JP2008510164A - ヒドロゲルを用いるマイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
全体に均一に分散したアンカリング部分を含む重合性ヒドロゲル層を平坦な基板に被覆することによりマイクロアレイを作製する方法。硬化後、均一な厚さの連続層を基板の上面にそのアレイ領域をとおして堅固に付着させる。次いで、プローブを硬化ヒドロゲルのアンカリング部分に結合させることにより、複数の異なるプローブを付着させてこのスラブ層の表面上の別個の空間位置にマイクロスポットを形成させる。そのようなアンカリング部分は、銅または他の金属により活性化される有機キレート化剤、およびアビジン−ビオチンのような相補対などの結合システムを用いることができる。
Description
本発明は、一般的にマイクロアレイを作製する方法および得られる製品に関し、より詳細には、適切な基板の領域を重合性ヒドロゲル層で実質的に均一に被覆することにより、そのような基板上にマイクロアレイまたはチップを作製する方法に関する。
マイクロアレイは、生物学的サンプル中の標的物質の存在および/または定量的な量をバイオアッセイするのに用いられている。それらは、標的物質、またはそのようなものを代表する分子を固体支持体上に捕捉し、次いで検出する、時として表面ベース検定法(surface−based assay)と呼ばれている成長しつつある分野である。そのようなDNAマイクロアレイは、多数の遺伝子を同時にモニターできるため、遺伝子発現および他の遺伝子型決定機能の研究に今や広く受入れられるようになっている。例えば、多数の異なるプローブ配列をマイクロアレイ表面にわたる別個の空間位置またはマイクロスポットに結合させることができ、そのような各マイクロスポットは、異なるプローブを含んでいてよい。そのようなマイクロアレイを標識サンプル物質を含む溶液を用いてハイブリッド形成させるとき、標的が存在するときには常にアレイの様々な異なるマイクロスポットにおける相補的DNA鎖間にハイブリッド形成が起る。非結合物質を除去するために洗浄した後、標識、例えば、蛍光の特性を用いて各マイクロスポットの標識物質の強度を測定する。このイメージングは、サンプル中に存在した特定の標的の定量的な量の尺度を提供することができる。
そのようなアレイは、抗体を含むタンパク質、およびハプテンまたはアプタマーなど、標的物質に結合するための他の部分を有するようにも作製された。これらの表面ベース検定法は、ELISAにも用いることができる。全般的に、そのようなマイクロアッセイチップの使用は、バイオアッセイのよりすぐりの方法としてゲル電気泳動のあとを継ぐものとなっており、プロテオミクスの分野がより進歩したことから、この傾向は続く可能性が非常に高いと考えられている。
マイクロアッセイチップがそのようなバイオアッセイの適用分野において有効であるためには、それは、適切なサンプルからの封鎖される十分な量の分析物または標的物質を固定化する能力を有するべきである。チップをその後の読み取りに供するときに十分な大きさのシグナルが得られるのは、この方法においてである。アッセイごとに再現性のある結果を得るためには、チップは、もちろん、高度に均一であるように作製することもできるべきである。
多数の異なるプローブを有するアレイを作るために、プローブを修飾ガラス基板、ケイ素基板等の別個の空間位置に固定化した多くのマイクロアレイが過去十年に開発された。最初に、プローブが基板の表面に直接結合された2次元形としてのマイクロアレイが開発された。より最近、マイクロスポットが微細な半球に類似し、その多孔質構造が3次元の組織またはマトリックスを示すヒドロゲル材料を用いた3次元マイクロアレイが開発された。この種のマイクロアレイは、特許文献1および特許文献2に記載されている。
特許文献3は、ポリペプチド分析物を吸収剤層に固定化するのに特に有用であると考えられ、該層がヒドロゲルにおける親水性部分と疎水性部分の比を変化させることによって巧みに処理されている水膨潤性ヒドロゲルの使用を開示している。ヒドロゲルを構成している親水性および疎水性モノマーは、所望のポリマーを作るために架橋されている。例として、アルミニウム基板を二酸化ケイ素で被覆し、次いでアルキルシランで処理した後、モノマーを複数のアドレス指定できる位置(マイクロスポット)にのせ、次いで、放射線により架橋させる。プローブを結合緩衝液を用いてチップ上の各マイクロスポットに加え、負荷されたチップを30分間インキュベートする。洗浄し、アッセイにおける使用の準備ができた状態にする。
