Affymetrix, ein Oligonukleotidarray mit typischerweise über 400 verschiedenen Capture Probes, die Base für Base auf dem Glaswafer aufgebaut werden. Die Chips zeichnen sich durch eine sehr hohe Informationsdichte von bis zu 40.000 Oligonukleotiden/cm² aus. Die einzelnen "Spots" sind rechteckig.

"Low Density Arrays" sind beispeilsweise von Genometrix erhältlich. Maximal 250 Spots von 50 μm Durchmesser werden mit einem Kapillar-Pin-Bündel aus bis zu 1000 Einzelkapillaren in die Kavitäten einer 96-er Mikrotiterplatte gedruckt. Zur Ankopplung an die Oberfläche werden konventionelle Techniken venrwendet, denen insbesondere Aminosilanisierungen und NHS-aktivierte Haptene, epoxyaktivierte Oberflächen, Carbodümidkopplungen an Carboxylgruppen sowie Biotin/Streptavidin-Bindungen zugrunde liegen (vgl. WO 97/18226; EP 0910570 A1 ; WO 98/29736).

Die Qualität dieser Biochips reicht für einen zufriedenstellenden Einsatz insbesondere in der medizinischen Diagnostik allerdings nicht aus. Dies hat verschiedene Gründe.

Ein zentrales Problem ist die unspezifische Adsorption von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen und Zellen auf Oberflächen. Diese führt dazu, dass bei Kontakt mit dem Analyten eine unspezifische Belegung der Oberfläche des Arrays bzw. Biochip mit Proteinen und Zellmaterial stattfinden kann, was zu einer Verringerung der Selektivität gegenüber dem Target und letztendlich zu einer Zerstörung des Biochips/Arrays führt.

Bei Proteinen und Antikörpern stellt sich zudem das Problem, dass diese aufgrund von unspezifischer Wechselwirkung mit der Substratobertläche ihre Aktivität verlieren können und schlimmstenfalls denaturieren. Für die Immobilisierung von Proteinen und Antikörpern sind daher Oberflächen erforderlich, die einerseits eine gezielte Anbindung der Biomoleküle erlauben und die andererseits eine äußert geringe Neigung zur unspezifischen Bindung derartiger Moleküle aufweisen.

Aus der WO 02/059372 sind Arrays bekannt, die auf einer Trägeroberfläche eine Vielzahl von Hydrogel-Zellen aufweisen, welche eine immobilisierte Bindungsstelle für Proteine aufweisen.

Aus der WO 99/36576 sind Arrays mit einer Vielzahl von Hydrogelbereichen bekannt, die dadurch erhalten werden, dass man eine erste hydrogel-bildende Schicht auf die Oberfläche eines Trägers aufbringt, aus diese Schicht Bereiche entfernt, so dass Vertiefungen entstehen, diese Vertiefungen mit einem zweiten Gel füllt und anschliessend die erste Schicht vollständig entfernt. Hierbei enthält das zweite Gel Biomoleküle. Nach Entfernen der ersten Schicht verbleiben somit eine Vielzahl von Hydrogel-bildenden, Biomoleküle-enthaltenden Bereichen auf der Oberfläche des Trägers.

Die US 6,174,683 beschreibt die Herstellung von Biochips, die kovalent gebundene Biomoleküle aufweisen, bei dem man ein Biomolekül mit einem Hydrogel-bildenden Präpolymer auf Polyurethanbasis in Lösung derivatisiert, die Polymerisation des derivatisierten Präpolymers in der Lösung auslöst und die Lösung des polymerisierenden Präpolymers durch Microspotting-Techniken auf die Oberfläche eines geeigneten Trägers aufbringt.

Die so hergestellten Biochips haben eine bessere Lebensdauer, sind jedoch vergleichsweise aufwendig herzustellen und bezüglich unspezifischer Wechselwirkungen mit Proteinen nicht zufriedenstellend.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Oberfläche für die Herstellung eines Arrays bereitzustellen, die sich durch eine geringe Neigung zur unspezifischen Wechselwirkung von Biomolekülen auszeichnet und die andererseits eine selektive Kopplung von Biomolekülen erlaubt.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass diese Aufgabe durch organische Schichten gelöst wird, die im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut sind, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind. Derartige Oberflächen sind grundsätzlich aus den deutschen Patentanmeldungen 10203937.2 und 10216639.0 bekannt, auf deren Offenbarung Bezug genommen wird.

Diese Oberflächen zeichnen sich durch eine besonders geringe Affinität gegenüber unspezifischer Bindung von Biomolekülen aus. Zudem weisen diese Oberflächen herstellungsbedingt eine Vielzahl funktioneller Gruppen R auf, die entweder direkt oder nach Aktivierung mit den in Biomolekülen üblicherweise vorhandenen funktionellen Gruppen R' wie NH₂, OH oder SH unter Bindungsbildung reagieren können, so dass es zu einer kovalenten Anbindung der Biomoleküle an die Oberfläche kommt, wodurch eine Immobilisierung der Biomoleküle auf der Oberfläche erreicht wird. Alternativ bietet sich die Aktivierung der Biomoleküle in an sich bekannter Weise an, d.h. die Einführung funktioneller Gruppen R' in die Biomoleküle, die unter Bindungsbildung mit den funktionellen Gruppen R auf der Oberfläche reagieren. Als weitere Alternative bietet sich die kovalente Anbindung von Substanzen an, die ein Biomoleküle über eine koordinative oder affinitive Bindung binden kann, d.h. für die das Biomolekül eine oder mehrere Bindungsstellen aufweist. Derartige Substanzen werden im Folgenden auch als Haftvermittler oder Kopplungsmittel bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Arrays immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflächenschicht gekoppelt sind, welche im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren P aufgebaut ist, wobei die Präpolymere P im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen wasserlöslich sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Arrays, umfassend:

i. Bereitstellung einer organischen Oberflächenschicht auf der Oberfläche eines Träger, wobei die Oberflächenschicht im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und auf ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist und
ii. Immobilisieren der Biomoleküle in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche der Oberflächenschicht.

Das Immobilisieren der Biomoleküle erfolgt in der Regel durch Aufbringen der Biomoleküle, welche entweder eine funktionelle Gruppen R' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren, oder durch Aufbringen von Biomolekülen, die eine Bindungsstelle für einen auf der Oberfläche kovalent gebundenen Bindungspartner (Haftvermittler) besitzen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt das Aufbringen der Biomoleküle auf die bereits vernetzte Oberflächenschicht. Gemäß einer zweiten Ausführungsform erfolgt das Aufbringen der Biomoleküle während oder vor dem Vernetzen der die Oberflächenschicht bildenden Präpolymere. Sofern man einen Haftvermittler zur Anbindung der Biomoleküle einsetzt, kann man diesen ebenfalls auf die bereits vernetzte Oberflächenschicht oder vor oder während des Vernetzens der Oberflächenschicht aufbringen.

Mit der Erfindung sind zahlreiche Vorteile verbunden:
Die erzeugten Arrays zeichnen sich durch eine ausserordentlich geringe Neigung aus, unspezifisch Proteine zu absorbieren. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Oberflächenschicht mit Wasser quillt, d.h. ein Hydrogel bildet. Zudem weist die Oberflächenschicht an ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen in hoher Flächen dichte auf, die für die Immobilisierung der Biomoleküle genutzt werden können. Aufgrund des Aufbaus der Schicht ist diese Oberflächenschicht zudem ausserordentlich stabil gegenüber Alterung und mechanischer Belastung. Die Biomoleküle sind zudem kovalent oder mittels eines kovalent gebundenen Haftvermittlers auf der Oberfläche gebunden und werden daher nicht abgewaschen. Die Arrays sind daher sehr robust und weisen eine hohe Langzeitstabilität auf. Die Arrays lassen sich verkapseln und/oder in automatische Analysengeräte integrieren. Die als Spot immobilisierten Biomoleküle weisen eine gleichmäßige Beschichtung auf, d.h. sie sind homogen. Für Oligonukleotidarrays werden gute Diskriminierungsraten erzielt und ein hoher dynamischer Bereich für Hybridisierungsexperimente Verfügung gestellt. Intra- und Interarray-Variationen sind gering. Damit wird der Einsatz der Arrays im diagnostisch/analytischen Bereich ermöglicht. Proteine, einschließlich Antikörper und Enzyme verlieren beim Koppeln auf die Oberflächenschicht nicht ihre Aktivität. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft daher Arrays immobilisierter Proteine, einschließlich Antikörper und Enzyme.

Der Begriff „Array" bezeichnet eine Anordnung definierter Plätze, insbesondere eine örtliche Zuordnung bestimmter Substanzen zu definierten Plätzen, wobei verschiedenen Plätzen gleiche oder unterschiedliche Substanzen zugeordnet sein können. Ein definierter Platz entspricht einer bestimmten Fläche, deren Wert einer Intraassay-Varianz von vorteilhafterweise weniger als 15%, vorzugsweise von weniger als 7% bzw. einer Interassay-Varianz von vorteilhafterweise weniger als 20%, vorzugsweise von weniger als 15% und insbesondere von weniger als 10% unterliegt, wenn man zwei Flächen miteinander vergleicht. Einem Platz ist in der Regel eine Substanzart zugeordnet, wobei allerdings auch denkbar ist, Gemische aus zwei oder mehreren Substanzarten einem Platz zuzuordnen. Bevorzugt sind zweidimensionale Arrays. Die Plätze bilden zweckmäßigerweise ein regelmäßiges zweidimensionales Muster von Feldern. Innerhalb eines Arrays können jeder Substanzart bzw. jeder Art von Substanzgemisch ein Feld oder mehrere Felder zugeordnet werden.

Der Begriff „Biochip" bezeichnet hier einen Array von Biomolekülen, die auf einem festen Träge immobilisiert, d.h. ortslokalisiert gebunden sind. Die Bindung kann auf kovalenten, ionischen, koordinativen oder affinitiven Wechselwirkungen, z.B. Protein-Ligand oder Protein-Protein-Wechselwirkungen, oder auf Mischformen der vorgenannten Wechselwirkungen beruhen.

Der Begriff „Biomoleküle" bezeichnet beliebige biochemische und biologische Substanzen, sowohl als einzelne Moleküle als auch als mehrere miteinander wechselwirkende Moleküle. Zu nennen sind beispielsweise:

• Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleinsäuren, z.B. einzel- und/oder doppelsträngige, lineare, verzweigte oder circuläre DNA, cDNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PSNA (Phosphothioate Nucleic Acid);
• Antikörper, insbesondere humane, tierische, polyklonale, monoklonale, rekombinante, Antikörperfragmente, z.B. Fab, Fab', F(ab)₂, synthetische;
• Proteine, z.B. Allergene, Inhibitoren, Rezeptoren;
• Enzyme, z.B. Peroxidasen, Alkalische-Phosphatasen, Glukose-Oxidase, Nukleasen;
• kleine Moleküle (Haptene), z.B. Pestizide, Hormone, Aminosäuren, Antibiotika, Pharmaka, Farbstoffe, synthetische Rezeptoren, Rezeptorliganden.

Einem weiteren Aspekt zufolge definiert der Begriff „Biomolekül" die Fähigkeit einer Substanz, mit einer biologischen Probe bzw. einem Teil davon, insbesondere dem Analyt, in eine bestimmte analytische Wechselwirkung treten zu können.

Einem besonderen Aspekt zufolge ist ein bestimmter Typ von Biomolekül als Ligand zu bezeichnen. Liganden wechselwirken mit und insbesondere binden sie – vorzugsweise spezifisch – an bestimmte Targets.

Reaktive Gruppen R in Sinne dieser Erfindung sind solche, die mit Nucleophilen in einer Additionsreaktion einschließlich einer Michael-Reaktion oder in einer Substitutionsreaktion reagieren, z. B. Isocyanat-Gruppen, (Meth)acrylgruppen, Vinylsulfongruppen, Oxiran-Gruppen, Oxazolingruppen, Aldehydgruppen, Carbonsäuregruppen, Carbonsäureester- und Carbonsäureanhydridgruppen, Carbonsäure- und Sulfonsäurehalogenid-Gruppen, aber auch die hierzu komplementären, als Nucleophil reagierenden Gruppen wie alkoholische OH-Gruppen, primäre und sekundäre Aminogruppen, Thiolgruppen und dergleichen. Als Beispiel für Carbonsäureestergruppen sind insbesondere sogenannte Aktivestergruppen der Formel -C(O)O-X bevorzugt, worin X für Pentafluorphenyl, Pyrrolidin-2,5-dion-1-yl, Benzo-1,2,3-triazol-1-yl oder einen Carboxamidin-Rest steht, sowie NHS-Ester (N-Hydroxy-succinimid-Ester). Reaktive Gruppen im Sinne der Erfindung sind auch nucleophile Gruppen, die mit den vorgenannten elektophilen Gruppen unter Bindungsbil dung reagieren, z. B. NH₂, SH, oder OH, insbesondere jedoch NH₂. Es versteht sich von selbst, dass eine erfindungsgemäße Oberfläche entweder überwiegend elektrophile Gruppen oder nicleophile Gruppen aufweist, wobei im Falle von NCO/NH₂ auch beide Gruppen nebeneinander vorliegen können.

