KR20070051330A - 하이드로겔을 이용한 마이크로어레이 - Google Patents

하이드로겔을 이용한 마이크로어레이 Download PDF

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Abstract

중합반응성 하이드로겔(hydrogel) 내에 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티(anchoring moiety)를 함유하는 중합반응성 하이드로겔 층으로 평편한 기질을 코팅하여 마이크로어레이를 제조하는 방법. 경화에 이어서, 균일한 두께의 연속층을 기질의 어레이 영역을 통하여 기질의 상부표면에 단단히 부착시킨다. 이후, 복수의 상이한 프로브(probe)를 부착하여 이 프로브를 경화된 하이드로겔 내의 앵커링모이어티에 연결함으로써 이러한 슬라브(slab) 층의 표면상의 구별되는 공간적 위치에 마이크로스팟(microspot)을 조성한다. 그러한 앵커링모이어티는 구리 또는 기타 금속에 의해 활성화되는 유기 킬레이트제와 같은 결합 시스템 및 아비딘-비오틴과 같은 상보적 쌍을 이용할 수도 있다.
하이드로겔, 앵커링모이어티, 마이크로어레이, 마이크로스팟, 기질

Description

하이드로겔을 이용한 마이크로어레이{MICROARRAYS UTILIZING HYDROGELS}
본 발명은 일반적으로 마이크로어레이(microarray)를 제조하는 방법 및 수득된 생성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 적절한 기질 또는 칩 상에 중합반응성(polymerizable) 하이드로겔 층으로 그러한 기질의 영역을 실질적으로 균일하게 코팅하여 마이크로어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
마이크로어레이는 생물학적 시료 내에 표적물질의 존재 및/또는 정량적 함유량을 분석하는데 이용되는데; 마이크로어레이는 표적물질 또는 이를 표방하는 분자가 고체 지지체에 포획되고 이어서 검출되는 것인, 표면-기반 분석(surface-based assay)으로서 언급되는 성장분야를 구성한다. 그러한 DNA 마이크로어레이는 다수의 유전자를 동시에 모니터할 수 있는 능력때문에 유전자 발현 및 기타 유전자형 확정(genotyping) 기능의 연구에 광범위하게 이용되고 있다. 예를 들어, 다수의 상이한 프로브 서열이 마이크로어레이 표면에 걸친 별개의 공간적 위치 또는 마이크로스팟(microspot)에 결합될 수 있고, 그러한 마이크로스팟 각각은 상이한 프로브를 함유할 수 있다. 그러한 마이크로어레이가 표지된 시료 물질을 함유하는 용액과 혼성화(hybridization)될 경우에, 혼성화는 표적이 존재하면 어레이의 다양하고 상이한 마이크로스팟에 상보적인 DNA 가닥 사이에서 일어난다. 결합하지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 표적의 특징, 예컨대 형광을 이용하여 가가 마이크로스팟에 표지된 물질의 강도를 측정하며; 이러한 이미지화가 시료 내에 존재했던 특정 표적의 정량적 함유량의 측정값을 제공한다.
그러한 어레이는 또한 표적 물질에 결합시키기 위한, 항체 및 합텐(hapten) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하여 단백질과 같은 기타 모이어티를 제시하도록 제조될 수 있다. 이러한 표면-기반 분석은 또한 ELISA에 이용될 수 있다. 전반적으로, 미량분석(microassay) 칩은 생물학적 분석을 위해 선택되는 방법으로서 겔 전기영동을 대체해왔으며, 이러한 경향은 프로테오믹스(proteomics) 분야가 보다 발전됨에 따라 계속 그러할 것으로 여겨진다.
그러한 생물학적 분석의 용도에 효과적인 마이크로분석 칩은, 관련된 시료로부터 격리될 만족스러운 양의 분석대상물 또는 표적물질을 고정화하는 능력을 보유하여야 하며; 이러한 방법에 있어서, 칩이 서열 판독에 들어갈 경우에 만족스러운 정도의 신호가 제공된다. 물론, 칩도 또한 분석과 분석간에 재현가능한 결과를 생성하기 위해서 고도로 균일하도록 제조될 수 있어야 한다.
지난 십여년간 다수의 마이크로칩이 개발되었는데, 이 마이크로칩에서 프로브는 개질된 유리 기질, 규소 기질, 또는 이의 유사체 상에 별개의 공간적 위치에 고정화된 다수의 상이한 프로브가 존재하는 어레이를 제작했다. 초기의 마이크로어레이는 프로브가 기질 상의 표면에 직접 결합하는 2-차원 형태로 개발되었다. 보다 최근에는 하이드로겔 물질을 이용하는 것이 개발되었는데, 여기서 마이크로스팟은 3-차원 골격 또는 매트릭스를 나타내는 다공성 구조의 미세한 반구와 유사할 수 있 다. 이러한 형태의 마이크로어레이는 미국특허 제6,174,683호 및 공개된 국제출원 WO02/059372호에 기술되어있다.