特許文献4は、プローブまたは捕捉物質としての役割を果たすタンパク質を付着させるのに特に適するゼラチンベースの基板を用いたマイクロアレイの作製を教示している。ガラスまたはケイ素または写真印画紙のような適切な基板をIV型ゼラチンで被覆する。例えば、ゼラチンを反射性写真印画紙に被覆し、次いで、低温定着させ、乾燥する。全体的なゼラチンコーティングを有するプレートにマイクロスポットして、二官能性化合物、例えば、ゼラチンに結合する基およびタンパク質と高い特異性で相互作用することができる第2の官能基を有するヤギ抗マウスIgGを付着させる。関連する特許文献5において、ケイ素ウェーハーまたはガラスプレートを最初にアルキルシランで処理し、次いで、ゼラチンの溶液中に浸漬する。次いで、ゼラチン被覆基板をポリエチレンイミン(PEI)の溶液中に浸漬する。該表面は、タンパク質に対する比較的低い非特異的結合能を有し、表面に間隔をおいて配置されたマイクロスポットにタンパク質捕捉物質を付着させることによってマイクロアレイ基板として用いることができると報告された。
特許文献6は、ガラススライドにアミノアルキルシランで被覆した後、アミノ基に結合させることにより全表面にビニルスルホニル基を結合させてDNAチップを作製することを教示している。次いで、リンカーを有するオリゴヌクレオチドを反応性プレート上にスポットし、適切にインキュベートして、ハイブリッド形成分析に有用なDNAチップを得るための結合を確実にした。
バイオチップ等を作製するこれらの方法に種々の利点はあると思われるが、これらの各々がその欠点を有さないことはない。したがって、そのようなマイクロアレイの作製のさらにより良い方法を得るための探究が、そのようなマイクロアレイにヒドロゲルを用いることにしばしば重点を置いて継続されてきた。
基板を準備し、その上面を有機分子で官能基化し、マイクロアレイとしての機能を果たす表面の連続的領域を覆うように、全体に均一に分布したアンカリング部分を含む重合性ヒドロゲル層で該表面を被覆することによって、マイクロアレイを作製することができることが今回発見された。被覆ヒドロゲル層を重合させるように被覆基板を硬化させた後に、硬化したヒドロゲル層に存在するアンカリング部分にプローブを結合させることにより、様々な異なるプローブを表面の別個の空間位置に付着させてマイクロスポットを形成させる。所望ならば、マイクロスポットの周囲の部分を不動態化することができる。しかし、ヒドロゲルがPEGまたはPPG(またはそのコポリマー)およびポリイソシアネート架橋剤に基づいており、用いられるアンカリング部分が有機キレート化剤である場合、非特異的結合は高くないはずであり、したがって、不動態化は必要でないと考えられる。
1つの特定の態様において、本発明は、マイクロアレイを作製する方法を提供するものであり、その方法は、有機分子で官能基化されている上面を有する基板を準備する段階と、前記面のアレイ領域を完全に覆うように、全体に均一に分散したアンカリング部分を含む重合性ヒドロゲル層で前記面を被覆する段階と、前記ヒドロゲル層を重合させるために前記被覆基板を硬化させる段階と、その後、前記硬化ヒドロゲル層内に存在する前記アンカリング部分に結合させることにより、複数の異なるプローブを前記被覆表面の別個の空間位置に付着させる段階とを含む。
他の特定の態様において、本発明は、有機分子により官能基化されている上面を有する基板、前記面のアレイ領域を完全に被覆し、全体に均一に分散しているアンカリング部分を含む重合ヒドロゲル層、および前記面上の前記ヒドロゲルコーティング層の別個の空間位置に付着している複数の異なるプローブを含み、前記プローブが前記重合ヒドロゲル層における前記アンカリング部分に結合しており、前記別個の位置の周囲の前記コーティング層の部分に本質的にプローブが含まれていないマイクロアレイを提供する。
化学実験室で一般的に用いられている適切な材料から製造することができる平坦なプレートなどの形態の基板を用いる。例えば、当技術分野でよく知られているようなガラス、石英、ケイ素、シリカ、ステンレススチールおよびポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル、ポリカーボネートなどの不活性ポリマーである。プレートは、場合によっては当技術分野でよく知られているような反射層で被覆されていてもよい。反射層は、プローブを付着させる基板の実質的にすべての表面領域、すなわちアレイ領域を覆っていることが好ましい。しかし、しばしば基板の上面全体を覆う反射コーティングが製造上の便宜のために用いられている。反射層は、鏡面層を与える反射性金属、例えば、アルミニウム、銀、金、ロジウム等であってよい。反射性金属とは、一般的に可視(400〜800nm)の、対象の波長領域、および、おそらく800〜1100nmのような近赤外におけるより長い波長を含む入射光の少なくとも90%を反射し、非常にわずかな(0%またはそれに近い)光が媒質中に屈折する金属を意味する。そのような薄い金属層は、従来の蒸着法またはそのような鏡面コーティングを得るための当技術分野でよく知られている他の被覆法のいずれかを用いて得ることができる。層の厚さは、連続性がある限り、特に重要ではないが、そのような層を含める場合、約0.01〜約15μmの厚さの層が一般的に用いられる。