Eine Übersicht über reaktive Gruppen R und hierzu komplementäre funktionelle Gruppen R' gibt die Tabelle 1, wobei die reaktiven Gruppen R in der ersten Zeile und die hierzu komplementären Gruppen R' in der ersten Spalte angegeben sind: Tabelle 1: Komplementäre funktionelle Gruppen

Geeignet sind als reaktive Gruppen R auch radikalisch polymerisierbare C=C-Doppelbindungen, z. B. neben den oben genannten (Meth)acrylgruppen auch Vinylether- und Vinylestergruppen, weiterhin aktivierte C=C-Doppelbindungen, aktivierte C≡C-Dreifachbindung und N=N-Doppelbindungen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en-Reaktion oder mit konjugierten Diolefin-Gruppen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren. Beispiele für Gruppen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en-Reaktion oder mit Dienen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren können, sind Maleinsäure- und Fumarsäure-Gruppen, Maleinsäureester- und Fumarsäureester-Gruppen, Zimtsäurees tergruppen, Propiolsäure(ester)gruppen, Maleinsäureamid- und Fumarsäureamid-Gruppen, Maleinimid-Gruppen, Azodicarbonsäureester-Gruppen und 1,3,4-Triazolin-2,5-dion-Gruppen.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die organische Oberflächenschicht auf ihrer Oberfläche solche funktionellen Gruppen auf, die einer Additions- oder Substitutionsreaktion durch Nucleophile zugänglich sind. Bevorzugte Gruppen R sind Isocyanat-, Isothiocyanat-, Aktivester, NHS-Ester, Aldehydgruppen, Acryl- und Methacrylgruppen, so dass die Biomoleküle mit der Oberfläche über eine der folgenden funktionellen Gruppen, ausgewählt unter Amidgruppen, Urethangruppen, Iminogruppen, Harnstoffgruppen, Thiourethangruppen, Estergruppen, Thioharnstoffgruppen oder Sulfoethylgruppen und gegebenenfalls über einen Spacer, gebunden sind. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft Arrays, in denen die Oberflächenschichten als reaktive Gruppen R Isocyanat-Gruppen aufweisen. Diese werden vor dem erfindungsgemäßen Einsatz nach dem Kuppeln der Biomoleküle durch Behandeln mit Wasser zu Aminogruppen deaktiviert.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Oberfläche eine Vielzahl an nucleophilen Gruppen, insbesondere NH₂-Gruppen auf.

Unter sternförmigen Polymeren versteht man solche Polymere, die mehrere an eine niedermolekulare Zentraleinheit gebundene Polymerketten aufweisen, wobei die niedermolekulare Zentraleinheit in der Regel 4 bis 100 Gerüstatome wie C-Atome, N-Atome oder O-Atome aufweisen wird. Dementsprechend lassen sich die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Polymere durch die nachfolgende allgemeine Formel I beschreiben: Z(A-B-FR)_n (I)worin
n eine ganze Zahl ist, mit einem Wert von wenigstens 4, z. B. 4 bis 12, insbesondere 5 bis 12 und speziell 6 bis 8;
Z für einen niedermolekularen n-valenten organischen Rest als Zentraleinheit steht, der in der Regel 4 bis 100, vorzugsweise 5 bis 50 Gerüstatome, insbesondere 6 bis 30 Gerüstatome aufweist. Die Zentraleinheit kann sowohl aliphatische als auch aromatische Gruppen aufweisen. Sie steht beispielsweise für einen von einem wenigstens 4-wertigen Alkohol, z. B. einem 4- bis 12-wertigen, vorzugsweise einem wenigstens 5-wertigen, insbesondere einem 6- bis 8-wertigen Alkohol, z. B. Pentaerythrit, Dipentaerythrit, einen Zuckeralkohol wie Erythritol, Xylitol, Mannitol, Sorbitol, Maltitol, Isomaltulose, Isomaltit, Trehalulose, oder dergleichen abgeleiteten Rest;
A eine hydrophile Polymerkette, die als solche wasserlöslich ist;
B eine chemische Bindung oder ein zweiwertiger, niedermolekularer organischer Rest mit vorzugsweise 1 bis 20, insbesondere 2 bis 10 C-Atomen, beispielsweise eine C₂-C₁₀-Alkylengruppe, eine Phenylen- oder eine Naphthylengruppe oder eine C₅-C₁₀-Cycloalkylengruppe, wobei die Phenylen-, Naphthylen und die Cycloalkylengruppe zusätzlich ein oder mehrere, z.B. 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 Substituenten, z. B. Alkylgruppen mit 1 bis 4 C-Atomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 C-Atomen oder Halogen aufweisen können; und
FR eine reaktive Gruppe die mit einer hierzu komplementären reaktiven funktionellen Gruppen FR' oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagieren kann.

Als reaktive Gruppen FR sowie als hierzu komplementär reaktive Gruppen FR' kommen die im Zusammenhang mit den Gruppen R bzw. R' in Tabelle 1 genannten funktionellen Gruppen in Betracht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Gruppen FR um Isocyanat-Gruppen.

Erfindungsgemäß weisen die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4, vorzugsweise wenigstens 5 und insbesondere wenigstens 6 Polymerarme, häufig jedoch nicht mehr als 16, insbesondere nicht mehr als 12 und speziell nicht mehr als 10 Polymerarme auf. Besonders bevorzugt weisen die sternförmigen Präpolymere 6 bis 8 Polymerarme A auf. Das zahlenmittlere Molekulargewicht der Polymerarme liegt in der Regel im Bereich von 200 bis 20000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 300 bis 10000 Dalton, insbesondere im Bereich von 400 bis 8000 Dalton und speziell im Bereich von 500 bis 5000 Dalton. Dementsprechend weist das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von in der Regel wenigstens 1500 Dalton, vorzugsweise 2000 bis 100000 Dalton, insbesondere 2500 bis 50000 Dalton und speziell 3000 bis 30000 Dalton auf.

Die Bestimmung des Molekulargewichts der sternförmigen Polymere kann in an sich bekannter Weise mittels Gelpermeationschromatographie erfolgen, wobei man auf handelsübliche Säulen, Detektoren und Auswertungssoftware zurückgreifen kann. Bei bekannter Anzahl von Endgruppen je Polymermolekül kann man das Molekulargewicht auch durch Titration der Endgruppen FR bestimmen, im Falle von Isocyanatgruppen z. B. durch Umsetzung mit einer definierten Menge eines sekundären Amins wie Dibutylamin und anschließende Titration des überschüssigen Amins mit Säure.

Die hydrogel-bildenden Eigenschaften der Oberflächenschicht wird durch die Wasserlöslichkeit der Polymerarme A gewährleistet. Sie sind in der Regel dann gewährleistet, wenn der molekulare Aufbau, d. h. zumindest die Art der Wiederholungseinheiten, vorzugsweise auch das Molekulargewicht des Polymerarms, einem Polymeren entspricht, dessen Löslichkeit in Wasser wenigstens 1 Gew.-% und vorzugsweise wenigstens 5 Gew.-% (bei 25°C und 1 bar) beträgt.

Beispiele für derartige Polymere mit hinreichender Wasserlöslichkeit sind Poly-C₂-C₄-alkylenoxide, Polyoxazoline, Polyvinylalkohole, Homo- und Copolymere, die wenigstens 50 Gew.-% N-Vinylpyrrolidon einpolymerisiert enthalten, Homo- und Copolymere, die wenigstens 30 Gew.-% Hydroxyethyl(meth)acrylat, Hydroxypropyl(meth)acrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylsäure und/oder Methacrylsäure einpolymerisiert enthalten, hydroxilierte Polydiene und dergleichen.

Vorzugsweise leiten sich die Polymerarme A von Poly-C₂-C₄-alkylenoxiden ab und sind insbesondere ausgewählt unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylenoxid/Polypropylenoxid-Copolymeren, die eine Block- oder eine statistische Anordnung der Wiederholungseinheiten aufweisen können. Insbesondere bevorzugt sind sternförmige Präpolymere deren Polymerarme A von Polyethylenoxiden oder von Polyethylenoxid/Polypropylenoxid-Copolymeren mit einem Propylenoxid-Anteil von nicht mehr als 50 % abgeleitet sind.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Präpolymere sind z. T. bekannt, z. B. aus der WO 98/20060, US 6,162,862 , Götz et al., Macromol. Mater. Eng. 2002, 287, S. 223, Bartelink et al. J. Polymer Science 2000, 38, S. 2555, DE 10216639.0 und DE 10203937 (Polyether-Stern-polymere), Chujo Y. et al., Polym. J. 1992, 24(11), 1301-1306 (sternförmige Polyoxazoline), WO 01/55360 (sternförmige Polyvinylalkohole, sternförmige Vinylpyrrolidon enthaltende Copolymere) oder können nach den dort beschriebenen Methoden hergestellt werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Präpolymere erfolgt in der Regel durch Funktionalisierung geeigneter sternförmiger Präpolymer-Vorstufen, welche bereits die oben beschriebene Präpolymerstruktur, d. h. wenigstens 4 wasserlösliche Polymerarme, aufweisen und die an den Enden der Polymerarme je eine funktionelle Gruppe FR'' aufweisen, die in eine der vorgenannten reaktiven Gruppen FR umgewandelt werden kann. Zu den Gruppen FR'' zählen an aliphatische oder aromatische C-Atome, vorzugsweise an ein primäres aliphatisches C-Atom gebundene Halogen-Atome, insbesondere Chlor, Brom oder lod, an ein aliphatisches oder aromatisches und insbesondere an ein primäres, aliphatisches C-Atom gebundene OH-Gruppen, Thiol-Gruppen und NHR²-Gruppen mit R²= Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl.

Derartige Präpolymervorstufen sind aus dem Stand der Technik bekannt, z.B. aus der US 3,865,806 , US 5,872,086 , US 6,162,862 , Polym. J. 1992, 24(11), 1301-1306, WO 01155360 und im Handel erhältlich, z. B. im Falle sternförmiger Poly-C₂-C₄-alkylenoxide unter den Handelsbezeichnungen VORANOL^®, TERRALOX^®, SYNALOX^® und DOWFAX^® der Dow-Chemical Corporation, SORBETH^® der Glyco-Chemicals Inc. und GLUCAM^® der Amerchol Corp. oder können nach bekannten Verfahren der Polymerchemie durch Polymerisation geeigneter Monomere in Gegenwart polyfunktionelle Starter hergestellt werden, z. B. durch „lebende" Polymerisation (siehe hierzu: Hsieh, H.L.; Quirk, R.P. Anionic polymerization: Principles and Practical Applications, New York, Marcel Dekker, 1996; Matyjaszewski, K. Controlled/Living radical polymerization: Progress in ATRP, NMP, and RAFT, Washington, DC: American Chemical Society, 2000) oder insbesondere im Falle ethylenisch ungesättigter Monomere durch Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) nach den in WO 98/40415 beschriebenen Verfahren.

Die Funktionalisierung der sternförmigen Präpolymer-Vorstufen kann grundsätzlich in Analogie zu bekannten Funktionalisierungsverfahren des Standes der Technik erfolgen.

Zur Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Aminogruppen tragen, bieten sich als Ausgangsmaterialien insbesondere solche Präpolymer-Vorstufen an, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen. Die Umwandlung von OH-Gruppen in Aminogruppen kann z. B. in Analogie zu der von Skarzewski, J. et al. Monatsh. Chem. 1983, 114, 1071-1077 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Hierzu werden die OH-Gruppen in an sich bekannter Weise, (z. B. nach Organikum, 15. Aufl., VEB, Berlin 1981 S. 241ff.; J. March, Advanced Organic Synthesis 3^rd ed. S. 382 ff.; siehe auch Beispiel 12) mit einem Halogenierungsmittel wie Thionylchlorid, Sulfurylchlorid, Thionylbromid, Phosphortribromid, Phosphoroxychlorid, Oxalylchlorid und dergleichen, gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase wie Pyridin oder Triethylamin, in das entsprechende Halogenid, oder mit Methansulfonylchlorid in das entsprechende Mesylat überführt. Die so erhaltene Halogenverbindung, bzw. das Mesylat wird anschließend mit einem Alkalimetallazid, vorzugsweise in einem aprotisch polaren Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon in die das entsprechende Azid überführt. Das Azid wird anschließend mit Wasserstoff in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators oder mit einem Komplexhydrid wie Lithiumaluminiumhydrid in die Aminoverbindung überführt.

Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Oxirangruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen, mit Glycidylchlorid.

Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A (Meth)acrylgruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Veresterung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen tragen, mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure oder durch Umsetzung der OH-Gruppen mit Acrylchlorid bzw. mit Methacrylchlorid, oder mit den Anhydriden der Acrylsäure oder der Methacrylsäure in Analogie zu bekannten Verfahren. Alternativ kann man in Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A NH₂-Gruppen tragen, die NH₂-Gruppen mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure, mit deren Anhydriden oder mit deren Säurechloriden umsetzen. Die Herstellung (Meth)acrylat-terminierter Präpolymere kann z. B. in Analogie zu den von Cruise et al. Biomaterials 1998, 19, 1287-1294 und Han et al. Macromolecules 1997, 30, 6077-6083 für die Modifizierung von Polyetherdiolen und -triolen beschriebenen Methoden erfolgen.

Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Thiolgruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A Halogenatome tragen, mit Thioessigsäure und nachfolgender Hydrolyse in Analogie zu dem in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Ed. E. Müller, 4. Aufl., Bd. 9, S. 749, G. Thieme, Stuttgart 1955 beschriebenen Verfahren.

Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Isocyanat tragen, gelingt bevorzugt durch Addition eines niedermolekularen Diisocyanats an Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-, SH-, oder NHR''-Gruppen aufweisen (R' = H, oder ein aliphatischer Rest wie C₁-C₄-Alkyl). Vorzugsweise werden sternförmige Polyole mit OH-Endgruppen eingesetzt.

Als Diisocyanate kommen sowohl aromatische Diisocyanate wie Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, kommerzielle erhältliche Mischung von Toluol-2,4- und -2,6-diisocyanat (TDI), m-Phenylendiisocyanat, 3,3'-Diphenyl-4,4'-biphenylendiisocyanat, 4,4'-biphenylendiisocyanat, 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat, 3,3'-Dichlor-4,4'-biphenylendiisocyanat, Cumen-2,4-diisocyanat, 1,5-Napthalindiisocyanat, p-Xylylendiisocyanat, p-Phenylendiisocyanat, 4-Methoxy-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Chloro-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Bromo-1,3-phenylendiisocyanat, 4-Ethoxy-1,3-phenylendiisocyanat, 2,4-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat, 5,6-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat, 2,4-Diisocyanatodiphenylether, Benzidindiisocyanat, 4,6-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat, 9,10-Anthracendiisocyanat, 4,4'-Diisocyanatodibenzyl, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylmethane, 2,6-Dimethyl-4,4'-diisocyantodiphenyl, 2,4-Diisocyanatostilben, 3,3'-Dimethoxy-4,4'-diisocyantodiphenyl, 1,4-Anthracenediisocyanat, 2,5-Fluorendiisocyanat, 1,8-Naphtalindiisocyanat, 2,6-Diisocyanatobenzofuran, als auch aliphatische und cycloaliphatische Diisocyanate wie Isophorondiisocyanat (IPDI), Ethylendiisocyanat, Ethylidendiisocyanat, Propylen-1,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1,4-diisocyanat, 1,6-Hexamethylendiisocyanat, 1,4-Tetramethylendiisocyanat, 1,10-Decamethylendiocyanat und Methylendicyclohexyldiisocyanat.

