EP1646672A1 - Arrays immobilisierter biomoleküle auf hydrogel-bildenden oberflächen, deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

Arrays immobilisierter biomoleküle auf hydrogel-bildenden oberflächen, deren herstellung und deren verwendung

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Publication number
EP1646672A1
EP1646672A1 EP04740781A EP04740781A EP1646672A1 EP 1646672 A1 EP1646672 A1 EP 1646672A1 EP 04740781 A EP04740781 A EP 04740781A EP 04740781 A EP04740781 A EP 04740781A EP 1646672 A1 EP1646672 A1 EP 1646672A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
groups
biomolecules
star
surface layer
prepolymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04740781A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haitao Rong
Stefano Levi
Jürgen GROLL
Thomas Ameringer
Claudia Mourran
Martin Möller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Sustech GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sustech GmbH and Co KG filed Critical Sustech GmbH and Co KG
Publication of EP1646672A1 publication Critical patent/EP1646672A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/08—Processes
    • C08G18/10—Prepolymer processes involving reaction of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen in a first reaction step
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/40—High-molecular-weight compounds
    • C08G18/48—Polyethers
    • C08G18/4833—Polyethers containing oxyethylene units
    • C08G18/4837—Polyethers containing oxyethylene units and other oxyalkylene units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Definitions

  • the present invention relates to arrays of immobilized biomolecules on hydrogel-forming surfaces, their production and use.
  • the present invention also relates to devices based on the arrays, in particular chips, microfluid devices and dipsticks.
  • a typical example of a so-called "high density array” is the GeneChip from Affymetrix, an oligonucleotide array with typically over 400 different capture samples that are built up base by base on the glass wafer.
  • the chips are characterized by a very high information density of up to 40,000 oligonucleotides / cm 2.
  • the individual "spots" are rectangular.
  • Low density arrays are available, for example, from Genometrix.
  • a maximum of 250 spots with a diameter of 50 ⁇ m are printed with a capillary pin bundle of up to 1000 individual capillaries into the cavities of a 96-well microtiter plate.
  • Conventional techniques are used for coupling to the surface, which are based in particular on amino silanizations and NHS-activated haptens, epoxy-activated surfaces, carbodiimide couplings on carboxyl groups and biotin / streptavidin bonds (cf. WO 97/18226; EP 0910570 A1; WO 98/29736).
  • the quality of these biochips is not sufficient for satisfactory use, especially in medical diagnostics. There are several reasons for this.
  • a central problem is the unspecific adsorption of biomolecules, especially proteins and cells on surfaces. This leads to the fact that contact with the analyte can cause non-specific coverage of the surface of the array or biochip with proteins and cell material, which leads to a reduction in the selectivity towards the target and ultimately to destruction of the biochip / array.
  • proteins and antibodies there is also the problem that they can lose their activity due to non-specific interaction with the substrate surface and, in the worst case, denature.
  • surfaces are required which, on the one hand, allow a targeted connection of the biomolecules and, on the other hand, have an extremely low tendency towards non-specific binding of such molecules.
  • Arrays are known from WO 02/059372 which have a large number of hydrogel cells on a support surface which have an immobilized binding site for proteins.
  • No. 6,174,683 describes the production of biochips which have covalently bound biomolecules, in which a biomolecule is derivatized with a hydrogel-forming prepolymer based on polyurethane in solution, the polymerization of the derivatized prepolymer is triggered in the solution and the solution of the polymerizing prepolymer is microspotted. Techniques on the surface of a suitable support. The biochips produced in this way have a better lifespan, but are comparatively complex to manufacture and unsatisfactory in terms of non-specific interactions with proteins.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a suitable surface for the production of an array which is distinguished by a low tendency towards the non-specific interaction of biomolecules and which on the other hand allows selective coupling of biomolecules.
  • these surfaces are characterized by a particularly low affinity for non-specific binding of biomolecules.
  • these surfaces have a large number of functional groups R, which can react either directly or after activation with the functional groups R 'usually present in biomolecules, such as NH 2 , OH or SH, with the formation of bonds, so that there is a covalent bond between the Biomolecules come to the surface, whereby an immobilization of the biomolecules on the surface is achieved.
  • the activation of the biomolecules in a manner known per se can be used, ie the introduction of functional groups R 'into the biomolecules which react with the functional groups R on the surface to form bonds.
  • Another alternative is the covalent attachment of substances that a biomolecule can bind via a coordinative or affinitive bond, ie for which the biomolecule has one or more binding sites.
  • substances are also referred to below as adhesion promoters or coupling agents.
  • the present invention thus relates to arrays of immobilized biomolecules which are coupled to an organic surface layer which is essentially composed of crosslinked star-shaped prepolymers P, the prepolymers P having on average at least 4 polymer arms A which are water-soluble in themselves.
  • the present invention also relates to a method for producing such an array, comprising:
  • an organic surface layer on the surface of a carrier the surface layer being essentially composed of cross-linked star-shaped prepolymers which on average have at least 4 polymer arms A, which are water-soluble in and of themselves, and have a multiplicity of functional groups R on their surface, and ii. Immobilize the biomolecules in several spatially separated areas on the surface of the surface layer.
  • the immobilization of the biomolecules is usually carried out by applying the biomolecules which either have a functional group R 'which react with the functional groups R of the surface to form bonds, or by applying biomolecules which have a binding site for a covalently bonded to the surface Have binding partners (adhesion promoters).
  • the biomolecules are applied to the already crosslinked surface layer.
  • the biomolecules are applied during or before the crosslinking of the prepolymers forming the surface layer. If an adhesion promoter is used to attach the biomolecules, this can also be applied to the already cross-linked surface layer or before or during the cross-linking of the surface layer.
  • the arrays produced are distinguished by an extraordinarily low tendency to absorb non-specific proteins. This is probably due to the fact that the surface layer swells with water, ie forms a hydrogel.
  • the surface layer has a large number of functional groups in high surface density on its surface, which can be used for the immobilization of the biomolecules. Due to the structure of the layer, this surface layer is also extremely stable against aging and mechanical stress.
  • the biomolecules are also covalently bonded to the surface or by means of a covalently bonded adhesion promoter and are therefore not washed off.
  • the arrays are therefore very robust and have high long-term stability.
  • the arrays can be encapsulated and / or automatically Integrate analyzers.
  • biomolecules immobilized as a spot have a uniform coating, ie they are homogeneous. Good discrimination rates are achieved for oligonucleotide arrays and a high dynamic range is made available for hybridization experiments. Intra and interarray variations are small. This enables the use of the arrays in the diagnostic / analytical area. Proteins, including antibodies and enzymes, do not lose their activity when coupled to the surface layer. A preferred embodiment of the invention therefore relates to arrays of immobilized proteins, including antibodies and enzymes.
  • array denotes an arrangement of defined places, in particular a local assignment of certain substances to defined places, different places being able to be assigned the same or different substances.
  • a defined place corresponds to a certain area, the value of which is advantageously less than an intra-assay variance 15%, preferably less than 7% or an interassay variance of advantageously less than 20%, preferably less than 15% and in particular less than 10%, is subject to when comparing two areas with one another assigned a substance type, although it is also conceivable to assign mixtures of two or more types of substance to a location.
  • Two-dimensional arrays are preferred.
  • the locations advantageously form a regular two-dimensional pattern of fields. Within an array, each type of substance or each type of substance mixture e in field or multiple fields.
  • biochip here designates an array of biomolecules that are immobilized on a solid support, ie bound in a localized manner.
  • the binding can be based on covalent, ionic, coordinative or affinitive interactions, for example protein-ligand or protein-protein interactions, or on Mixed forms of the aforementioned interactions are based.
  • biomolecules denotes any biochemical and biological substances, both as individual molecules and as several interacting molecules. Examples include: • nucleic acids, in particular oligonucleic acids, for example single and / or double-stranded, linear, branched or circular DNA, cDNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), PSNA (phosphothioate nucleic acid); • Antibodies, in particular human, animal, polyclonal, monoclonal, recombinant, antibody fragments, for example Fab, Fab ', F (ab) 2 , synthetic;
  • Proteins e.g. Allergens, inhibitors, receptors;
  • Enzymes e.g. Peroxidases, alkaline phosphatases, glucose oxidase, nucleases;
  • haptens e.g. Pesticides, hormones, amino acids, antibiotics, pharmaceuticals, dyes, synthetic receptors, receptor ligands.
  • biomolecule defines the ability of a substance to be able to interact with a biological sample or a part thereof, in particular the analyte.
  • a certain type of biomolecule can be called a ligand.
  • Ligands interact with and in particular bind - preferably specifically - to certain targets.
  • Reactive groups R in the sense of this invention are those which react with nucleophiles in an addition reaction including a Michael reaction or in a substitution reaction, e.g. B. isocyanate groups, (meth) acrylic groups, vinylsulfone groups, oxirane groups, oxazoline groups, aldehyde groups, carboxylic acid groups, carboxylic acid ester and carboxylic anhydride groups, carboxylic acid and sulfonic acid halide groups, but also the complementary, nucleophile-reacting groups such as alcoholic OH groups, primary and secondary amino groups, thiol groups and the like.
  • active ester groups of the formula -C (O) OX in which X is pentafluorophenyl, pyrrolidin-2,5-dione-1-yl, benzo-1,2,3-triazol-1-yl or one, are particularly preferred as examples of carboxylic ester groups
  • Reactive groups in the sense of the invention are also nucleophilic groups which react with the aforementioned electophilic groups to form bonds, eg. B. NH 2 , SH, or OH, but especially NH 2 . It goes without saying that a surface according to the invention either has predominantly electrophilic groups or nicleophilic groups, and in the case of NCO / NH 2 both groups can also be present side by side.
  • vinyl sulfone Complementary group R vinyl sulfone Complementary group
  • C C double bonds
  • R reactive groups
  • C C double bonds
  • acrylic groups also vinyl ether and vinyl ester groups
  • activated C C double bonds
  • N N double bonds
  • allyl groups in the sense of an en reaction or with conjugated diolefin Groups react in the sense of a Diels-Alder reaction.
  • Examples of groups which can react with allyl groups in the sense of an en reaction or with dienes in the sense of a Diels-Alder reaction are maleic acid and fumaric acid groups, maleic acid ester and fumaric acid ester groups, cinnamic acid ester groups, propiolic acid (ester) groups, Maleic acid amide and fumaric acid amide groups, maleimide groups, azodicarboxylic acid ester groups and 1, 3,4-triazoline-2,5-dione groups.
  • the surface of the organic surface layer has functional groups which are accessible to an addition or substitution reaction by nucleophiles.
  • Preferred groups R are isocyanate, isothiocyanate, active esters, NHS esters, aldehyde groups, acrylic and methacrylic groups, so that the biomolecules are bound to the surface via one of the following functional groups, selected from amide groups, urethane groups, imino groups, urea groups, thio urethane groups, ester groups, thiourea groups or sulfoethyl groups and optionally via a spacer.
  • a particularly preferred embodiment relates to arrays in which the surface layers have reactive isocyanate groups as R groups. These are deactivated prior to the use according to the invention after the coupling of the biomolecules by treatment with water to form amino groups.
  • the surface has a large number of nucleophilic groups, in particular NH 2 groups.
  • Star-shaped polymers are understood to mean those polymers which have a plurality of polymer chains bonded to a low-molecular central unit, the low-molecular central unit generally having 4 to 100 skeletal atoms, such as C atoms, N atoms or O atoms. Accordingly, the star-shaped polymers used according to the invention can be described by the following general formula I:
  • n is an integer with a value of at least 4, e.g. B. 4 to 12, in particular 5 to 12 and especially 6 to 8;
  • Z stands for a low molecular weight n-valent organic radical as central unit, which generally has 4 to 100, preferably 5 to 50 framework atoms, in particular 6 to 30 framework atoms.
  • the central unit can have both aliphatic and aromatic groups. It stands for example for one of at least 4-valent alcohol, e.g. B. a 4- to 12-valent, preferably an at least 5-valent, especially a 6- to 8-valent alcohol, e.g. B.
  • pentaerythritol dipentaerythritol, a sugar alcohol such as erythritol, xylitol, mannitol, sorbitol, maltitol, isomaltulose, isomaltitol, trehalulose, or the like derived residue;
  • A is a hydrophilic polymer chain which as such is water soluble
  • B is a chemical bond or a divalent, low molecular weight organic radical with preferably 1 to 20, in particular 2 to 10, carbon atoms, for example one C 2 -C 10 alkylene group, a phenylene or a naphthylene group or a C 5 - C 10 cycloalkylene group, where the phenylene, naphthylene and the cycloalkylene group additionally one or more, for. B. 1, 2, 3, 4, 5, or 6 substituents, e.g. B. alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups with 1 to 4 carbon atoms or halogen have granules; and
  • FR is a reactive group which can react with a complementary reactive functional group FR "or with itself to form bonds.
  • Possible reactive groups FR and complementary reactive groups FR 1 are the functional groups mentioned in connection with the groups R or R 'in Table 1.
  • the groups FR are isocyanate groups.
  • the star-shaped prepolymers have on average at least 4, preferably at least 5 and in particular at least 6 polymer arms, but often not more than 16, in particular not more than 12 and especially not more than 10 polymer arms.
  • the star-shaped prepolymers particularly preferably have 6 to 8 polymer arms A.
  • the number average molecular weight of the polymer arms is generally in the range from 200 to 20,000 daltons, preferably in the range from 300 to 10,000 daltons, in particular in the range from 400 to 8000 daltons and especially in the range from 500 to 5000 daltons.
  • the star-shaped prepolymer has a number average molecular weight in the range of at least 1500 daltons, preferably 2000 to 100000 daltons, in particular 2500 to 50,000 daltons and especially 3000 to 30,000 daltons.
  • the molecular weight of the star-shaped polymers can be determined in a manner known per se by means of gel permeation chromatography, in which case commercially available columns, detectors and evaluation software can be used. If the number of end groups per polymer molecule is known, the molecular weight can also be determined by titration of the end groups FR, in the case of isocyanate groups, for. B. by reaction with a defined amount of a secondary amine such as dibutylamine and subsequent titration of the excess amine with acid.
  • a secondary amine such as dibutylamine
  • the hydrogel-forming properties of the surface layer are guaranteed by the water solubility of the polymer arms A. They are usually guaranteed when the molecular structure, ie at least the type of repeat units, preferably also the molecular weight of the polymer arm, corresponds to a polymer whose solubility in water is at least 1% by weight and preferably at least 5% by weight (at 25 ° C. and 1 bar) ,
  • polymers with sufficient water solubility examples include poly-C 2 -C - alkylene oxides, polyoxazolines, polyvinylalcohols, homo- and copolymers containing at least 50 wt .-% N-vinylpyrrolidone in copolymerized form, homo- and copolymers containing at least 30 weight % Copolymerized hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, acrylamide, methacrylamide, acrylic acid and / or methacrylic acid, hydroxylated polydienes and the like.
  • the polymer arms A are preferably derived from poly-C 2 -C 4 -alkylene oxides and are selected in particular from polyethylene oxide, polypropylene oxide and polyethylene oxide / polypropylene oxide copolymers, which may have a block or a statistical arrangement of the repeating units.
  • Star-shaped prepolymers whose polymer arms A are derived from polyethylene oxides or from polyethylene oxide / polypropylene oxide copolymers with a propylene oxide content of not more than 50% are particularly preferred.
  • the prepolymers used according to the invention are e.g. T. known, e.g. B. from WO 98/20060, US 6,162,862, Götz et al., Macromol. Mater. Closely. 2002, 287, p. 223, Bartelink et al. J. Polymer Science 2000, 38, p. 2555, DE 10216639.0 and DE 10203937 (polyether star polymers), Chujo Y. et al., Polym. J.
  • the star-shaped prepolymers used in accordance with the invention are generally produced by functionalizing suitable star-shaped prepolymer precursors which already have the prepolymer structure described above, ie at least 4 water-soluble polymer arms, and which each have a functional group FR "at the ends of the polymer arms, which can be converted into one of the aforementioned reactive groups FR.
  • prepolymer precursors are known from the prior art, for. B. from US 3,865,806, US 5,872,086, US 6,162,862, Polym. J. 1992, 24 (11), 1301-1306, WO 01/55360 and commercially available, e.g. B. in the case of star-shaped poly-C 2 -C 4 -alkylene oxides under the trade names VORANOL®, TERRALOX®, SYNALOX® and DOWFAX® from Dow-Chemical Corporation, SORBETH® from Glyco-Chemicals Inc. and GLUCAM® from Amerchol Corp. or can be prepared by known methods in polymer chemistry by polymerizing suitable monomers in the presence of polyfunctional initiators, e.g. B.
  • the star-shaped prepolymer precursors can in principle be functionalized in analogy to known functionalization processes of the prior art.
  • those prepolymer precursors which have A OH groups at the ends of the polymer arms A are particularly suitable as starting materials.
  • the conversion of OH groups into amino groups can e.g. B. in analogy to that of Skarzewski, J. et al. Monatsh. Chem. 1983, 114, 1071-1077 method described.
  • the OH groups in a conventional manner, (z. B. by Organikum, 15th ed., VEB, Berlin 1981 S. 241ff .; J. March, Advanced Organic Synthesis 3rd ed. S. 382 ff.
  • a halogenating agent such as thionyl chloride, sulfuryl chloride, thionyl bromide, phosphorus tribromide, phosphorus oxychloride, oxalyl chloride and the like, optionally in the presence of an auxiliary base such as pyridine or triethylamine, in the corresponding halide, or with methanesulfonyl chloride in the corresponding mesylate transferred.
  • the halogen compound or the mesylate thus obtained is then converted into the corresponding azide using an alkali metal azide, preferably in an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone.
  • an alkali metal azide preferably in an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone.
  • the azide is then with Hydrogen is converted into the amino compound in the presence of a transition metal catalyst or with a complex hydride such as lithium aluminum hydride.
  • prepolymers which carry oxirane groups at the ends of the polymer arms A can be achieved, for example, by reacting prepolymer precursors which have A OH groups at the ends of the polymer arms with glycidyl chloride.
  • Prepolymers which carry A (meth) acrylic groups at the ends of the polymer arms can be produced, for example, by esterifying prepolymer precursors which carry A OH groups at the ends of the polymer arms with acrylic acid or methacrylic acid or by reacting the OH- Groups with acrylic chloride or with methacrylic chloride, or with the anhydrides of acrylic acid or methacrylic acid in analogy to known processes.
  • prepolymer precursors which carry A NH 2 groups at the ends of the polymer arms the NH 2 groups can be reacted with acrylic acid or methacrylic acid, with their anhydrides or with their acid chlorides.
  • the preparation of (meth) acrylate-terminated prepolymers can e.g. B. in analogy to that of Cruise et al. Biomaterials 1998, 19, 1287-1294 and Han et al. Macromolecules 1997, 30, 6077-6083 for the modification of polyether diols and triols described methods take place.
  • Prepolymers which carry thiol groups at the ends of polymer arms A can be prepared, for example, by reacting prepolymer precursors which carry halogen atoms at the ends of polymer arms A with thioacetic acid and subsequent hydrolysis in analogy to that in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Ed. E. Müller, 4th ed., Vol. 9, p. 749, G. Thieme, Stuttgart 1955.
  • aromatic diisocyanates such as toluene-2,4-diisocyanate, toluene-2,6-diisocyanate, commercially available mixture of toluene-2,4- and -2,6-diisocyanate (TDI), m-phenylene diisocyanate, 3, 3 'diphenyl-4,4' -biphenylendiisocyanat, 4,4'- biphenylene diisocyanate, biphenylene diisocyanate 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, 3,3 'dichloro-4,4'-, cumene-2,4-diisocyanate, 1, 5-naphthalene diisocyanate, p-xylylene diisocyanate, p-phenylene diisocyanate, 4-methoxy-1 , 3-phenylene diisocyanate, 4-chloro-1,3-phenylene diisocyanate, 4-bromo-1,
  • diisocyanates whose isocyanate groups differ in their reactivity, such as toluene-2,4-diisocyanate, toluene-2,6-diisocyanate, and a mixture of toluene-2,4- and -2,6-diisocyanate and ice and trans-isophorone.
  • Star-shaped prepolymers with aliphatic diisocyanate groups are particularly preferred, in particular those obtained by adding IPDI to the chain ends of OH-group-terminated star-shaped prepolymer precursors.
  • the star-shaped prepolymers are naturally reacted with the diisocyanate in such a way that a diisocyanate unit is added to each chain end of the star molecules, the second isocyanate group of the diisocyanate remaining free.
  • each end group of the star molecules is provided with a free isocyanate group via a urethane linkage.
  • Methods for this are e.g. from US 5,808,131, WO 98/20060 and US 6,162,862, Bartelink CF et al., J. Polymer Science 2000, 38, 2555-2565 and Götz et al., Macromolecular Materials and Engineering, 2002, 287, 223-230 ,
  • the prepolymer precursor for avoiding the formation of multimeric adducts, ie adducts in which two or more prepolymers are linked to one another via diisocyanate units is added to an excess of the diisocyanate for this purpose.
  • the excess is at least 10 mol%, based on the Stoichiometry of the reaction, ie at least 1, 1 mol, preferably a little. at least 2 moles and in particular at least 5 moles of diisocyanate and especially at least 10 moles of diisocyanate per mole of functional group in the prepolymer precursor.
  • the reaction is preferably carried out under controlled reaction conditions, ie the addition of the prepolymer precursor takes place under the reaction conditions so slowly that heating of the reactor contents by more than 20 K is avoided.
  • the prepolymer precursor is preferably reacted with the diisocyanate in the absence of a solvent or diluent.
  • the reaction can take place in the absence or in the presence of small amounts of conventional catalysts which promote the formation of urethanes.
  • Suitable catalysts are, for example, tertiary amines such as diazabicyclooctane (DABCO) and organotin compounds, e.g. B. dialkyltin (IV) salts of aliphatic carboxylic acids such as dibutyltin dilaurate and dibutyltin dioctoate.
  • the amount of catalyst is usually not more than 0.5 wt .-%, based on the prepolymer precursor, for. B. 0.01 to 0.5 wt .-%, in particular 0.02 to 0.3 wt .-%. In a preferred procedure, no catalyst is used.
  • the required reaction temperatures naturally depend on the reactivity of the prepolymer precursor used, the diisocyanate, and if used on the type and amount of the catalyst used. It is generally in the range from 20 to 100 ° C. and in particular in the range from 35 to 80 ° C. It goes without saying that the reaction of the prepolymer precursor with the diisocyanate takes place in the absence of moisture ( ⁇ 2000 ppm, preferably ⁇ 500 ppm).
  • the reaction mixture thus obtained is generally worked up by distilling off the excess diisocyanate, preferably under reduced pressure.
  • the reaction products obtained predominantly contain the star-shaped prepolymer which has isocyanate groups at the ends of the polymer arms.
  • the proportion of the star-shaped prepolymer is generally at least 70% by weight, preferably at least 80% by weight, of the reaction product.
  • the remaining constituents of the reaction product are essentially dimers and, to a small extent, trimers, which in these quantities are also suitable for producing the coatings according to the invention. 1 b
  • the organic surface layer is usually arranged on the surface of a carrier.
  • the provision of the organic surface essentially composed of crosslinked star-shaped prepolymers P therefore usually comprises the deposition of the star-shaped prepolymers P on the surface of the support and subsequent crosslinking of the reactive groups FR of the prepolymers P.