基板を用いて、自発的または励起に応じて光を放射する標識またはタグ、例えば、蛍光、化学発光またはリン光標識を用いるマイクロアッセイに用いられるマイクロアレイを作製する場合、これらの様々な標識から放射される光は、既知の波長を有する。2003年9月16日に出願された特許文献7は、マイクロスポットの位置または他のそのようなプローブの位置のバックグラウンドアーチファクト発光は反射金属層の上に特定の波長の実質的な除去をもたらす誘電層を用いることによって非常に実質的に減少させることができることを教示している。一酸化ケイ素および/または二酸化ケイ素のような材料製の通常、約0.1〜約5μmの厚さの透明な誘電層を用いることができる。基板の上面をそのような薄い金属製の鏡面層で均一に被覆する場合、上面全体をこのような均一な誘電層で被覆することが好ましい。気相からのシリカ、アルミナ、フッ化マグネシウム等のそのような非常に薄い誘電膜の沈着は、当技術分野でよく知られている。
そのような薄い誘電層が施されたならば、誘電層の上面を、プローブまたは捕捉物質のアレイを得るのに用いるヒドロゲルの強い付着を促進するために化学的に処理することが好ましい。誘電性表面は、当技術分野でよく知られているように、反応性分子の強い付着に用いることができるペンダントアミノ基で表面全体を覆うPEI、ポリリシンまたはアミノアルキルシランのような適切な試薬で誘導体化することが好ましい。そのようなシランカップリング剤の例としては、アミノプロピルトリエトキシシラン、N−β−(アミノエチル)−α−アミノプロピルトリメトキシシランおよびN−β−(アミノエチル)−α−アミノプロピルメチルジメトキシシランなどがある。
ヒドロゲルの3次元マイクロスポットをプローブまたは捕捉物質のホルダーとするために用いるマイクロアレイは、特許文献1ならびに"Three Dimensional Format Biochips"と題する特許文献8および"Methods and Gel Compositions For Encapsulating Living Cells and Organic Molecules"と題する特許文献9に記載されている。
えり抜きの重合性ヒドロゲルコーティングは、好ましくは、ポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールから、それらを二官能性および/または多官能性(すなわち、三またはそれ以上)イソシアネート化合物と反応させることにより調製されるイソシアネート官能性プレポリマーを用いて調製されるものである。好ましいプレポリマーは、エチレンオキシド単位のホモポリマー、またはエチレンオキシド単位およびプロピレンオキシドもしくはブチレンオキシド単位の混合物を含むブロックもしくはランダムコポリマーから調製されるものである。そのようなブロックもしくはランダムコポリマーの場合、単位の少なくとも75%がエチレンオキシド単位であることが好ましい。そのようなポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールの分子量は、好ましくは500〜10000ダルトン、より好ましくは約1000〜6000ダルトンであり、場合によって、約5000〜6000ダルトンの分子量が最も好ましい。本明細書で後により詳細に述べるように、本質的にすべてのヒドロキシル基がポリイソシアネートでキャップされるように、選択されるポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールをポリイソシアネートと反応させることにより適切なプレポリマーを調製することができる。一般的に、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)またはそのコポリマーが好ましい。イソシアネート官能性プレポリマーは、約0.1meq/g〜約1meq/g、より好ましくは約0.2meq/g〜約0.8meq/gの量の活性イソシアネートを含むことが好ましい。比較的低い分子量、例えば2000ダルトン未満のプレポリマーを用いる場合、それらは比較的高いイソシアネート含量(約1meq/gまたはそれ以上)を含むことが好ましい。しかし、そのようなより小さいプレポリマーの重合速度は、過度に急速な重合を避けるためにより精密な制御を必要とするかもしれない。さらに、かなり高いイソシアネート含量を有するプレポリマーは、重合の後に比較的高い含量の遊離アミンを含む可能性があり、中性pHでのそのようなアミン官能基上の正電荷は、より高いレベルの望ましくないバックグラウンドシグナルをもたらす可能性がある負に荷電した生体分子の非特異的結合を増加させる可能性がある。したがって、比較的低いイソシアネート含量を含むより高い分子量のプレポリマーが一般的に好ましいと思われる。