Bevorzugt sind Diisocyanate, deren Isocyanatgruppen sich in ihrer Reaktivität zu unterscheiden, wie Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, sowie Mischung von Toluol-2,4- und -2,6-diisocyanat und cis- und trans-Isophorondiisocyanat.

Besonders bevorzugt sind sternförmige Präpolymere mit aliphatischen Diisocyanatendgruppen, insbesondere solchen wie sie durch Addition von IPDI auf die Kettenenden von OH-Gruppen-terminierten sternförmigen Präpolymervorstufen erhalten werden.

Die sternförmigen Präpolymere werden naturgemäß so mit dem Diisocyanat umgesetzt, dass an jedes Kettenende der Sternmoleküle eine Diisocyanateinheit addiert wird, wobei die zweite Isocyanatgruppe des Diisocyanats frei bleibt. Auf diese Weise wird jede Endgruppe der Sternmoleküle über eine Urethanverknüpfung mit einer freien Isocyanatgruppe versehen. Verfahren hierzu sind z.B. aus den US 5,808,131 , WO 98/20060 und US 6,162,862 , Bartelink C. F. et al., J. Polymer Science 2000, 38, 2555-2565 sowie Götz et al., Macromolecular Materials and Engineering, 2002, 287, 223-230, bekannt.

In der Regel wird man zu diesem Zweck die Präpolymervorstufe zur Vermeidung der Bildung von multimeren Addukten, d. h. Addukte, in denen zwei oder mehrere Präpolymere über Diisocyanateinheiten miteinander verknüpft sind, zu einem Überschuss des Diisocyanats geben. In der Regel beträgt der Überschuss wenigstens 10 Mol-%, bezogen auf die Stöchiometrie der Reaktion, d. h. man setzt wenigstens 1,1 Mol, vorzugsweise wenigstens 2 Mol und insbesondere wenigstens 5 Mol Diiso-cyanat und speziell wenigstens 10 Mol Diisocyanat pro Mol funktioneller Gruppe in der Präpolymervorstufe ein. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion unter kontrollierten Reaktionsbedingungen, d. h. die Zugabe der Präpolymervorstufe erfolgt unter Reaktionsbedingungen so langsam, dass eine Erwärmung des Reaktorinhalts um mehr als 20 K vermieden wird. Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit eines Lösungs- oder Verdünnungsmittels.

Die Umsetzung kann in Abwesenheit oder in Gegenwart geringer Mengen üblicher Katalysatoren, welche die Bildung von Urethanen fördern, erfolgen. Geeignete Katalysatoren sind beispielsweise tertiäre Amine wie Diazabicyclooctan (DABCO) und zinnorganische Verbindungen, z. B. Dialkylzinn(IV)salze von aliphatischen Carbonsäuren wie Dibutylzinndilaurat und Dibutylzinndioctoat. Die Menge an Katalysator beträgt in der Regel nicht mehr als 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Präpolymervorstufe, z.B. 0,01 bis 0,5 Gew.-%, insbesondere 0,02 bis 0,3 Gew.-%. In einer bevorzugten Vorgehensweise wird kein Katalysator eingesetzt.

Die erforderlichen Reaktionstemperaturen hängen naturgemäß von der Reaktivität der eingesetzten Präpolymervorstufe, des Diisocyanats, und sofern eingesetzt von der Art und Menge des verwendeten Katalysators ab. Sie liegt in der Regel im Bereich von 20 bis 100°C und insbesondere im Bereich von 35 bis 80°C. Es versteht sich von selbst, dass die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit von Feuchtigkeit (< 2000 ppm, vorzugsweise < 500 ppm) erfolgt.

Die Aufarbeitung der so erhaltenen Reaktionsmischung erfolgt in der Regel durch Abdestillieren des überschüssigen Diisocyanats, vorzugsweise bei vermindertem Druck. Die erhaltenen Reaktionsprodukte enthalten zu einem überwiegenden Anteil das sternförmige Präpolymer, das an den Enden der Polymerarme Isocyanatgruppen aufweist. Der Anteil des sternförmigen Präpolymeren beträgt in der Regel wenigstens 70 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 80 Gew.-% des Reaktionsprodukts. Die übrigen Bestandteile des Reaktionsproduktes sind im Wesentlichen Dimere und in geringen Anteilen Trimere, die in diesen Mengen ebenfalls zur Herstellung der erfindungsgemäßen Beschichtungen geeignet sind.

Die organische Oberflächenschicht ist in der Regel auf der Oberfläche eines Trägers angeordnet. Die Bereitstellung der im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren P aufgebauten organischen Oberfläche umfasst daher üblicherweise das Abscheiden der sternförmigen Präpolymere P auf der Oberfläche des Trägers und anschließendes Vernetzen der reaktiven Gruppen FR der Präpolymere P. Die Schritte der Abscheidung und der Vernetzung können gewünschtenfalls wiederholt durchgeführt werden. Man gelangt auf diese Weise zu dickeren Schichten.

In der Regel umfasst das Verfahren des Abscheidens der sternförmigen Präpolymere P die folgenden Schritte:

i.a. Abscheiden des sternförmigen Präpolymeren P auf der Oberfläche eines Trägers durch Aufbringen einer Lösung wenigstens eines sternförmigen Präpolymeren, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR tragen, auf die Oberfläche des Trägers;
i.b. anschließend Durchführen einer Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander und Entfernen des Lösungsmittels; und
i.c. gegegebenenfalls Aktivieren der funktionellen Gruppen R auf der Oberfläche der Oberflächenschicht.

In Schritt i.a. erhält man eine Oberflächenschicht, die aus unvernetzten Präpolymeren aufgebaut ist und die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR auf ihrer Oberfläche aufweist. In dieser Oberflächenschicht wird eine Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander durchgeführt, wobei die Verknüpfungsreaktion nach dem Aufbringen und Entfernen des Lösungsmittels durch nachträgliches Behandeln der Oberflächenschicht mit einem Vernetzer oder beim Entfernen des Lösungsmittels erfolgen kann.

Wie bereits erwähnt, kann das Aufbringen der Biomoleküle vor, während oder nach der Verknüpfungs-/Vernetzungsreaktion der Präpolymere erfolgen. Es ergeben sich somit 4 Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens, die im folgenden näher erläutert werden.

Gemäß einer ersten Variante wird man die Biomoleküle auf eine bereits vollständig vernetzte Oberflächenschicht aufbringen. Gemäß einer zweiten Variante werden die funktionellen Gruppen R der Oberflächenschicht vor dem Aufbringen der Biomoleküle durch Behandlung mit einer geeigneten Verbindung aktiviert, um eine hinreichende Aktivität gegenüber den funktionellen Gruppen FR' der Biomoleküle bzw. eine Affinität gegenüber den Bindungstellen der Biomoleküle zu erreichen. Im Anschluß an das Aufbringen der Biomoleküle wird man dann gegebenenfalls überschüssige, d.h. nicht durch Biomoleküle belegte Gruppen FR wieder deaktivieren, im Falle von NCO-Gruppen oder Isothiocyanat-Gruppen durch Behandeln mit Wasser bzw. Wasserdampf.

Gemäß einer dritten Variante umfasst das erfindungsgemäße Verfahren:

i. Bereitstellung einer organischen Oberflächenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflächenschicht erhält die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist;
ii. Aufbringen von Biomolekülen, welche funktionelle Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren, in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche, und
iii. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;

oder gemäß einer vierten Variante:

i. Bereitstellung einer organischen Oberflächenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflächenschicht erhält die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist;
ii. Aufbringen einer Aktivatorsubstanz (bzw. eines Haftvermittlers), welche funktionelle Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren auf der Oberfläche,
iii. Aufbringen der Biomoleküle unter Anbindung and die Aktivatorsubstanz und Entfernen der nicht abreagierten Biomoleküle und
iv. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;

Bei den Varianten 3 und 4 können die Schritte ii und iii bzw. ii und iv gleichzeitig oder in engem zeitlichen Zusammenhang erfolgen, d.h. Schritt ii kann durchgeführt werden, während die Vernetzung in Schritt iii bwz. iv. stattfindet.

Bei den Varianten 1 bis 4 wird sternförmige Präpolymer P üblicherweise als Lösung auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht. Dementsprechend umfassen diese Verfahrensvarianten selbstredend auch die Entfernung des Lösungsmittels. Das Entfernen kann vor oder während der Vernetzungsreaktion erfolgen, jedoch stets vor Aufbringen der Aktivatorsubstanz und vor Aufbringen der Biomoleküle.

Die Vernetzung erfolgt in der Regel durch Reaktion der reaktiven Gruppen FR der Präpolymere, die an den freien Enden der wasserlöslichen Polymerarme A angeordnet sind, untereinander oder mit hierzu komplementär-reaktiven Gruppen FR' unter Bindungsbil dung. Die komplementär-reaktiven Gruppen FR' können dabei sowohl sich an den Enden der wasserlöslichen Arme A sternförmiger Präpolymere befinden als auch in davon verschiedenen vernetzend wirkenden Substanzen (Vernetzer).

Beispiele für Abscheidungsverfahren sind die Immersion der zu beschichtenden Oberfläche in der Lösung des Präpolymeren sowie das Spincoating – hierbei wird die Lösung des Präpolymeren auf die mit hoher Geschwindigkeit rotierende zu beschichtende Oberfläche aufgebracht. Es versteht sich von selbst, dass man zur Herstellung ultradünner Beschichtungen die Beschichtungsmaßnahmen in der Regel unter staubfreien Bedingungen durchführt.

Bei dem Immersionsverfahren taucht man die Substrate in eine Lösung des Sternpolymers in einem geeigneten Lösungsmittel und lässt anschließend die Lösung ablaufen, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm mit möglichst einheitlicher Dicke auf dem Substrat verbleibt. Dieser wird anschließend eingetrocknet. Die resultierende Filmdicke hängt von der Konzentration der Sternpolymer-Lösung ab. Anschließend wird die Vernetzung ausgelöst.

Beim Spincoating wird in der Regel das zunächst nicht rotierende Substrat mit der Lösung des sternförmigen Präpolymeren vollständig benetzt. Anschließend wird das zu beschichtende Substrat mit hohen Umdrehungszahlen, in der Regel wenigstens 50 U/min, häufig wenigstens 500 U/min, z.B. 500 bis 30000 U/min, vorzugsweise oberhalb 1000 U/min, z.B. 1000 bis 10000 U/min, und besonders bevorzugt 3000 bis 6000 U/min, in Rotation versetzt, wobei die Lösung weitgehend abgeschleudert wird und ein dünner Beschichtungsfilm auf der Oberfläche des Substrats verbleibt. Anschließend wird auch hier eine Vernetzung ausgelöst.

Üblicherweise beträgt die Konzentration wenigstens 0,001 mg/ml, vorzugsweise wenigstens 0,01 mg/ml, insbesondere wenigstens 0,1 mg/ml, besonders bevorzugt wenigstens 1 mg/ml. Die Konzentration des Präpolymeren in der Lösung wird in der Regel einen Wert von 500 mg/ml, vorzugsweise 250 mg/ml und insbesondere 100 mg/ml nicht überschreiten. Über die Konzentration lässt sich naturgemäß die Dicke der Beschichtung steuern.

Zur Erzielung der gewünschten, hydrogel-bildenden Eigenschaften der Oberflächenschicht wird diese in der Regel eine Schichtdicke im trockenen Zustand (<10% Wasser) von wenigstens 2 nm, vorzugsweise wenigstens 5 nm und insbesondere wenigstens 10 nm aufweisen (gemessen mittels Ellipsometrie nach dem in Guide to using WVASE 32^TH, J. A. Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998 beschriebenen Verfahren). In der Regel wird man Beschichtungsdicken im trockenen Zustand (<10% Wasser) von insbesondere 500 μm und speziell 100 μm nicht überschreiten, um die Funktion der Biochips nicht zu beeinträchtigen. Vorteilhafte Schichtdicken liegen insbesondere im Bereich von 10 nm bis 50 μm (trocken).

Zur Herstellung der Lösungen der Präpolymere P sind grundsätzlich alle Lösungsmittel geeignet, welche keine oder nur eine geringe Reaktivität gegenüber den funktionellen Gruppen FR des zu lösenden Präpolymeren aufweisen. Hierunter sind solche bevorzugt, die einen hohen Dampfdruck aufweisen und sich somit leicht entfernen lassen. Bevorzugt sind daher solche Lösungsmittel die bei Normaldruck eine Siedetemperatur unterhalb 150°C und vorzugsweise unterhalb 120°C aufweisen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, z.B. Ether wie Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Diethylether, tert.-Butylmethylether, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Xylole und Toluol, weiterhin Acetonitril, Propionitril und Mischungen dieser Lösungsmittel. Im Falle von Präpolymeren mit OH-, SH-, Carboxyl-, (Meth)acryl- und Oxirangruppen sind auch protische Lösungsmittel wie Wasser oder Alkohole, z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol und tert.-Butanol, sowie deren Mischungen mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanat-Gruppen sind neben den vorgenannten aprotischen Lösungsmitteln überraschenderweise auch Wasser sowie Mischungen von Wasser mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet, da der Abbau der Isocyanatgruppen der Präpolymere in derartigen Lösungen vergleichsweise langsam erfolgt.

Die Vernetzung der Präpolymere kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Beispielsweise kann die Präpolymere mit einem Vernetzungsmittell umsetzen. Als Vernetzungsmittel sind grundsätzlich alle Verbindungen mit 2 oder mehr funktionellen Gruppen FR' geeignet, welche mit den funktionellen Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren.

Demnach erfolgt gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung die Bereitstellung der organischen Oberfläche durch ein Verfahren, bei dem man die Verknüpfung der reaktiven Gruppen FR durch Zugabe einer Verbindung V1 auslöst, die wenigstens zwei reaktive Gruppen FR' pro Molekül aufweist, die mit den reaktiven Gruppen FR des sternförmigen Präpolymers unter Bindungsbildung reagiert.