  • the steps of deposition and crosslinking can, if desired, be carried out repeatedly become. This leads to thicker layers.
  • the method of depositing the star-shaped prepolymers P comprises the following steps: i.a. Deposition of the star-shaped prepolymer P on the surface of a support by applying a solution of at least one star-shaped prepolymer, which on average has at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and carry a reactive functional group FR at their free ends, on which Surface of the support; i.b. subsequently carrying out a linking reaction of the reactive groups FR with one another and removing the solvent; and i.e. optionally activating the functional groups R on the surface of the surface layer.
  • step i.a. a surface layer is obtained which is composed of uncrosslinked prepolymers and which has a large number of functional groups FR on its surface.
  • a linking reaction of the reactive groups FR to one another is carried out in this surface layer, the linking reaction being able to take place after the application and removal of the solvent by subsequently treating the surface layer with a crosslinking agent or when removing the solvent.
  • biomolecules can be applied before, during or after the linking-crosslinking reaction of the prepolymers. This results in 4 variants of the method according to the invention, which are explained in more detail below.
  • the biomolecules will be applied to an already completely cross-linked surface layer.
  • the functional groups R of the surface layer are activated before the application of the biomolecules by treatment with a suitable compound in order to have sufficient activity towards the functional groups FR 'of the biomolecules or an affinity for them to reach the binding sites of the biomolecules.
  • any excess FR, ie groups not occupied by biomolecules will then be deactivated again, in the case of NCO groups or isothiocyanate groups by treatment with water or steam.
  • the method according to the invention comprises:
  • an organic surface layer on a support which is essentially composed of non-crosslinked star-shaped prepolymers which on average have at least 4 polymer arms A, which are in themselves water-soluble and which have reactive groups FR at their ends, one surface layer being obtained Has a large number of functional groups FR; ii. Applying biomolecules which have functional groups FR ', which react with the functional groups FR of the surface to form bonds, in several spatially separated areas on the surface, and iii. Performing a crosslinking reaction;
  • an organic surface layer on a support which is essentially composed of non-crosslinked star-shaped prepolymers which on average have at least 4 polymer arms A, which are in themselves water-soluble and which have reactive groups FR at their ends, one surface layer being obtained Has a large number of functional groups FR;
  • an activator substance or an adhesion promoter
  • which has functional groups FR ' which react with the functional groups FR of the surface to form bonds on the surface, iii.
  • steps ii and iii or ii and iv can be carried out simultaneously or in a narrow temporal connection, ie step ii can be carried out while the networking in step iii or. iv. takes place.
  • star-shaped prepolymer P is usually applied as a solution to the surface of the carrier. Accordingly, these process variants naturally also include the removal of the solvent. The removal can take place before or during the crosslinking reaction, but always before applying the activator substance and before applying the biomolecules.
  • the crosslinking is generally carried out by reacting the reactive groups FR of the prepolymers, which are arranged at the free ends of the water-soluble polymer arms A, with one another or with complementary-reactive groups FR 'with the formation of bonds.
  • the complementary-reactive groups FR ' can be located either at the ends of the water-soluble arms A of star-shaped prepolymers or in different crosslinking substances (crosslinkers).
  • Examples of deposition processes are the immersion of the surface to be coated in the solution of the prepolymer as well as the spin coating - the solution of the prepolymer is applied to the surface to be coated rotating at high speed. It goes without saying that for the production of ultra-thin coatings, the coating measures are usually carried out under dust-free conditions.
  • the substrates are immersed in a solution of the star polymer in a suitable solvent and then the solution is run off, so that a thin liquid film with a thickness that is as uniform as possible remains on the substrate. This is then dried. The resulting film thickness depends on the concentration of the star polymer solution.
  • the networking is then triggered.
  • the initially non-rotating substrate is generally completely wetted with the solution of the star-shaped prepolymer.
  • the substrate to be coated is rotated at high speeds, usually at least 50 rpm, often at least 500 rpm, for example 500 to 30,000 rpm, preferably above 1000 rpm, e.g. B. 1000 to 10000 U / min, and particularly preferably 3000 to 6000 U / min, set in rotation, wherein the solution is largely spun off and a thin coating film remains on the surface of the substrate.
  • networking is also triggered here.
  • the concentration is usually at least 0.001 mg / ml, preferably at least 0.01 mg / ml, in particular at least 0.1 mg / ml, particularly preferably at least 1 mg / ml.
  • the concentration of the prepolymer in the solution will generally not exceed 500 mg / ml, preferably 250 mg / ml and in particular 100 mg / ml.
  • the thickness of the coating can of course be controlled via the concentration.
  • this will generally have a layer thickness in the dry state ( ⁇ 10% water) of at least 2 nm, preferably at least 5 nm and in particular at least 10 nm (measured by means of ellipsometry according to that in Guide to using WVASE 32 TM, JA Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998).
  • a layer thickness in the dry state ( ⁇ 10% water) of at least 2 nm, preferably at least 5 nm and in particular at least 10 nm (measured by means of ellipsometry according to that in Guide to using WVASE 32 TM, JA Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998).
  • coating thicknesses in the dry state ( ⁇ 10% water) of in particular 500 ⁇ m and especially 100 ⁇ m will not be exceeded in order not to impair the function of the biochips.
  • Advantageous layer thicknesses are in particular in the range from 10 nm to 50 ⁇ m (dry).
  • solvents which have no or only a low reactivity towards the functional groups FR of the prepolymer to be dissolved are suitable for the preparation of the solutions of the prepolymers P.
  • those are preferred which have a high vapor pressure and are therefore easy to remove.
  • Such solvents are therefore preferably have a boiling point below 150 ° C and preferably below 120 C C at atmospheric pressure.
  • suitable solvents are aprotic solvents, e.g. B.
  • ethers such as tetrahydrofuran (THF), dioxane, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, aromatic hydrocarbons such as xylenes and toluene, acetonitrile, propionitrile and mixtures of these solvents.
  • protic solvents such as water or alcohols, e.g. B. methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol and tert-butanol, and mixtures thereof with aprotic solvents.
  • the prepolymers can be crosslinked in different ways.
  • the prepolymers can be reacted with a crosslinking agent.
  • all compounds with 2 or more functional groups FR ' are suitable as crosslinking agents. net, which react with the functional groups FR of the prepolymer to form bonds.
  • the organic surface is provided by a method in which the linking of the reactive groups FR is triggered by adding a compound V1 which has at least two reactive groups FR 'per molecule which are in contact with the reactive groups FR of the star-shaped prepolymer reacts to form bonds.
  • the polyfunctional compounds V1 can be low molecular weight compounds, e.g. B. aliphatic or cycloaliphatic diols, triols and tetraols, e.g. B. ethylene glycol, butanediol, diethylene glycol, triethylene glycol, trimethylolpropane, pentaerythritol and the like, aliphatic or cycloaliphatic diamines, triamines or tetramines, eg. B.
  • the low molecular weight polyfunctional compounds generally have a molecular weight of ⁇ 500 g / mol.
  • the polyfunctional compound V1 can already be contained in the solution of the prepolymer which is used in the process according to the invention. Then react in the initially created surface layer of largely uncrosslinked prepolymers, e.g. B. when drying or heating the layer, the reactive groups FR 'of the crosslinking agent with the reactive groups FR of the prepolymer and in this way form a layer of crosslinked prepolymers, which as a rule still have a large number of functional groups FR and / or FR' has on their surface.
  • the compound V1 will accordingly have at least two dienophilic groups and vice versa. If the prepolymers have reactive groups which undergo an en reaction, the compound V1 will have at least two allylic double bonds. As a rule, in such systems for the production of the coatings, solutions are used which contain both the prepolymer and the compounds. gen V1 included. The crosslinking then takes place when the coating obtained primarily is dried, if appropriate after heating.
  • prepolymers are also suitable as polyfunctional compounds V1 which have at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and have a reactive functional group FR 'at their free ends, which react with the reactive groups FR of the prepolymer to form bonds.
  • solutions of at least two different prepolymers can also be used according to the invention, in which one prepolymer has reactive groups FR and the other reactive groups FR 'complementary thereto. In this way too, a layer of crosslinked prepolymers is obtained, which generally still has a large number of functional groups FR and / or FR 'on its surface.
  • the linking of the reactive groups R is triggered by adding a sufficient amount of a compound V2 which reacts with a part of the reactive groups FR to form reactive groups FR ', which then reacts with the remaining reactive groups FR below React bond formation.
  • crosslinking can be triggered, for example, by treating the coated article with water, e.g. B. by storage in a damp atmosphere or under water.
  • some of the isocyanate groups react to form amino groups, which in turn react with the remaining isocyanate groups to form bonds, forming a layer of crosslinked prepolymers.
  • the crosslinking agent V2 is therefore water here. Coatings produced in this way, when freshly produced, still have free isocyanate groups. In the event of prolonged exposure to moisture, the isocyanate groups arranged on the surface are converted into amino groups.
  • solutions of the prepolymer in water or in a mixture of water with one or more water-miscible solvents are used.
  • suitable water-miscible solvents are, in particular, those which do not react with the isocyanate groups or react very slowly than water.
  • Examples include cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane, and also N-alkylamides such as N-methylpyrrolidone, dimethylformamide and dimethylacetamide.
  • the mixing ratio of water and solvent is generally in the range from 1: 100 to 100: 1, preferably in the range from 50: 1 to 1:10 and especially in the range 20: 1 to 1: 1.
  • This variant is particularly suitable for the production of thicker layers.
  • the concentration of prepolymer is then preferably in the range from 0.1 to 500 mg / ml, in particular in the range from 0.5 to 200 mg / ml and especially in the range from 1 to 100 mg / ml.
  • a solution of a star-shaped prepolymer for example as a monolayer, is first applied to the surface to be coated in the manner described above, if necessary a partial crosslinking of the reactive groups FR is carried out and then at least one further star-shaped prepolymer 2 is applied to the so applied surface, which has at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and have at their free ends a reactive functional group FR ', which have a complementary to the reactive groups R of the first prepolymer reactivity. If necessary, the remaining reactive groups FR 'are then crosslinked again. This process can be repeated one or more times. In this way it is possible to produce multilayer coatings in a targeted manner.
  • the layer-by-layer method can be implemented in a particularly elegant manner with those prepolymers which have reactive groups FR which react with compounds V2 to form reactive groups R 'which have a reactivity that is complementary to the groups FR.
  • groups FR are isocyanate groups.
  • the connection V2 is water.
  • NH 2 groups then form as complementarily reactive groups FR '. If the crosslinking of the first layer with the compound V2 is triggered, the coating obtained has free groups FR '(for example amino groups) on its surface. These then react with the groups FR (for example isocyanate groups) of the prepolymers applied in a second coating process to form bonds
  • the surface layers can also contain water-soluble polysaccharides, such as hyaluronates, heparins, alginates or z. B. contain dextrans.
  • Such coatings are produced by depositing the prepolymer and water-soluble polysaccharide on the surface to be finished.
  • prepolymers with functional groups R reactive toward OH functions, e.g. B. isocyanate groups then the polysaccharide acts as a crosslinker. Polysaccharide and prepolymer then together form the hydrogel-forming organic surface layer.
  • the weight ratio of polysaccharide to star shaped prepolymer in the coating will generally not exceed a value of 1: 1 and is, for example, in the range from 1: 1000 to 1: 1 and especially in the range from 1: 100 to 1: 2.
  • the surfaces of inert materials will often be chemically activated before the actual finishing.
  • This can be done, for example, by treating the surface to be coated with acid or alkali, by oxidation (flaming), by electron radiation or by plasma treatment with an oxygen-containing plasma, as described by P. Chevallier et al. J. Phys. Chem. B 2001, 105 (50), 12490-12497; in JP 09302118 A2; in DE 10011275; or by D. Klee, et al. Adv. Polym. Be. 1999, 149, 1-57.
  • the surface can also be activated by means of plasma treatment with a plasma containing NH 3 , as described in US Pat. Nos. 6,017,577, 6,040,058 and 6,080,488.
  • the surface of the support can also be treated with compounds which, on the one hand, have a known good adhesion to the surface and which, moreover, have functional groups FR 'which are complementary to the functional groups FR of the star-shaped prepolymer.
  • Such connections are also referred to below as adhesion promoters.
  • Suitable groups FR ' depending on the reactive group FR of the prepolymer: isocyanate, aldehyde, amino, hydroxyl, mercapto and epoxy groups, furthermore groups which react in the sense of a Michael addition, dienophilic groups, the Diels-Alder Enter addition reactions, electron-deficient double bonds, which react with allylic double bonds in a Diels-Alder addition or ene reaction; activated ester groups; oxazoline; as well as vinyl groups, specifically enter into a free radical addition.
  • trialkoxyaminoal- kylsilanes such as triethoxyaminopropylsilane and N [(3-triethoxysilyl) propyl] ethylenediamine
  • trialkoxyalkyl-3-glycidyl ether silanes such as triethoxypropyl-3-glycidyl ether silane
  • trialkoxyalkyl mercaptane such as triethoxypropyl mercaptane methanekylsiloxane triloxysiloxane triloxysilane triloxysiloxane
  • - (meth) acrylamidoalkanes such as 1-triethoxysilyl-3-acryloxypropane.
  • Polyoxidic polyammonium groups are also suitable as adhesion-promoting groups for oxidic materials and plastic materials.
  • Examples of such compounds are polyammonium compounds with free primary amine groups, such as those used for. B. by J. Scheerder, JFJ Engbersen, and DN Reinhoudt, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1996, 115 (6), 307-320, and von Decher, Science 1997, 277, 1232-1237 for this purpose, furthermore polylysine and polyethyleneimine.
  • the adhesion promoters are preferably applied as a monolayer to the surface to be equipped. Such monolayers can be achieved in a manner known per se by treating the surfaces to be coated with dilute solutions of the compounds, for. B. according to the immersion process described above or by means of spin coating. Solvents and concentrations correspond to the information given for the application of the prepolymers. It is often advisable to carry out the surface treatment with the abovementioned adhesion promoters following activation by flame, by electron radiation or by plasma treatment.
  • Carriers in the sense of the invention are generally materials with a rigid or semi-rigid surface and in this sense can be described as solid. Planar surfaces are common. In certain cases, however, it can be advantageous to use profiled beams. Elevations and depressions, such as steps, grooves, channels, notches, for example V-notches or mesa structures, are possible. These structures can be arranged on the surface in such a way that they appropriately influence the immobilization of the biomolecules. Channels can be used to carry liquid. At least parts of the surface of such carriers correspond to the specifications according to the invention.
  • the carrier materials are generally not subject to any restrictions.
  • suitable surface materials are oxidic surfaces, e.g. B. silicates such as glass, quartz, silicon dioxide such as in silica gels, or ceramics, further semimetals such as silicon, semiconductor materials, metals and metal alloys such as steel, polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polymethylpentene, polypropylene, polyester, fluoropolymers (e.g. Teflon®), polyamides, polyurethanes, poly (meth) acrylates, blends and composites of the aforementioned materials.
  • the surface of the carrier on which the organic surface layer is to be provided has a low roughness.
  • the R a value which is characteristic of the roughness is advantageously not more than 100 nm and in particular not more than 50 nm.
  • a carrier can be varied and depends primarily on the type of use of the carrier to be described. For example, it can be slides, microtiter plates, tubes, chips, dipsticks, stamps, caps, particles, strands, in particular fiber bundles, spherical bodies, such as spheres or spheres, precipitation products, membranes, gels, sheets, containers, capillaries, disks, foils or Trade records. Wafer formats can also serve as carriers, which can be separated if desired. The carriers can also be provided with further useful components, for example chips can be encapsulated. According to a particular embodiment, a body, in particular in the form of a dip stick, is closed with a closure means, e.g.
  • the body is preferably in the form of a stick, at one end of which the closure means and at the other end of which the biomolecules are expediently immobilized. At least part of the surface of the body thus complies with the requirements of the invention.
  • the body can be formed from the polymer based on polycycloolefin or a suitable composite material with corresponding surface parts.
  • a plurality of dipsticks can also be connected to one another - also in accordance with the embodiment explained above.
  • the surface of the carrier available for the coupling can have customary dimensions, e.g. B. 0.5 to 50 cm 2 , in particular 1 cm 2 to 25 cm 2 .
  • a typical dimension is 20 mm x 70 mm or 26 mm x 76 mm or intermediate formats, half formats etc.
  • the biomolecules are immobilized on the organic surface layer in a manner known per se by binding, ie coupling the biomolecules to that on the The surface of this layer contains reactive functional groups R.
  • the connection can be made both to a surface layer which has not yet been crosslinked and to an already crosslinked surface layer.
  • the surface has a large number of the groups FR composed of the star-shaped prepolymer.
  • these are isocyanate groups.
  • the groups R can be converted into functional groups R2 which react with the functional groups of the biomolecule to form bonds, for example in epoxy groups, in isocyanate groups, in active esters, in NHS esters, in Michael systems such as acrylic amide -Groups, vinyl sulfone groups, acrylic ester groups or maleimide groups or in aldehydes.
  • This is achieved, for example, by applying activator compounds which, in addition to a suitable functional group R 'which reacts with the functional groups R of the surface to form bonds, have a further functional group R2 which has the reactivity required for binding the biomolecule.
  • the activator compound can be applied in a manner which leads to a more or less uniform activation of the entire surface.
  • an organic surface is obtained which, in a uniformly distributed manner, has a large number of reactive groups R2 which are suitable for forming bonds with the reactive groups R 'of the biomolecules.
  • the activator compound can also be applied only in those areas (places) in which the biomolecules are to be coupled to the array. In this way a surface is obtained which has a multiplicity of regions in which the surface carries reactive groups R2, whereas the surface outside these regions carries no or essentially no groups R2. ,__O
  • activator compounds is particularly useful when the surface provided has a large number of nucleophilic groups of comparatively low reactivity, for example SH, OH and NH 2 groups.
  • Such surfaces are obtained in particular when the star-shaped prepolymers have such a group or when the reactive groups R of the star-shaped prepolymers are converted into such a group during crosslinking, for example in the case of isocyanate-terminated prepolymers when crosslinked with water (see above).
  • deactivating compounds for example low-molecular nucleophilic compounds such as water, alcohols, ammonia, primary amines or dilute alkali.
  • the deactivation is usually carried out by washing the surface with the deactivating compound or a solution of the deactivating compound in an inert solvent. Excess biomolecules that are not coupled to the surface are also removed.
  • the biomolecules are functionalized with suitable reactive groups R3, which react with the reactive groups R of the surface to form bonds.
  • the groups R3 are then usually electrophilic functional groups which form a bond with the nucleophilic groups R on the surface.
  • Suitable groups R3 are selected, for example, from active ester groups, N-hydroxysuccinimide ester groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, (meth) acrylic groups and vinylsulfone groups. This procedure is particularly useful when the surface provided has a large number of nucleophilic groups R, for example SH, OH and NH 2 groups.
  • Such surfaces are obtained in particular when the star-shaped prepolymers have such a group or when the reactive groups R of the star-shaped prepolymers are converted into such a group during crosslinking, for example in the case of iso (thio) cyanate-terminated prepolymers when crosslinked with water ,
  • the biomolecules can be functionalized in a manner known per se.
  • the biomolecule binds to an activator compound covalently bound on the surface.
  • This type of connection can be a covalent, ionic, coordinative or affinitive bond, for example in the sense of a protein ligand or a protein-protein bond.
  • the activator compound in addition to the ⁇ ) group (s) R 'necessary for binding to the surface, has at least one functional group or at least one binding group Center that has a connection of the functional group or the binding center of the biomolecule to be immobilized.
  • it is a binding center that can form a coordinative bond to the biomolecule, which is mediated via a transition metal atom.
  • these are transition metal atoms of the third period and especially those that can form divalent ions, such as in copper (II), nickel (II), zinc (II), cobalt (II) and iron (II).
  • Such activator compounds preferably bind the metal ion in a chelating manner, ie the activator compounds have at least 2, preferably at least 3, e.g. B. 3, 4 or 5 functional groups that can form a coordinative bond to the above metal ions.
  • the spatial arrangement of the functional groups is preferably selected so that the connection in the form of a chelate is carried out over several and in particular all functional groups of the activator compound.
  • suitable activator compounds which are able to coordinate bind metal atoms and which simultaneously have a reactive group R 'include, for example, aromatic orthohydroxy aldehydes such as salicylaldehyde, functionalized pyridine and quinoline compounds such as 8-hydroxyquinoline, dipicolylamine, N-2-pyridylmethylaminoacetate , furthermore polycarboxylic acids with preferably at least 2, for example 2, 3, 4, 5 or 6, carboxyl groups, in particular compounds which contain at least 2, for. B.
  • the activator compounds which can form complexes with transition metal ions, can be applied to the surface in a complex form or, preferably, in an uncomplicated form. If uncomplexed compounds V are used, a complexation is then carried out by rinsing with a solution containing metal ions. If appropriate, after the application of the compound V or after the complexation of the compound V bound to the surface, a washing step will be introduced in order to to remove excess compound V and / or excess metal ions.
  • carboxylic acids as activator compounds, they can also be used in carboxyl-protected form, ie. H. use as ester.
  • Suitable protective groups for carboxyl groups are known to the person skilled in the art from the relevant literature, preference being given to those groups which can be split off under conditions which do not impair or even destroy the hydrogel layer.
  • An example of this is the tert-butyl group, which is thermally, for. B. can be removed by heating to 150-220 ° C.
  • the solutions used for complexation are usually aqueous solutions of water-soluble salts of the metal ions, e.g. Solutions of chlorides, nitrates, sulfates, acetates etc.
  • the concentration of the metal ions in the solution is generally in the range from 1 mM to 1 M.
  • the pH of the solution is in the Rule 5 to 12, in particular 6 to 11.
  • the solutions may optionally contain weak complexing agents, for example Ammonia to ensure the solubility of the metal ions at higher pH values.
  • the activator compounds have, in addition to the reactive group R ′ required for binding to the surface, a group which can bind to the biomolecule via at least 2 and preferably via at least 3 hydrogen bonds.
  • groups are, for example, oligonucleotide groups with at least 2, preferably at least 3, e.g. B. 3 to 100 and in particular 3 to 20 nucleotide bases. Biomolecules which have an oligonucleotide sequence complementary thereto can bind to these groups, the proportion of complementary bases being at least 50%.
  • the activator compounds used are substances which are known to have an affinitive interaction with biomolecules.
  • suitable activator compounds of this type are ligands, for example haptens and antibodies, which are functionalized, that is to say have a group R 'such that they can react with the surface to form a covalent bond.
  • This also includes chemical compounds which, in addition to at least one reactive group R ', have a further molecular group or amino acid sequence which can bind to the biomolecule in the sense of an affinitive interaction, for example a protein ligand or protein-protein interaction.
  • biotin derivatives which are modified with a group R 'and thus an anchor for Form biomolecules that have a streptavidin or avidin sequence, as well as streptavidin and avidin derivatives that are modified with a group R ', so that they are an anchor for biotinylated biomolecules.
  • the surfaces provided in step i have a large number of reactive, typically electrophilic groups R, which are qualified for binding biomolecules, without activation being necessary.
  • reactive groups R typically electrophilic groups
  • examples of this are, in particular, isocyanate groups which can be crosslinked in a simple manner by the action of water, and on the other hand have a high reactivity towards nucleophilic groups, for example SH, OH and NH 2 groups.