そのような高分子量のプレポリマーは、次の2つの一般的な方法のいずれかによりしばしば調製されるが、当技術分野で知られている他の方法も用いることができる。(1)少なくとも2000ダルトンの分子量を有するポリオール(トリオールまたはより高級)をイソホロンジイソシアネートのようなポリイソシアネートと反応させる、または(2)少なくとも2000ダルトンの分子量を有するジオールをポリイソシアネートおよびグリセロール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、トリエタノールアミンまたは有機トリアミンのような架橋剤と反応させる。
芳香族、脂肪族または環状脂肪族ポリイソシアネートを用いることができる。ジおよび多イソシアネートを含むポリイソシアネートを用いる。高分子量脂肪族イソシアネートでキャップされたプレポリマーは、一般的に約20〜90分で水和ポリマー状態にゲル化するが、芳香族イソシアネートでキャップされたプレポリマーは、はるかに速やかにゲル化する。適切な二および多官能性イソシアネートは次のとおりである。4,4’−メチレンビス−(フィエニルイソシアネート)(MDI)、トルエン−2,4−ジイソシアネート、トルエン−2,6−ジイソシアネート(異性体混合物がTDIの名で市販されている)、イソホロンジイソシアネート(IPDI)、エチレンジイソシアネート、エチリデンジイソシアネート、プロピレン−1,2−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−1,2−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−1,4−ジイソシアネート、−フェニレンジイソシアネート、3,3”−ジフェニル−4,4”−ビフェニレンジイソシアネート、1,6−ヘキサメチレンジイソシアネート、1,4−テトラメチレンジイソシアネート、1,10−デカメチレンジイソシアネート、クメン−2,4−ジイソシアネート、1,5−ナフタレンジイソシアネート、メチレンジシクロヘキシルジイソシアネート、1,4−シクロヘキシレンジイソシアネート、p−テトラメチルキシリレンジイソシアネート、p−フェニレンジイソシアネート、4−メトキシ−1,3−フェニレンジイソシアネート、4−クロロ−1,3−フェニレンジイソシアネート、4−ブロモ−1,3−フェニレンジイソシアネート、4−エトキシル−1,3−フェニレンジイソシアネート、2,4−ジメチル−1,3−フェニレンジイソシアネート、2,4−ジメチル−1,3−フェニレンジイソシアネート、5,6−ジメチル−1,3−フェニレンジイソシアネート、1,4−ジイソシアナトジフェニルエーテル、4,4’−ジイソシアナトジフェニルエーテル、ベンジジンジイソシアネート、4,6−ジメチル−1,3−フェニレンジイソシアネート、9,10−アントラセンジイソシアネート、4,4’−ジイソシアナトジベンジル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジイソシアナトジフェニルメタン、1,6−ジメチル−4,4’−ジイソシアナトジフェニル、2,4−ジイソシアナトスチベン、3,3’−ジメトキシ−4,4’−ジイソシアナトジフェニル、1,4−アントラセンジイソシアネート、2,5−フルオロンジイソシアネート、1,8−ナフタレンジイソシアネート、2,6−ジイソシアナトベンズルラン、2,4,6−トルエントリイソシアネート、p,p’,p”−トリフェニルメタントリイソシアネート、イソホロンジイソシアネートの3官能三量体(イソシアヌレート)、ヘキサメチレンジイソシアネートの3官能性ビウレット、ヘキサメチレンジイソシアネートの3官能三量体(イソシアヌレート)、ポリマー状4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネートおよびm−テトラメチルキシリレンジイソシアネート。
プレポリマーを生成させるための選択されるジオールまたはポリオールのポリイソシアネートによるキャッピングは、化学量論量の反応物を用いて行わせることができる。イソシアネートとヒドロキシル基との比は、当技術分野で知られているように変化させることができるが、好ましくは約1〜約3、より好ましくは約1.2〜2.2であるべきである。キャッピング反応は、乾燥窒素中で約2時間から約14日間、好ましくは触媒の非存在下で約20℃〜約150℃のようないずれかの適切な条件を用いて行わせることができる。好ましい温度は、約60℃〜100℃であり、反応は、イソシアネート濃度が理論値に近づくときに終結する。