Bei den polyfunktionellen Verbindungen V1 kann es sich um niedermolekulare Verbindungen handeln, z.B. um aliphatische oder cycloaliphatische Diole, Triole und Tetraole, z.B. Ethylenglykol, Butandiol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Trimethylolpropan, Pentaerythrit und dergleichen, aliphatische oder cycloaliphatische Diamine, Triamine oder Tetramine, z.B. Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin, 1,8-Diamino-3,6-dioxaoctan, Diaminocyclohexan, Isophorondiamin und dergleichen, Aminoalkohole wie Ethanolamin, Diethanolamin, aliphatische oder cycloaliphatische Dithiole, um Dicarbonsäuren oder Tricarbonsäuren wie Sebazinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Phthalsäure, Isophthalsäure, oder um die vorgenannten Diisocyanate, je nachdem welche Art von reaktiven Gruppen das Präpolymer aufweist. Die niedermolekularen polyfunktionellen Verbindungen weisen im Unterschied zu den Präpolymeren in der Regel ein Molekulargewicht < 500 g/mol auf.

Die polyfunktionelle Verbindung V1 kann bereits in der Lösung des Präpolymeren enthalten sein, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird. In der zunächst entstehende Oberflächenschicht aus weitgehend unvernetzten Präpolymeren reagieren dann, z.B. beim Trocknen oder beim Erwärmen der Schicht die reaktiven Gruppen FR' des Vernetzungsmittels mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren und bilden auf diese Weise eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren, die in der Regel noch eine Vielzahl funktionelle Gruppen FR und/oder FR' auf ihrer Oberfläche aufweist.

Wenn es sich bei den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren um konjugierte Diene handelt, wird die Verbindung V1 dementsprechend wenigstens zwei dienophile Gruppen aufweisen und umgekehrt. Wenn die Präpolymere reaktive Gruppen aufweisen, die eine en-Reaktion eingehen, wird die Verbindung V1 wenigstens zwei allylische Doppelbindungen aufweisen. In der Regel wird man bei derartigen Systemen zur Herstellung der Beschichtungen Lösungen verwenden die sowohl das Präpolymer als auch die Verbin dungen V1 enthalten. Die Vernetzung erfolgt dann beim Trocknen der primär erhaltenen Beschichtung, gegebenenfalls nach Erwärmen.

Als polyfunktionelle Verbindungen V1 sind grundsätzlich auch Präpolymere geeignet, die wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR' aufweisen, die mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren. Mit anderen Worten, zur Bereitstellung der Hydrogel-bildenden Oberflächenschicht können erfindungsgemäß auch Lösungen von wenigstens zwei unterschiedlichen Präpolymeren eingesetzt werden, worin das eine Präpolymer reaktive Gruppen FR und das andere dazu komplementäre reaktive Gruppen FR' aufweist. Auch auf diese Weise wird eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren erhalten, die in der Regel noch eine Vielzahl funktionelle Gruppen FR und/oder FR' auf ihrer Oberfläche aufweist.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R ausgelöst, indem man eine ausreichende Menge einer Verbindung V2 zugibt, die mit einem Teil der reaktiven Gruppen FR unter Bildung reaktiver Gruppen FR' reagiert, welche dann mit den verbliebenen reaktiven Gruppen FR unter Bindungsbildung reagieren. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanatgruppen kann man beispielsweise die Vernetzung auslösen, indem man den beschichteten Gegenstand mit Wasser behandelt, z.B. durch Lagern in einer feuchten Atmosphäre oder unter Wasser. Hierbei reagiert ein Teil der Isocyanatgruppen unter Bildung von Aminogruppen ab, die ihrerseits mit den verbleibenden Isocyanatgruppen unter Bindungsbildung reagieren, wobei eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren entsteht. Das Vernetzungsmittel V2 ist hier somit Wasser. So hergestellt Beschichtungen weisen, wenn sie frisch hergestellt worden sind, noch freie Isocyanat-Gruppen auf. Bei längerer Einwirkung von Feuchtigkeit werden die an der Oberfläche angeordneten Isocyanatgruppen in Aminogruppen umgewandelt.

In einer Variante dieser Ausführungsform setzt man Lösungen des Präpolymeren in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser mit einem oder mehreren mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln ein. Beispiele für geeignete, mit Wasser mischbare Lösungsmittel sind insbesondere solche, die mit den Isocyanatgruppen nicht oder nur sehr viel langsamer als Wasser eine Reaktion eingehen. Beispiele hierfür sind cyclische Ether wie Tetrahydrofuran und Dioxan, weiterhin N-Alkylamide wie N-Methylpyrrolidon, Dimethylformamid und Dimethylacetamid. Das Mischungsverhältnis Wasser:Lösungsmittel liegt in der Regel im Bereich von 1:100 bis 100:1, vorzugsweise im Bereich von 50:1 bis 1:10 und speziell im Bereich 20:1 bis 1:1. Diese Variante eignet sich insbesondere zur Herstellung dickerer Schichten. Die Konzentration an Präpolymer liegt dann vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 500 mg/ml, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 200 mg/ml und speziell im Bereich von 1 bis 100 mg/ml.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird man zunächst in der oben beschriebenen Weise eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, beispielsweise als Monoschicht, auf die zu beschichtende Oberfläche aufbringen, gegebenenfalls eine partielle Vernetzung der reaktiven Gruppen FR durchführen und anschließend wenigstens ein weiteres sternförmiges Präpolymer 2 auf die so behandelte Oberfläche aufbringt, das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR' aufweisen, welche eine zu den reaktiven Gruppen R des ersten Präpolymeren komplementäre Reaktivität aufweisen. Gegebenenfalls führt man im Anschluss daran eine erneute Vernetzung der verbliebenen reaktiven Gruppen FR' durch. Dieser Vorgang kann ein oder mehrmals wiederholt werden. Auf diese Weise gelingt es gezielt mehrschichtige Beschichtungen herzustellen. Diese Vorgehensweise wird im Folgenden auch als Schicht-für-Schicht-Verfahren bezeichnet. Das Schicht-für-Schicht-Verfahren kann in besonders eleganter Weise mit solchen Präpolymeren realisiert werden, die reaktive Gruppen FR aufweisen, welche mit Verbindungen V2 zu reaktiven Gruppen R' abreagieren, die eine zu den Gruppen FR komplementäre Reaktivität aufweisen. Beispiele für Gruppen FR sind Isocyanatgruppen. Die Verbindung V2 ist in diesem Fall Wasser. Als komplementär reaktive Gruppen FR' entstehen dann NH₂-Gruppen. Wird nämlich die Vernetzung der ersten Schicht mit der Verbindung V2 ausgelöst, weist die erhaltene Beschichtung an ihrer Oberfläche freie Gruppen FR' (z.B. Aminogruppen) auf. Diese reagieren dann mit den Gruppen FR (z.B. Isocyanatgruppen) der in einem zweiten Beschichtungsvorgang aufgebrachten Präpolymeren unter Bindungsbildung

Neben den vernetzten sternförmigen Präpolymeren können die Oberflächenschichten auch wasserlösliche Polysacharide, wie Hyaluronate, Heparine, Alginaten oder z.B. Dextrane enthalten. Die Herstellung derartiger Beschichtungen erflogt durch gemeinsa mes Abscheiden von Präpolymer und wasserlöslichem Polysacharid auf der auszurüstenden Oberfläche. Bei Verwendung von Präpolymeren mit gegenüber OH-Funktionen reaktiven funktionellen Gruppen R, z. B. Isocyanatgruppen, wirkt dann das Polysacharid als Vernetzer. Polysacharid und Präpolymer bilden dann gemeinsam die hydrogelbildende organische Oberflächenschicht. Das Gewichtsverhältnis von Polysacharid zu sternförmigem Präpolymer in der Beschichtung wird in der Regel einen Wert von 1:1 nicht überschreiten und liegt beispielsweise im Bereich von 1:1000 bis 1:1 und speziell im Bereich von 1:100 bis 1:2.

Häufig ist es vorteilhaft, die Oberfläche des Trägers in einer Weise vorzubehandeln, dass sie eine erhöhte Anzahl (Flächendichte) an funktionellen Gruppen FR' aufweist, die mit den funktionellen Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren können.

Hierzu wird man die Oberflächen inerter Materialien häufig vor der eigentlichen Ausrüstung chemisch aktivieren. Dies kann beispielsweise durch Behandlung der zu beschichtenden Oberfläche mit Säure oder Laugen, durch Oxidation (Abflammen), durch Elektronenbestrahlung oder durch eine Plasmabehandlung mit einem sauerstoffhaltigen Plasma erfolgen wie sie von P. Chevallier et al. J. Phys. Chem. B 2001, 105(50), 12490-12497; in JP 09302118 A2 ; in DE 10011275 ; oder von D. Klee. et al. Adv. Polym. Sci. 1999, 149, 1-57, beschrieben wurde. Die Aktivierung der Oberfläche kann auch mittels Plasmabehandlung mit einem NH₃-haltigen Plasma erfolgen, wie sie in US 6,017,577, 6,040,058 und 6,080,488 beschrieben wird.

Man kann die Oberfläche des Trägers auch mit Verbindungen behandeln, die einerseits eine bekanntermaßen gute Haftung auf den Oberfläche aufweisen und die außerdem funktionelle Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR des sternförmigen Präpolymeren komplementär sind. Derartige Verbindungen werden im Folgenden auch als Haftvermittler bezeichnet. Geeignete Gruppen FR' sind, abhängig von der reaktiven Gruppe FR des Präpolymeren: Isocyanat-, Aldehyd, Amino-, Hydroxyl-, Mercapto- und Epoxygruppen, weiterhin Gruppen, die im Sinne einer Michael-Addition reagieren, dienophile Gruppen, die Diels-Alder Additionsreaktionen eingehen, elektronenarme Doppelbindungen, die in einer Diels-Alder Addition oder En-Reaktion mit allylischen Doppelbindungen reagieren; aktivierten Estergruppen; Oxazolingruppen; sowie Vinylgruppen, spezifisch eine freie Radikaladdition eingehen.

Die Art der Gruppe, die eine Haftung auf der Oberfläche bewirkt, hängt naturgemäß von der chemischen Natur dieser Oberfläche ab. Im Fall von oxidischen, wie keramischen und glasartigen Oberflächen, sowie im Falle metallischer Oberflächen haben sich Verbindungen bewährt, die als haftungsvermittelnde Gruppen Silangruppen, insbesondere Trialkoxysilangruppen aufweisen. Beispiele für derartige Verbindungen sind Trialkoxyaminoalkylsilane wie Triethoxyaminopropylsilan und N[(3-Triethoxysilyl)propyl]ethylendiamin, Trialkoxyalkyl-3-glycidylethersilane wie Triethoxypropyl-3-glycidylethersilan, Trialkoxyalkylmercaptane wie Triethoxypropylmercaptan, Trialkoxyallylsilane wie Allyltrimethoxysilan, Trialkoxy(isocyanatoalkyl)silane sowie Trialkoxysilyl(meth)acryloxyalkane und -(meth)acrylamidoalkane wie 1-Triethoxysilyl-3-acryloxypropan. Für oxidische Materialien und Kunststoffmaterialien sind als haftungsvermittelnde Gruppen auch polyfunktionalen Polyammoniumgruppen geeignet. Beispiele für derartige Verbindungen sind Polyammoniumverbindung mit freien primären Amingruppen wie sie z. B. von J. Scheerder, J.F.J Engbersen, und D.N. Reinhoudt, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1996, 115(6), 307–320, und von Decher, Science 1997, 277, 1232–1237 zu diesem Zweck beschrieben werden, weiterhin Polylysin und Polyethylenimin.

Bevorzugt werden die Haftvermittler als Monolage auf die auszurüstende Oberfläche aufgebracht. Derartige Monolagen lassen sich in an sich bekannter Weise durch Behandeln der zu beschichtenden Oberflächen mit verdünnten Lösungen der Verbindungen erreichen, z. B. nach dem oben beschriebenen Immersionsverfahren oder mittels Spincoating. Lösungsmittel und Konzentrationen entsprechen dabei den für das Aufbringen der Präpolymere gemachten Angaben. Häufig empfiehlt es sich, die Oberflächenbehandlung mit den vorgenannten Haftvermittlern im Anschluss an eine Aktivierung durch Abflammen, durch Elektronenbestrahlung oder durch Plasmabehandlung durchzuführen.

Träger im erfindungsgemäßen Sinn sind in der Regel Materialien mit starrer oder halbstarrer Oberfläche und in diesem Sinne als fest zu bezeichnen. Üblich sind planare Oberflächen. In bestimmten Fällen kann es aber von Vorteil sein, profilierte Träger zu verwenden. Erhebungen und Vertiefungen, wie Stufen, Rillen, Kanäle, Kerben, beispielsweise V-Kerben oder Mesa-Strukturen sind möglich. Diese Strukturen können so auf der Oberfläche angeordnet sein, daß sie die Immobilisierung der Biomoleküle zweckmäßig beeinflussen. Kanäle können zum Führen von Flüssigkeit dienen. Zumindest Teile der Oberfläche derartiger Träger entsprechen den erfindungsgemäßen Vorgaben.

Die Trägermaterialien unterliegen grundsätzlich keinen Einschränkungen. Beispiele für geeignete Oberflächenmaterialien sind oxidische Oberflächen, z. B. Silikate wie Glas, Quarz, Siliciumdioxid wie in Silicagelen, oder Keramik, weiterhin Halbmetalle wie Silicium, Halbleitermaterialien, Metalle und Metalllegierungen wie Stahl, Polymere wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polymethylpentene, Polypropylen, Polyester, Fluorpolymere (z. B. Teflon^®), Polyamide, Polyurethane, Poly(meth)acrylate, Blends und Komposite der vorgenannten Materialien.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Oberfläche des Trägers, auf welcher die organische Oberflächenschicht bereitgestellt werden soll, eine geringe Rauhigkeit aufweist. Vorteilhafterweise beträgt der für die Rauhigkeit charakteristische R_a-Wert nicht mehr als 100 nm und insbesondere nicht mehr als 50 nm.