  • the surface layer obtained in this way then still has sufficient amounts of isocyanate groups as groups R which permit coupling of those biomolecules which have one or more nucleophilic groups R ', for example SH, OH and NH 2 groups.
  • Partial crosslinking is achieved in a particularly simple manner by applying the star-shaped prepolymer containing isocyanate groups to the support in an aqueous solvent as described above, at least partially removing the solvent while maintaining a coating, and immediately afterwards, but at the latest after 2 h, preferably not later than 1 h, the biomolecules are applied to the surface thus obtained in spatially separated areas on the surface thus generated.
  • excess isocyanate groups are then deactivated by treatment with water or aqueous solutions.
  • the biomolecules have at least one reactive group R 'which is qualified for coupling to the reactive groups R of the surface.
  • This group can be present in the actual biomolecule or can be connected to the biomolecule via a spacer, ie the biomolecule has been functionalized in a manner known per se, so that it has one or more reactive groups R 'which are separated from the actual biomolecule via a molecular group ( Spacer) is spatially separated.
  • Suitable spacers are, for example, homobifunctional compounds, such as diamines, diacids, e.g. Dicarboxylic acids, or ethylene glycol oligomers, or heterobifunctional compounds, such as amino acids, e.g. ⁇ -alanine, glycine, 6-aminocapric acid or v-aminobutyric acid, arylacetylenes, biotins, avidines, strepavidines, oligosaccharides, e.g. from riboses or deoxyriboses, nucleic acids, especially oligo- (d) A or - (d) T, fatty acids, phosphoric acid esters and derivatives and / or combinations thereof.
  • homobifunctional compounds such as diamines, diacids, e.g. Dicarboxylic acids, or ethylene glycol oligomers
  • heterobifunctional compounds such as amino acids, e.g. ⁇ -alanine, gly
  • Spacers can also be constructed from several parts (linkers) which are linked to one another by covalent and / or non-covalent bonds.
  • covalently linkable parts of a spacer are heterobifunctional elements, such as amino acids, for example 6-aminocaproic acid or ⁇ -aminobutyric acid, of which several can be connected to one another to extend a spacer.
  • non-covalently linkable parts of a spacer are molecules between which affinity bonds can form, such as between biotin and avidin or streptavidin or their analogs.
  • Spacers can have one or more binding sites for biomolecules (e.g. dendrimers).
  • biomolecules e.g. dendrimers
  • the above-mentioned heterobifunctional elements for example, generally have one, two or three such binding sites, while molecules that form affinity bonds, such as avidin or streptavidin, have multiple binding sites. The latter can lead to an advantageous increase in immobilized biomolecules per unit area.
  • Spacers can also have variable binding parts which offer different binding possibilities depending on their respective configuration. This applies in particular to affinity bonds, the binding affinity of which can vary depending on the configuration of the binding partners involved.
  • Preferred spacers are based on diamines of the formula III
  • n1 corresponds to a value from 1 to 50 and in particular from 5 to 20 and n2 corresponds to a value from 2 to 100 and preferably 5 to 50
  • R 1 is the amino acid naturally occurring for ⁇ -C substituents, in particular represents hydrogen and CrC 4 alkyl, where several R 1 radicals can be the same or different (in the case of n1 ⁇ 1) and the sugar is in particular ribose and deoxyribose, preferably in the D form.
  • n1 corresponds in particular to a value from 2 to 6 and preferably from 3 while n2 corresponds in particular to a value from 2 to 20, preferably 4 to 10, for example 6.
  • the functional group R ' is then arranged at the end of the spacer distal to the biomolecule.
  • spacers to biomolecules
  • Covalently attached spacers in particular via -O-, -NH- or -S- attached spacers, are preferred.
  • Biomolecules can specify certain functionalities for this purpose, but they can also be modified appropriately.
  • proteins can be Bind sulfide or carboxy groups, and nucleic acids via 5'- or 3'-OH groups.
  • proteins can be reductively modified in a manner known per se in order to convert disulfide bridges into free sulfide groups, and nucleic acids can be reacted for example with known and also commercially available reagents in order to convert terminal OH groups into groups having amino groups.
  • nucleic acids are bound to the spacer via their respective 5 'ends. This can advantageously be done using polyethylene glycol spacers, in particular the spacers of formula VII.
  • the biomolecules are applied to the organic surface layer by means of a stamping technique, the so-called ⁇ CP method.
  • ⁇ CP method An overview of such processes can be found in Xia et al., Chem. Ref. 1999, 99, pp. 1823-1848, Appl. Chem. Int. ed. 1998, 37, pp. 550-575.
  • a An overview of the application of the ⁇ CP technique for the application of biomolecules can be found in Kane et al., Biomaterials 1999, 20, pp. 2363-2376.
  • a stamp which has a large number of elevations, is wetted with a solution of the biomolecule that is to be immobilized.
  • the stamp is then pressed onto the organic surface layer.
  • a pattern (array) of immobilized biomolecules is obtained on the organic surface layer.
  • the arrangement and number of places of immobilized biomolecules on the organic surface layer corresponds to the arrangement and number of elevations on the stamp surface.
  • the stamp surface is formed from an elastic material in order to ensure the best possible transfer of the biomolecules to the organic surface layer.
  • Suitable stamps are e.g. B. from the publications of Xia et al. (see above), Bernard et al., Adv. Mater. 2000, 12, 1067-1070, and Kane et al. (see above).
  • the number and arrangement of the elevations depends on the geometry of the array.
  • the elevations are columnar with a circular, ellipsoidal, rectangular or strip-shaped end face. Circular or ellipsoidal geometries are preferred.
  • the individual elevations have an average diameter in the range from 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the diameter here refers to twice the average distance between the boundary line of the end face and its center point. In the case of a rectangular arrangement, the diameter specified here corresponds approximately to the mean value of the diagonals and heights of the end face.
  • the size of the surveys is of minor importance. As a rule, however, it will not fall below a value of 0.5 ⁇ m and in particular 1 ⁇ m. As a rule, it is in the range from 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, with a ratio of the height of the elevation h to the diameter d of h / d ⁇ 5, in particular ⁇ 2, being guaranteed for reasons of stability.
  • the distance between the elevations is generally in the range from 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m, in particular 1 to 100 ⁇ m and especially 5 to 50 ⁇ m, depending on the desired surface pattern of the array. Corresponding dimensions also apply to stamp surfaces with strip or ribbon-shaped elevations.
  • Elastic materials are generally suitable as stamp materials.
  • the stamp materials are materials containing polydimethylsiloxane, as are already used for this purpose in the prior art. Occasionally it has proven advantageous to hydrophilize the stamp surface, for example by treatment with oxygen plasma as described by Donzel et al., in Adv. Mater. 2001, 13, pp. 1164-1167.
  • the concentration of the biomolecules in the solution is in the range from 1 mmol / ml to 1 ⁇ mol / ml.
  • Non-contact methods such as piezo dispensers and pressure pulse dispensers can also be used.
  • the control of temperature and relative humidity to avoid satellite spots has proven to be useful.
  • the grounding of the carrier material is useful for dissipating electrostatic charge.
  • capillary dispensers which apply the liquid with a thin capillary, for example with an inner diameter of 1.5 to 5 ⁇ m
  • pin and ring technology can also be used.
  • the polarity of the medium to be dispensed can be used to ensure an optimal tear-off, e.g. by adding salt or solvents such as ethanol or 1-propanol.
  • the amount of liquid dispensed is important because it determines the area on which the biomolecules are immobilized, in particular the spot size.
  • amounts of liquid in the femto to nanoliter range are applied. For example, spots with a diameter of approximately 150 to 200 ⁇ m are available with a contact-free amount of approximately 10 nl to 2 ⁇ l. Spots with diameters in the range of 10 ⁇ m can be created by applying amounts of approximately 0.01 nl to 0.1 ⁇ l using capillary dispensers.
  • the solvent is generally first evaporated. This can normally take place at room temperature because of the relatively small amounts of liquid, but can also be influenced by the selection of suitable higher or lower temperatures. Accordingly, the coupling reaction essentially does not take place in solution, although a residual solvent content can be advantageous.
  • a washing process is generally carried out. The purpose of this washing process is in particular to remove uncoupled biomolecules. In line with the solution previously used to apply the biomolecules, aqueous solvents or solvent mixtures are also used for washing. In principle, the above statements apply accordingly.
  • washing is carried out with a solvent or solvent mixture which contains a surfactant, preferably a nonionic surfactant.
  • a surfactant preferably a nonionic surfactant.
  • Polyalkoxylated, in particular polyethoxylated, fatty acid esters of polyols, in particular of glycerol or sorbitol, for example the sorbitan fatty acid esters sold under the trade name Tween® are particularly preferred.
  • the use of ethoxylated sorbitan hexylaurate has proven to be expedient.
  • the concentration of surfactant in the washing solution is expediently chosen so that on the one hand an effective removal of uncoupled biomolecules is ensured, and on the other hand the washing solution is compatible with the immobilized biomolecules. Concentrations in the range from 0.01% by weight to 10% by weight and preferably 0.05% by weight to 2% by weight have proven to be expedient.
  • the concentration of the biomolecules in the solution to be applied is variable and depends in particular on the desired density and molecular weight of immobilized biomolecules. Concentrations in the range of 1 nmol / ml to 1 ⁇ mol / ml can be used, in certain cases in the lower concentration range the surface is not saturated with biomolecules, while in the upper concentration range this is the case and excess biomolecules due to saturation not paired, can then be removed. Concentrations above at least 10 nmol / ml and in particular at least 20 nmol / ml have proven to be expedient for the purpose of saturating the surface with a satisfactory homogeneity of the immobilized biomolecules.
  • washing steps can follow.
  • organic solvents in particular lower alcohols, for example isopropanol, which can then subsequently be removed again by rinsing with water.
  • the surface is dried under customary conditions, conveniently at ambient temperature and, if desired, by blowing dry with air or inert gas.
  • arrays are obtained which have a large number of sites with immobilized biomolecules.
  • more than 10, 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000, 400000 or 1000000 defined places (areas) can be arranged on an array per cm 2 carrier surface.
  • arrays according to the invention have 5-10000 spaces / mm 2 .
  • a special embodiment is arrays with 5 to 100 places / mm 2 and in particular 10 to 50 places / mm 2 (low density).
  • Another special embodiment is arrays with 100-10000 spaces / mm 2 and in particular 500-2500 spaces / mm 2 (high density).
  • the same or different biomolecules can be immobilized in different places.
  • the locations at which biomolecules are immobilized, in particular fields of immobilized biomolecules, can have different geometries.
  • the shape can be arbitrary, for example circular, rectangular, square or elliptical.
  • the area is preferably less than 1 mm 2 , in particular less than 10000 ⁇ m 2 , and very particularly preferably less than 1000 ⁇ m 2 .
  • biomolecules are immobilized as spots, i.e. as essentially circular fields.
  • spots preferably have diameters in a range from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, in particular 2 ⁇ m to 50 ⁇ m or 50 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • spots with diameters below 200 ⁇ m and especially below 50 ⁇ m or 20 ⁇ m can advantageously be realized with the ⁇ CP technology described above.
  • the biomolecules are nucleic acids, in particular oligonucleotides with a length of 2 to 500 bases.
  • the immobilized oligonucleotides are able to bind to a target nucleic acid. In this sense, the immobilized oligonucleotides are also referred to as probes.
  • the probes are usually single-stranded oligomers. DNA, RNA and nucleic acid analogs and derivatives, such as, optionally modified, PNA, LNA and PSNA as well as modified DNA or RNA can be used.
  • the minimum length of the probes depends on the complexity of the sample, in particular the number of bases of nucleic acids to be detected, but also on the type of nucleic acid used as a probe and the thermodynamic stability that can be achieved between sample and probe.
  • probes usually have a length of 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA, 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA-LNA hybrids, 8 to 60, preferably from 13 to 25 and in particular from 13 bases for PSNA, from 6 to 30, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for LNA, and from 6 to 18, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for PNA on.
  • nucleic acids to be detected e.g. Amplificates, in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms, in particular for applications such as the detection of mutations, SNPs or methylations (epigenetics)
  • Amplificates in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms, in particular for applications such as the detection of mutations, SNPs or methylations (epigenetics)
  • PCR amplificates in particular PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g. PCR amplificates
  • viruses e.g., viruses, plasmids and microorgan
  • RNA unamplified RNA
  • Longer probes for example in the range of 16-60 mer and in particular 25-50 mer for synthetic probes, are expedient for cDNA of total amplified RNA, unamplified total genomic DNA and amplified total genomic DNA, in particular for applications such as gene expression determinations or the detection of genomic amplifications or deletions or the probes consist of PCR products, cDNA, plasmids or DNA from lysed bacteria, which can also have a number of bases beyond this.
  • a test probe generally has a base sequence which is complementary to a specific target sequence of a nucleic acid to be detected or, according to another aspect, can hybridize specifically with the target sequence.
  • a control probe can in particular have the function of a normalization, mismatch, housekeeping, sample preparation, hybridization or amplification control and accordingly have a base sequence which is complementary to a base sequence of a reference nucleic acid, a nucleic acid to be detected with a similar base sequence, a constitutively expressed nucleic acid, for example a nucleic acid derived from the ß 2 microglobulin, ß-actin, GAPDH, PBGD, ubiquitin, tubulin or transferrin receptor gene, a species-specific nucleic acid or an amplificate.
  • the immobilized biomolecules are provided with a marking in accordance with the above particular embodiment, a quality control of the array can now follow.
  • the array can be measured with a detection system corresponding to the marking.
  • the coupling efficiency and thus the immobilization of the biomolecules can be assessed in terms of area, homogeneity and density via the measured amount of immobilized marking.
  • the present invention also relates to the use of arrays according to the invention for analytical and in particular diagnostic purposes.
  • arrays according to the invention are suitable both for non-competitive and for competitive analytical methods (assays).
  • the substance to be analyzed interacts with the biomolecules immobilized on the surface.
  • the analyte is marked beforehand, but marking is also possible after the analyte has already interacted with the immobilized biomolecules, for example by means of primer extension or rolling-cycle PCR. In these cases, a measurement signal is obtained which is greater the more analyte is present.
  • the interaction of the sample with the substances immobilized on the surface changes the fluorescence of the immobilized substances (weakening, amplification, for example molecular beacons) or changes the activity of an enzyme and this change is registered as a measurement signal .
  • non-competitive assays are hybridization reactions of PCR products or labeled DNA / RNA on immobilized on the surface.
  • a labeled substance (marker) is added to the sample which has similar binding properties to the biomolecules immobilized on the surface as the analyte itself. There is a competitive reaction between analyte and marker for the limited number of binding sites on the surface. A signal is obtained which is lower the more analyte is present.
  • competitive assays are immunoassays (ELISA) and receptor assays).
  • Figure 1 Fluorescence microscope image of a fluorescence-labeled nucleotide array with spots at a distance of 20 ⁇ m and a spot diameter of 5 ⁇ m.
  • Figure 2a Fluorescence microscope image of an array with stripe-shaped areas of an immobilized biotin-streptavidin system with fluorescent marker, the stripes being 5 ⁇ m wide and 10 ⁇ m apart between the stripes.
  • Figure 2b Intensity distribution of the fluorescence of the array from Figure 2a along a line perpendicular to the strips.
  • Figure 30 Fluorescence microscope image of an array with punctiform areas of an immobilized green fluorescent protein
  • IPDI isophorone diisocyanate
  • the prepolymer precursors used are commercially available 6-armed polyalkylene ethers (hereinafter referred to as polyols) which have been prepared by anionic ring-opening polymerization from ethylene oxide and / or propylene oxide using sorbitol as initiator.
  • the polyol used was dried to a residual water content of less than 350 ppm before use. Remains of the for Production of the polyols used alkali metal hydroxide was bound by neutralization with phosphoric acid.
  • the polyol was slowly added via a pump (approx. 80 ml / h), so that the reaction temperature did not deviate by more than 10 K from the specified temperature.
  • the elution diagrams were adapted for evaluation on two Gaussian curves, the proportion of bi- / trimer being determined via the area ratios.
  • the unreacted OH groups were determined by reacting the prepolymers with acetic anhydride in pyridine and titrating excess acid (hydrolysis of the unreacted acetic anhydride) with NaOH.
  • the star-shaped polyether polyol used is a 6-arm statistical poly (ethylene / propylene oxide) with an EO / PO ratio of 80/20 with a molecular weight of 3100 g / mol.
  • phosphoric acid 0.05% by weight was added to the polyol and heated to 80 ° C. in vacuo with stirring.
  • the isophorone diisocyanate (IPDI) used was distilled in vacuo before use (95 ° C / 0.01 mbar) 125 ml (0.59 mol) were placed in a reactor and heated to 50 ° C. in an inert gas atmosphere. The dried and degassed polyol (20 g, 6.45 mmol) was then added slowly (approx.
  • the substrate surfaces were first pretreated.
  • the substrates pre-cleaned by water and acetone were treated in a plasma system of the type TePla 100-E from the company Plasma Systems in oxygen plasma for 2 minutes (pressure: 1 mbar, 50W) and then washed with water and acetone.
  • the pre-cleaned substrates can also be treated with oxygen under a 40 w UV lamp with a wavelength of 185 nm for 10 min (distance between substrate surface and Light source 2 mm), and then washed with water and acetone.
  • the substrates can also be stored for 1 hour at 60 ° C. in a mixture of concentrated aqueous ammonia, hydrogen peroxide (25% by weight) and water in a volume ratio of 1: 1: 5 without pre-cleaning. Then they were rinsed several times with water. The substrates treated in this way were then stored in deionized water.
  • the pretreated substrates were coated with an aminosilian monolayer.
  • the sample taken from the water and blown dry with nitrogen was transferred to a glove box.
  • the substrates were stored in a 0.5% (v / v) solution of N- (3- (trimethoxysilyl) propyl) ethylenediamine or (3-aminopropyl) trimethoxylsilane in dry toluene for 16 h, then thoroughly with toluene washed and dried in a glove box using a filtered nitrogen stream before use in a nitrogen atmosphere.
  • G1 Solution of 3'-amino-terminated-5'-fluorescence-labeled oligonucleotide (from Molecular Probes) in PBS buffer with a concentration of 100 pmol / ⁇ l.
  • G2 Solution of 3'-amino-terminated oligonucleotide (from Molecular Probes) in PBS buffer with a concentration of 100 pmol / ⁇ l.
  • G3 Solution of 5'-fluorescence-labeled oligonucleotide (opposite strand to the oligonucleotide used in G2; from Molecular Probes) in PBS buffer with a concentration of 100 pmol / ⁇ l.
  • Example 2 a) The prepolymer from Preparation Example 1 was dissolved in a concentration of 10 mg / ml in dry tetrahydrofuran. Then an amino-functionalized silicon carrier, produced according to II, was coated by means of spin coating. For this purpose, the non-rotating, dried substrate was first completely wetted with the prepolymer solution before the solution was spun off at a final speed of 4000 rpm for 40 seconds. The coating was then dry. b) 2 spots of 1 ⁇ l of solution G1 and 2 spots of 1 ⁇ l of solution G2 were applied to the coating produced in this way using a micropipette. The mean diameter of the Spots was about 200 ⁇ m.
  • the array thus obtained was then kept overnight in an atmosphere saturated with water vapor.
  • the coating was then washed with PBS (pH 7.5) and stored in a mixture of 10 ⁇ l G3, 10 ⁇ l Tween20 with 10 ml double PBS at 4 ° C. overnight, and then washed with double PBS.
  • the substrates were then measured with a fluorescence scanner. The intensity of the fluorescence of the respective spots G1 and G2 was determined. The G2 spots before hybridization served as a reference. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 Prepolymer from Preparation Example 1 with a concentration of 10 mg / ml in tetrahydrofuran / water 1: 1 (v / v).
  • Example 4 Prepolymer from Preparation Example 1 with a concentration of 1 mg / ml in dry tetrahydrofuran.
  • Example 5 Prepolymer from Preparation Example 1 with a concentration of 1 mg / ml in tetrahydrofuran / water 1: 1 (v / v).
  • Example 6 a) The prepolymer from Preparation Example 2 was dissolved in a concentration of 10 mg / ml in dry tetrahydrofuran. Then an amino-functionalized silicon carrier 4b
  • the non-rotating, dried substrate was first completely wetted with the prepolymer solution before the solution was spun off at a final speed of 4000 rpm for 40 seconds.
  • Example 7 Array with stripe-shaped regions of a biotin-streptavidin system
  • Example 8 Production of a protein array via complex formation
  • the support thus obtained was then kept overnight in an atmosphere saturated with water vapor and washed with toluene.
  • the carrier obtained was 10 min. stored at 200 C C under vacuum (0.02 mbar) and after cooling for 5 min. immersed in a solution of NiCI 2 in water (5 mg / ml) and washed with water.
  • the carrier treated in this way was then dissolved in a solution of a His-tagged green fluorescent protein in PBS buffer (0.03 mg / ml) for 10 min. immersed and then washed with PBS buffer.
  • the array obtained was examined by fluorescence microscopy. The pattern shown in Figure 3 was obtained.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflächenschicht gekoppelt sind, welche im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, wobei die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und Vorrichtungen, die derartige Arrays aufweisen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung derartiger Arrays und die Verwendung derartiger Arrays und Vorrichtungen für diagnostisch/analytische Zwecke.

Description

Arrays immobilisierter Biomoleküle auf Hydrogel-bildenden Oberflächen, deren Herstellung und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Arrays immobilisierter Biomoleküle auf Hydrogel- bildenden Oberflächen, deren Herstellung und Verwendung. Ebenfalls betrifft die vorliegende Erfindung Vorrichtungen auf Basis der Arrays, insbesondere Chips, Microfluid- Vorrichtungen und Dipsticks.
Mit der zunehmenden praktischen Bedeutung der molekularbiologischen Analytik stoßen die mit einem sehr hohen Arbeits- und Kostenaufwand verknüpften, oft Tage oder Wochen dauernden etablierten Standardtechniken an Grenzen. Neue Testformate wie Biochips sollen eine enorme Zeit und Kostenersparnis ermöglichen. Da mit dieser Technik sehr viele verschiedene auf engstem Raum immobilisierte Substanzen gleichzeitig mit einer einzigen zu analysierendenjProbe in Kontakt gebracht werden können, ist der pro Messung aus einem Chip gewonnene Informationsgehalt sehr hoch.
Eine Übersicht über die bekanntesten Biochip-Systeme findet man beispielsweise in Bow- tell D. D. L. Nature Genetics Supplement 21 (1999) 25-32; Lockhart et al, Nature Biotech- nology 14 (1996) 1675. Eine Übersicht über Protein- und Antikörper-Arrays gibt Cahill, D. J. Immunol. Methods, 250 (2001) 81-91.
Ein typisches Beispiel eines sogenannten „high density array" ist der GeneChip von Affy- metrix, ein Oligonukleotidarray mit typischerweise über 400 verschiedenen Capture Pro- bes, die Base für Base auf dem Glaswafer aufgebaut werden. Die Chips zeichnen sich durch eine sehr hohe Informationsdichte von bis zu 40.000 Oligonukleotiden/cm2 aus. Die einzelnen "Spots" sind rechteckig.