好ましいプレポリマーとしては、トルエンジイソシアネートでエンドキャップされたポリエチレングリコール、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド(場合によってトリメチロールプロパンを含む)およびトルエンジイソシアネートのコポリマー、トルエンジイソシアネート−ポリエチレングリコール−トリメチロールプロパン、メチレンジイソシアネート−メチレンホモポリマー、重合メチレンジイソシアネート−ポリエチレングリコール、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−トリメチロールプロパンとイソホロンジイソシアネートのポリマー、ならびにポリエチレングリコールトリアセテートおよびトルエンジイソシアネートなどがある。上のタイプの適切なプレポリマーは、Dow Chemical CompanyからHYPOL PreMA(登録商標)G−50、HYPOL(登録商標)2000、HYPOL(登録商標)3000、HYPOL(登録商標)4000およびHYPOL(登録商標)5000として入手できる。これらの製剤は、ポリエチレンオキシドと約6000ダルトンの分子量を有する微量のポリプロピレンオキシドとのコポリマーを一般的に含む。他のものはEnviroChem Technologiesから商標Urepolのもとに入手でき、また、同等のプレポリマーを市販の原材料から調製することができる。
すべてのことを考慮すると、ヒドロゲルポリマーの主鎖は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーからなることが好ましい。ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールヒドロゲルの非イオン性親水性は、ヒドロゲルへの分析物の非特異的結合のレベルを低くし、また、その天然コンフォーメーションおよび生体反応性を維持するように、固定化される生体分子との適合性も良好にすると考えられる。この一般的なタイプのポリウレタンベースのイソシアネート官能性ヒドロゲルは、特許文献10(Mathewsら)、特許文献11(Vandegaerら)および特許文献12(Hartdeganら)に記載されている。
好ましい実施形態において、マイクロアレイ用基板は、水活性ジイソシアネートでキャップされ、適切な架橋剤で場合によってわずかに架橋されていてよい、高分子量ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのコポリマーのジオールまたはトリオールに基づくイソシアネート官能性ヒドロゲルを用いて調製することができる。先に示したように、プレポリマー中に存在する活性イソシアネートの量は約0.1〜約1meq/gであることが好ましい。一般的に好ましいジイソシアネートとしては、芳香族ベースのジイソシアネートであるトルエンジイソシアネート(TDI)およびメチレンジフェニルイソシアネート(MDI)ならびに脂肪族ジイソシアネートであるイソホロンジイソシアネートなどがある。プレポリマー中約0.01%〜約15%の反応性イソシアネートが一般的に基板にコーティングを結合させるために用いられ、これによりアンカリング部分を固定化するために十分な部位が残される。プレポリマーは、水混和性有機溶媒中で前調合することができ、重合は、一般的に水の単純な添加により発生する尿素結合の形成によって起る。
施すヒドロゲルコーティングは、全体に均一に分散したアンカリング部分を含み、アンカリング部分は、マイクロアレイの一部としてプローブを直接的または間接的に固定するために用いられる。それらは水溶液に溶解し、プレポリマーと混合して重合反応を開始することができる。適切なアンカリング部分の例は、ストレプトアビジンおよびビオチンのような相補的リンカーの対の半分であり、その対の他のメンバーが対象のプローブに結合する有機キレート化剤および有機リンカーなどである。有機キレート化剤を重合性層の1成分として混合する場合(それにより硬化した層全体に均一に分散した状態になる)、その硬化後に、金属陽イオンが有機キレート化剤の通常3または4箇所に結合するようにコーティングを水溶液中の水溶性金属イオンで処理する。このシステムを用いる場合、プローブを、硬化コーティング層中のキレート化剤を今や活性化したこれらの金属イオンと錯体を形成する有機分子に同様に結合させる。
硬化ヒドロゲル層またはスラブの厚さは、約1μmから約1000μmまで変化してよく、少なくとも約5μmの厚さであることが好ましい。例えば、イミノ二酢酸(IDA)またはニトリロ三酢酸(NTA)のような三座または四座有機キレート化剤を用いる場合、十分な量のこれらのアンカリング部分がアレイの領域を覆うコーティング層全体に均一に分布するように、それらを約50mMから約1mMまでの濃度でコーティング組成物に含めることができる。