Die Form eines Trägers kann mannigfaltig sein und richtet sich in erster Linie nach der Art der noch zu beschreibenden Verwendung des Trägers. Es kann sich beispielsweise um Objektträger, Mikrotiterplatten, Röhrchen, Chips, Dipsticks, Stempel, Caps, Partikel, Stränge, insbesondere Faserbündel, sphärische Körper, wie Kugeln oder Kügelchen, Fällungsprodukte, Membranen, Gele, Blätter, Behältnisse, Kapillaren, Scheiben, Folien oder Platten handeln. Auch Wafer-Formate können als Träger dienen, die gewünschtenfalls vereinzelbar sind. Die Träger können ferner mit weiteren zweckmäßigen Bauteilen versehen sein, beispielsweise kann man Chips einkapseln. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist ein Körper, insbesondere in Form eines Dipsticks, mit einem Verschlußmittel, z.B. einem Schnapp- oder Schraubdeckel versehen, der, aufgesetzt auf ein passendes Behältnis, insbesondere ein Inkubationsgefäß, die auf dem Körper immobilisierten Biomoleküle mit einem im Behältnis befindlichen Probenfluid in Kontakt bringen kann. Der Körper hat vorzugsweise die Form eines Stiftes, an dessen einem Ende das Verschlußmittel und an dessen anderem Ende zweckmäßigerweise die Biomoleküle immobilisiert sind. So entspricht wenigstens ein Teil der Oberfläche des Körpers den erfindungsgemäßen Vorgaben. Praktischerweise kann der Körper aus dem Polymer auf Polycycloolefin-Basis oder einem geeigneten Verbundwerkstoff mit entsprechenden O berflächenteilen gefornt sein. Ferner können mehrere Dipsticks – auch gemäß der vorstehend erläuterten Ausführungsform – vereinzelbar miteinander verbunden sein.

Die für die Kopplung zur Verfügung stehende Oberfläche des Trägers kann übliche Dimensionen haben, z. B. 0,5 bis 50 cm², insbesondere 1 cm² bis 25 cm². Eine typische Abmessung ist 20 mm × 70 mm oder 26 mm × 76 mm oder Zwischenformate, Halbformate etc..

Das Immobilisieren der Biomoleküle auf der organischen Oberflächenschicht erfolgt in an sich bekannter Weise durch Anbindung, d.h. Kopplung der Biomoleküle an die auf der Oberfläche dieser Schicht befindlichen reaktiven funktionellen Gruppen R. Dabei kann die Anbindung sowohl auf eine noch nicht vernetzte Oberflächenschicht erfolgen als auch an eine bereits vernetzte Oberflächenschicht.

Im Falle der noch nicht vernetzten Oberflächenschicht weist die Oberfläche eine Vielzahl der Gruppen FR aus dem sternförmigen Präpolymeren auf. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei um Isocyanat-Gruppen.

Im Falle der vernetzten Oberflächenschicht kann die Oberfläche je nach Vernetzungsmittel eine Vielzahl reaktiver Gruppen R aus dem sternförmigen Präpolymeren (FR = R) oder eine Vielzahl reaktiver Gruppen R, die durch Reaktion mit dem Vernetzungsmittel entstanden sind, aufweisen. Handelt es sich bei den Gruppen FR im Präpolymeren um Isocyanatgruppen und wurde die Vernetzung durch Einwirkung von Wasser bewirkt, weist die Oberfläche in der Regel eine Vielzahl von Aminogruppen auf.

Gegebenenfalls ist es für die Kopplung der Biomoleküle erforderlich, die auf der Oberfläche befindlichen funktionellen Gruppen R in geeigneter Weise zu aktivieren. Zur Aktivierung kann man die Gruppen R in funktionelle Gruppen R2 zu überführen, die mit den funktionellen Gruppen des Biomoleküls unter Bindungsbildung reagieren, z.B. in Epoxid-Gruppen, in Isocyanatgruppen, in Aktivester, in NHS-Ester, in Michael-Systeme wie Acrylamid-Gruppen, Vinylsulfongruppen, Acrylestergruppen oder Maleinimid-Gruppen oder in Aldehyde. Dies gelingt beispielesweise durch Aufbringen von Aktivatorverbindungen, die neben einer geeigneten funktionellen Gruppe R', welche mit den funktionellen Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagiert, eine weitere funktionelle Gruppe R2 aufweist, welche die zur Anbindung des Biomoleküls erforderliche Reaktivität aufweist. Die Aktivatorverbindung kann hierzu in einer Weise aufgebracht werden, die zu einer mehr oder weniger gleichmäßigen Aktivierung der gesamten Oberfläche führt. Man erhält auf diese Weise eine organische Oberfläche, die in gleichmäßig verteilter Weise eine Vielzahl reaktiver Gruppen R2 aufweist, welche zur Bindungsbildung mit den reaktiven Gruppen R' der Biomoleküle geeignet sind. Man kann die Aktivatorverbindung jedoch auch nur in denjenigen Bereichen (Plätzen) aufbringen, in denen die Biomoleküle auf den Array gekoppelt werden sollen. Man erhält auf diese Weise eine Oberfläche, die eine Vielzahl von Bereichen aufweist, in denen die Oberfläche reaktive Gruppen R2 trägt, wohingegen die Oberfläche ausserhalb dieser Bereiche keine oder im wesentlichen keine Gruppen R2 trägt.

Der Einsatz von Aktivatorverbindungen bietet sich insbesondere dann an, wenn die bereitgestellte Oberfläche eine Vielzahl nucleophiler Gruppen von vergleichsweise geringer Reaktivität, z.B. SH-, OH- und NH₂-Gruppen, aufweist. Derartige Oberflächen werden insbesondere dann erhalten, wenn die sternförmigen Präpolymere eine derartige Gruppe aufweisen oder wenn die reaktiven Gruppen R der sternförmigen Präpolymere bei der Vernetzung in eine derartige Gruppe umgewandelt werden, z.B. im Falle Isocyanat-terminierter Präpolymere bei der Vernetzung mit Wasser (s.o.). Nach Aktivierung der Oberfläche und Koppeln der Biomoleküle empfiehlt es sich, die Oberfläche zu deaktivieren, in dem man die Oberfläche mit deaktivierenden Verbindungen, z.B. niedermolekularen nucleophilen Verbindungen wie Wasser, Alkoholen, Ammoniak, primären Aminen oder verdünntem Alkali behandelt. Die Deaktivierung erfolgt üblicherweise durch Waschen der Oberfläche mit der deaktivierenden Verbindung oder einer Lösung der deaktivierenden Verbindung in einem inerten Lösungsmittel. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt.

In einer anderen Ausführungsform sind die Biomoleküle mit geeigneten reaktiven Gruppen R3 funktionalisiert, die mit den reaktiven Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren. Bei den Gruppen R3 handelt es sich dann üblicherweise um elektrophile funktionelle Gruppen, die mit den nucleophilen Gruppen R der Oberfläche eine Bindungsbildung eingehen. Geeignete Gruppen R3 sind z.B. ausgewählt sind unter Aktivestergruppen, N-Hydroxysuccinimid-Estergruppen, Isocyanat-Gruppen, Isothiocyantat-Gruppen, (Meth)acryl-Gruppen und Vinylsulfongruppen. Diese Vorgehensweise bietet sich insbesondere dann an, wenn die bereitgestellte Oberfläche eine Vielzahl nucleophiler Gruppen R, z.B. SH-, OH- und NH₂-Gruppen, aufweist. Derartige Oberflächen werden insbesondere dann erhalten, wenn die sternförmigen Präpolymere eine derartige Gruppe aufweisen oder wenn die reaktiven Gruppen R der sternförmigen Präpolymere bei der Vernetzung in eine derartige Gruppe umgewandelt werden, z.B. im Falle Iso(thio)cyanat-terminierter Präpolymere bei der Vernetzung mit Wasser. Die Funktionalisierung der Biomoleküle kann in an sich bekannter Weise erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bindet das Biomolekül an eine auf der Oberfläche kovalent gebundene Aktivatorverbindung. Bei dieser Art von Anbindung kann es sich um eine kovalente, ionische, koordinative oder affinitive Bindung, z.B. im Sinne einer Protein-Ligand oder einer Protein-Protein-Bindung handeln. In diesem Fall weist die Aktivatorverbindung neben der zur Anbindung an die Oberfläche notwendige(n) Gruppe(n) R' wenigstens eine funktionelle Gruppe oder wenigstens ein Bindungszentrum auf, dass eine Anbindung der funktionellen Gruppe bzw. des Bindungszentrums des zu immobilisierenden Biomoleküls aufweist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform handelt es sich um ein Bindungszentrum, das eine koordinative Bindung zum Biomolekül ausbilden kann, die über ein Übergangsmetallatom vermittelt wird. Insbesondere handelt es sich um Übergangsmetallatome der dritten Periode und speziell solche, die zweiwertige Ionen ausbilden können, wie in Kupfer(II), Nickl(II), Zink(II), Kobalt(II) und Eisen(II). Vorzugsweise binden derartige Aktivatorverbindungen das Metallion chelatisierend, d. h. die Aktivatorverbindungen weisen wenigstens 2, vorzugsweise wenigstens 3, z.B. 3, 4 oder 5 funktionelle Gruppen auf, die eine koordinative Bindung zu den oben genannten Metallionen ausbilden können. Die räumliche Anordnung der funktionellen Gruppen ist dabei vorzugsweise so gewählt, dass die Anbindung in Form eines Chelats über mehrere und insbesondere alle funktionellen Gruppen der Aktivatorverbindung erfolgt. Beispiele für geeignete Aktivatorverbindungen, welche Metallatome koordinativ zu binden vermögen und die gleichzeitig eine reaktive Gruppe R' aufweisen, umfassen beispielsweise aromatische Ortho-hydroxy-Aldehyde wie Salicylaldehyd, funktionalisierte Pyridin- und Chinolin-Verbindungen, wie 8-Hydroxychinolin, Dipicolylamin, N-2-Pyridylmethylaminoacetat, weiterhin Polycarbonsäuren mit vorzugsweise wenigstens 2, z.B. 2, 3, 4, 5 oder 3 Carboxylgruppen, insbesondere Verbindungen, die wenigstens 2, z.B. 2, 3, 4, 5 oder 6 Carbo xymethyl-Gruppen und gegebenenfalls eine weitere funktionelle Gruppe R' aufweisen, wie in Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und ihre Derivate, wie sie von Liu et al., Synthesis, 2002, 10, 1398, beschrieben werden, carboxymethylierte Asparaginsäure, N,N,N-Tris(carboxymethyl)ethylendiamin, N,N,N,N-Tetra(carboxymethyl)ethylendiamin (EDTA) und dergleichen, weiterhin ortho-Phosphoserin und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man ein Amino-funktionalisiertes Derivat einer Verbindung ein, die wenigstens zwei Carboxymethyl-Gruppen aufweist, insbesondere ein Amino-funktionalisiertes Derivat der Nitrilotriessigsäure wie Lysin-NTA (= 6-Amino-2-(N,N-bis(carboxymethyl)amino)-hexansäure). Die Aktivatorverbindungen, die mit Übergangsmetallionen Komplexe bilden können, können in komplexierter Form oder vorzugsweise in unkomplizierter Form auf die Oberfläche aufgebracht werden. Bei Einsatz unkomplexierter Verbindungen V wird man dann im Anschluss eine Komplexierung durch Spülen mit einer Metallionen-haltigen Lösung durchführen. Gegebenenfalls wird man im Anschluss an das Aufbringen der Verbindung V bzw. im Anschluss an das Komplexieren der an die Oberfläche gebundenen Verbindung V einen Waschschritt einführen, um überschüssige Verbindung V und/oder überschüssige Metallionen zu entfernen.

Im Falle von Carbonsäuren als Aktivatorverbindungen kann man diese auch in Carboxylgeschützter Form, d. h. als Ester einsetzen. Geeignete Schutzgruppen für Carboxylgruppen sind dem Fachmann aus der einschlägigen Literatur bekannt, wobei solche Gruppen bevorzugt werden, die sich unter Bedingungen abspalten lassen, die die Hydrogel-Schicht nicht beeinträchtigen oder gar zerstören. Beispiel hierfür ist die tert.-Butylgruppe, die sich thermisch, z. B. durch Erhitzen auf 150–220°C entfernen lässt.

Bei den zur Komplexierung eingesetzten Lösungen handelt es sich üblicherweise um wässrige Lösungen wasserlöslicher Salze der Metallionen, z.B. Lösungen der Chloride, Nitrate, Sulfate, Acetate etc. Die Konzentration der Metallionen in der Lösung liegt in der Regel im Bereich von 1 mM bis 1 M. Je nach Art des Liganden und der Natur des Metallions beträgt der pH-Wert der Lösung in der Regel 5 bis 12, insbesondere 6 bis 11. Die Lösungen können gegebenenfalls noch schwache Komplexbildner enthalten, z.B. Ammoniak, um die Löslichkeit der Metallionen bei höheren pH-Werten zu gewährleisten.

In einer anderen Ausgestaltung dieser Ausführungsform weisen die Aktivatorverbindungen neben der zur Anbindung an die Oberfläche erforderlichen reaktiven Gruppe R' eine Gruppe auf, die über wenigstens 2 und vorzugsweise über wenigstens 3 Wasserstoffbrücken-Bindungen an das Biomolekül binden kann. Derartige Gruppen sind beispielsweise Oligonukleotid-Gruppen mit wenigstens 2, vorzugsweise wenigstens 3, z.B. 3 bis 100 und insbesondere 3 bis 20 Nukleotidbasen aufweisen. An diese Gruppen können solche Biomoleküle binden, die eine hierzu komplementäre Oligonukleotid-Sequenz aufweisen, wobei der Anteil komplementärer Basen wenigstens 50% betragen sollte.

In einer weiteren Ausgestaltung dieser Ausführungsform setzt man als Aktivatorverbindungen solche Substanzen ein, die bekannterweise mit Biomolekülen eine affinitive Wechselwirkung eingehen. Beispiele für geeignete Aktivatorverbindungen dieses Typs sind Liganden, z.B. Haptene und Antikörper, die so funktionalisiert sind, d.h. eine Gruppe R' aufweisen, dass die mit der Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren können. Hierzu zählen auch chemische Verbindungen, die neben wenigstens einer reaktiven Gruppe R' eine weitere Molekülgruppe oder Aminosäure-Sequenz aufweisen, die mit dem Biomolekül im Sinne einer affinitiven Wechselwirkung, beispielsweise einer Protein-Ligand oder Protein-Protein-Wechselwirkung binden können. Beispiele hierfür sind Biotin-Derivate, die mit einer Gruppe R' modifiziert sind und somit einen Anker für Biomoleküle bilden, die ein Streptavidin- oder Avidin-Sequenz aufweisen, sowie Streptavidin-und Avidin-Derivate, die mit einer Gruppe R' modifiziert sind, so dass sie einen Anker für biotinylierte Biomoleküle darstellen.