"Low Density Arrays" sind beispeilsweise von Genometrix erhältlich. Maximal 250 Spots von 50 μm Durchmesser werden mit einem Kapillar-Pin-Bündel aus bis zu 1000 Einzelkapillaren in die Kavitäten einer 96-er Mikrotiterplatte gedruckt. Zur Ankopplung an die Oberfläche werden konventionelle Techniken verwendet, denen insbesondere Aminosila- nisierungen und NHS-aktivierte Haptene, epoxyaktivierte Oberflächen, Carbodiimid- kopplungen an Carboxylgruppen sowie Biotin/Streptavidin-Bindungen zugrunde liegen (vgl. WO 97/18226; EP 0910570 A1; WO 98/29736). Die Qualität dieser Biochips reicht für einen zufriedenstellenden Einsatz insbesondere in der medizinischen Diagnostik allerdings nicht aus. Dies hat verschiedene Gründe.
Ein zentrales Problem ist die unspezifische Adsorption von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen und Zellen auf Oberflächen. Diese führt dazu, dass bei Kontakt mit dem Analyten eine unspezifische Belegung der Oberfläche des Arrays bzw. Biochip mit Proteinen und Zellmaterial stattfinden kann, was zu einer Verringerung der Selektivität gegenüber dem Target und letztendlich zu einer Zerstörung des Biochips/Arrays führt.
Bei Proteinen und Antikörpern stellt sich zudem das Problem, dass diese aufgrund von unspezifischer Wechselwirkung mit der Substratoberfläche ihre Aktivität verlieren können und schlimmstenfalls denaturieren. Für die Immobilisierung von Proteinen und Antikörpern sind daher Oberflächen erforderlich, die einerseits eine gezielte Anbindung der Biomoleküle erlauben und die andererseits eine äußert geringe Neigung zur unspezifischen Bindung derartiger Moleküle aufweisen.
Aus der WO 02/059372 sind Arrays bekannt, die auf einer Trägeroberfläche eine Vielzahl von Hydrogel-Zellen aufweisen, welche eine immobilisierte Bindungsstelle für Proteine aufweisen.
Aus der WO 99/36576 sind Arrays mit einer Vielzahl von Hydrogelbereichen bekannt, die dadurch erhalten werden, dass man eine erste hydrogel-bildende Schicht auf die Oberfläche eines Trägers aufbringt, aus diese Schicht Bereiche entfernt, so dass Vertiefungen entstehen, diese Vertiefungen mit einem zweiten Gel füllt und anschliessend die erste Schicht vollständig entfernt. Hierbei enthält das zweite Gel Biomoleküle. Nach Entfernen der ersten Schicht verbleiben somit eine Vielzahl von Hydrogel-bildenden, Biomoleküle- enthaltenden Bereichen auf der Oberfläche des Trägers.
Die US 6,174,683 beschreibt die Herstellung von Biochips, die kovalent gebundene Biomoleküle aufweisen, bei dem man ein Biomolekül mit einem Hydrogel-bildenden Präpolymer auf Polyurethanbasis in Lösung derivatisiert, die Polymerisation des derivatisierten Präpolymers in der Lösung auslöst und die Lösung des polymerisierenden Präpolymers durch Microspotting-Techniken auf die Oberfläche eines geeigneten Trägers aufbringt. Die so hergestellten Biochips haben eine bessere Lebensdauer, sind jedoch vergleichsweise aufwendig herzustellen und bezüglich unspezifischer Wechselwirkungen mit Proteinen nicht zufriedenstellend.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Oberfläche für die Herstellung eines Arrays bereitzustellen, die sich durch eine geringe Neigung zur unspezifischen Wechselwirkung von Biomolekülen auszeichnet und die andererseits eine selektive Kopplung von Biomolekülen erlaubt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass diese Aufgabe durch organische Schichten gelöst wird, die im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut sind, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind. Derartige Oberflächen sind grundsätzlich aus den deutschen Patentanmeldungen 10203937.2 und 10216639.0 bekannt, auf deren Offenbarung Bezug genommen wird.
Diese Oberflächen zeichnen sich durch eine besonders geringe Affinität gegenüber unspezifischer Bindung von Biomolekülen aus. Zudem weisen diese Oberflächen herstellungsbedingt eine Vielzahl funktioneller Gruppen R auf, die entweder direkt oder nach Aktivierung mit den in Biomolekülen üblicherweise vorhandenen funktioneilen Gruppen R' wie NH2, OH oder SH unter Bindungsbildung reagieren können, so dass es zu einer kova- lenten Anbindung der Biomoleküle an die Oberfläche kommt, wodurch eine Immobilisierung der Biomoleküle auf der Oberfläche erreicht wird. Alternativ bietet sich die Aktivierung der Biomoleküle in an sich bekannter Weise an, d.h. die Einführung funktioneller Gruppen R' in die Biomoleküle, die unter Bindungsbildung mit den funktionellen Gruppen R auf der Oberfläche reagieren. Als weitere Alternative bietet sich die kovalente Anbindung von Substanzen an, die ein Biomoleküle über eine koordinative oder affinitive Bindung binden kann, d.h. für die das Biomolekül eine oder mehrere Bindungsstellen aufweist. Derartige Substanzen werden im Folgenden auch als Haftvermittler oder Kopplungsmittel bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Arrays immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflachenschicht gekoppelt sind, welche im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren P aufgebaut ist, wobei die Präpolymere P im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen wasserlöslich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Arrays, umfassend:
i. Bereitstellung einer organischen Oberflachenschicht auf der Oberfläche eines Träger, wobei die Oberflachenschicht im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und auf ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist und ii. Immobilisieren der Biomoleküle in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche der Oberflachenschicht.
Das Immobilisieren der Biomoleküle erfolgt in der Regel durch Aufbringen der Biomoleküle, welche entweder eine funktionelle Gruppen R' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren, oder durch Aufbringen von Biomolekülen, die eine Bindungsstelle für einen auf der Oberfläche kovalent gebundenen Bindungspartner (Haftvermittler) besitzen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt das Aufbringen der Biomoleküle auf die bereits vernetzte Oberflachenschicht. Gemäß einer zweiten Ausführungsform erfolgt das Aufbringen der Biomoleküle während oder vor dem Vernetzen der die Oberflachenschicht bildenden Präpolymere. Sofern man einen Haftvermittler zur An- bindung der Biomoleküle einsetzt, kann man diesen ebenfalls auf die bereits vernetzte Oberflachenschicht oder vor oder während des Vernetzens der Oberflachenschicht aufbringen.
Mit der Erfindung sind zahlreiche Vorteile verbunden: Die erzeugten Arrays zeichnen sich durch eine ausserordentlich geringe Neigung aus, unspezifisch Proteine zu absorbieren. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Oberflachenschicht mit Wasser quillt, d.h. ein Hydrogel bildet. Zudem weist die Oberflachenschicht an ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen in hoher Flächendichte auf, die für die Immobilisierung der Biomoleküle genutzt werden können. Aufgrund des Aufbaus der Schicht ist diese Oberflachenschicht zudem ausserordentlich stabil gegenüber Alterung und mechanischer Belastung. Die Biomoleküle sind zudem kovalent oder mittels eines kovalent gebundenen Haftvermittlers auf der Oberfläche gebunden und werden daher nicht abgewaschen. Die Arrays sind daher sehr robust und weisen eine hohe Langzeitstabilität auf. Die Arrays lassen sich verkapseln und/oder in automatische Analysengeräte integrieren. Die als Spot immobilisierten Biomoleküle weisen eine gleichmäßige Beschichtung auf, d.h. sie sind homogen. Für Oligonukleotidarrays werden gute Diskriminierungsraten erzielt und ein hoher dynamischer Bereich für Hybridisierungsexpe- rimente Verfügung gestellt. Intra- und Interarray-Variationen sind gering. Damit wird der Einsatz der Arrays im diagnostisch/analytischen Bereich ermöglicht. Proteine, einschließlich Antikörper und Enzyme verlieren beim Koppeln auf die Oberflachenschicht nicht ihre Aktivität. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft daher Arrays immobilisierter Proteine, einschließlich Antikörper und Enzyme.
Der Begriff „Array" bezeichnet eine Anordnung definierter Plätze, insbesondere eine örtliche Zuordnung bestimmter Substanzen zu definierten Plätzen, wobei verschiedenen Plätzen gleiche oder unterschiedliche Substanzen zugeordnet sein können. Ein definierter Platz entspricht einer bestimmten Fläche, deren Wert einer Intraassay-Varianz von vorteilhafterweise weniger als 15%, vorzugsweise von weniger als 7% bzw. einer Interassay- Varianz von vorteilhafterweise weniger als 20%, vorzugsweise von weniger als 15% und insbesondere von weniger als 10% unterliegt, wenn man zwei Flächen miteinander vergleicht. Einem Platz ist in der Regel eine Substanzart zugeordnet, wobei allerdings auch denkbar ist, Gemische aus zwei oder mehreren Substanzarten einem Platz zuzuordnen. Bevorzugt sind zweidimensionale Arrays. Die Plätze bilden zweckmäßigerweise ein regelmäßiges zweidimensionales Muster von Feldern. Innerhalb eines Arrays können jeder Substanzart bzw. jeder Art von Substanzgemisch ein Feld oder mehrere Felder zugeordnet werden.
Der Begriff „Biochip" bezeichnet hier einen Array von Biomolekülen, die auf einem festen Träge immobilisiert, d.h. ortslokalisiert gebunden sind. Die Bindung kann auf kovalenten, ionischen, koordinativen oder affinitiven Wechselwirkungen, z.B. Protein-Ligand oder Protein-Protein-Wechselwirkungen, oder auf Mischformen der vorgenannten Wechselwirkungen beruhen.
Der Begriff „Biomoleküle" bezeichnet beliebige biochemische und biologische Substanzen, sowohl als einzelne Moleküle als auch als mehrere miteinander wechselwirkende Moleküle. Zu nennen sind beispielsweise: • Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleinsäuren, z.B. einzel- und/oder doppelsträn- gige, lineare, verzweigte oder circuläre DNA, cDNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic A- cid), LNA (Locked Nucleic Acid), PSNA (Phosphothioate Nucleic Acid); • Antikörper, insbesondere humane, tierische, polyklonale, monoklonale, rekombinante, Antikörperfragmente, z.B. Fab, Fab', F(ab)2, synthetische;
• Proteine, z.B. Allergene, Inhibitoren, Rezeptoren;
• Enzyme, z.B. Peroxidasen, Alkalische-Phosphatasen, Glukose-Oxidase, Nukleasen;
• kleine Moleküle (Haptene), z.B. Pestizide, Hormone, Aminosäuren, Antibiotika, Phar- maka, Farbstoffe, synthetische Rezeptoren, Rezeptorliganden.
Einem weiteren Aspekt zufolge definiert der Begriff „Biomolekül" die Fähigkeit einer Substanz, mit einer biologischen Probe bzw. einem Teil davon, insbesondere dem Analyt, in eine bestimmte analytische Wechselwirkung treten zu können.
Einem besonderen Aspekt zufolge ist ein bestimmter Typ von Biomolekül als Ligand zu bezeichnen. Liganden wechselwirken mit und insbesondere binden sie - vorzugsweise spezifisch - an bestimmte Targets.
Reaktive Gruppen R in Sinne dieser Erfindung sind solche, die mit Nucleophilen in einer Additionsreaktion einschließlich einer Michael-Reaktion oder in einer Substitutionsreaktion reagieren, z. B. Isocyanat-Gruppen, (Meth)acryigruppen, Vinylsulfongruppen, Oxiran- Gruppen, Oxazolingruppen, Aldehydgruppen, Carbonsäuregruppen, Carbonsäureesterund Carbonsäureanhydridgruppen, Carbonsäure- und Sulfonsäurehalogenid-Gruppen, aber auch die hierzu komplementären, als Nucleophil reagierenden Gruppen wie alkoholische OH-Gruppen, primäre und sekundäre Aminogruppen, Thiolgruppen und dergleichen. Als Beispiel für Carbonsäureestergruppen sind insbesondere sogenannte Aktivestergruppen der Formel -C(O)O-X bevorzugt, worin X für Pentafluorphenyl, Pyrrolidin-2,5- dion-1-yl, Benzo-1,2,3-triazol-1-yl oder einen Carboxamidin-Rest steht, sowie NHS-Ester (N-Hydroxy-succinimid-Ester). Reaktive Gruppen im Sinne der Erfindung sind auch nuc- leophile Gruppen, die mit den vorgenannten elektophilen Gruppen unter Bindungsbildung reagieren, z. B. NH2, SH, oder OH, insbesondere jedoch NH2. Es versteht sich von selbst, dass eine erfindungsgemäße Oberfläche entweder überwiegend elektrophile Gruppen oder nicleophile Gruppen aufweist, wobei im Falle von NCO/NH2 auch beide Gruppen nebeneinander vorliegen können.
Eine Übersicht über reaktive Gruppen R und hierzu komplementäre funktionelle Gruppen R' gibt die Tabelle 1 , wobei die reaktiven Gruppen R in der ersten Zeile und die hierzu komplementären Gruppen R' in der ersten Spalte angegeben sind:
Tabelle 1 : Komplementäre funktioneile Gruppen
Reaktive Gruppe Isocyanat (Meth)Acryl/ -SH -NH2 -OH -CHO Oxiran R Vinylsulfon Komplementäre Gruppe R' Isocyanat X* X X X (Meth)Acrylat X X X Vinylsulfon X X X -SH X X X X -NH2 X X X X -OH X X X -COOH X Oxiran X X X Aktivester/NHS X X CHO X X
* In Gegenwart von Wasser
Geeignet sind als reaktive Gruppen R auch radikalisch polymerisierbare C=C- Doppelbindungen, z. B. neben den oben genannten (Meth)acrylgruppen auch Vinylether- und Vinylestergruppen, weiterhin aktivierte C=C-Doppelbindungen, aktivierte C≡C- Dreifachbindung und N=N-Doppelbindungen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en- Reaktion oder mit konjugierten Diolefin-Gruppen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren. Beispiele für Gruppen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en-Reaktion oder mit Dienen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren können, sind Maleinsäure- und Fumarsäure-Gruppen, Maleinsäureester- und Fumarsäureester-Gruppen, Zimtsäureestergruppen, Propiolsäure(ester)gruppen, Maleinsäureamid- und Fumarsäureamid- Gruppen, Maleinimid-Gruppen, Azodicarbonsäureester-Gruppen und 1 ,3,4-Triazolin-2,5- dion-Gruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die organische Oberflachenschicht auf ihrer Oberfläche solche funktionellen Gruppen auf, die einer Additions- oder Substitutionsreaktion durch Nucleophile zugänglich sind. Bevorzugte Gruppen R sind Isocyanat-, Isothio- cyanat-, Aktivester, NHS-Ester, Aldehydgruppen, Acryl- und Methacrylgruppen, so dass die Biomoleküle mit der Oberfläche über eine der folgenden funktionellen Gruppen, ausgewählt unter Amidgruppen, Urethangruppen, Iminogruppen, Harnstoffgruppen, Thio- urethangruppen, Estergruppen, Thiohamstoffgruppen oder Sulfoethylgruppen und gegebenenfalls über einen Spacer, gebunden sind. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft Arrays, in denen die Oberflächenschichten als reaktive Gruppen R Isocyanat- Gruppen aufweisen. Diese werden vor dem erfindungsgemäßen Einsatz nach dem Kuppeln der Biomoleküle durch Behandeln mit Wasser zu Aminogruppen deaktiviert.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Oberfläche eine Vielzahl an nucleophilen Gruppen, insbesondere NH2-Gruppen auf.
Unter sternförmigen Polymeren versteht man solche Polymere, die mehrere an eine niedermolekulare Zentraleinheit gebundene Polymerketten aufweisen, wobei die niedermolekulare Zentraleinheit in der Regel 4 bis 100 Gerüstatome wie C-Atome, N-Atome oder O-Atome aufweisen wird. Dementsprechend lassen sich die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Polymere durch die nachfolgende allgemeine Formel I beschreiben:
Z(A-B-FR)n (I) worin n eine ganze Zahl ist, mit einem Wert von wenigstens 4, z. B. 4 bis 12, insbesondere 5 bis 12 und speziell 6 bis 8;
Z für einen niedermolekularen n-valenten organischen Rest als Zentraleinheit steht, der in der Regel 4 bis 100, vorzugsweise 5 bis 50 Gerüstatome, insbesondere 6 bis 30 Gerüstatome aufweist. Die Zentraleinheit kann sowohl aliphatische als auch a- romatische Gruppen aufweisen. Sie steht beispielsweise für einen von einem wenigstens 4-wertigen Alkohol, z. B. einem 4- bis 12-wertigen, vorzugsweise einem wenigstens 5-wertigen, insbesondere einem 6- bis 8-wertigen Alkohol, z. B. Pentae- rythrit, Dipentaerythrit, einen Zuckeralkohol wie Erythritol, Xylitol, Mannitol, Sorbitol, Maltitol, Isomaltulose, Isomaltit, Trehalulose, oder dergleichen abgeleiteten Rest;
A eine hydrophile Polymerkette, die als solche wasserlöslich ist;
B eine chemische Bindung oder ein zweiwertiger, niedermolekularer organischer Rest mit vorzugsweise 1 bis 20, insbesondere 2 bis 10 C-Atomen, beispielsweise eine C2-C10-Alkylengruppe, eine Phenylen- oder eine Naphthylengruppe oder eine C5- C10-Cycloalkylengruppe, wobei die Phenylen-, Naphthylen und die Cycloalky- lengruppe zusätzlich ein oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3, 4, 5, oder 6 Substituenten, z. B. Alkylgruppen mit 1 bis 4 C-Atomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 C-Atomen oder Halogen aufweisen körinen; und
FR eine reaktive Gruppe die mit einer hierzu komplementären reaktiven funktioneilen Gruppen FR" oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagieren kann.
Als reaktive Gruppen FR sowie als hierzu komplementär reaktive Gruppen FR1 kommen die im Zusammenhang mit den Gruppen R bzw. R' in Tabelle 1 genannten funktioneilen Gruppen in Betracht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Gruppen FR um Isocyanat-Gruppen.
Erfindungsgemäß weisen die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4, vorzugsweise wenigstens 5 und insbesondere wenigstens 6 Polymerarme, häufig jedoch nicht mehr als 16, insbesondere nicht mehr als 12 und speziell nicht mehr als 10 Polymerarme auf. Besonders bevorzugt weisen die sternförmigen Präpolymere 6 bis 8 Polymerarme A auf. Das zahlenmittlere Molekulargewicht der Polymerarme liegt in der Regel im Bereich von 200 bis 20000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 300 bis 10000 Dalton, insbesondere im Bereich von 400 bis 8000 Dalton und speziell im Bereich von 500 bis 5000 Dalton. Dementsprechend weist das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von in der Regel wenigstens 1500 Dalton, vorzugsweise 2000 bis 100000 Dalton, insbesondere 2500 bis 50000 Dalton und speziell 3000 bis 30000 Dalton auf.
Die Bestimmung des Molekulargewichts der sternförmigen Polymere kann in an sich bekannter Weise mittels Gelpermeationschromatographie erfolgen, wobei man auf handelsübliche Säulen, Detektoren und Auswertungssoftware zurückgreifen kann. Bei bekannter Anzahl von Endgruppen je Polymermolekül kann man das Molekulargewicht auch durch Titration der Endgruppen FR bestimmen, im Falle von Isocyanatgruppen z. B. durch Umsetzung mit einer definierten Menge eines sekundären Amins wie Dibutylamin und anschließende Titration des überschüssigen Amins mit Säure.
Die hydrogel-bildenden Eigenschaften der Oberflachenschicht wird durch die Wasserlöslichkeit der Polymerarme A gewährleistet. Sie sind in der Regel dann gewährleistet, wenn der molekulare Aufbau, d. h. zumindest die Art der Wiederholungseinheiten, vorzugsweise auch das Molekulargewicht des Polymerarms, einem Polymeren entspricht, dessen Löslichkeit in Wasser wenigstens 1 Gew.-% und vorzugsweise wenigstens 5 Gew.-% (bei 25 °C und 1 bar) beträgt.
Beispiele für derartige Polymere mit hinreichender Wasserlöslichkeit sind Poly-C2-C - alkylenoxide, Polyoxazoline, Polyvinylalkohole, Homo- und Copolymere, die wenigstens 50 Gew.-% N-Vinylpyrrolidon einpolymerisiert enthalten, Homo- und Copolymere, die wenigstens 30 Gew.-% Hydroxyethyl(meth)acrylat, Hydroxypropyl(meth)acrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylsäure und/oder Methacrylsäure einpolymerisiert enthalten, hydroxi- lierte Polydiene und dergleichen.
Vorzugsweise leiten sich die Polymerarme A von Poly-C2-C4-alkylenoxiden ab und sind insbesondere ausgewählt unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylen- oxid/Polypropylenoxid-Copolymeren, die eine Block- oder eine statistische Anordnung der Wiederholungseinheiten aufweisen können. Insbesondere bevorzugt sind sternförmige Präpolymere deren Polymerarme A von Polyethylenoxiden oder von Polyethylen- oxid/Polypropylenoxid-Copolymeren mit einem Propylenoxid-Anteil von nicht mehr als 50 % abgeleitet sind.
Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Präpolymere sind z. T. bekannt, z. B. aus der WO 98/20060, US 6,162,862, Götz et al., Macromol. Mater. Eng. 2002, 287, S. 223, Bartelink et al. J. Polymer Science 2000, 38, S. 2555, DE 10216639.0 und DE 10203937 (Polyether-Stern-polymere), Chujo Y. et al., Polym. J. 1992, 24(11), 1301-1306 (sternförmige Polyoxazoline), WO 01/55360 (sternförmige Polyvinylalkohole, sternförmige Vinylpyrrolidon enthaltende Copolymere) oder können nach den dort beschriebenen Methoden hergestellt werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Präpolymere erfolgt in der Regel durch Funktionalisierung geeigneter sternförmiger Präpolymer-Vorstufen, welche bereits die oben beschriebene Präpolymerstruktur, d. h. wenigstens 4 wasserlösliche Polymerarme, aufweisen und die an den Enden der Polymerarme je eine funktioneile Gruppe FR" aufweisen, die in eine der vorgenannten reaktiven Gruppen FR umgewandelt werden kann. Zu den Gruppen FR" zählen an aliphatische oder aromatische C-Atome, vorzugsweise an ein primäres aliphatisches C-Atom gebundene Halogen-Atome, insbesondere Chlor, Brom oder lod, an ein aliphatisches oder aromati- sches und insbesondere an ein primäres, aliphatisches C-Atom gebundene OH-Gruppen, Thiol-Gruppen und NHR2-Gruppen mit R2= Wasserstoff oder Cι-C4-Alkyl.
Derartige Präpolymervorstufen sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. aus der US 3,865,806, US 5,872,086, US 6,162,862, Polym. J. 1992, 24(11), 1301-1306, WO 01/55360 und im Handel erhältlich, z. B. im Falle sternförmiger Poly-C2-C4-alkylenoxide unter den Handelsbezeichnungen VORANOL®, TERRALOX®, SYNALOX® und DOWFAX® der Dow-Chemical Corporation, SORBETH® der Glyco-Chemicals Inc. und GLUCAM® der Amerchol Corp. oder können nach bekannten Verfahren der Polymerchemie durch Polymerisation geeigneter Monomere in Gegenwart polyfunktionelle Starter hergestellt werden, z. B. durch „lebende" Polymerisation (siehe hierzu: Hsieh, H.L.; Quirk, R.P. Anionic polymerization: Principles and Practical Applications, New York, Marcel Dek- ker, 1996; Matyjaszewski, K. Controlled/Living radical polymerization: Progress in ATRP, NMP, and RAFT, Washington, DC: American Chemical Society, 2000) oder insbesondere im Falle ethylenisch ungesättigter Monomere durch Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) nach den in WO 98/40415 beschriebenen Verfahren.