ヒドロゲル層またはスラブを施したならば、調合物が十分に架橋するまで硬化させる。施工と硬化は閉鎖条件下で実施することができるので、溶媒蒸気に伴う問題は本質的に解消することができる(マイクロスポットを平坦なプレート上に規則的なパターンで付着させる状況と対照的)。したがって、環境または他の製造上の困難に遭遇することなく、より広い範囲の溶媒およびヒドロゲル調合物が利用可能である。同様に、キャスティング/モールディング/コーティング段階は極めて一様に行うことができ、多数のプレートを一度に被覆することができ、機械的スポッティングに固有の多くの制約を同様に回避されるので、被覆済みプレート間の変動は非常にわずかであるはずである。
スライドが十分に硬化、すなわち、架橋が本質的に完了したならば、洗浄して、ヒドロゲルに結合しなかった有機キレート化剤または他の有機リンカーを除去し、またコーティング組成物を調合かつ/または施すのに用いた溶媒を除去する。アンカリング部分が有機キレート化剤である場合、被覆基板を例えば、硝酸銅または硝酸ニッケルの溶液とともにインキュベートしてもよい。結果として、そのような溶液の銅またはニッケルイオンがキレート化剤に結合する。これは、当技術分野ではキレート化剤を活性化すると呼ぶ。次いで、被覆基板は場合によって乾燥し、無期限保存することができる。そのような乾燥を実施する場合、すべてのコーティングまたは少なくともマイクロスポットが配置されている領域の再水和は、マイクロアレイが形成される前またはそのときに行うことが好ましい。
捕捉物質またはプローブとして用いる生物学的物質は、当技術分野でよく知られている様々なものであってよい。それらは、DNA配列およびペプチドから抗体のようなはるかに大きい分子までの全範囲を含む。生細胞でさえも適切な相補性リンカーを用いて多孔質ヒドロゲルの別個の空間位置に付着させることができる。他のそのような結合対は、本明細書で言及したキレート化剤およびビオチン−アビジンに加えて、前述の特許および公開国際出願に開示されている。
通常の分析において、マイクロアレイを、ハイブリッド形成/結合条件下で生物学的物質のサンプルを含む通常水性の溶液に曝露し、インキュベートする。この溶液は、リポーターもしくはシグナル物質で、またはその後リポーター物質を封鎖するリンカーでタグ付けまたは標識された潜在的標的を含む。標識またはタグは、標的、例えば、核酸配列に結合させることができ、その検出および/または定量を可能にする置換基を指すために用いる。例としては、32P、33Pおよび35Sのような放射性標識、蛍光、化学発光または有色化合物のような比色指示薬、ビオチンのようなリガンド、ならびに質量または他の分光学的特性により区別できる化学基などがある。適切な標識のより具体的な例としては、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン3(Cy−3)およびシアニン5(Cy−5)などがある。標的が核酸である場合、標識は、プライマーの一部として直接取込みにより分析物核酸に導入することが好ましい。しかし、標的と中間リガンドとの化学反応または酵素反応またはハイブリッド形成またはアニーリングによる間接的付加も用いることができる。簡単および効率のため、ハイブリッド形成段階に用いる分析物サンプルに蛍光、化学発光またはリン光物質の発光標識を単に用いることが好ましいと思われる。アビジン−ビオチンのような結合対は、後に標識を付加するのに用いることができるが、これらの基板は、標識がインキュベーション段階に用いられるサンプル溶液中の標的生物学的物質に既に共有結合している分析用のマイクロアレイを形成するための特別な利点を提供してもよい。Cy−3およびCy−5のような蛍光標識は、一般的に用いられているそのような標識の例である。
マイクロアレイをサンプル溶液とともに適切な期間インキュベートした後、当技術分野でよく知られ、一般的に行われているように、洗浄を通常繰り返して行う。次いで、通常、イメージングに供する前にマイクロアレイを乾燥する。自発的または刺激したときに発光する標識を用いる場合、イメージングに用いることができる多くの市販の光度計が存在する。例えば、特許文献13は、蛍光を刺激するためのレーザー光線を用いて発光蛍光を収集し、収集した光をフォトディテクタに伝送してシグナルを発生させる蛍光イメージングシステムを開示している。特許文献14は、光を収集し、シグナルを処理ユニットに送る光電子増倍管(PMT)に伝送する高スループット蛍光検出用の走査型分光光度計を開示している。
(実施例)