In den Varianten 3 und 4 des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die in Schritt i bereitgestellten Oberflächen herstellungsbedingt eine Vielzahl reaktiver, typischerweise elektrophiler Gruppen R auf, die sich für eine Anbindung von Biomolekülen qualifizieren, ohne dass es einer Aktivierung bedarf. Beispiele hierfür sind insbesondere Isocyanat-Gruppen, die sich einerseits in einfacher Weise durch Einwirkung von Wasser vernetzen lassen, andererseits eine hohe Reaktivität gegenüber nucleophilen Gruppen, z.B. SH-, OH- und NH₂-Gruppen, aufweisen. Nach dem Koppeln der Biomoleküle auf die Oberfläche empfiehlt es sich, die überschüssigen reaktiven Gruppen R in der oben beschriebenen Weise zu deaktivieren. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Variante 3 wird zur Bereitstellung der organischen Oberflächenschicht eine Lösung eines oder mehrerer der sternförmigen Präpolymere, das als reaktive Gruppen FR Isocyanatgruppen aufweist, in der oben beschriebenen Weise auf den Träger aufgebracht und entweder durch Entfernen des Lösungsmittels zu einer festen Beschichtung getrocknet und/oder durch Einwirkung von Feuchtigkeit partiell vernetzt. Die so erhaltene Oberflächenschicht weist dann noch hinreichende Mengen an Isocyanatgruppen als Gruppen R auf, die eine Kopplung solcher Biomoleküle erlauben, die eine oder mehrere nucleophile Gruppen R', z.B. SH-, OH- und NH₂-Gruppen, aufweisen. Eine partielle Vernetzung gelingt in besonders einfacher Weise, indem man das Isocyanat-Gruppen aufweisende, sternförmige Präpolymer in einem wässrigen Lösungsmittel wie oben beschrieben auf den Träger aufbringt, das Lösungsmittel zumindest teilweise unter erhalt einer Beschichtung entfernt und unmittelbar im Anschluss daran, spätestens jedoch nach 2 h, vorzugsweise nicht später als 1 h, die Biomoleküle auf die so erhaltene Oberfläche in voneinander räumlich getrennten Bereichen auf die so generierte Oberfläche aufbringt. Hierbei kommt es zu einer Reaktion der Isocyanat-Gruppen mit den reaktiven Gruppen R' des Biomoleküls unter Ausbildung von Urethan/Harnstoffgruppen, wodurch die Biomoleküle auf der Oberfläche chemisch gebunden werden. Gegebenenfalls werden im Anschluss daran überschüssige Isocyanatgruppen durch Behandlung mit Wasser oder wässrigen Lösungen deaktiviert. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt.

Erfindungsgemäß weisen die Biomoleküle wenigstens eine zur Kopplung an die reaktiven Gruppen R der Oberfläche qualifizierter reaktive Gruppen R' auf. Diese Gruppe kann in dem eigentlichen Biomolekül vorliegen oder über einen Spacer mit dem Biomolekül verbunden sein, d.h. das Biomolekül wurde in an sich bekannter Weise funktionalisiert, so dass es eine oder mehrere reaktive Gruppen R' aufweist, die von dem eigentlichen Biomolekül über eine Molekülgruppe (Spacer) räumlich getrennt ist.

Als Spacer eignen sich beispielsweise homobifunktionelle Verbindungen, wie Diamine, Disäuren, z.B. Dicarbonsäuren, oder Ethylenglycol-Oligomere, bzw. heterobifunktionelle Verbindungen, wie Aminosäuren, z.B. β-Alanin, Glycin, 6-Aminocaprinsäure oder γ-Aminobuttersäure, Arylacetylene, Biotine, Avidine, Strepavidine, Oligosaccharide, z.B. aus Ribosen oder Desoxyribosen, Nukleinsäuren, vor allem oligo-(d)A oder -(d)T, Fettsäuren, Phosphorsäureester sowie Derivate und/oder Kombinationen davon.

Spacer können auch aus mehreren Teilen (Linkern) aufgebaut sein, die miteinander durch kovalente und/oder nichtkovalente Bindungen verknüpft sind. Beispiele für kovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind heterobifunktionelle Elemente, wie Aminosäuren, beispielsweise 6-Aminocapronsäure oder γ-Aminobuttersäure, von denen mehrere zur Verlängerung eines Spacers miteinander verbunden werden können. Beispiele für nichtkovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind Moleküle, zwischen denen sich Affinitätsbindungen ausbilden können, wie zwischen Biotin und Avidin bzw. Streptavidin oder deren Analoga.

Spacer können eine oder auch mehrere Bindungsstellen für Biomoleküle aufweisen (z.B. Dendrimere). Die vorstehend genannten heterobifunktionellen Elemente beispielsweise weisen in der Regel eine, zwei oder drei derartige Bindungsstelle auf, während Affinitätsbindungen ausbildende Moleküle, wie Avidin oder Streptavidin, mehrere Bindungsstellen aufweisen. Letzteres kann zu einer vorteilhaften Erhöhung immobilisierter Biomoleküle pro Flächeneinheit führen.

Spacer können auch variable Bindungstellen aufweisen, die in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Konfiguration unterschiedliche Bindungsmöglichkeiten bieten. Dies gilt insbesondere für Affinitätsbindungen, deren Bindungsaffinität je nach Konfiguration der beteiligten Bindungspartner variieren kann.

Bevorzugte Spacer basieren auf
Diaminen der Formel III -NH-(CHR¹)_n1-NH- (III)Aminosäuren der Formel IV -NH-(CHR¹)_n1-CO- (IV)Polyethylenglykolen der Formel V -(OCH₂CH₂)_n2- (V) Oligo-Zuckerphopshaten der Formel VI -(O-PO₂-O-5'-Zucker-3')_n1-O-PO₂- (VI)oder Kombinationen davon, insbesondere -NH-(CHR¹)_n1-NH-(OCH₂CH₂)_n2- (VII)wobei in den Formeln III bis VII n1 einem Wert von 1 bis 50 und insbesondere von 5–20 entspricht und n2 einem Wert von 2 bis 100 und vorzugsweise 5 bis 50 entspricht, R¹ die für α-C-Substituenten natürlich vorkommender Aminosäuren, insbesondere für Wasserstoff und C₁-C₄-Alkyl steht, wobei mehrere Reste R₁ gleich oder verschieden sein können (bei n1 ≠ 1) und der Zucker insbesondere Ribose und Desoxyribose, vorzugsweise in der D-Form, ist. In der Kombination entspricht n1 insbesondere einem Wert von 2 bis 6 und bevorzugt von 3 während n2 insbesondere einem Wert von 2 bis 20, bevorzugt 4 bis 10, z.B. 6, entspricht. Die funktionelle Gruppe R' ist dann an dem zum Biomolekül distalen Ende des Spacers angeordnet.

Die Anbindung von Spacern an Biomoleküle sind grundsätzlich bekannt. Kovalent angebundene Spacer, insbesondere über -O-, -NH- oder -S- angebundene Spacer, werden bevorzugt. Biomoleküle können dazu bestimmte Funktionalitäten vorgeben, sie können aber auch zweckmäßig modifiziert werden. Beispielsweise können Proteine über Amino-, Sulfid oder Carboxygruppen, und Nukleinsaüren über 5'- oder 3'-OH-Gruppen binden. Proteine können beispielsweise in an sich bekannter Weise reduktiv modifiziert werden, um Disulfidbrücken in freie Sulfidgruppen zu überführen, und Nukleinsäuren können beispielsweise mit bekannten und auch kommerziell erhältlichen Reagenzien umgesetzt werden, um terminale OH-Gruppen in Aminogruppen aufweisende Gruppen zu überführen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind Nukleinsäuren über ihr jeweiliges 5'-Ende an den Spacer gebunden. Vorteilhafterweise kann dies über Polyethylenglykol-Spacer erfolgen, insbesondere den Spacern der Formel VII.

Zum Aufbringen der Biomoleküle sind prinzipiell alle Techniken geeignet, die eine definierte und reproduzierbare Abgabe einer bestimmten Flüssigkeitsmenge erlauben. Beispielsweise können Techniken wie Pipettieren einschließlich Spotting-Techniken, Dis pensieren, Drucken, Stempeln einschließlich Mikrokontakt-Drucken (μCP-Technik), weiterhin die Wellpad-Technik, Technik mikrofluider Netzwerke (μFN) und kombinierte Methoden zur Anwendug kommen.

Verfahren hierzu sind aus dem Stand der Technik bekannt, z.B. aus US 5,512,131 , US 5,731,152 Kane et al., Biomaterials 1999, 20, S. 2363–2376; Bernard et al., Langmuir 1998, 14, S. 2225–2229; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, S. 8395 ff.; Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519–523; Martin et al., Langmuir 1998, 14, S. 3971–3975; Donzel et al., Adv. Mater. 2001, 13, S. 1164; (Stempeltechnik), Delamarche et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, S. 500–508 (μFN-Technik); Hyun et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6943–6944 (Wellpad-Technik); Inerowicz et al., Lanmuir 2002, 18, 5263-5268 (kombinierte WellpadμCP-Technik). Eine Übersicht über weitere geeignete Methoden, insbesondere Lithographiemethoden und Spotting-Techniken, die für die Herstellung von Arrays immobilisierter Biomoleküle geeignet sind, findet man auch in Cheng et al., Biochip Technology, Harvard Academic Publishers, 2001; in WO96/29629 (Micro-Drucktechnik), Anal. Chem. 1997, 69, S. 543–551, US 5,843,767 und US 5,837,860 . Geeignet sind auch kommerziell erhältliche Vorrichtungen wie Omnibrid^® von Genemachines Inc., San Carlos, CA, USA, und High-Throughput-Arrayer der Fa. Bioinstruments, Cambridge, Massachusets, USA.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Biomoleküle mittels einer Stempeltechnik, dem sogenannten μCP-Verfahren, auf die organische Oberflächenschicht aufgebracht. Eine Übersicht über derartige Verfahren findet man in Xia et al, Chem. Ref. 1999, 99, S. 1823–1848, angew. Chem. Int. ed. 1998, 37, S. 550–575. Eine Übersicht über die Anwendung der μCP-Technik für das Aufbringen von Biomolekülen findet man in Kane et al., Biomaterials 1999, 20, S. 2363–2376.

Bei der μCP-Technik wird ein Stempel, der eine Vielzahl von Erhebungen aufweist, mit einer Lösung des Biomoleküls, das immobilisiert werden soll, benetzt. Anschließend wird der Stempel auf die organische Oberflächenschicht aufgedrückt. Auf diese Weise erhält man ein Muster (Array) immobilisierter Biomoleküle auf der organischen Oberflächenschicht. Die Anordnung und Anzahl der Plätze immobilisierter Biomoleküle auf der organischen Oberflächenschicht entspricht dabei der Anordnung und Anzahl der Erhebungen auf der Stempelfläche.

In der Regel wird die Stempelfläche von einem elastischen Material gebildet, um eine möglichst optimale Übertragung der Biomoleküle auf die organische Oberflächenschicht zu gewährleisten. Geeignete Stempel sind z.B. aus den Publikationen von Xia et al. (s. o.), Bernard et al., Adv. Mater. 2000, 12, 1067–1070, und Kane et al. (s.o.) bekannt. Die Anzahl und Anordnung der Erhebungen richtet sich, wie oben gesagt, nach der Geometrie des Arrays. In der Regel sind die die Erhebungen säulenförmig mit einer kreisförmigen elipsoiden, rechteckigen oder streifenförmigen Stirnfläche. Bevorzugt sind kreisförmige oder elipsoide Geometrien. Im Falle säulenförmiger Erhebungen weisen die einzelnen Erhebungen im Mittel-Durchmesser im Bereich von 0,1 μm bis 100 μm auf. Der Durchmesser bezieht sich hier auf den doppelten Wert des mittleren Abstands der Begrenzungslinie der Stirnfläche zu ihrem Flächenmittelpunkt. Im Falle einer rechteckigen Anordnung entspricht der hier angegebene Durchmesser dann in Näherung dem Mittelwert der Diagonalen und Höhen der Stirnfläche. Die Höhe der Erhebungen ist von untergeordneter Bedeutung. Sie wird in der Regel jedoch einen Wert von 0,5 μm und insbesondere 1 μm nicht unterschreiten. In der Regel liegt sie im Bereich von 1 μm bis 500 μm, wobei aus Stabilitätsgründen in der Regel ein Verhältnis von Höhe der Erhebung h zu Durchmesser d von h/d ≤ 5 insbesondere ≤ 2 gewährleistet bleibt. Der Abstand zwischen den Erhebungen liegt in der Regel im Bereich von 0,1 μm bis 100 μm, insbesondere 1 bis 100 μm und speziell 5 bis 50 μm, abhängig von dem gewünschten Flächenmuster des Arrays. Entsprechende Abmessungen gelten auch für Stempelflächen mit streifen- bzw. bandförmigen Erhebungen.

Als Stempelmaterialien sind grundsätzlich elastische Materialien geeignet. In der Regel handelt es sich bei den Stempelmaterialien um Polydimethylsiloxan-artige Materialien, wie sie im Stand der Technik zu diesem Zweck bereits eingesetzt werden. Gelegentlich hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Stempelfläche zu hydrophilisieren, beispielsweise durch Behandlung mit Sauerstoffplasma wie von Donzel et al., in Adv. Mater. 2001, 13, S. 1164–1167 beschrieben.

Für eine saubere Übertragung der Biomoleküle auf die Oberfläche hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Stempelfläche nach Benetzen mit der Lösung des Biomoleküls zu trocknen. Weiterhin hat es sich als günstig erwiesen, wenn die Konzentration der Biomoleküle in der Lösung im Bereich von 1 mmol/ml bis 1 μmol/ml liegt.

Brauchbar sind weiterhin kontaktfreie Verfahren wie Piezodispenser und Druckpulsdispenser. Hier hat sich die Kontrolle von Temperatur und relativer Luftfeuchte zur Vermeidung von Satellitenspots als zweckmäßig erwiesen. Vor allem bei Kunststoffträgern ist die Erdung des Trägermaterials zur Ableitung von elektrostatischer Ladung sinnvoll.