Die Funktionalisierung der sternförmigen Präpolymer-Vorstufen kann grundsätzlich in Analogie zu bekannten Funktionalisierungsverfahren des Standes der Technik erfolgen.
Zur Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Ami- nogruppen tragen, bieten sich als Ausgangsmaterialien insbesondere solche Präpolymer- Vorstufen an, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen. Die Umwandlung von OH-Gruppen in Aminogruppen kann z. B. in Analogie zu der von Skar- zewski, J. et al. Monatsh. Chem. 1983, 114, 1071-1077 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Hierzu werden die OH-Gruppen in an sich bekannter Weise, (z. B. nach Organikum, 15. Aufl., VEB, Berlin 1981 S. 241ff.; J. March, Advanced Organic Synthesis 3rd ed. S. 382 ff.; siehe auch Beispiel 12) mit einem Halogenierungsmittel wie Thionylchlo- rid, Sulfurylchlorid, Thionylbromid, Phosphortribromid, Phosphoroxychlorid, Oxalylchlorid und dergleichen, gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase wie Pyridin oder Triethy- lamin, in das entsprechende Halogenid, oder mit Methansulfonylchlorid in das entsprechende Mesylat überführt. Die so erhaltene Halogenverbindung, bzw. das Mesylat wird anschließend mit einem Alkalimetallazid, vorzugsweise in einem aprotisch polaren Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N- Methylpyrrolidon in die das entsprechende Azid überführt. Das Azid wird anschließend mit Wasserstoff in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators oder mit einem Komplexhydrid wie Lithiumaiuminiumhydrid in die Aminoverbindung überführt.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Oxi- rangruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen, mit Glycidylchlorid.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A (Meth)acrylgruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Veresterung von Präpolymer- Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen tragen, mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure oder durch Umsetzung der OH-Gruppen mit Acrylchlorid bzw. mit Methacrylchlorid, oder mit den Anhydriden der Acrylsäure oder der Methacrylsäure in Analogie zu bekannten Verfahren. Alternativ kann man in Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A NH2-Gruppen tragen, die NH2-Gruppen mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure, mit deren Anhydriden oder mit deren Säurechloriden umsetzen. Die Herstellung (Meth)acrylat-terminierter Präpolymere kann z. B. in Analogie zu den von Cruise et al. Biomaterials 1998, 19, 1287-1294 und Han et al. Macromolecules 1997, 30, 6077-6083 für die Modifizierung von Polyetherdiolen und -triolen beschriebenen Methoden erfolgen.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Thiolgrup- pen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A Halogenatome tragen, mit Thioessigsäure und nachfolgender Hydrolyse in Analogie zu dem in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Ed. E. Müller, 4. Aufl., Bd. 9, S. 749, G. Thieme, Stuttgart 1955 beschriebenen Verfahren.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Isocyanat tragen, gelingt bevorzugt durch Addition eines niedermolekularen Diisocyanats an Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-, SH-, oder NHR"-Gruppen aufweisen (R' = H, oder ein aliphatischer Rest wie C C4-Alkyl). Vorzugsweise werden sternförmige Polyole mit OH-Endgruppen eingesetzt.
Als Diisocyanate kommen sowohl aromatische Diisocyanate wie Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, kommerzielle erhältliche Mischung von Toluol-2,4- und -2,6- diisocyanat (TDI), m-Phenylendiisocyanat, 3,3'-Diphenyl-4,4'-biphenylendiisocyanat, 4,4'- biphenylendiisocyanat, 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat, 3,3'-Dichlor-4,4'- biphenylendiisocyanat, Cumen-2,4-diisocyanat, 1 ,5-Napthalindiisocyanat, p- Xylylendiisocyanat, p-Phenylendiisocyanat, 4-Methoxy-1 ,3-phenylendiisocyanat, 4-Chloro- 1 ,3-phenylendiisocyanat, 4-Bromo-1 ,3-phenylendiisocyanat, 4-Ethoxy-1 ,3- phenylendiisocyanat, 2,4-Dimethyl-1 ,3-phenylendiisocyanat, 5,6-Dimethyl-1 ,3- phenylendiisocyanat, 2,4-Diisocyanatodiphenylether, Benzidindiisocyanat, 4,6-Dimethyl- 1 ,3-phenylendiisocyanat, 9,10-Anthracendiisocyanat, 4,4'-Diisocyanatodibenzyl, 3,3'- Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylmethane, 2,6-Dimethyl-4,4'-diisocyantodiphenyl, 2,4- Diisocyanatostilben, 3,3'-Dimethoxy-4,4'-diisocyantodiphenyl, 1 ,4-Anthracenediisocyanat, 2,5-Fluorendiisocyanat, 1 ,8-Naphtalindiisocyanat, 2,6-Diisocyanatobenzofuran, als auch aliphatische und cycloaliphatische Diisocyanate wie Isophorondiisocyanat (IPDI), Ethylen- diisocyanat, Ethylidendiisocyanat, Propylen-1 ,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1 ,2- diisocyanat, Cyclohexylen-1 ,4-diisocyanat, 1 ,6-Hexamethylendiisocyanat, 1 ,4- Tetramethylendiisocyanat, 1 ,10-Decamethylendiisocyanat und Methylendicyclohexyldiiso- cyanat.
Bevorzugt sind Diisocyanate, deren Isocyanatgruppen sich in ihrer Reaktivität zu unterscheiden, wie Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, sowie Mischung von Toluol- 2,4- und -2,6-diisocyanat und eis- und trans-lsophorondiisocyanat.
Besonders bevorzugt sind sternförmige Präpolymere mit aliphatischen Diisocyana- tendgruppen, insbesondere solchen wie sie durch Addition von IPDI auf die Kettenenden von OH-Gruppen-terminierten sternförmigen Präpolymervorstufen erhalten werden.
Die sternförmigen Präpolymere werden naturgemäß so mit dem Diisocyanat umgesetzt, dass an jedes Kettenende der Sternmoleküle eine Diisocyanateinheit addiert wird, wobei die zweite Isocyanatgruppe des Diisocyanats frei bleibt. Auf diese Weise wird jede Endgruppe der Sternmoleküle über eine Urethanverknüpfung mit einer freien Isocyanatgruppe versehen. Verfahren hierzu sind z.B. aus den US 5,808,131 , WO 98/20060 und US 6,162,862, Bartelink C. F. et al., J. Polymer Science 2000, 38, 2555-2565 sowie Götz et al., Macromolecular Materials and Engineering, 2002, 287, 223-230, bekannt.
In der Regel wird man zu diesem Zweck die Präpolymervorstufe zur Vermeidung der Bildung von multimeren Addukten, d. h. Addukte, in denen zwei oder mehrere Präpolymere über Diisocyanateinheiten miteinander verknüpft sind, zu einem Uberschuss des Diisocyanats geben. In der Regel beträgt der Uberschuss wenigstens 10 Mol-%, bezogen auf die Stöchiometrie der Reaktion, d. h. man setzt wenigstens 1 ,1 Mol, vorzugsweise wenigs- . tens 2 Mol und insbesondere wenigstens 5 Mol Diiso-cyanat und speziell wenigstens 10 Mol Diisocyanat pro Mol funktioneller Gruppe in der Präpolymervorstufe ein. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion unter kontrollierten Reaktionsbedingungen, d. h. die Zugabe der Präpolymervorstufe erfolgt unter Reaktionsbedingungen so langsam, dass eine Erwärmung des Reaktorinhalts um mehr als 20 K vermieden wird. Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit eines Lösungsoder Verdünnungsmittels.
Die Umsetzung kann in Abwesenheit oder in Gegenwart geringer Mengen üblicher Katalysatoren, welche die Bildung von Urethanen fördern, erfolgen. Geeignete Katalysatoren sind beispielsweise tertiäre Amine wie Diazabicyclooctan (DABCO) und zinnorganische Verbindungen, z. B. Dialkylzinn(IV)salze von aliphatischen Carbonsäuren wie Dibutylzinn- dilaurat und Dibutylzinndioctoat. Die Menge an Katalysator beträgt in der Regel nicht mehr als 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Präpolymervorstufe, z. B. 0,01 bis 0,5 Gew.-%, insbesondere 0,02 bis 0,3 Gew.-%. In einer bevorzugten Vorgehensweise wird kein Katalysator eingesetzt.
Die erforderlichen Reaktionstemperaturen hängen naturgemäß von der Reaktivität der eingesetzten Präpolymervorstufe, des Diisocyanats, und sofern eingesetzt von der Art und Menge des verwendeten Katalysators ab. Sie liegt in der Regel im Bereich von 20 bis 100 °C und insbesondere im Bereich von 35 bis 80 °C. Es versteht sich von selbst, dass die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit von Feuchtigkeit (< 2000 ppm, vorzugsweise < 500 ppm) erfolgt.
Die Aufarbeitung der so erhaltenen Reaktionsmischung erfolgt in der Regel durch Abdes- tillieren des überschüssigen Diisocyanats, vorzugsweise bei vermindertem Druck. Die erhaltenen Reaktionsprodukte enthalten zu einem überwiegenden Anteil das sternförmige Präpolymer, das an den Enden der Polymerarme Isocyanatgruppen aufweist. Der Anteil des sternförmigen Präpolymeren beträgt in der Regel wenigstens 70 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 80 Gew.-% des Reaktionsprodukts. Die übrigen Bestandteile des Reaktionsproduktes sind im Wesentlichen Dimere und in geringen Anteilen Trimere, die in diesen Mengen ebenfalls zur Herstellung der erfindungsgemäßen Beschichtungen geeignet sind. 1 b
Die organische Oberflachenschicht ist in der Regel auf der Oberfläche eines Trägers angeordnet. Die Bereitstellung der im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren P aufgebauten organischen Oberfläche umfasst daher üblicherweise das Abscheiden der sternförmigen Präpolymere P auf der Oberfläche des Trägers und anschließendes Vernetzen der reaktiven Gruppen FR der Präpolymere P. Die Schritte der Abscheidung und der Vernetzung können gewünschtenfalls wiederholt durchgeführt werden. Man gelangt auf diese Weise zu dickeren Schichten.
In der Regel umfasst das Verfahren des Abscheidens der sternförmigen Präpolymere P die folgenden Schritte: i.a. Abscheiden des sternförmigen Präpolymeren P auf der Oberfläche eines Trägers durch Aufbringen einer Lösung wenigstens eines sternförmigen Präpolymeren, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktioneile Gruppe FR tragen, auf die Oberfläche des Trägers; i.b. anschließend Durchführen einer Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander und Entfernen des Lösungsmittels; und i.e. gegegebenenfalls Aktivieren der funktionellen Gruppen R auf der Oberfläche der Oberflachenschicht.
In Schritt i.a. erhält man eine Oberflachenschicht, die aus unvemetzten Präpolymeren aufgebaut ist und die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR auf ihrer Oberfläche aufweist. In dieser Oberflachenschicht wird eine Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander durchgeführt, wobei die Verknüpfungsreaktion nach dem Aufbringen und Entfernen des Lösungsmittels durch nachträgliches Behandeln der Oberflachenschicht mit einem Vernetzer oder beim Entfernen des Lösungsmittels erfolgen kann.
Wie bereits erwähnt, kann das Aufbringen der Biomoleküle vor, während oder nach der Verknüpfungs-rVemetzungsreaktion der Präpolymere erfolgen. Es ergeben sich somit 4 Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens, die im folgenden näher erläutert werden.
Gemäß einer ersten Variante wird man die Biomoleküle auf eine bereits vollständig vernetzte Oberflachenschicht aufbringen. Gemäß einer zweiten Variante werden die funktioneilen Gruppen R der Oberflachenschicht vor dem Aufbringen der Biomoleküle durch Behandlung mit einer geeigneten Verbindung aktiviert, um eine hinreichende Aktivität gegenüber den funktionellen Gruppen FR' der Biomoleküle bzw. eine Affinität gegenüber den Bindungstellen der Biomoleküle zu erreichen. Im Anschluß an das Aufbringen der Biomoleküle wird man dann gegebenenfalls überschüssige, d.h. nicht durch Biomoleküle belegte Gruppen FR wieder deaktivieren, im Falle von NCO-Gruppen oder Isothiocyanat- Gruppen durch Behandeln mit Wasser bzw. Wasserdampf.
Gemäß einer dritten Variante umfasst das erfindungsgemäße Verfahren:
i. Bereitstellung einer organischen Oberflachenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvemetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflachenschicht erhält die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist; ii. Aufbringen von Biomolekülen, welche funktionelle Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren, in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche, und iii. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;
oder gemäß einer vierten Variante:
i. Bereitstellung einer organischen Oberflachenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvemetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflachenschicht erhält die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist; ii. Aufbringen einer Aktivatorsubstanz (bzw. eines Haftvermittlers), welche funktioneile Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren auf der Oberfläche, iii. Aufbringen der Biomoleküle unter Anbindung and die Aktivatorsubstanz und Entfernen der nicht abreagierten Biomoleküle und iv. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;
Bei den Varianten 3 und 4 können die Schritte ii und iii bzw. ii und iv gleichzeitig oder in engem zeitlichen Zusammenhang erfolgen, d.h. Schritt ii kann durchgeführt werden, während die Vernetzung in Schritt iii bwz. iv. stattfindet. Bei den Varianten 1 bis 4 wird sternförmige Präpolymer P üblicherweise als Lösung auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht. Dementsprechend umfassen diese Verfahrensvarianten selbstredend auch die Entfernung des Lösungsmittels. Das Entfernen kann vor oder während der Vernetzungsreaktion erfolgen, jedoch stets vor Aufbringen der Aktivatorsubstanz und vor Aufbringen der Biomoleküle.
Die Vernetzung erfolgt in der Regel durch Reaktion der reaktiven Gruppen FR der Präpolymere, die an den freien Enden der wasserlöslichen Polymerarme A angeordnet sind, untereinander oder mit hierzu komplementär-reaktiven Gruppen FR' unter Bindungsbildung. Die komplementär-reaktiven Gruppen FR' können dabei sowohl sich an den Enden der wasserlöslichen Arme A sternförmiger Präpolymere befinden als auch in davon verschiedenen vernetzend wirkenden Substanzen (Vernetzer).
Beispiele für Abscheidungsverfahren sind die Immersion der zu beschichtenden Oberfläche in der Lösung des Präpolymeren sowie das Spincoating - hierbei wird die Lösung des Präpolymeren auf die mit hoher Geschwindigkeit rotierende zu beschichtende Oberfläche aufgebracht. Es versteht sich von selbst, dass man zur Herstellung ultradünner Beschichtungen die Beschichtungsmaßnahmen in der Regel unter staubfreien Bedingungen durchführt.
Bei dem Immersionsverfahren taucht man die Substrate in eine Lösung des Sternpolymers in einem geeigneten Lösungsmittel und lässt anschließend die Lösung ablaufen, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm mit möglichst einheitlicher Dicke auf dem Substrat verbleibt. Dieser wird anschließend eingetrocknet. Die resultierende Filmdicke hängt von der Konzentration der Sternpolymer-Lösung ab. Anschließend wird die Vernetzung ausgelöst.
Beim Spincoating wird in der Regel das zunächst nicht rotierende Substrat mit der Lösung des sternförmigen Präpolymeren vollständig benetzt. Anschließend wird das zu beschichtende Substrat mit hohen Umdrehungszahlen, in der Regel wenigstens 50 U/min, häufig wenigstens 500 U/min, z.B. 500 bis 30000 U/min, vorzugsweise oberhalb 1000 U/min, z. B. 1000 bis 10000 U/min, und besonders bevorzugt 3000 bis 6000 U/min, in Rotation versetzt, wobei die Lösung weitgehend abgeschleudert wird und ein dünner Be- schichtungsfilm auf der Oberfläche des Substrats verbleibt. Anschließend wird auch hier eine Vernetzung ausgelöst. Üblicherweise beträgt die Konzentration wenigstens 0,001 mg/ml, vorzugsweise wenigstens 0,01 mg/ml, insbesondere wenigstens 0,1 mg/ml, besonders bevorzugt wenigstens 1 mg/ml. Die Konzentration des Präpolymeren in der Lösung wird in der Regel einen Wert von 500 mg/ml, vorzugsweise 250 mg/ml und insbesondere 100 mg/ml nicht überschreiten. Über die Konzentration lässt sich naturgemäß die Dicke der Beschichtung steuern.
Zur Erzielung der gewünschten, hydrogel-bildenden Eigenschaften der Oberflachenschicht wird diese in der Regel eine Schichtdicke im trockenen Zustand (<10% Wasser) von wenigstens 2 nm, vorzugsweise wenigstens 5 nm und insbesondere wenigstens 10 nm aufweisen (gemessen mittels Ellipsometrie nach dem in Guide to using WVASE 32™, J. A. Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998 beschriebenen Verfahren). In der Regel wird man Beschichtungsdicken im trockenen Zustand (<10% Wasser) von insbesondere 500 μm und speziell 100 μm nicht überschreiten, um die Funktion der Biochips nicht zu beeinträchtigen. Vorteilhafte Schichtdicken liegen insbesondere im Bereich von 10 nm bis 50 μm (trocken).
Zur Herstellung der Lösungen der Präpolymere P sind grundsätzlich alle Lösungsmittel geeignet, welche keine oder nur eine geringe Reaktivität gegenüber den funktionellen Gruppen FR des zu lösenden Präpolymeren aufweisen. Hierunter sind solche bevorzugt, die einen hohen Dampfdruck aufweisen und sich somit leicht entfernen lassen. Bevorzugt sind daher solche Lösungsmittel die bei Normaldruck eine Siedetemperatur unterhalb 150 °C und vorzugsweise unterhalb 120 CC aufweisen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, z. B. Ether wie Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Diethy- lether, tert.-Butylmethylether, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Xylole und Toluol, weiterhin Acetonitril, Propionitril und Mischungen dieser Lösungsmittel. Im Falle von Präpolymeren mit OH-, SH-, Carboxyl-, (Meth)acryl- und Oxirangruppen sind auch protische Lösungsmittel wie Wasser oder Alkohole, z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropa- nol, n-Butanol und tert.-Butanol, sowie deren Mischungen mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanat-Gruppen sind neben den vorgenannten aprotischen Lösungsmitteln überraschenderweise auch Wasser sowie Mischungen von Wasser mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet, da der Abbau der Isocyanatgrup- pen der Präpolymere in derartigen Lösungen vergleichsweise langsam erfolgt.
Die Vernetzung der Präpolymere kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Beispielsweise kann die Präpolymere mit einem Vernetzungsmittel umsetzen. Als Vernetzungsmittel sind grundsätzlich alle Verbindungen mit 2 oder mehr funktionellen Gruppen FR' geeig- net, welche mit den funktionellen Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren.
Demnach erfolgt gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung die Bereitstellung der organischen Oberfläche durch ein Verfahren, bei dem man die Verknüpfung der reaktiven Gruppen FR durch Zugabe einer Verbindung V1 auslöst, die wenigstens zwei reaktive Gruppen FR' pro Molekül aufweist, die mit den reaktiven Gruppen FR des sternförmigen Präpolymers unter Bindungsbildung reagiert.
Bei den polyfunktionellen Verbindungen V1 kann es sich um niedermolekulare Verbindungen handeln, z. B. um aliphatische oder cycloaliphatische Diole, Triole und Tetraole, z. B. Ethylenglykol, Butandiol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Trimethylolpropan, Pen- taerythrit und dergleichen, aliphatische oder cycloaliphatische Diamine, Triamine oder Tetramine, z. B. Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpenta- min, 1,8-Diamino-3,6-dioxaoctan, Diaminocyclohexan, Isophorondiamin und dergleichen, Aminoalkohole wie Ethanolamin, Diethanolamin, aliphatische oder cycloaliphatische Dithiole, um Dicarbonsäuren oder Tricarbonsäuren wie Sebazinsäure, Glutarsäure, Adi- pinsäure, Phthalsäure, Isophthalsäure, oder um die vorgenannten Diisocyanate, je nachdem welche Art von reaktiven Gruppen das Präpolymer aufweist. Die niedermolekularen polyfunktionellen Verbindungen weisen im Unterschied zu den Präpolymeren in der Regel ein Molekulargewicht < 500 g/mol auf.
Die polyfunktionelle Verbindung V1 kann bereits in der Lösung des Präpolymeren enthalten sein, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird. In der zunächst entstehende Oberflachenschicht aus weitgehend unvemetzten Präpolymeren reagieren dann, z. B. beim Trocknen oder beim Erwärmen der Schicht die reaktiven Gruppen FR' des Vernetzungsmittels mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren und bilden auf diese Weise eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren, die in der Regel noch eine Vielzahl funktioneile Gruppen FR und/oder FR' auf ihrer Oberfläche aufweist.
Wenn es sich bei den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren um konjugierte Diene handelt, wird die Verbindung V1 dementsprechend wenigstens zwei dienophile Gruppen aufweisen und umgekehrt. Wenn die Präpolymere reaktive Gruppen aufweisen, die eine en-Reaktion eingehen, wird die Verbindung V1 wenigstens zwei allylische Doppelbindungen aufweisen. In der Regel wird man bei derartigen Systemen zur Herstellung der Beschichtungen Lösungen verwenden die sowohl das Präpolymer als auch die Verbindun- gen V1 enthalten. Die Vernetzung erfolgt dann beim Trocknen der primär erhaltenen Beschichtung, gegebenenfalls nach Erwärmen.
Als polyfunktionelle Verbindungen V1 sind grundsätzlich auch Präpolymere geeignet, die wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR' aufweisen, die mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren. Mit anderen Worten, zur Bereitstellung der Hydrogel-bildenden Oberflachenschicht können erfindungsgemäß auch Lösungen von wenigstens zwei unterschiedlichen Präpolymeren eingesetzt werden, worin das eine Präpolymer reaktive Gruppen FR und das andere dazu komplementäre reaktive Gruppen FR' aufweist. Auch auf diese Weise wird eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren erhalten, die in der Regel noch eine Vielzahl funktionelle Gruppen FR und/oder FR' auf ihrer Oberfläche aufweist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R ausgelöst, indem man eine ausreichende Menge einer Verbindung V2 zugibt, die mit einem Teil der reaktiven Gruppen FR unter Bildung reaktiver Gruppen FR' reagiert, welche dann mit den verbliebenen reaktiven Gruppen FR unter Bindungsbildung reagieren. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanatgruppen kann man beispielsweise die Vernetzung auslösen, indem man den beschichteten Gegenstand mit Wasser behandelt, z. B. durch Lagern in einer feuchten Atmosphäre oder unter Wasser. Hierbei reagiert ein Teil der Isocyanatgruppen unter Bildung von Aminogruppen ab, die ihrerseits mit den verbleibenden Isocyanatgruppen unter Bindungsbildung reagieren, wobei eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren entsteht. Das Vernetzungsmittel V2 ist hier somit Wasser. So hergestellt Beschichtungen weisen, wenn sie frisch hergestellt worden sind, noch freie Isocyanat-Gruppen auf. Bei längerer Einwirkung von Feuchtigkeit werden die an der Oberfläche angeordneten Isocyanatgruppen in Aminogruppen umgewandelt.