以下の実施例は、本発明を実施するために現在知られている最良の態様を提供するために示す。しかし、これらの実施例は例示のために示したものにすぎず、添付の請求の範囲により定義されている本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
以下の実施例は、本発明を実施するために現在知られている最良の態様を提供するために示す。しかし、これらの実施例は例示のために示したものにすぎず、添付の請求の範囲により定義されている本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
反射アルミニウム層の上に酸化ケイ素の薄層を被覆した標準実験用ガラススライドを使用し、それに全体に分散したアンカリング部分を有するヒドロゲルプレポリマー溶液の連続層を被覆する。溶液Aは、0.075gのHypol PreMa G−50(Dow Chemical Company)を0.225gのアセトニトリルおよび0.225gのN−メチル−2−ピロリドンの溶液と混合して調製する。溶液Bは、pH8.2の50mM水性ホウ酸緩衝液中0.5μM誘導体化NTAキレート化剤として調製する。このキレート化剤は、架橋ヒドロゲル中で共有結合する第一級アミンを有する。次いで、約200μLの溶液Aを50μLの溶液Bと混合して重合を開始させ、得られた組成物をアミン処理ガラススライドに被覆する。キレート化剤を含むヒドロゲルコーティングを、脱水を避けるために約95%RHおよび室温の加湿ボックス内で注意深く重合させる。この調合物を、室温で約2時間以内に重合する。硬化後は、ヒドロゲルスラブは、厚さが約50μmで、物理的に安定であり、ガラススライドに強く付着している。次いで、硬化スライドを約50μMの濃度の硝酸銅を含む水溶液で室温で2時間処理して、多孔質ヒドロゲルスラブ全体に均一に分散しているキレート化剤分子により銅陽イオンを封鎖させる。このようにしてキレート化剤を活性化した後、スライドを0.1M KNO3(pH4)を含む50μM酢酸溶液で1時間洗浄した後、脱イオンH2Oですすぐ。次いで、乾燥して、試験マイクロアレイを作製するためのマイクロスポッティングに備える。
5μLのガラス微細毛細管を用いてマイクロスポッティングを行い、活性化ヒドロゲルスラブの表面に規則的パターンのマイクロスポットを形成させる。試験目的のために、毛細管はプローブを模擬するために銅と錯体を形成するヒスチジンに富むペプチドで標識されている緑色蛍光タンパク質をそれぞれ含む。マイクロスポットした表面を室温で約2時間インキュベートして、硬化ヒドロゲルスラブの表面にマイクロスポットのこの規則的パターンのこれらのプローブを付着させる。
マイクロアレイを洗浄して過剰なプローブを除去し、電荷結合カメラを用いて走査する。画像は、アレイ表面にわたる規則的パターンの均一に発光したマイクロスポットを示し、マイクロスポットの間の領域からの有意な蛍光の発出はない。このことは、ヒドロゲルスラブに対する非特異的結合は問題ではなく、該基板は非常に感度の高いマイクロアレイの作製に十分に適していることを示している。
実施例1に記載した手順を同様なイソシアネートキャッププレポリマーを用いて繰り返す。しかし、今度は溶液Bは、pH8.2の50mM水性ホウ酸緩衝液中ストレプトアビジンの0.5mM溶液として調製する。再び、約200μLの溶液Aを50μLの溶液Bと混合し、得られた組成物をアミン処理ガラススライドに連続層として被覆し、前述のように重合させる。
硬化後、再び5μLのガラス微細毛細管を用いてマイクロスポッティングを行い、ヒドロゲルスラブの表面に規則的パターンのマイクロスポットを形成させる。この試験のために、毛細管は本技術分野でよく知られているプローブとして用いる前立腺特異抗原(PSA)に対するビオチニル化抗体をそれぞれ含む。マイクロスポットした表面を25℃で約60分間インキュベートして、硬化ヒドロゲルスラブの表面に規則的パターンのこれらのプローブのビオチン−アビジン付着をもたらす。
マイクロアレイを洗浄して過剰のプローブを除去し、次いで、試験標的物質としてのCy−3で標識されているPSAの水溶液を用いたハイブリッド形成に供する。標識PSAはプローブに選択的に結合する。25℃で約60分間インキュベートした後、アレイを洗浄し、次いで、レーザースキャナ(ScanArray(登録商標)Lite、Perkin Elmer)を用いてイメージングして、マイクロアレイの表面の蛍光像を得る。画像は、アレイ表面にわたる規則的パターンの均一に発光したマイクロスポットを示し、マイクロスポットの間の領域からの有意な蛍光の発出はない。このことは、ヒドロゲルスラブに対する非特異的結合は問題ではなく、該基板は非常に感度の高いマイクロアレイの作製に十分に適していることを示している。