Brauchbar sind auch kontaktierende Verfahren, wie Kapillardispenser, welche die Flüssigkeit mit einer dünnen Kapillare, beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1,5 bis 5 μm, auftragen, und die sogenannte Pin- und Ring-Technologie. Über die Polarität des zu dispensierenden Mediums kann ein optimaler Tropfenabriß gewährleistet werden, z.B. durch Zusatz von Salz oder Lösungsmitteln wie Ethanol oder 1-Propanol.

Die abgegebene Flüssigkeitsmenge ist von Bedeutung, da sie die Fläche, auf der die Biomoleküle immobilisiert werden, also insbesondere die Spotgröße bestimmt. In der Regel werden Flüssigkeitsmengen im Femto- bis Nanoliter-Bereich aufgebracht. So sind Spots mit einem Durchmesser von etwa 150 bis 200 μm mit einer kontaktfrei aufgebrachten Menge von etwa 10 nl bis 2 μl erhältlich. Spots mit Durchmessern im Bereich von 10 μm können erzeugt werden, indem man mittels Kapillardispensern Mengen von etwa 0,01 nl bis 0,1 μl aufbringt.

Nach dem Aufbringen der Biomoleküle läßt man in der Regel zunächst das Lösungsmittel verdampfen. Dies kann wegen relativ geringer Flüssigkeitsmengen normalerweise bei Raumtemperatur erfolgen, kann aber auch durch Wahl geeigneter höherer oder niedrigerer Temperaturen beeinflußt werden. Die Kopplungsreaktion erfolgt demgemäß im wesentlichen nicht in Lösung, wobei allerdings ein Restgehalt an Lösungsmittel von Vorteil sein kann.

Im Anschluß an das Aufbringen der Biomoleküle und die damit einhergehende Kopplung organische Oberfläche wird in der Regel ein Waschvorgang durchgeführt. Zweck dieses Waschvorgangs ist es insbesondere, nicht gekoppelte Biomoleküle zu entfernen. In Anlehnung an die zuvor zum Aufbringen der Biomoleküle verwendete Lösung werden zum Waschen ebenfalls wäßrige Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet. Prinzipiell gelten obige Ausführungen hier entsprechend.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wäscht man mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das ein Tensid, vorzugsweise ein nichtionisches Tensid, enthält. Besonders bevorzugt sind polyalkoxylierte, insbesondere polyethoxylierte Fettsäurester von Polyolen, insbesondere von Glycerin oder Sorbitol, beispielsweise die unter dem Handelsnamen Tween^® vertriebenen Sorbitanfettsäureester. Insbesondere hat sich die Verwendung von ethoxyliertem Sorbitanhexylaurat als zweckmäßig erwiesen.

Die Konzentration an Tensid in der Waschlösung wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß einerseits eine effektive Entfernung nicht gekoppelter Biomoleküle gewährleistet ist, andererseits die Waschlösung mit den immobilisierten Biomolekülen kompatibel ist. Konzentrationen im Bereich von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 0,05 Gew.-% bis 2 Gew.-% haben sich als zweckmäßig erwiesen.

Die Konzentration der Biomoleküle in der aufzubringenden Lösung ist variabel und richtet sich insbesondere nach der gewünschten Dichte und Molekulargewicht immobilisierter Biomoleküle. Konzentrationen im Bereich von 1 nmol/ml bis 1 μmol/ml können eingesetzt werden, wobei im unteren Konzentrationsbereich in bestimmten Fällen eine Absättigung der Oberfläche mit Biomolekülen nicht erreicht wird, während dies im oberen Konzentrationsbereich der Fall ist und überschüssige Biomoleküle, die aufgrund der Sättigung nicht gekoppelt haben, anschließend entfernt werden können. Konzentrationen oberhalb von wenigstens 10 nmol/ml und insbesondere wenigstens 20 nmol/ml haben sich zwecks Sättigung der Oberfläche bei zufriedenstellender Homogenität der immobilisierten Biomoleküle als zweckmäßig erwiesen.

Nach dem Waschen mit tensidhaltigem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch können sich weitere Waschschritte anschließen. Dazu kann es zweckmäßig sein, organische Lösungsmittel, insbesondere niedere Alkohole, beispielsweise Isopropanol, zu verwenden, die dann anschließend durch Spülen mit Wasser wieder entfernt werden können.

Schließlich trocknet man die Oberfläche unter üblichen Bedingungen, bequemerweise bei Umgebungstemperatur und gewünschtenfalls durch Trockenblasen durch Luft oder Inertgas.

Auf diese Weise werden Arrays erhalten die eine Vielzahl von Plätzen mit immobilisierten Biomolekülen aufweisen. Prinzipiell können auf einen Array pro cm² Trägeroberfläche mehr als 10, 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000, 400000 oder 1000000 definierte Plätze (Bereiche) angeordnet sein. In der Regel weisen erfindungsgemäße Arrays 5–10000 Plätze/mm² auf. Eine besondere Ausführungsform sind Arrays mit 5–100 Plätzen/mm² und insbesondere 10 bis 50 Plätzen/mm² (low density). Eine weitere besondere Ausführungsform sind Arrays mit 100–10000 Plätzen/mm² und insbesondere 500–2500 Plätzen/mm² (high density). An verschiedenen Plätzen können gleiche oder verschiedene Biomoleküle immobilisiert sein.

Die Plätze, an denen Biomoleküle immobilisiert sind, also insbesondere Felder immobilisierter Biomoleküle, können unterschiedliche Geometrien aufweisen. Prinzipiell kann die Form beliebig sein, z.B. kreisförmig, rechteckig, quadratisch oder elliptisch. Die Fläche beträgt vorzugsweise weniger als 1 mm², insbesondere weniger als 10000 μm², und ganz besonders bevorzugt weniger als 1000 μm².

Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind Biomoleküle als Spots immobilisiert, d.h. als im wesentlichen kreisförmige Felder. Derartige Spots haben vorzugsweise Durchmesser in einem Bereich von 1 μm bis 1000 μm, insbesondere 2 μm bis 50 μm oder 50 μm bis 500 μm. Insbesondere Spots mit Durchmessern unterhalb von 200 μm und vor allem unterhalb von 50 μm oder 20 μm lassen sich mit der oben beschriebenen μCP-Technik vorteilhaft verwirklichen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Arrays handelt es sich bei den Biomolekülen um Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide mit einer Länge von 2 bis 500 Basen. In der Regel sind die immobilisierten Oligonukleotide in der Lage, an eine Target-Nukleinsäure zu binden. In diesem Sinne werden die immobilisierten Oligonukleotide auch als Sonden bezeichnet.

Die Sonden sind in der Regel einzelsträngige Oligomere. DNA, RNA sowie Nukleinsäure-Analoga und -Derivate, wie, gegebenenfalls modifizierte, PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA können verwendet werden. Die Mindestlänge der Sonden hängt ab von der Komplexität der Probe, insbesondere der Anzahl der Basen nachzuweisender Nukleinsäuren, aber auch von der Art des als Sonde verwendeten Nuklein säuretyps und der erreichbaren thermodynamische Stabilität zwischen Probe und Sonde.

In Abhängigkeit vom Nukleinsäuretyp weisen Sonden üblicherweise ein Länge von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA-LNA Hybride, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für PSNA, von 6 bis 30, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für LNA, und von 6 bis 18, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für PNA auf.

Bei relativ geringer Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. Amplifikaten, insbesondere PCR-Amplifikaten, Viren, Plasmiden und Mikroorganismen, insbesondere für Anwendungen wie den Nachweis von Mutationen, SNPs oder Methylierungen (Epigenetics), sind relativ kurze Sonden, etwa im Bereich von 8–25meren und insbesondere 8–15meren, zweckmäßig. Bei relativ hoher Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. nichtamplifizierter RNA; über cDNA gesamtamplifizierter RNA, nichtamplifizierter gesamtgenomischer DNA und amplifizierter gesamtgenomischer DNA, insbesondere für Anwendungen wie Genexpressions-Bestimmungen oder den Nachweis genomischer Amplifikationen bzw. Deletionen, sind längere Sonden, etwa im Bereich von 16–60meren und insbesondere 25–50meren für synthetische Sonden, zweckmäßig oder die Sonden bestehen aus PCR-Produkten, cDNA, Plasmiden oder DNA aus lysierten Bakterien, die auch eine darüber hinaus gehende Basenanzahl aufweisen können.

Die Basenabfolge der Sonden richtet sich vornehmlich nach ihrer Funktion. Eine Testsonde weist in der Regel eine Basenabfolge auf, die zu einer bestimmten Targetsequenz einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist oder einem anderen Aspekt zufolge mit der Targetsequenz spezifisch hybridisieren kann. Eine Kontrollsonde kann insbesondere die Funktion einer Normalisierungs-, Mismatch-, Housekeeping-, Probenzubereitungs-, Hybridisierungs- oder Amplifikationskontrolle haben und dementsprechend eine Basenabfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer Referenz-Nukleinsäure, einer nachzuweisenden Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge, einer konstitutiv exprimierten Nukleinsäure, z.B. einer vom β₂-Mikroglobulin, β-Aktin-, GAPDH-, PBGD-, Ubiquitin-, Tubulin- oder Transferrin-Rezeptor-Gen abgeleiteten Nukleinsäure, einer speziesspezifischen Nukleinsäure bzw. eines Amplifikats.

Sind die immobilisierten Biomoleküle gemäß obiger besonderer Ausführungsform mit einer Markierung versehen, so kann sich nun eine Qualitätskontrolle des Arrays anschließen. Dazu kann der Array mit einem der Markierung entsprechenden Detektionssystem vermessen werden. Über die gemessene Menge an immobilisierter Markierung lassen sich insbesondere die Kopplungseffizienz und damit die Immobilisierung der Biomoleküle in Bezug auf Fläche, Homogenität und Dichte beurteilen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemäßer Arrays für analytische und insbesondere diagnostische Zwecke.

Beispielhaft seien folgende Anwendungen genannt:
Diagnostik, Therapiewahl und Therapiekontrolle von Tumor- und Stoffwechselerkrankungen; Untersuchung der genetischen Prädisposition (SNPs), insbesondere die Detektion von Mutationen, auch im forensichen Bereich; Nachweis von Promotormethylierungen (Epigenetics); Genexpressionskontrolle; Sequenzierung, insbesondere Sequenzierung durch Hybridisierung; Mikrobiologische Anwendungen wie in Bakteriologie und Virologie, beispielsweise zur Differenzierung verschiedener Stämme; ELISA-Anwendungen mit immobilisierten Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren und Liganden in der klinischen Chemie bis hin zur Lebensmittelchemie und Umweltanalytik; Allergiediagnostik mit immobilisierten Allergene; High Throughput Screening von Substanzbibliotheken; Toxicogenomics.

Prinzipiell eignen sich erfindungsgemäße Arrays sowohl für nichtkompetitive als auch für kompetitive analytische Verfahren (Assays).

Bei nichtkompetitiven Assays tritt die zu analysierende Substanz (Analyt) mit den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung. In der Regel wird der Analyt zuvor markiert, möglich ist aber auch eine Markierung, nachdem der Analyt bereits mit den immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung getreten ist, z.B. mittels Primer Extension oder Rolling-Cycle-PCR. In diesen Fällen erhält man ein Meßsignal, das um so größer ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Es ist auch möglich, daß durch die Wechselwirkung der Probe mit den auf der Oberfläche immobilisierten Substanzen die Fluoreszenz der immobilisierten Substanzen verändert wird (Abschwächung, Verstärkung, z.B. Mole cular Beacons) oder die Aktivität eines Enzyms verändert wird und diese Änderung als Meßsignal registriert wird. Beispiele für nichtkompetitive Assays sind Hybridisierungsreaktionen von PCR-Produkten oder markierter DNA/RNA an auf der Oberfläche immobilisierte Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide oder cDNA, sowie Sandwichimmunoassays.

Bei kompetitiven Verfahren wird der Probe eine markierte Substanz (Marker) zugesetzt, die ähnliche Bindungseigenschaften zu den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen hat wie der Analyt selbst. Es findet eine Konkurrenzreaktion zwischen Analyt und Marker um die begrenzte Anzahl von Bindungsplätzen auf der Oberfläche statt. Man erhält ein Signal, das um so niedriger ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Beispiele für kompetivie Assays sind Immunoassays (ELISA) und Rezeptorassays).

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.

1: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines fluoreszenz-markierten Nucleotid-Arrays mit Spots im Abstand von 20 μm und einem Spotdurchmesser von 5 μm.

2a: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Arrays mit streifenförmigen Bereichen eines immobilisierten Biotin-Streptavidin-Systems mit Fluoreszenzmarker, wobei die Streifen eine Breite von 5 μm und einen Abstand von 10 μm zwischen den Streifen aufweisen.

2b: Intensitätsverteilung der Fluoreszenz des Arrays aus 2a entlang einer Linie senkrecht zu den Streifen.