In einer Variante dieser Ausführungsform setzt man Lösungen des Präpolymeren in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser mit einem oder mehreren mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln ein. Beispiele für geeignete, mit Wasser mischbare Lösungsmittel sind insbesondere solche, die mit den Isocyanatgruppen nicht oder nur sehr viel langsamer als Wasser eine Reaktion eingehen. Beispiele hierfür sind cyclische Ether wie Tetrahydrofuran und Dioxan, weiterhin N-Alkylamide wie N-Methylpyrrolidon, Di- methylformamid und Dimethylacetamid. Das Mischungsverhältnis WasseπLösungsmittel liegt in der Regel im Bereich von 1:100 bis 100:1, vorzugsweise im Bereich von 50:1 bis 1:10 und speziell im Bereich 20:1 bis 1:1. Diese Variante eignet sich insbesondere zur Herstellung dickerer Schichten. Die Konzentration an Präpolymer liegt dann vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 500 mg/ml, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 200 mg/ml und speziell im Bereich von 1 bis 100 mg/ml.
In einerweiteren Ausführungsform der Erfindung wird man zunächst in der oben beschriebenen Weise eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, beispielsweise als Monoschicht, auf die zu beschichtende Oberfläche aufbringen, gegebenenfalls eine partielle Vernetzung der reaktiven Gruppen FR durchführen und anschließend wenigstens ein weiteres sternförmiges Präpolymer 2 auf die so behandelte Oberfläche aufbringt, das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR' aufweisen, welche eine zu den reaktiven Gruppen R des ersten Präpolymeren komplementäre Reaktivität aufweisen. Gegebenenfalls führt man im Anschluss daran eine erneute Vernetzung der verbliebenen reaktiven Gruppen FR' durch. Dieser Vorgang kann ein oder mehrmals wiederholt werden. Auf diese Weise gelingt es gezielt mehrschichtige Beschichtungen herzustellen. Diese Vorgehensweise wird im Folgenden auch als Schicht-für-Schicht-Verfahren bezeichnet. Das Schicht-für-Schicht-Verfahren kann in besonders eleganter Weise mit solchen Präpolymeren realisiert werden, die reaktive Gruppen FR aufweisen, welche mit Verbindungen V2 zu reaktiven Gruppen R' abreagieren, die eine zu den Gruppen FR komplementäre Reaktivität aufweisen. Beispiele für Gruppen FR sind Isocyanatgruppen. Die Verbindung V2 ist in diesem Fall Wasser. Als komplementär reaktive Gruppen FR' entstehen dann NH2-Gruppen. Wird nämlich die Vernetzung der ersten Schicht mit der Verbindung V2 ausgelöst, weist die erhaltene Beschichtung an ihrer Oberfläche freie Gruppen FR' (z.B. Aminogruppen) auf. Diese reagieren dann mit den Gruppen FR (z.B. Isocyanatgruppen) der in einem zweiten Beschichtungsvorgang aufgebrachten Präpolymeren unter Bindungsbildung
Neben den vernetzten sternförmigen Präpolymeren können die Oberflächenschichten auch wasserlösliche Polysacharide, wie Hyaluronate, Heparine, Alginaten oder z. B. Dextrane enthalten. Die Herstellung derartiger Beschichtungen erflogt durch gemeinsames Abscheiden von Präpolymer und wasserlöslichem Polysacharid auf der auszurüstenden Oberfläche. Bei Verwendung von Präpolymeren mit gegenüber OH-Funktionen reaktiven funktionellen Gruppen R, z. B. Isocyanatgruppen, wirkt dann das Polysacharid als Vernetzer. Polysacharid und Präpolymer bilden dann gemeinsam die hydrogelbilden- de organische Oberflachenschicht. Das Gewichtsverhältnis von Polysacharid zu stern- förmigem Präpolymer in der Beschichtung wird in der Regel einen Wert von 1:1 nicht ü- berschreiten und liegt beispielsweise im Bereich von 1:1000 bis 1:1 und speziell im Bereich von 1:100 bis 1:2.
Häufig ist es vorteilhaft, die Oberfläche des Trägers in einer Weise vorzubehandeln, dass sie eine erhöhte Anzahl (Flächendichte) an funktionellen Gruppen FR' aufweist, die mit den funktionellen Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren können.
Hierzu wird man die Oberflächen inerter Materialien häufig vor der eigentlichen Ausrüstung chemisch aktivieren. Dies kann beispielsweise durch Behandlung der zu beschichtenden Oberfläche mit Säure oder Laugen, durch Oxidation (Abflammen), durch Elektronenbestrahlung oder durch eine Plasmabehandlung mit einem sauerstoffhaltigen Plasma erfolgen wie sie von P. Chevallier et al. J. Phys. Chem. B 2001, 105(50), 12490-12497; in JP 09302118 A2; in DE 10011275; oder von D. Klee, et al. Adv. Polym. Sei. 1999, 149, 1- 57, beschrieben wurde. Die Aktivierung der Oberfläche kann auch mittels Plasmabehandlung mit einem NH3-haltigen Plasma erfolgen, wie sie in US 6,017,577, 6,040,058 und 6,080,488 beschrieben wird.
Man kann die Oberfläche des Trägers auch mit Verbindungen behandeln, die einerseits eine bekanntermaßen gute Haftung auf den Oberfläche aufweisen und die außerdem funktionelle Gruppen FR' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen FR des sternförmigen Präpolymeren komplementär sind. Derartige Verbindungen werden im Folgenden auch als Haftvermittler bezeichnet. Geeignete Gruppen FR' sind, abhängig von der reaktiven Gruppe FR des Präpolymeren: Isocyanat-, Aldehyd, Amino-, Hydroxyl-, Mercapto- und Epoxygruppen, weiterhin Gruppen, die im Sinne einer Michael-Addition reagieren, dienophile Gruppen, die Diels-Alder Additionsreaktionen eingehen, elektronenarme Doppelbindungen, die in einer Diels-Alder Addition oder En-Reaktion mit allylischen Doppelbindungen reagieren; aktivierten Estergruppen; Oxazolingruppen; sowie Vinylgruppen, spezifisch eine freie Radikaladdition eingehen.
Die Art der Gruppe, die eine Haftung auf der Oberfläche bewirkt, hängt naturgemäß von der chemischen Natur dieser Oberfläche ab. Im Fall von oxidischen, wie keramischen und glasartigen Oberflächen, sowie im Falle metallischer Oberflächen haben sich Verbindungen bewährt, die als haftungsvermittelnde Gruppen Silangruppen, insbesondere Trialko- xysilangruppen aufweisen. Beispiele für derartige Verbindungen sind Trialkoxyaminoal- kylsilane wie Triethoxyaminopropylsilan und N[(3-Triethoxysilyl)propyl]ethylendiamin, Tri- alkoxyalkyl-3-glycidylethersilane wie Triethoxypropyl-3-glycidylethersilan, Trialkoxyalkyl- mercaptane wie Triethoxypropylmercaptan, Trialkoxyallylsilane wie Allyltrimethoxysilan, Trialkoxy(isocyanatoalkyl)silane sowie Trialkoxysilyl(meth)acryloxyalkane und - (meth)acrylamidoalkane wie 1-TriethoxysiIyl-3-acryloxypropan. Für oxidische Materialien und Kunststoffmaterialien sind als haftungsvermittelnde Gruppen auch polyfunktionalen Polyammoniumgruppen geeignet. Beispiele für derartige Verbindungen sind Polyammo- niumverbindung mit freien primären Amingruppen wie sie z. B. von J. Scheerder, J.F.J Engbersen, und D.N. Reinhoudt, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1996, 115(6), 307-320, und von Decher, Science 1997, 277, 1232-1237 zu diesem Zweck beschrieben werden, weiterhin Polylysin und Polyethylenimin.
Bevorzugt werden die Haftvermittler als Monolage auf die auszurüstende Oberfläche aufgebracht. Derartige Monolagen lassen sich in an sich bekannter Weise durch Behandeln der zu beschichtenden Oberflächen mit verdünnten Lösungen der Verbindungen erreichen, z. B. nach dem oben beschriebenen Immersionsverfahren oder mittels Spincoating. Lösungsmittel und Konzentrationen entsprechen dabei den für das Aufbringen der Präpolymere gemachten Angaben. Häufig empfiehlt es sich, die Oberflächenbehandlung mit den vorgenannten Haftvermittlern im Anschluss an eine Aktivierung durch Abflammen, durch Elektronenbestrahlung oder durch Plasmabehandlung durchzuführen.
Träger im erfindungsgemäßen Sinn sind in der Regel Materialien mit starrer oder halbstarrer Oberfläche und in diesem Sinne als fest zu bezeichnen. Üblich sind planare Oberflächen. In bestimmten Fällen kann es aber von Vorteil sein, profilierte Träger zu verwenden. Erhebungen und Vertiefungen, wie Stufen, Rillen, Kanäle, Kerben, beispielsweise V- Kerben oder Mesa-Strukturen sind möglich. Diese Strukturen können so auf der Oberfläche angeordnet sein, daß sie die Immobilisierung der Biomoleküle zweckmäßig beeinflussen. Kanäle können zum Führen von Flüssigkeit dienen. Zumindest Teile der Oberfläche derartiger Träger entsprechen den erfindungsgemäßen Vorgaben.
Die Trägermaterialien unterliegen grundsätzlich keinen Einschränkungen. Beispiele für geeignete Oberflächenmaterialien sind oxidische Oberflächen, z. B. Silikate wie Glas, Quarz, Siliciumdioxid wie in Silicagelen, oder Keramik, weiterhin Halbmetalle wie Silicium, Halbleitermaterialien, Metalle und Metalllegierungen wie Stahl, Polymere wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polymethylpentene, Polypropylen, Polyester, Fluorpolymere (z. B. Teflon®), Polyamide, Polyurethane, Poly(meth)acrylate, Blends und Komposite der vorgenannten Materialien.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Oberfläche des Trägers, auf welcher die organische Oberflachenschicht bereitgestellt werden soll, eine geringe Rauhigkeit aufweist. Vorteilhafterweise beträgt der für die Rauhigkeit charakteristische Ra-Wert nicht mehr als 100 nm und insbesondere nicht mehr als 50 nm.
Die Form eines Trägers kann mannigfaltig sein und richtet sich in erster Linie nach der Art der noch zu beschreibenden Verwendung des Trägers. Es kann sich beispielsweise um Objektträger, Mikrotiterplatten, Röhrchen, Chips, Dipsticks, Stempel, Caps, Partikel, Stränge, insbesondere Faserbündel, sphärische Körper, wie Kugeln oder Kügelchen, Fällungsprodukte, Membranen, Gele, Blätter, Behältnisse, Kapillaren, Scheiben, Folien oder Platten handeln. Auch Wafer-Formate können als Träger dienen, die gewünschtenfalls vereinzelbar sind. Die Träger können ferner mit weiteren zweckmäßigen Bauteilen versehen sein, beispielsweise kann man Chips einkapseln. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist ein Körper, insbesondere in Form eines Dipsticks, mit einem Verschlußmittel, z.B. einem Schnapp- oder Schraubdeckel versehen, der, aufgesetzt auf ein passendes Behältnis, insbesondere ein Inkubationsgefäß, die auf dem Körper immobilisierten Biomoleküle mit einem im Behältnis befindlichen Probenfluid in Kontakt bringen kann. Der Körper hat vorzugsweise die Form eines Stiftes, an dessen einem Ende das Verschlußmittel und an dessen anderem Ende zweckmäßigerweise die Biomoleküle immobilisiert sind. So entspricht wenigstens ein Teil der Oberfläche des Körpers den erfindungsgemäßen Vorgaben. Praktischerweise kann der Körper aus dem Polymer auf Polycycloolefin- Basis oder einem geeigneten Verbundwerkstoff mit entsprechenden Oberflächenteilen gefornt sein. Ferner können mehrere Dipsticks - auch gemäß der vorstehend erläuterten Ausführungsform - vereinzelbar miteinander verbunden sein.
Die für die Kopplung zur Verfügung stehende Oberfläche des Trägers kann übliche Dimensionen haben, z. B. 0,5 bis 50 cm2, insbesondere 1 cm2 bis 25 cm2. Eine typische Abmessung ist 20 mm x 70 mm oder 26 mm x 76 mm oder Zwischenformate, Halbformate etc..
Das Immobilisieren der Biomoleküle auf der organischen Oberflachenschicht erfolgt in an sich bekannter Weise durch Anbindung, d.h. Kopplung der Biomoleküle an die auf der Oberfläche dieser Schicht befindlichen reaktiven funktionellen Gruppen R. Dabei kann die Anbindung sowohl auf eine noch nicht vernetzte Oberflachenschicht erfolgen als auch an eine bereits vernetzte Oberflachenschicht.
Im Falle der noch nicht vernetzten Oberflachenschicht weist die Oberfläche eine Vielzahl der Gruppen FR aus dem sternförmigen Präpolymeren auf. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei um Isocyanat-Gruppen.
Im Falle der vernetzten Oberflachenschicht kann die Oberfläche je nach Vernetzungsmittel eine Vielzahl reaktiver Gruppen R aus dem sternförmigen Präpolymeren (FR = R) oder eine Vielzahl reaktiver Gruppen R, die durch Reaktion mit dem Vernetzungsmittel entstanden sind, aufweisen. Handelt es sich bei den Gruppen FR im Präpolymeren um Isocyanatgruppen und wurde die Vernetzung durch Einwirkung von Wasser bewirkt, weist die Oberfläche in der Regel eine Vielzahl von Aminogruppen auf.
Gegebenenfalls ist es für die Kopplung der Biomoleküle erforderlich, die auf der Oberfläche befindlichen funktionellen Gruppen R in geeigneter Weise zu aktivieren. Zur Aktivierung kann man die Gruppen R in funktionelle Gruppen R2 zu überführen, die mit den funktionellen Gruppen des Biomoleküls unter Bindungsbildung reagieren, z.B. in Epoxid- Gruppen, in Isocyanatgruppen, in Aktivester, in NHS-Ester, in Michael-Systeme wie Acry- lamid-Gruppen, Vinylsulfongruppen, Acrylestergruppen oder Maleinimid-Gruppen oder in Aldehyde. Dies gelingt beispielesweise durch Aufbringen von Aktivatorverbindungen, die neben einer geeigneten funktionellen Gruppe R', welche mit den funktionellen Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagiert, eine weitere funktionelle Gruppe R2 aufweist, welche die zur Anbindung des Biomoleküls erforderliche Reaktivität aufweist. Die Aktivatorverbindung kann hierzu in einer Weise aufgebracht werden, die zu einer mehr oder weniger gleichmäßigen Aktivierung der gesamten Oberfläche führt. Man erhält auf diese Weise eine organische Oberfläche, die in gleichmäßig verteilter Weise eine Vielzahl reaktiver Gruppen R2 aufweist, welche zur Bindungsbildung mit den reaktiven Gruppen R' der Biomoleküle geeignet sind. Man kann die Aktivatorverbindung jedoch auch nur in denjenigen Bereichen (Plätzen) aufbringen, in denen die Biomoleküle auf den Array gekoppelt werden sollen. Man erhält auf diese Weise eine Oberfläche, die eine Vielzahl von Bereichen aufweist, in denen die Oberfläche reaktive Gruppen R2 trägt, wohingegen die Oberfläche ausserhalb dieser Bereiche keine oder im wesentlichen keine Gruppen R2 trägt. ,__o
Der Einsatz von Aktivatorverbindungen bietet sich insbesondere dann an, wenn die bereitgestellte Oberfläche eine Vielzahl nucleophiler Gruppen von vergleichsweise geringer Reaktivität, z.B. SH-, OH- und NH2-Gruppen, aufweist. Derartige Oberflächen werden insbesondere dann erhalten, wenn die sternförmigen Präpolymere eine derartige Gruppe aufweisen oder wenn die reaktiven Gruppen R der sternförmigen Präpolymere bei der Vernetzung in eine derartige Gruppe umgewandelt werden, z.B. im Falle Isocyanat- terminierter Präpolymere bei der Vernetzung mit Wasser (s.o.). Nach Aktivierung der O- berfläche und Koppeln der Biomoleküle empfiehlt es sich, die Oberfläche zu deaktivieren, in dem man die Oberfläche mit deaktivierenden Verbindungen, z.B. niedermolekularen nucleophilen Verbindungen wie Wasser, Alkoholen, Ammoniak, primären Aminen oder verdünntem Alkali behandelt. Die Deaktivierung erfolgt üblicherweise durch Waschen der Oberfläche mit der deaktivierenden Verbindung oder einer Lösung der deaktivierenden Verbindung in einem inerten Lösungsmittel. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt.
In einer anderen Ausführungsform sind die Biomoleküle mit geeigneten reaktiven Gruppen R3 funktionalisiert, die mit den reaktiven Gruppen R der Oberfläche unter Bindungsbildung reagieren. Bei den Gruppen R3 handelt es sich dann üblicherweise um elektrophi- le funktionelle Gruppen, die mit den nucleophilen Gruppen R der Oberfläche eine Bindungsbildung eingehen. Geeignete Gruppen R3 sind z.B. ausgewählt sind unter Aktivestergruppen, N-Hydroxysuccinimid-Estergruppen, Isocyanat-Gruppen, Isothiocyantat- Gruppen, (Meth)acryl-Gruppen und Vinylsulfongruppen. Diese Vorgehensweise bietet sich insbesondere dann an, wenn die bereitgestellte Oberfläche eine Vielzahl nucleophiler Gruppen R, z.B. SH-, OH- und NH2-Gruppen, aufweist. Derartige Oberflächen werden insbesondere dann erhalten, wenn die sternförmigen Präpolymere eine derartige Gruppe aufweisen oder wenn die reaktiven Gruppen R der sternförmigen Präpolymere bei der Vernetzung in eine derartige Gruppe umgewandelt werden, z.B. im Falle lso(thio)cyanat- terminierter Präpolymere bei der Vernetzung mit Wasser. Die Funktionalisierung der Biomoleküle kann in an sich bekannter Weise erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bindet das Biomolekül an eine auf der Oberfläche kovalent gebundene Aktivatorverbindung . Bei dieser Art von Anbindung kann es sich um eine kovalente, ionische, koordinative oder affinitive Bindung, z.B. im Sinne einer Protein-Ligand oder einer Protein-Protein-Bindung handeln. In diesem Fall weist die Aktivatorverbindung neben der zur Anbindung an die Oberfläche notwendige^) Gruppe(n) R' wenigstens eine funktionelle Gruppe oder wenigstens ein Bindungs- Zentrum auf, dass eine Anbindung der funktionellen Gruppe bzw. des Bindungszentrums des zu immobilisierenden Biomoleküls aufweist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform handelt es sich um ein Bindungszentrum, das eine koordinative Bindung zum Biomolekül ausbilden kann, die über ein Übergangsmetallatom vermittelt wird. Insbesondere handelt es sich um Übergangs- mefallatome der dritten Periode und speziell solche, die zweiwertige Ionen ausbilden können, wie in Kupfer(ll), Nickl(ll), Zink(ll), Kobalt(ll) und Eisen(ll). Vorzugsweise binden derartige Aktivatorverbindungen das Metallion chelatisierend, d. h. die Aktivatorverbindungen weisen wenigstens 2, vorzugsweise wenigstens 3, z. B. 3, 4 oder 5 funktionelle Gruppen auf, die eine koordinative Bindung zu den oben genannten Metallionen ausbilden können. Die räumliche Anordnung der funktionellen Gruppen ist dabei vorzugsweise so gewählt, dass die Anbindung in Form eines Chelats über mehrere und insbesondere alle funktionellen Gruppen der Aktivatorverbindung erfolgt. Beispiele für geeignete Aktivatorverbindungen, welche Metallatome koordinativ zu binden vermögen und die gleichzeitig eine reaktive Gruppe R' aufweisen, umfassen beispielsweise aromatische Orthohydroxy- Aldehyde wie Salicylaldehyd, funktionalisierte Pyridin- und Chinolin-Verbindungen, wie 8- Hydroxychinolin, Dipicolylamin, N-2-Pyridylmethylaminoacetat, weiterhin Polycarbonsäu- ren mit vorzugsweise wenigstens 2, z.B. 2, 3, 4, 5 oder 6 Carboxylgruppen, insbesondere Verbindungen, die wenigstens 2, z. B. 2, 3, 4, 5 oder 6 Carboxymethyl-Gruppen und gegebenenfalls eine weitere funktionelle Gruppe R' aufweisen, wie in Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und ihre Derivate, wie sie von Liu et al., Synthesis, 2002, 10, 1398, beschrieben werden, carboxymethylierte Asparaginsäure, N,N,N- Tris(carboxymethyl)ethylendiamin, N,N,N,N-Tetra(carboxymethyl)ethylendiamin (EDTA) und dergleichen, weiterhin ortho-Phosphoserin und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man ein Amino-funktionalisiertes Derivat einer Verbindung ein, die wenigstens zwei Carboxymethyl-Gruppen aufweist, insbesondere ein Amino-funktionalisiertes Derivat der Nitrilotriessigsäure wie Lysin-NTA (= 6-Amino-2- (N,N-bis(carboxymethyl)amino)-hexansäure). Die Aktivatorverbindungen, die mit Über- gangsmetallionen Komplexe bilden können, können in komplexierter Form oder vorzugsweise in unkomplizierter Form auf die Oberfläche aufgebracht werden. Bei Einsatz un- komplexierter Verbindungen V wird man dann im Anschluss eine Komplexierung durch Spülen mit einer Metallionen-haltigen Lösung durchführen. Gegebenenfalls wird man im Anschluss an das Aufbringen der Verbindung V bzw. im Anschluss an das Komplexieren der an die Oberfläche gebundenen Verbindung V einen Waschschritt einführen, um über- schüssige Verbindung V und/oder überschüssige Metallionen zu entfernen.
Im Falle von Carbonsäuren als Aktivatorverbindungen kann man diese auch in Carboxyl- geschützter Form, d. h. als Ester einsetzen. Geeignete Schutzgruppen für Carboxylgruppen sind dem Fachmann aus der einschlägigen Literatur bekannt, wobei solche Gruppen bevorzugt werden, die sich unter Bedingungen abspalten lassen, die die Hydrogel-Schicht nicht beeinträchtigen oder gar zerstören. Beispiel hierfür ist die tert.-Butylgruppe, die sich thermisch, z. B. durch Erhitzen auf 150-220°C entfernen lässt.
Bei den zur Komplexierung eingesetzten Lösungen handelt es sich üblicherweise um wässrige Lösungen wasserlöslicher Salze der Metallionen, z.B. Lösungen der Chloride, Nitrate, Sulfate, Acetate etc. Die Konzentration der Metallionen in der Lösung liegt in der Regel im Bereich von 1 mM bis 1 M. Je nach Art des Liganden und der Natur des Metallions beträgt der pH-Wert der Lösung in der Regel 5 bis 12, insbesondere 6 bis 11. Die Lösungen können gegebenenfalls noch schwache Komplexbildner enthalten, z.B. Ammoniak, um die Löslichkeit der Metallionen bei höheren pH-Werten zu gewährleisten.