そのようなヒドロゲルの連続スラブを有する基板を用いることにより、全体に均一に分散したアンカリング部分を用いてマイクロアレイを作製することができる効率が実質的に増大することがわかる。
本発明を特定の好ましい実施形態に関して記述したが、当業者に明らかであるような様々な変更または修正は、本明細書に添付の請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることを理解すべきである。
Claims (18)
- マイクロアレイを作製する方法であって、
有機分子で官能基化されている上面を有する基板を準備する段階と、
前記面のアレイ領域を完全に覆うように、全体に均一に分散したアンカリング部分を含む重合性ヒドロゲル層で前記面を被覆する段階と、
前記ヒドロゲル層を重合させるために前記被覆基板を硬化させる段階と、
その後、前記硬化ヒドロゲル層内に存在する前記アンカリング部分に複数の異なるプローブを結合させることにより、前記プローブを前記被覆表面の別個の空間位置に付着させる段階と
を含むことを特徴とする方法。 - 前記アンカリング部分が前記重合性層の成分と混合されている有機キレート化剤であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記硬化段階の後に、前記キレート化剤を水溶液中の水溶性金属イオンで処理して前記キレート化剤を活性化することを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記プローブが前記金属イオンに強く結合する化合物で誘導体化された分子であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記プローブがヒスチジンに富むペプチドで誘導体化されていることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記プローブが前記付着段階中に前記アンカリング部分に直接結合する相補性リンカーで誘導体化されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記リンカーおよび前記アンカリング部分がそれぞれビオチンおよびストレプトアビジンであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記重合性ヒドロゲルがPEGまたはPPGまたはそのコポリマーを含むことを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記重合性ヒドロゲルがポリイソシアネート架橋剤を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記架橋剤が脂肪族または芳香族ポリイソシアネートであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記被覆基板を前記硬化後に乾燥し、前記プローブを付着させる前記位置を再水和することを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 有機分子により官能基化されている上面を有する基板、
前記面のアレイ領域を完全に被覆し、全体に均一に分散しているアンカリング部分を含む重合ヒドロゲル層、および
前記面上の前記ヒドロゲルコーティング層の別個の空間位置に付着している複数の異なるプローブを含み、前記プローブが前記重合ヒドロゲル層における前記アンカリング部分に結合しており、前記別個の位置の周囲の前記コーティング層の部分に本質的にプローブが含まれていない
ことを特徴とするマイクロアレイ。 - 前記アンカリング部分が金属イオンで活性化されている有機キレート化剤であることを特徴とする請求項12に記載のマイクロアレイ。
- 前記プローブがヒスチジンに富むペプチドで誘導体化されていることを特徴とする請求項13に記載のマイクロアレイ。
- 前記プローブが前記アンカリング部分に直接結合する相補性リンカーで誘導体化されていることを特徴とする請求項12に記載のマイクロアレイ。
- 前記プローブがビオチニル化されており、前記アンカリング部分がストレプトアビジンであることを特徴とする請求項15に記載のマイクロアレイ。
- 前記重合ヒドロゲルがPEGまたはPPGまたはそのコポリマーの反応生成物を含むことを特徴とする請求項12から16のいずれか一項に記載のマイクロアレイ。
- 前記重合ヒドロゲルが(a)約1000〜約6000ダルトンの分子量のPEGまたはPPGまたはそのコポリマーと(b)多官能性イソシアネートの反応生成物を含むことを特徴とする請求項12から16のいずれか一項に記載のマイクロアレイ。
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