3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Arrays mit punktförmigen Bereichen eines immobilisierten Green-Fluoreszend-Proteins

I. Herstellungsbeispiele: Sechsarmige Isocyanat-terminierte Polyether.
Als Isocyanat diente in allen Fällen ein handelsübliches Isophorondiisocyanat (IP-DI: 72% cis- und 28% trans-Isomer)
Bei den eingesetzten Präpolymervorstufen handelt es sich um handelsübliche 6-armige Polyalkylenether (im Folgenden Polyole), die durch anionische ringöffnende Polymerisation aus Ethylenoxid und/oder Propylenoxid unter Verwendung von Sorbitol als Initiator hergestellt wurden. Das eingesetzte Polyol wurde vor Einsatz auf einen Restwassergehalt von weniger als 350 ppm getrocknet. Reste des für die Herstellung der Polyole eingesetzten Alkalihydroxids wurden durch Neutralisieren mit Phosphorsäure gebunden.
Das Polyol wurde in allen Herstellungsbeispielen über eine Pumpe langsam zugegeben (ca. 80 ml/h), so dass die Reaktionstemperatur nicht mehr als 10 K von der angegebene Temperatur abwich.
Die Bestimmung des Molekulargewichts (angegeben ist jeweils das Zahlenmittel) erfolgte durch Gelpermeationschromatographie bei Raumtemperatur an drei in Reihe geschalteten Säulen (Säule 1: Waters μ-Styragel 1000 Angström, l = 30 cm; Säule 2: Waters μ-Styragel 100 Angström, l = 30 cm; Säule 3: PSS SDV 50 Angström, l = 60 cm) unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Eluenten, einen Refraktometrie-Detektor (Waters RI 2410) und unter Verwendung der Auswertungssoftware PSS Win-GPC V 4.02. Die Elutionsdiagramme wurden zur Auswertung an zwei Gausskurven angepasst, wobei über die Flächenverhältnisse der Anteil an Bi-/Trimer bestimmt wurde.
Die Charakterisierung der Endgruppen funktionalisierter Präpolymere sowie die Funktionalisierungsausbeute erfolgte, wo angegeben, zudem elementaranalytisch (Schwefel, Stickstoff), mittels IR-Spektroskopie (v SH, C=O, NH) oder mittels Titration (nicht umgesetzte OH-Gruppen).
Die Bestimmung der nicht umgesetzten OH-Gruppen erfolgte durch Umsetzung der Präpolymere mit Acetanhydrid in Pyridin und Titration überschüssiger Säure (Hydrolyse des nicht umgesetzten Acetanhydrids) mit NaOH.
Herstellungsbeispiel 1:
Das verwendete sternförmige Polyetherpolyol ist ein 6-armiges statistisches Poly(ethylen/propylenoxid) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem Molekulargewicht von 3100 g/mol. Vor der Umsetzung gab man 0,05 Gew.-% Phosphor säure zu dem Polyol und erwärmte unter Rühren 1 h auf 80°C im Vakuum. Das verwendete Isophorondiisocyanat (IPDI) wurde vor Benutzung im Vakuum destilliert (95°C/0,01 mbar)
In einem Reaktor legte man 125 ml (0,59 mol) vor und erwärmte unter Schutzgas-Atmosphäre auf 50°C. Danach gab man unter heftigem Rühren das getrocknete und entgaste Polyol (20 g, 6,45 mmol) mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe langsam zu (ca. 80 ml/h). Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50°C für weitere 60 Stunden gerührt. Überschüssiges IPDI wurde bei 100°C und einem Druck von 0,001 mbar mit Hilfe einer Dünnschichtdestillationsapparatur vollständig abdestilliert. Man erhält auf diese Weise ein sternförmiges 6-Arm-Präpolymer, das an den Enden seiner Polymerarme Isocyanatgruppen aufweist.
Herstellungsbeispiel 2:
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden 30 g (2,5 mmol) eines 6-armigen, statistischen Poly(ethylenoxid/propylenoxids) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 12000 mit 48 ml (0,23 Mol) IPDI umgesetzt. Nach Dünnschichtdestillation (100°C/0,001 mbar) erhielt man das Isocyanat-terminierte Stern-Präpolymer. Der Anteil höherer Oligomere beträgt weniger als 1 Gew.-%.
Herstellungsbeispiel 3:
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden 20g (1,11 mmol) ein 6-armiges, statistisches Poly(ethylenoxid/propylenoxids) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 18000 mit IPDI (42 ml, 0,2 mol) umgesetzt. Nach Dünnschichtdestillation (100 °C/0,001 mbar) erhielt man das Isocyanatterminierte Stern-Präpolymer.
II. Aminofunktionalisierung des Trägers:
Die Substratoberflächen (Glasplättchen, Mikroskopieträger oder Siliziumträger) wurden zunächst vorbehandelt. Hierzu wurden die durch Wasser und Aceton vor gereinigten Substrate in einer Plasmaanlage des Typs TePla 100-E der Firma Plasma Systeme 2 Minuten im Sauerstoffplasma behandelt (Druck: 1 mbar, 50W) und anschließend mit Wasser und Aceton nachgewaschen. Alternativ können die vorgereinigten Substrate auch unter einer 40 w UV-Lampe mit Wellenlänge von 185 nm für 10 min mit Sauerstoff behandelt (Abstand zwischen Substratoberfläche und Lichtquelle 2 mm), und anschließend mit Wasser und Aceton nachgewaschen werden.
Zur Vorbehandlung können die Substrate auch ohne Vorreinigung 1 h bei 60°C in einer Mischung aus konzentriertem wässrigem Ammoniak, Wasserstoffperoxid (25 Gew.-%ig) und Wasser in einem Volumenverhältnis 1:1:5 gelagert werden. Danach wurden sie mehrmals mit Wasser abgespült. Die so behandelten Substrate wurden anschließend in entsalztem Wasser aufbewahrt.
Zur Aminofunktionalisierung wurden die vorbehandelten Substrate mit einer Aminosilian-Monolage beschichtet. Hierzu wurde die aus dem Wasser entnommene und mit Stickstoff trockengeblasene Probe in eine Glovebox transferiert. Dort wurden die Substrate in einer 0,5%igen (v/v) Lösung von N-(3-(Trimethoxysilyl)propyl)-ethylendiamin bzw. (3-Aminopropyl)-Trimethoxylsilane in trockenem Toluol 16 h gelagert, anschließend mit Toluol gründlich gewaschen und vor Benutzung unter Stickstoffatmosphäre in der Glovebox mittels eines gefilterten Stickstoffstroms getrocknet.
III. Beschichtung des Trägers
Alle Maßnahmen erfolgten unter staubfreien Bedingungen (Reinraumbedingungen).
Beispiel 1:

a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 3 wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Glasträger, hergestellt nach II in diese Lösung getaucht und mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/sec senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche herausgezogen. Auf diese weise erhielt man eine nahezu monomolekulare Beschichtung des Glasträgers mit dem Präpolymeren, die herstellungsbedingt an ihrer Oberfläche Isocyanatgruppen aufweist.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519–523 mit einer Fläche von 15 mm × 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde in einer Lösung von Lysin in PBS-Puffer (100 nmol/ml) 1 h gelagert. Der so behandelte Stempel wurde mit PBS-Puffer nachgewaschen und im Argonstrom getrocknet. Der so vorbereitete Stempel wurde 2 min mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so behandelte, beschichtete Träger 16 h in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Anschließend wusch man mit PBS-Puffer nach und untersuchte die Oberfläche mikroskopisch. Auf diese Weise erhält man ein nahezu fehlerfreies Abbild des Stempelmusters auf der Oberfläche.

Bei Zelladhäsionsexperimente mit GFP-Actin 3T3 Fibroblasten (chicken) und MC3T3-E1 Osteoblasten (chicken) wurde keine unselektive Adhäsion von Zellen auf der in b) erhaltenen Oberfläche beobachtet.
Beispiele 2 bis 6: Herstellung von Nucleotid-Arrays
Für die folgenden Experimente der Beispiele 2 bis 6 wurden folgenden Oligonucleotid-Lösungen hergestellt.

G1: Lösung von 3'-aminoterminiertem-5'-fluoreszenzmarkiertem Oligonucleotid (Fa. Molecular Probes) in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl
G2: Lösung von 3'-aminoterminiertem-Oligonucleotid (Fa. Molecular Probes) in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl.
G3: Lösung von 5'-fluoreszenzmarkiertem Oligonucleotid (Gegenstrang zu dem in G2 verwendeten Oligonucleotid; Fa. Molecular Probes) in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl.

Beispiel 2:

a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträger, hergestellt nach II, mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde. Danach war die Beschichtung trocken.
b) Auf die so hergestellte Beschichtung wurden mittels Mikropipette 2 Spots á 1 μl der Lösung G1 und 2 Spots á 1 μl der Lösung G2 aufgebracht. Der mittlere Durchmesser der Spots betrug etwa 200 μm. Der so erhaltene Array wurde anschließend über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Dann wurde die Beschichtung mit PBS (pH 7,5) gewaschen und in einer Mischung von 10 μl G3, 10 μl Tween20 mit 10 ml doppeltem PBS bei 4°C über Nacht gelagert, und anschließend mit doppeltem PBS gewaschen.

Die Substrate wurde anschließend mit einem Fluoreszenzscanner vermessen. Es wurde die Intensität der Fluoreszenz der jeweiligen Spots G1 und G2 bestimmt. Als Referenz dienten die G2-Spots vor Hybridisierung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Beispiele 3 bis 5:
Analog Beispiel 2 wurden die Arrays der Beispiele 3 bis 5 hergestellt, wobei man in den Beispielen die folgenden Präpolymerlösungen einsetzte:

Beispiel 3: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Tetrahydrofuran/Wasser 1:1 (v/v).
Beispiel 4: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 1 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran.
Beispiel 5: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Tetrahydrofuran/Wasser 1:1 (v/v).

Tabelle 2: Intensität der Fluoreszenz nach Hybridisierung mit G3 (LAU/mm²)
Beispiel 6:

a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 2 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträger, hergestellt nach II, mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519–523, mit einer Fläche von 15 mm × 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde gemäß der Vorschrift von Donzel et al., Adv. Mater. 2001, 13, 1164, im Sauerstoffplasma hydrophil modifiziert. Dieser Stempel wurde mit der Lösung G1 benetzt und getrocknet. Der so behandelte Stempel wurde 2 min mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so behandelte, beschichtete Träger 16 h in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Überschüssiges Nucleotid wurde anschließend durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt. Auf diese Weise erhält man ein nahezu fehlerfreies Abbild des Stempelmusters auf der Oberfläche, wie in 1 gezeigt.

Beispiel 7: Array mit streifenförmigen Bereichen eines Biotin-Streptavidin-Systems

a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 2 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträger, hergestellt nach II., mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde. Das so beschichtete Substrat wurde dann über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt, wobei man eine Oberfläche mit NH₂-Gruppen erhielt.
b) Analog Beispiel 6 b) wurde ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel mit einer Fläche von 15 mm × 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von streifenförmigen Erhebungen (Breite 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 10 μm) mit einer Lösung von Biotinamidocapronsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester (Molecular Probes) in Dimethylformamid (10 μg/ml) benetzt und anschließend getrocknet. Der so erhaltene Stempel wurde 2 min. mit der in a) hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde die so erhaltene Beschichtung zum Entfernen von nicht-gebundenem Ester nacheinander mit Dimethylformamid und Wasser gewaschen und im Argonstrom getrocknet. Auf diese Weise erhielt man ein Array mit streifenförmigen Bereichen immobilisiertem Biotius.
c) Das in b) hergestellte Biotin-Array wurde 4 h in einer Lösung von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin (Molecular Probes) im PBS-Puffer (0,04 mg/ml) gelagert. Anschließend wurde der Array mit PBS-Puffer nachgewaschen, im Argonstrom getrocknet und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse sind in den 2 a) und 2 b) dargestellt. Sie zeigen, dass sich die Biotin-Streptavidin-Komplexe in Streifenform auf der Oberfläche der Arrays bilden und belegen die Immobilisierung, dass Biotin in streifenförmigen Bereichen immobilisiert ist und seine Funktion/Bindungsfähigkeit nicht verloren hat.

Beispiel 8: Herstellung eines Protein-Arrays über Komplexbildung

a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in einer Mischung aus Tetrahydrofuran und Wasser (1:9 v/v) gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Glasträger, hergestellt nach I, in diese Lösung getaucht und mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/sec senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche herausgezogen. Auf diese weise erhielt man eine nahezu monomolekulare Beschichtung des Glasträgers mit dem Präpolymeren, die herstellungsbedingt an ihrer Oberfläche Isocyanatgruppen aufweist.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519–523, mit einer Fläche von 15 mm × 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde mit einer Lösung von Lysino-NTA-tert-Butylester, hergestellt nach Jürgen Groll, Diplomarbeit der Universität Ulm, 2001, in Toluol (20 mg/ml) benetzt und anschließend getrocknet. Der so erhaltene Stempel wurde 15 min. mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so erhaltende Träger über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt und mit Toluol gewaschen. Der erhaltene Träger wurde 10 min. bei 200°C unter Vakuum (0,02 mbar) gelagert und nach dem Abkühlen für 5 min. in eine Lösung von NiCl₂ in Wasser (5 mg/ml) getaucht und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde der so behandelte Träger in eine Lösung eines mit His-Tags versehenen Green-Fluorescent-Proteins in PBS-Puffer (0,03 mg/ml) für 10 min. eingetaucht und anschließend mit PBS-Puffer gewaschen. Der erhaltene Array wurde fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Man erhielt das in der 3 gezeigte Muster.

Claims

Array immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflächenschicht gekoppelt sind, die im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, wobei die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind.
Array nach Anspruch 1, wobei das sternförmige Präpolymer im Mittel 6 bis 8 Polymerarme A aufweist.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 2000 bis 100000 g/mol aufweist.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme A des sternförmigen Präpolymeren ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20000 g/mol aufweisen.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme A ausgewählt sind unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylenoxid/Polypropylenoxid-Copolymeren.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberflächenschicht im trockenen Zustand eine Dicke von wenigstens 10 nm aufweist.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Biomoleküle über eine funktionelle Gruppe, ausgewählt unter Amid-Gruppen, Iminogruppen, Urethangruppen, Harnstoffgruppen, Thiourethan-Gruppen, Thioharnstoffgruppen, Estergruppen, Sulfoethylgruppen und gegebenenfalls über einen Spacer mit der organischen Oberflächenschicht verknüpft sind.
Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberflächenschicht auf einem Träger angeordnet ist.
Array nach Anspruch nach 8, worin der Träger ausgewählt ist unter Glas, Kunststoff, Keramik, Metall und Halbmetall.
Vorrichtung auf Basis wenigstens eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Form eines Chips, Microfluid-Vorrichtung oder Dipsticks.
Verfahren zur Herstellung eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: i. Bereitstellung einer organischen Oberflächenschicht auf der Oberfläche eines Trägers, wobei die Oberflächenschicht im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und auf ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist und ii. Immobilisieren von Biomolekülen in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche der Oberflächenschicht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei man die organische Oberflächenschicht, welche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist, bereitstellt, indem man i.a. eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR tragen, auf eine Oberfläche eines Trägers aufbringt, i.b. anschließend Durchführen einer Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander durchführt; i.c. gegebenenfalls die reaktiven funktionellen Gruppen FR in funktionelle Gruppen R umwandelt.
Verfahren zur Herstellung eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: i. Bereitstellung einer organischen Oberflächenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflächenschicht erhält, die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist, ii. Immobilisieren von Biomolekülen in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche, und iii. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die funktionelle Gruppe FR eine Isocyanat-Gruppe ist und die Vernetzung durch Wasser und/oder Ammoniak bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Oberfläche des Trägers in einer Weise vorbehandelt wurde, dass sie eine erhöhte Anzahl funktioneller Gruppen FR' aufweist, die mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren.
Verwendung eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Vorrichtung nach Anspruch 10 für diagnostisch/analytische Zwecke.