In einer anderen Ausgestaltung dieser Ausführungsform weisen die Aktivatorverbindungen neben der zur Anbindung an die Oberfläche erforderlichen reaktiven Gruppe R' eine Gruppe auf, die über wenigstens 2 und vorzugsweise über wenigstens 3 Wasserstoffbrücken-Bindungen an das Biomolekül binden kann. Derartige Gruppen sind beispielsweise Oligonukleotid-Gruppen mit wenigstens 2, vorzugsweise wenigstens 3, z. B. 3 bis 100 und insbesondere 3 bis 20 Nukleotidbasen aufweisen. An diese Gruppen können solche Biomoleküle binden, die eine hierzu komplementäre Oligonukleotid-Sequenz aufweisen, wobei der Anteil komplementärer Basen wenigstens 50% betragen sollte.
In einer weiteren Ausgestaltung dieser Ausführungsform setzt man als Aktivatorverbindungen solche Substanzen ein, die bekannterweise mit Biomolekülen eine affinitive Wechselwirkung eingehen. Beispiele für geeignete Aktivatorverbindungen dieses Typs sind Liganden, z.B. Haptene und Antikörper, die so funktionalisiert sind, d.h. eine Gruppe R' aufweisen, dass die mit der Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren können. Hierzu zählen auch chemische Verbindungen, die neben wenigstens einer reaktiven Gruppe R' eine weitere Molekülgruppe oder Aminosäure-Sequenz aufweisen, die mit dem Biomolekül im Sinne einer affinitiven Wechselwirkung, beispielsweise einer Protein-Ligand oder Protein-Protein-Wechselwirkung binden können. Beispiele hierfür sind Biotin-Derivate, die mit einer Gruppe R' modifiziert sind und somit einen Anker für Biomoleküle bilden, die ein Streptavidin- oder Avidin-Sequenz aufweisen, sowie Strepta- vidin-und Avidin-Derivate, die mit einer Gruppe R' modifiziert sind, so dass sie einen Anker für biotinylierte Biomoleküle darstellen.
In den Varianten 3 und 4 des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die in Schritt i bereitgestellten Oberflächen herstellungsbedingt eine Vielzahl reaktiver, typischerweise e- lektrophiler Gruppen R auf, die sich für eine Anbindung von Biomolekülen qualifizieren, ohne dass es einer Aktivierung bedarf. Beispiele hierfür sind insbesondere Isocyanat- Gruppen, die sich einerseits in einfacher Weise durch Einwirkung von Wasser vernetzen lassen, andererseits eine hohe Reaktivität gegenüber nucleophilen Gruppen, z.B. SH-, OH- und NH2-Gruppen, aufweisen. Nach dem Koppeln der Biomoleküle auf die Oberfläche empfiehlt es sich, die überschüssigen reaktiven Gruppen R in der oben beschriebenen Weise zu deaktivieren. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Variante 3 wird zur Bereitstellung der organischen Oberflachenschicht eine Lösung eines oder mehrerer der sternförmigen Präpolymere, das als reaktive Gruppen FR Isocyanatgruppen aufweist, in der oben beschriebenen Weise auf den Träger aufgebracht und entweder durch Entfernen des Lösungsmittels zu einer festen Beschichtung getrocknet und/oder durch Einwirkung von Feuchtigkeit partiell vernetzt. Die so erhaltene Oberflachenschicht weist dann noch hinreichende Mengen an Isocyanatgruppen als Gruppen R auf, die eine Kopplung solcher Biomoleküle erlauben, die eine oder mehrere nucleophile Gruppen R', z.B. SH-, OH- und NH2-Gruppen, aufweisen. Eine partielle Vernetzung gelingt in besonders einfacher Weise, indem man das Isocyanat-Gruppen aufweisende, sternförmige Präpolymer in einem wässrigen Lösungsmittel wie oben beschrieben auf den Träger aufbringt, das Lösungsmittel zumindest teilweise unter erhalt einer Beschichtung entfernt und unmittelbar im Anschluss daran, spätestens jedoch nach 2 h, vorzugsweise nicht später als 1 h, die Biomoleküle auf die so erhaltene Oberfläche in voneinander räumlich getrennten Bereichen auf die so generierte Oberfläche aufbringt. Hierbei kommt es zu einer Reaktion der Isocyanat-Gruppen mit den reaktiven Gruppen R' des Biomoleküls unter Ausbildung von Urethan/Hamstoffgruppen, wodurch die Biomoleküle auf der Oberfläche chemisch gebunden werden. Gegebenenfalls werden im Anschluss daran überschüssige Isocyanatgruppen durch Behandlung mit Wasser oder wässrigen Lösungen deaktiviert. Hierbei werden auch überschüssige Biomoleküle, die nicht an die Oberfläche gekoppelt sind, entfernt. Erfindungsgemäß weisen die Biomoleküle wenigstens eine zur Kopplung an die reaktiven Gruppen R der Oberfläche qualifizierter reaktive Gruppen R' auf. Diese Gruppe kann in dem eigentlichen Biomolekül vorliegen oder über einen Spacer mit dem Biomolekül verbunden sein, d.h. das Biomolekül wurde in an sich bekannter Weise funktionalisiert, so dass es eine oder mehrere reaktive Gruppen R' aufweist, die von dem eigentlichen Biomolekül über eine Molekülgruppe (Spacer) räumlich getrennt ist.
Als Spacer eignen sich beispielsweise homobifunktionelle Verbindungen, wie Diamine, Disäuren, z.B. Dicarbonsäuren, oder Ethylenglycol-Oligomere, bzw. heterobifunktionelle Verbindungen, wie Aminosäuren, z.B. ß-Alanin, Glycin, 6-Aminocaprinsäure oder v- Aminobuttersäure, Arylacetylene, Biotine, Avidine, Strepavidine, Oligosaccharide, z.B. aus Ribosen oder Desoxyribosen, Nukleinsäuren, vor allem oligo-(d)A oder -(d)T, Fettsäuren, Phosphorsäureester sowie Derivate und/oder Kombinationen davon.
Spacer können auch aus mehreren Teilen (Linkern) aufgebaut sein, die miteinander durch kovalente und/oder nichtkovalente Bindungen verknüpft sind. Beispiele für kovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind heterobifunktionelle Elemente, wie Aminosäuren, beispielsweise 6-Aminocapronsäure oder γ-Aminobuttersäure, von denen mehrere zur Verlängerung eines Spacers miteinander verbunden werden können. Beispiele für nicht- kovalent verknüpfbare Teile eines Spacers sind Moleküle, zwischen denen sich Affinitätsbindungen ausbilden können, wie zwischen Biotin und Avidin bzw. Streptavidin oder deren Analoga.
Spacer können eine oder auch mehrere Bindungsstellen für Biomoleküle aufweisen (z.B. Dendrimere). Die vorstehend genannten heterobifunktionellen Elemente beispielsweise weisen in der Regel eine, zwei oder drei derartige Bindungsstelle auf, während Affinitätsbindungen ausbildende Moleküle, wie Avidin oder Streptavidin, mehrere Bindungsstellen aufweisen. Letzteres kann zu einer vorteilhaften Erhöhung immobilisierter Biomoleküle pro Flächeneinheit führen.
Spacer können auch variable Bindungsteilen aufweisen, die in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Konfiguration unterschiedliche Bindungsmöglichkeiten bieten. Dies gilt insbesondere für Affinitätsbindungen, deren Bindungsaffinität je nach Konfiguration der beteiligten Bindungspartner variieren kann. Bevorzugte Spacer basieren auf Diaminen der Formel III
-NH-(CHR1)m-NH- (III)
Aminosäuren der Formel IV
-NH-(CHR1)m-CO- (IV)
Polyethylenglykolen der Formel V
-(OCH2CH2)n2- (V)
Oligo-Zuckerphopshaten der Formel VI
-(O-PO2-O-5'-Zucker-3')n1-O-PO2- (VI)
oder Kombinationen davon, insbesondere
-NH-(CHR1)n1-NH-(OCH2CH2)n2- (VII)
wobei in den Formeln III bis VII n1 einem Wert von 1 bis 50 und insbesondere von 5 - 20 entspricht und n2 einem Wert von 2 bis 100 und vorzugsweise 5 bis 50 entspricht, R1 die für α-C-Substituenten natürlich vorkommender Aminosäuren, insbesondere für Wasserstoff und CrC4-Alkyl steht, wobei mehrere Reste R1 gleich oder verschieden sein können (bei n1 ≠ 1) und der Zucker insbesondere Ribose und Desoxyribose, vorzugsweise in der D-Form, ist. In der Kombination entspricht n1 insbesondere einem Wert von 2 bis 6 und bevorzugt von 3 während n2 insbesondere einem Wert von 2 bis 20, bevorzugt 4 bis10, z.B. 6, entspricht. Die funktionelle Gruppe R' ist dann an dem zum Biomolekül distalen Ende des Spacers angeordnet.
Die Anbindung von Spacern an Biomoleküle sind grundsätzlich bekannt. Kovalent angebundene Spacer, insbesondere über -O-, -NH- oder -S- angebundene Spacer, werden bevorzugt. Biomoleküle können dazu bestimmte Funktionalitäten vorgeben, sie können aber auch zweckmäßig modifiziert werden. Beispielsweise können Proteine über Amino-, Sulfid oder Carboxygruppen, und Nukleinsäuren über 5'- oder 3'-OH-Gruppen binden. Proteine können beispielsweise in an sich bekannter Weise reduktiv modifiziert werden, um Disulfidbrücken in freie Sulfidgruppen zu überführen, und Nukleinsäuren können beispielsweise mit bekannten und auch kommerziell erhältlichen Reagenzien umgesetzt werden, um terminale OH-Gruppen in Aminogruppen aufweisende Gruppen zu überführen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind Nukleinsäuren über ihr jeweiliges 5'-Ende an den Spacer gebunden. Vorteilhafterweise kann dies über Polyethylenglykol- Spacer erfolgen, insbesondere den Spacern der Formel VII.
Zum Aufbringen der Biomoleküle sind prinzipiell alle Techniken geeignet, die eine definierte und reproduzierbare Abgabe einer bestimmten Flüssigkeitsmenge erlauben. Beispielsweise können Techniken wie Pipettieren einschließlich Spotting-Techniken, Dispensieren, Drucken, Stempeln einschließlich Mikrokontakt-Drucken (μCP-Technik), weiterhin die Wellpad-Technik, Technik mikrofluider Netzwerke (μFN) und kombinierte Methoden zur Anwendug kommen.
Verfahren hierzu sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. aus US 5,512,131, US 5,731 ,152 Kane et al., Biomaterials 1999, 20, S. 2363-2376; Bernard et al., Langmuir 1998, 14, S. 2225-2229; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, S. 8395 ff.; Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519-523; Martin et al., Langmuir 1998, 14, S. 3971-3975; Donzel et al., Adv. Mater. 2001, 13, S. 1164; (Stempeltechnik), Delamarche et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, S. 500-508 (μFN-Technik); Hyun et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 6943-6944 (Wellpad-Technik); Inerowicz et al., Lanmuir 2002, 18, 5263-5268 (kombinierte Wellpad- μCP-Technik). Eine Übersicht über weitere geeignete Methoden, insbesondere Lithographiemethoden und Spotting-Techniken, die für die Herstellung von Arrays immobilisierter Biomoleküle geeignet sind, findet man auch in Cheng et al., Biochip Technology, Harvard Academic Publishers, 2001; in WO96/29629 (Micro-Drucktechnik), Anal. Chem. 1997, 69, S. 543-551, US 5,843,767 und US 5,837,860. Geeignet sind auch kommerziell erhältliche Vorrichtungen wie Omnibrid® von Genemachines Inc., San Carlos, CA, USA, und High- Throughput-Arrayer der Fa. Bioinstruments, Cambridge, Massachusets, USA.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Biomoleküle mittels einer Stempeltechnik, dem sogenannten μCP-Verfahren, auf die organische Oberflachenschicht aufgebracht. Eine Übersicht über derartige Verfahren findet man in Xia et al., Chem. Ref. 1999, 99, S. 1823-1848, angew. Chem. Int. ed. 1998, 37, S. 550-575. Eine Übersicht über die Anwendung der μCP-Technik für das Aufbringen von Biomolekülen findet man in Kane et al., Biomaterials 1999, 20, S. 2363-2376.
Bei der μCP-Technik wird ein Stempel, der eine Vielzahl von Erhebungen aufweist, mit einer Lösung des Biomoleküls, das immobilisiert werden soll, benetzt. Anschließend wird der Stempel auf die organische Oberflachenschicht aufgedrückt. Auf diese Weise erhält man ein Muster (Array) immobilisierter Biomoleküle auf der organischen Oberflachenschicht. Die Anordnung und Anzahl der Plätze immobilisierter Biomoleküle auf der organischen Oberflachenschicht entspricht dabei der Anordnung und Anzahl der Erhebungen auf der Stempelfläche.
In der Regel wird die Stempelfläche von einem elastischen Material gebildet, um eine möglichst optimale Übertragung der Biomoleküle auf die organische Oberflachenschicht zu gewährleisten. Geeignete Stempel sind z. B. aus den Publikationen von Xia et al. (s. o.), Bernard et al., Adv. Mater. 2000, 12, 1067-1070, und Kane et al. (s. o.) bekannt. Die Anzahl und Anordnung der Erhebungen richtet sich, wie oben gesagt, nach der Geometrie des Arrays. In der Regel sind die die Erhebungen säulenförmig mit einer kreisförmigen elipsoiden, rechteckigen oder streifenförmigen Stirnfläche. Bevorzugt sind kreisförmige oder elipsoide Geometrien. Im Falle säulenförmiger Erhebungen weisen die einzelnen Erhebungen im Mittel-Durchmesser im Bereich von 0,1 μm bis 100 μm auf. Der Durchmesser bezieht sich hier auf den doppelten Wert des mittleren Abstands der Begrenzungslinie der Stirnfläche zu ihrem Flächenmittelpunkt. Im Falle einer rechteckigen Anordnung entspricht der hier angegebene Durchmesser dann in Näherung dem Mittelwert der Diagonalen und Höhen der Stirnfläche. Die Höhe der Erhebungen ist von untergeordneter Bedeutung. Sie wird in der Regel jedoch einen Wert von 0,5 μm und insbesondere 1 μm nicht unterschreiten. In der Regel liegt sie im Bereich von 1 μm bis 500 μm, wobei aus Stabilitätsgründen in der Regel ein Verhältnis von Höhe der Erhebung h zu Durchmesser d von h/d < 5 insbesondere < 2 gewährleistet bleibt. Der Abstand zwischen den Erhebungen liegt in der Regel im Bereich von 0,1 μm bis 100 μm, insbesondere 1 bis 100 μm und speziell 5 bis 50 μm, abhängig von dem gewünschten Flächenmuster des Arrays. Entsprechende Abmessungen gelten auch für Stempelflächen mit streifen- bzw. bandförmigen Erhebungen.
Als Stempelmaterialien sind grundsätzlich elastische Materialien geeignet. In der Regel handelt es sich bei den Stempelmaterialien um Polydimethylsiloxan-ärtige Materialien, wie sie im Stand der Technik zu diesem Zweck bereits eingesetzt werden. Gelegentlich hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Stempelfläche zu hydrophilisieren, beispielsweise durch Behandlung mit Sauerstoffplasma wie von Donzel et al., in Adv. Mater. 2001 , 13, S. 1164-1167 beschrieben.
Für eine saubere Übertragung der Biomoleküle auf die Oberfläche hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Stempelfläche nach Benetzen mit der Lösung des Biomoleküls zu trocknen. Weiterhin hat es sich als günstig erwiesen, wenn die Konzentration der Biomoleküle in der Lösung im Bereich von 1 mmol/ml bis 1 μmol/ml liegt.
Brauchbar sind weiterhin kontaktfreie Verfahren wie Piezodispenser und Druckpuls- dispenser. Hier hat sich die Kontrolle von Temperatur und relativer Luftfeuchte zur Vermeidung von Satellitenspots als zweckmäßig erwiesen. Vor allem bei Kunststoffträgern ist die Erdung des Trägermaterials zur Ableitung von elektrostatischer Ladung sinnvoll.
Brauchbar sind auch kontaktierende Verfahren, wie Kapillardispenser, welche die Flüssigkeit mit einer dünnen Kapillare, beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1,5 bis 5 μm, auftragen, und die sogenannte Pin- und Ring-Technologie. Über die Polarität des zu dispensierenden Mediums kann ein optimaler Tropfenabriß gewährleistet werden, z.B. durch Zusatz von Salz oder Lösungsmitteln wie Ethanol oder 1-Propanol.
Die abgegebene Flüssigkeitsmenge ist von Bedeutung, da sie die Fläche, auf der die Biomoleküle immobilisiert werden, also insbesondere die Spotgröße bestimmt. In der Regel werden Flüssigkeitsmengen im Femto- bis Nanoliter-Bereich aufgebracht. So sind Spots mit einem Durchmesser von etwa 150 bis 200 μm mit einer kontaktfrei aufgebrachten Menge von etwa 10 nl bis 2 μl erhältlich. Spots mit Durchmessern im Bereich von 10 μm können erzeugt werden, indem man mittels Kapillardispensern Mengen von etwa 0,01 nl bis 0,1 μl aufbringt.
Nach dem Aufbringen der Biomoleküle läßt man in der Regel zunächst das Lösungsmittel verdampfen. Dies kann wegen relativ geringer Flüssigkeitsmengen normalerweise bei Raumtemperatur erfolgen, kann aber auch durch Wahl geeigneter höherer oder niedrigerer Temperaturen beeinflußt werden. Die Kopplungsreaktion erfolgt demgemäß im wesentlichen nicht in Lösung, wobei allerdings ein Restgehalt an Lösungsmittel von Vorteil sein kann. Im Anschluß an das Aufbringen der Biomoleküle und die damit einhergehende Kopplung organische Oberfläche wird in der Regel ein Waschvorgang durchgeführt. Zweck dieses Waschvorgangs ist es insbesondere, nicht gekoppelte Biomoleküle zu entfernen. In Anlehnung an die zuvor zum Aufbringen der Biomoleküle verwendete Lösung werden zum Waschen ebenfalls wäßrige Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet. Prinzipiell gelten obige Ausführungen hier entsprechend.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wäscht man mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das ein Tensid, vorzugsweise ein nichtionisches Tensid, enthält. Besonders bevorzugt sind polyalkoxylierte, insbesondere polyethoxylierte Fettsäurester von Polyolen, insbesondere von Glycerin oder Sorbitol, beispielsweise die unter dem Handelsnamen Tween® vertriebenen Sorbitanfettsäureester. Insbesondere hat sich die Verwendung von ethoxyliertem Sorbitanhexylaurat als zweckmäßig erwiesen.
Die Konzentration an Tensid in der Waschlösung wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß einerseits eine effektive Entfernung nicht gekoppelter Biomoleküle gewährleistet ist, andererseits die Waschlösung mit den immobilisierten Biomolekülen kompatibel ist. Konzentrationen im Bereich von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 0,05 Gew.-% bis 2 Gew.-% haben sich als zweckmäßig erwiesen.
Die Konzentration der Biomoleküle in der aufzubringenden Lösung ist variabel und richtet sich insbesondere nach der gewünschten Dichte und Molekulargewicht immobilisierter Biomoleküle. Konzentrationen im Bereich von 1 nmol/ml bis 1 μmol/ml können eingesetzt werden, wobei im unteren Konzentrationsbereich in bestimmten Fällen eine Absättigung der Oberfläche mit Biomolekülen nicht erreicht wird, während dies im oberen Konzentrationsbereich der Fall ist und überschüssige Biomoleküle, die aufgrund der Sättigung nicht gekoppelt haben, anschließend entfernt werden können. Konzentrationen oberhalb von wenigstens 10 nmol/ml und insbesondere wenigstens 20 nmol/ml haben sich zwecks Sättigung der Oberfläche bei zufriedenstellender Homogenität der immobilisierten Biomoleküle als zweckmäßig erwiesen.
Nach dem Waschen mit tensidhaltigem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch können sich weitere Waschschritte anschließen. Dazu kann es zweckmäßig sein, organische Lösungsmittel, insbesondere niedere Alkohole, beispielsweise Isopropanol, zu verwenden, die dann anschließend durch Spülen mit Wasser wieder entfernt werden können. Schließlich trocknet man die Oberfläche unter üblichen Bedingungen, bequemerweise bei Umgebungstemperatur und gewünschtenfalls durch Trockenblasen durch Luft oder Inertgas.
Auf diese Weise werden Arrays erhalten die eine Vielzahl von Plätzen mit immobilisierten Biomolekülen aufweisen. Prinzipiell können auf einen Array pro cm2 Trägeroberfläche mehr als 10, 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000, 400000 oder 1000000 definierte Plätze (Bereiche) angeordnet sein. In der Regel weisen erfindungsgemäße Arrays 5 —10000 Plätze/mm2 auf. Eine besondere Ausführungsform sind Arrays mit 5 - 100 Plätzen/mm2 und insbesondere 10 bis 50 Plätzen/mm2 (low density). Eine weitere besondere Ausführungsform sind Arrays mit 100 - 10000 Plätzen/mm2 und insbesondere 500 - 2500 Plätzen/mm2 (high density). An verschiedenen Plätzen können gleiche oder verschiedene Biomoleküle immobilisiert sein.
Die Plätze, an denen Biomoleküle immobilisiert sind, also insbesondere Felder immobilisierter Biomoleküle, können unterschiedliche Geometrien aufweisen. Prinzipiell kann die Form beliebig sein, z.B. kreisförmig, rechteckig, quadratisch oder elliptisch. Die Fläche beträgt vorzugsweise weniger als 1 mm2, insbesondere weniger als 10000 μm2, und ganz besonders bevorzugt weniger als 1000 μm2.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind Biomoleküle als Spots immobilisiert, d.h. als im wesentlichen kreisförmige Felder. Derartige Spots haben vorzugsweise Durchmesser in einem Bereich von 1 μm bis 1000 μm, insbesondere 2 μm bis 50 μm oder 50 μm bis 500 μm. Insbesondere Spots mit Durchmessern unterhalb von 200 μm und vor allem unterhalb von 50 μm oder 20 μm lassen sich mit der oben beschriebenen μCP-Technik vorteilhaft verwirklichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Arrays handelt es sich bei den Biomolekülen um Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide mit einer Länge von 2 bis 500 Basen. In der Regel sind die immobilisierten Oligonukleotide in der Lage, an eine Target-Nukleinsäure zu binden. In diesem Sinne werden die immobilisierten Oligonukleotide auch als Sonden bezeichnet.
Die Sonden sind in der Regel einzelsträngige Oligomere. DNA, RNA sowie Nukleinsäure- Analoga und -Derivate, wie, gegebenenfalls modifizierte, PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA können verwendet werden. Die Mindestlänge der Sonden hängt ab von der Komplexität der Probe, insbesondere der Anzahl der Basen nachzuweisender Nukleinsäuren, aber auch von der Art des als Sonde verwendeten Nukleinsäure- typs und der erreichbaren thermodynamische Stabilität zwischen Probe und Sonde.
In Abhängigkeit vom Nukleinsäuretyp weisen Sonden üblicherweise ein Länge von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA-LNA Hybride, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für PSNA, von 6 bis 30, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für LNA, und von 6 bis 18, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für PNA auf.
Bei relativ geringer Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. Amplifikaten, insbesondere PCR-Amplifikaten, Viren, Plasmiden und Mikroorganismen, insbesondere für Anwendungen wie den Nachweis von Mutationen, SNPs oder Methylierungen (Epige- netics), sind relativ kürze Sonden, etwa im Bereich von 8-25meren und insbesondere 8- 15meren, zweckmäßig. Bei relativ hoher Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. nichtamplifizierter RNA; über cDNA gesamtamplifizierter RNA, nichtamplifizierter gesamtgenomischer DNA und amplifizierter gesamtgenomischer DNA, insbesondere für Anwendungen wie Genexpressions-Bestimmungen oder den Nachweis genomischer Amplifikationen bzw. Deletionen, sind längere Sonden, etwa im Bereich von 16-60meren und insbesondere 25-50meren für synthetische Sonden, zweckmäßig oder die Sonden bestehen aus PCR-Produkten, cDNA, Plasmiden oder DNA aus lysierten Bakterien, die auch eine darüber hinaus gehende Basenanzahl aufweisen können.
Die Basenabfolge der Sonden richtet sich vornehmlich nach ihrer Funktion. Eine Testsonde weist in der Regel eine Basenabfolge auf, die zu einer bestimmten Targetsequenz einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist oder einem anderen Aspekt zufolge mit der Targetsequenz spezifisch hybridisieren kann. Eine Kontrollsonde kann insbesondere die Funktion einer Normalisierungs-, Mismatch-, Housekeeping-, Probenzube- reitungs-, Hybridisierungs- oder Amplifikationskontrolle haben und dementsprechend eine Basenabfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer Referenz- Nukleinsäure, einer nachzuweisenden Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge, einer konstitutiv exprimierten Nukleinsäure, z.B. einer vom ß2-Mikroglobulin, ß-Aktin-, GAPDH-, PBGD-, Ubiquitin-, Tubulin- oder Transferrin-Rezeptor-Gen abgeleiteten Nukleinsäure, einer speziesspezifischen Nukleinsäure bzw. eines Amplifikats. Sind die immobilisierten Biomoleküle gemäß obiger besonderer Ausführungsform mit einer Markierung versehen, so kann sich nun eine Qualitätskontrolle des Arrays anschließen. Dazu kann der Array mit einem der Markierung entsprechenden Detektionssystem vermessen werden. Über die gemessene Menge an immobilisierter Markierung lassen sich insbesondere die Kopplungseffizienz und damit die Immobilisierung der Biomoleküle in Bezug auf Fläche, Homogenität und Dichte beurteilen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemäßer Arrays für analytische und insbesondere diagnostische Zwecke.
Beispielhaft seien folgende Anwendungen genannt:
Diagnostik, Therapiewahl und Therapiekontrolle von Tumor- und Stoffwechselerkrankungen; Untersuchung der genetischen Prädisposition (SNPs), insbesondere die Detektion von Mutationen, auch im forensichen Bereich; Nachweis von Promotormethylierungen (Epigenetics); Genexpressionskontrolle; Sequenzierung, insbesondere Sequenzierung durch Hybridisierung; Mikrobiologische Anwendungen wie in Bakteriologie und Virologie, beispielsweise zur Differenzierung verschiedener Stämme; ELISA-Anwendungen mit immobilisierten Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren und Liganden in der klinischen Chemie bis hin zur Lebensmittelchemie und Umweltanalytik; Allergiediagnostik mit immobilisierten Allergene; High Throughput Screening von Substanzbibliotheken; Toxicogenomics.
Prinzipiell eignen sich erfindungsgemäße Arrays sowohl für nichtkompetitive als auch für kompetitive analytische Verfahren (Assays).
Bei nichtkompetitiven Assays tritt die zu analysierende Substanz (Analyt) mit den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung. In der Regel wird der Analyt zuvor markiert, möglich ist aber auch eine Markierung, nachdem der Analyt bereits mit den immobilisierten Biomolekülen in Wechselwirkung getreten ist, z.B. mittels Primer Ex- tension oder Rolling-Cycle-PCR. In diesen Fällen erhält man ein Meßsignal, das um so größer ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Es ist auch möglich, daß durch die Wechselwirkung der Probe mit den auf der Oberfläche immobilisierten Substanzen die Fluoreszenz der immobilisierten Substanzen verändert wird (Abschwächung, Verstärkung, z.B. Mole- cular Beacons) oder die Aktivität eines Enzyms verändert wird und diese Änderung als Meßsignal registriert wird. Beispiele für nichtkompetitive Assays sind Hybridisierungsreak- tionen von PCR-Produkten oder markierter DNA/RNA an auf der Oberfläche immobilisier- te Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide oder cDNA, sowie Sandwichimmunoas- says.
Bei kompetitiven Verfahren wird der Probe eine markierte Substanz (Marker) zugesetzt, die ähnliche Bindungseigenschaften zu den auf der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen hat wie der Analyt selbst. Es findet eine Konkurrenzreaktion zwischen Analyt und Marker um die begrenzte Anzahl von Bindungsplätzen auf der Oberfläche statt. Man erhält ein Signal, das um so niedriger ist, je mehr Analyt vorhanden ist. Beispiele für kompetivie Assays sind Immunoassays (ELISA) und Rezeptorassays).
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.
Abbildung 1 : Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines fluoreszenz-markierten Nucle- otid-Arrays mit Spots im Abstand von 20 μm und einem Spotdurchmesser von 5 μm. Abbildung 2a: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Arrays mit streifenförmigen Bereichen eines immobilisierten Biotin-Streptavidin-Systems mit Fluoreszenzmarker, wobei die Streifen eine Breite von 5 μm und einen Abstand von 10 μm zwischen den Streifen aufweisen.
Abbildung 2b: Intensitätsverteilung der Fluoreszenz des Arrays aus Figur 2a entlang einer Linie senkrecht zu den Streifen.
Abbildung 30: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Arrays mit punktförmigen Bereichen eines immobilisierten Green-FIuoreszend-Proteins
Beispiele
I. Herstellungsbeispiele: Sechsarmige Isocyanat-terminierte Polyether.
Als Isocyanat diente in allen Fällen ein handelsübliches Isophorondiisocyanat (IPDI: 72 % eis- und 28 % trans-lsomer)
Bei den eingesetzten Präpolymervorstufen handelt es sich um handelsübliche 6- armige Polyalkylenether (im Folgenden Polyole), die durch anionische ringöffnende Polymerisation aus Ethylenoxid und/oder Propylenoxid unter Verwendung von Sor- bitol als Initiator hergestellt wurden. Das eingesetzte Polyol wurde vor Einsatz auf einen Restwassergehalt von weniger als 350 ppm getrocknet. Reste des für die Herstellung der Polyole eingesetzten Alkalihydroxids wurden durch Neutralisieren mit Phosphorsäure gebunden.
Das Polyol wurde in allen Herstellungsbeispielen über eine Pumpe langsam zugegeben (ca. 80 ml/h), so dass die Reaktionstemperatur nicht mehr als 10 K von der angegebene Temperatur abwich.
Die Bestimmung des Molekulargewichts (angegeben ist jeweils das Zahlenmittel) erfolgte durch Gelpermeationschromatographie bei Raumtemperatur an drei in Reihe geschalteten Säulen (Säule 1: Waters μ-Styragel 1000 Angström, I = 30 cm; Säule 2: Waters μ-Styragel 100 Angström, I = 30 cm; Säule 3: PSS SDV 50 Angström, I = 60 cm) unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Eluenten, einen Refraktometrie-Detektor (Waters Rl 2410) und unter Verwendung der Auswertungssoftware PSS Win-GPC V 4.02. Die Elutionsdiagramme wurden zur Auswertung an zwei Gausskurven angepasst, wobei über die Flächenverhältnisse der Anteil an Bi-/Trimer bestimmt wurde.
Die Charakterisierung der Endgruppen funktionalisierter Präpolymere sowie die Funktionalisierungsausbeute erfolgte, wo angegeben, zudem elementaranalytisch (Schwefel, Stickstoff), mittels IR-Spektroskopie (v SH, C=O, NH) oder mittels Titration (nicht umgesetzte OH-Gruppen).
Die Bestimmung der nicht umgesetzten OH-Gruppen erfolgte durch Umsetzung der Präpolymere mit Acetanhydrid in Pyridin und Titration überschüssiger Säure (Hydrolyse des nicht umgesetzten Acetanhydrids) mit NaOH.
Herstellungsbeispiel 1 :
Das verwendete sternförmige Polyetherpolyol ist ein 6-armiges statistisches Po- ly(ethylen/propylenoxid) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem Molekulargewicht von 3100 g/mol. Vor der Umsetzung gab man 0,05 Gew.-% Phosphorsäure zu dem Polyol und erwärmte unter Rühren 1 h auf 80 °C im Vakuum. Das verwendete Isophorondiisocyanat (IPDI) wurde vor Benutzung im Vakuum destilliert (95°C/0,01 mbar) In einem Reaktor legte man 125 ml (0,59 mol) vor und erwärmte unter Schutzgas- Atmosphäre auf 50 °C. Danach gab man unter heftigem Rühren das getrocknete und entgaste Polyol (20 g, 6,45 mmol) mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe langsam zu (ca. 80 ml/h). Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50 °C für weitere 60 Stunden gerührt. Überschüssiges IPDI wurde bei 100 °C und einem Druck von 0,001 mbar mit Hilfe einer Dünnschichtdestillationsapparatur vollständig abdestilliert. Man erhält auf diese Weise ein sternförmiges 6-Arm- Präpolymer, das an den Enden seiner Polymerarme Isocyanatgruppen aufweist.
Herstellungsbeispiel 2:
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden 30 g (2,5 mmol) eines 6-armigen, statistischen Poly(ethylenoxid/propylenoxids) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 12000 mit 48 ml (0,23 Mol) IPDI umgesetzt. Nach Dünnschichtdestillation (100 °C/0,001 mbar) erhielt man das Isocya- nat-terminierte Stern-Präpolymer. Der Anteil höherer Oligomere beträgt weniger als 1 Gew.-%.
Herstellungsbeispiel 3:
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden 20g (1 ,11 mmol) ein 6-armiges, statistisches Poly(ethylenoxid/propylenoxids) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 18000 mit IPDI (42 ml, 0,2 mol) umgesetzt. Nach Dünnschichtdestillation (100 °C/0,001 mbar) erhielt man das Isocyanat- terminierte Stern-Präpolymer.
Aminofunktionalisierung des Trägers:
Die Substratoberflächen (Glasplättchen, Mikroskopieträger oder Siliziumträger) wurden zunächst vorbehandelt. Hierzu wurden die durch Wasser und Aceton vorgereinigten Substrate in einer Plasmaanlage des Typs TePla 100-E der Firma Plasma Systeme 2 Minuten im Sauerstoffplasma behandelt (Druck: 1 mbar, 50W) und anschließend mit Wasser und Aceton nachgewaschen. Alternativ können die vorgereinigten Substrate auch unter einer 40 w UV-Lampe mit Wellenlänge von 185 nm für 10 min mit Sauerstoff behandelt (Abstand zwischen Substratoberfläche und Lichtquelle 2 mm), und anschließend mit Wasser und Aceton nachgewaschen werden.
Zur Vorbehandlung können die Substrate auch ohne Vorreinigung 1 h bei 60CC in einer Mischung aus konzentriertem wässrigem Ammoniak, Wasserstoffperoxid (25 Gew.-%ig) und Wasser in einem Volumenverhältnis 1:1 :5 gelagert werden. Danach wurden sie mehrmals mit Wasser abgespült. Die so behandelten Substrate wurden anschließend in entsalztem Wasser aufbewahrt.
Zur Aminofunktionalisierung wurden die vorbehandelten Substrate mit einer Amino- silian-Monolage beschichtet. Hierzu wurde die aus dem Wasser entnommene und mit Stickstoff trockengeblasene Probe in eine Glovebox transferiert. Dort wurden die Substrate in einer 0,5%igen (v/v) Lösung von N-(3-(Trimethoxysilyl)propyl)- ethylendiamin bzw. (3-Aminopropyl)-Trimethoxylsilane in trockenem Toluol 16 h gelagert, anschließend mit Toluol gründlich gewaschen und vor Benutzung unter Stickstoffatmosphäre in der Glovebox mittels eines gefilterten Stickstoffstroms getrocknet.
III. Beschichtung des Trägers
Alle Maßnahmen erfolgten unter staubfreien Bedingungen (Reinraumbedingungen).
Beispiel 1:
a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 3 wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Glasträger, hergestellt nach II in diese Lösung getaucht und mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/sec senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche herausgezogen. Auf diese weise erhielt man eine nahezu monomolekulare Beschichtung des Glasträgers mit dem Präpolymeren, die herstellungsbedingt an ihrer Oberfläche Isocyanatgruppen aufweist.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519-523 mit einer Fläche von 15 mm x 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde in einer Lösung von Lysin in PBS-Puffer (100 nmol/ml) 1 h gelagert. Der so behandelte Stempel wurde mit PBS-Puffer nachgewaschen und im Argonstrom getrocknet. Der so vorbereitete Stempel wurde 2 min mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so behandelte, beschichtete Träger 16 h in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Anschließend wusch man mit PBS-Puffer nach und untersuchte die Oberfläche mikroskopisch. Auf diese Weise erhält man ein nahezu fehlerfreies Abbild des Stempelmusters auf der Oberfläche.
Bei Zeiladhäsionsexperimente mit GFP-Actin 3T3 Fibroblasten (chicken) und MC3T3-E1 Osteoblasten (chicken) wurde keine unselektive Adhäsion von Zellen auf der in b) erhaltenen Oberfläche beobachtet.
Beispiele 2 bis 6: Herstellung von Nucleotid-Arrays
Für die folgenden Experimente der Beispiele 2 bis 6 wurden folgenden Oligonucleotid- Lösungen hergestellt.
G1: Lösung von 3'-aminoterminiertem-5'-fluoreszenzmarkiertem Oligonucleotid (Fa. Molecular Probes) in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl.
G2: Lösung von 3'-aminoterminiertem-Oligonucleotid (Fa. Molecular Probes) in PBS- Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl.
G3: Lösung von 5'-fluoreszenzmarkiertem Oligonucleotid (Gegenstrang zu dem in G2 verwendeten Oligonucleotid; Fa. Molecular Probes) in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 100 pmol/μl.
Beispiel 2: a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträger, hergestellt nach II, mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde. Danach war die Beschichtung trocken. b) Auf die so hergestellte Beschichtung wurden mittels Mikropipette 2 Spots a 1 μl der Lösung G1 und 2 Spots a 1 μl der Lösung G2 aufgebracht. Der mittlere Durchmesser der Spots betrug etwa 200 μm. Der so erhaltene Array wurde anschließend über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Dann wurde die Beschichtung mit PBS (pH 7,5) gewaschen und in einer Mischung von 10 μl G3, 10 μl Tween20 mit 10 ml doppeltem PBS bei 4 °C über Nacht gelagert, und anschließend mit doppeltem PBS gewaschen.
Die Substrate wurde anschließend mit einem Fluoreszenzscanner vermessen. Es wurde die Intensität der Fluoreszenz der jeweiligen Spots G1 und G2 bestimmt. Als Referenz dienten die G2-Spots vor Hybridisierung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Beispiele 3 bis 5:
Analog Beispiel 2 wurden die Arrays der Beispiele 3 bis 5 hergestellt, wobei man in den Beispielen die folgenden Präpolymerlösungen einsetzte:
Beispiel 3: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Tetrahydrofuran/Wasser 1:1 (v/v).
Beispiel 4: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 1 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran.
Beispiel 5: Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Tetrahydrofuran/Wasser 1:1 (v/v).
Tabelle 2: Intensität der Fluoreszenz nach Hybridisierung mit G3 (LAU/mm2)
Beispiel 6: a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 2 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträ- 4b
ger, hergestellt nach II, mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519-523, mit einer Fläche von 15 mm x 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde gemäß der Vorschrift von Donzel et al., Adv. Mater. 2001, 3, 1164, im Sauerstoffplasma hydrophil modifiziert. Dieser Stempel wurde mit der Lösung G1 benetzt und getrocknet. Der so behandelte Stempel wurde 2 min mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so behandelte, beschichtete Träger 16 h in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt. Überschüssiges Nucleotid wurde anschließend durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt. Auf diese Weise erhält man ein nahezu fehlerfreies Abbild des Stempelmusters auf der Oberfläche, wie in Abbildung 1 gezeigt.
Beispiel 7: Array mit streifenförmigen Bereichen eines Biotin-Streptavidin-Systems
a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 2 wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Siliziumträger, hergestellt nach II., mittels Spincoating beschichtet. Hierzu wurde zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung vollständig benetzt, bevor die Lösung bei einer Endgeschwindigkeit von 4000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wurde. Das so beschichtete Substrat wurde dann über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt, wobei man eine Oberfläche mit NH2-Gruppen erhielt.
b) Analog Beispiel 6 b) wurde ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel mit einer Fläche von 15 mm x 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von streifenförmigen Erhebungen (Breite 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 10 μm) mit einer Lösung von Bioti- namidocapronsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester (Molecular Probes) in Dimethylformamid (10 μg/ml) benetzt und anschließend getrocknet. Der so erhaltene Stempel wurde 2 min. mit der in a) hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde die so erhaltene Beschichtung zum Entfernen von nicht-gebundenem Ester nacheinander mit Dimethylformamid und Wasser gewaschen und im Argonstrom getrocknet. Auf diese Weise erhielt man ein Array mit streifenförmigen Bereichen immobilisiertem Biotius. 40
c) Das in b) hergestellte Biotin-Array wurde 4 h in einer Lösung von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin (Molecular Probes) im PBS-Puffer (0,04 mg/ml) gelagert. Anschließend wurde der Array mit PBS-Puffer nachgewaschen, im Argonstrom getrocknet und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2 a) und 2 b) dargestellt. Sie zeigen, dass sich die Biotin-Streptavidin-Komplexe in Streifenform auf der Oberfläche der Arrays bilden und belegen die Immobilisierung, dass Biotin in streifenförmigen Bereichen immobilisiert ist und seine Funktion/Bindungsfähigkeit nicht verloren hat.
Beispiel 8: Herstellung eines Protein-Arrays über Komplexbildung
a) Das Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 1 wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in einer Mischung aus Tetrahydrofuran und Wasser (1 :9 v/v) gelöst. Dann wurde ein aminofunktionalisierter Glasträger, hergestellt nach I, in diese Lösung getaucht und mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/sec senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche herausgezogen. Auf diese weise erhielt man eine nahezu monomolekulare Beschichtung des Glasträgers mit dem Präpolymeren, die herstellungsbedingt an ihrer Oberfläche Isocyanatgruppen aufweist.
b) Ein rechteckiger Polydimethyldisiloxanstempel hergestellt nach Tan et al., Langmuir 2002, 18, S. 519-523, mit einer Fläche von 15 mm x 15 mm mit einer regelmäßigen Anordnung von Säulen (Durchmesser 5 μm, Höhe 2 μm, mittlerer Abstand 20 μm) wurde mit einer Lösung von Lysino-NTA-tert-Butylester, hergestellt nach Jürgen Groll, Diplomarbeit der Universität Ulm, 2001 , in Toluol (20 mg/ml) benetzt und anschließend getrocknet. Der so erhaltene Stempel wurde 15 min. mit der in a) frisch hergestellten Beschichtung in Kontakt gebracht. Anschließend wurde der so erhaltende Träger über Nacht in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre aufbewahrt und mit Toluol gewaschen. Der erhaltene Träger wurde 10 min. bei 200 CC unter Vakuum (0,02 mbar) gelagert und nach dem Abkühlen für 5 min. in eine Lösung von NiCI2 in Wasser (5 mg/ml) getaucht und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde der so behandelte Träger in eine Lösung eines mit His-Tags versehenen Green-Fluorescent-Proteins in PBS-Puffer (0,03 mg/ml) für 10 min. eingetaucht und anschließend mit PBS-Puffer gewaschen. Der erhaltene Array wurde fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Man erhielt das in der Abbildung 3 gezeigte Muster.

Claims

Patentansprüche
1. Array immobilisierter Biomoleküle, die an eine organische Oberflachenschicht gekoppelt sind, die im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, wobei die sternförmigen Präpolymere im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind.
2. Array nach Anspruch 1 , wobei das sternförmige Präpolymer im Mittel 6 bis 8 Polymerarme A aufweist.
3. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 2000 bis 100000 g/mol aufweist.
4. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme A des sternförmigen Präpolymeren ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20000 g/mol aufweisen.
5. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme A ausgewählt sind unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylen- oxid/Polypropylenoxid-Copolymeren.
6. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberflachenschicht im trockenen Zustand eine Dicke von wenigstens 10 nm aufweist.
7. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Biomoleküle über eine funktionelle Gruppe, ausgewählt unter Amid-Gruppen, Iminogruppen, Urethangrup- pen, Harnstoffgruppen, Thiourethan-Gruppen, Thioharnstoffgruppen, Estergruppen, Sulfoethylgruppen und gegebenenfalls über einen Spacer mit der organischen O- berflächenschicht verknüpft sind.
8. Array nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberflachenschicht auf einem Träger angeordnet ist.
. Array nach Anspruch nach 8, worin der Träger ausgewählt ist unter Glas, Kunststoff, Keramik, Metall und Halbmetall.
10. Vorrichtung auf Basis wenigstens eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Form eines Chips, Microfluid-Vorrichtung oder Dipsticks.
11. Verfahren zur Herstellung eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: i. Bereitstellung einer organischen Oberflachenschicht auf der Oberfläche eines Trägers, wobei die Oberflachenschicht im wesentlichen aus miteinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind, und auf ihrer Oberfläche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist und ii. Immobilisieren von Biomolekülen in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche der Oberflachenschicht.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei man die organische Oberflachenschicht, welche eine Vielzahl funktioneller Gruppen R aufweist, bereitstellt, indem man i.a. eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe FR tragen, auf eine O- berfläche eines Trägers aufbringt, i.b. anschließend Durchführen einer Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen FR untereinander durchführt; i.e. gegebenenfalls die reaktiven funktionellen Gruppen FR in funktionelle Gruppen R umwandelt.
13. Verfahren zur Herstellung eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: i. Bereitstellung einer organischen Oberflachenschicht auf einem Träger, die im wesentlichen aus unvemetzten sternförmigen Präpolymeren aufgebaut ist, welche im Mittel wenigstens 4 Polymerarme A aufweisen, die für sich gesehen wasserlöslich sind und die an ihren Enden reaktive Gruppen FR aufweisen, wobei man eine Oberflachenschicht erhält, die eine Vielzahl funktioneller Gruppen FR aufweist, 4y ii. Immobilisieren von Biomolekülen in mehreren voneinander räumlich getrennten Bereichen auf der Oberfläche, und iii. Durchführen einer Vernetzungsreaktion;
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die funktionelle Gruppe FR eine Isocyanat- Gruppe ist und die Vernetzung durch Wasser und/oder Ammoniak bewirkt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Oberfläche des Trägers in einer Weise vorbehandelt wurde, dass sie eine erhöhte Anzahl funktioneller Gruppen FR' aufweist, die mit den reaktiven Gruppen FR des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren.
16. Verwendung eines Arrays nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Vorrichtung nach Anspruch 10 für diagnostisch/analytische Zwecke.Zusammenfassung
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