공개된 미국출원 2003/0124371호에는 흡수층 상에 폴리펩타이드(polypeptide) 분석대상물을 고정화하는데 특히 유용한 것으로 여겨지는 수-팽윤성(water-swellable) 친수성 하이드로겔의 이용하는 방법이 게시되어있는데, 상기 흡수 층은 하이드로겔 내의 친수성 모이어티와 소수성 모이어티의 비율을 다양하게 하여 처리된다. 하이드로겔을 보완하는 친수성 및 소수성 단량체는 가교결합되어 원하는 중합체를 형성한다. 한가지 예로서, 알루미늄 기질이 이산화규소로 코팅되고, 이후 알킬실란으로 처리된 후, 단량체가 복수의 어드레서블(addressable) 위치(마이크로스팟)에 도포되며, 이후 방사능(radiation)에 의해 가교결합된다. 프로브는 결합성 버퍼(binding buffer)를 이용하여 칩 상의 각 마이크로스팟에 첨가되고, 적재된 칩은 30분간 배양된다. 이후, 이 칩을 세척하고 분석에 사용하기 위해 준비한다.
공개된 미국특허출원 2003/0138649호는 젤라틴-기반 기질을 이용하여 프로브 또는 포획제(capture agent)로서 기능할 것인 단백질을 부착하는데 특히 적합한 마이크로어레이의 제조방법을 교시하고 있다. 유리 또는 규소 또는 인화지와 같은 적절한 기질이 IV형 젤라틴의 용액으로 코팅되는데; 예를 들어, 젤라틴은 반사성 인화지 상에 코팅되고, 이후 이는 냉경(chill-set) 및 건조된다. 이후, 전체적으로 젤라틴 코팅을 보유한 이 플레이트는 이작용기성 화합물, 예컨대 염소의 항-마우스 항체 IgG(goat anti-mouse antibody IgG)를 부착하기 위해 마이크로스팟팅되는데, 이 염소의 항-마우스 항체 IgG는 젤라틴과 결합될 하나의 기(group) 및 단백질과 고도의 특이성을 가지고 상호작용할 수 있는 제2의 작용기를 보유한다. 공개된 미국의 관련출원 제2003/0170474호에는, 규소 웨이퍼(wafer) 또는 유리판이 먼저 알킬실란으로 처리된 후, 젤라틴 용액에 침지된다. 그 다음, 이 젤라틴-코팅 기질은 폴리에틸렌이민(PEI) 용액에 침지된다. 이 표면은 단백질에 대하여 상대적으로 낮은 비특이적 결합 용량을 보유한 것으로 보고되었고, 이는 표면 전반에 걸쳐 이격된 마이크로스팟에서 단백질 포획제를 고착화시킴으로써 마이크로어레이 기질로 이용될 수 있다는 것이 보고되었다.
공개된 미국출원 2003/0096257호는 슬라이드 글래스를 아미노알킬실란으로 코팅하고, 이후 아미노기를 결합함으로써 전체 표면에 걸쳐 비닐설포닐기(vinylsulfonyl)를 부착시켜 DNA 칩을 제조하는 방법을 교시하고 있다. 링커(linker)를 보유한 올리고뉴클레오티드는 반응성 플레이트 상에 스팟팅되고, 혼성화 분석에 유용한 DNA 칩을 생성하기 위한 결합을 확실하게 하기 위해 적절하게 배양된다.
바이오칩 또는 이의 유사체를 제조하는 이들 방법에 여러 유리한 효과가 있다고 해도, 이들 방법 각각에 있어서 단점이 없는 방법은 없다. 그러한 마이크로어레이에 하이드로겔을 이용하는데 집중하도록 강조된 그러한 마이크로어레이의 제조방법이 여전히 요구되고 있다.
발명의 개요
이제, 그 상부 표면이 유기 분자로 작용기화된 기질을 제공하고, 마이크로어레이로서 기능할 것인 표면의 연속 영역을 덮기 위해 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티(anchoring moiety)를 함유하는 중합반응성 하이드로겔 층으로 상기 표면을 코팅하여 제조될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 코팅된 하이드로겔 층을 중합시키기 위해 코팅된 기질을 경화시킨 후, 경화된 하이드로겔 층에 존재하는 앵커링모이어티에 프로브를 결합시킴으로써, 다양하고 상이한 프로브를 표면 상의 별개의 공간적 위치에 부착시켜 마이크로스팟을 형성시킨다. 원한다면, 마이크로스팟을 둘러싸는 영역을 부동화시킬 수 있다. 그러나, 하이드로겔이 PEG 또는 PPG(또는 이의 공중합체) 및 폴리이소시아네이트 가교결합제를 기반으로하는 경우 및 이용되는 앵커링모이어티가 유기 킬레이트제일 경우에는, 비특이적 결합이 그다지 높지 않아서 부동화가 필요하다고 느껴지지 않을 수도 있다.
일 특정 양태에서, 본 발명은 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기의 단계를 포함한다: 유기 분자로 작용기화된 상부 표면을 보유한 기질을 제공하는 단계, 표면의 어레이 영역을 완전히 덮기 위해서, 그 안에 전체적으로 균일하게 분포된 앵커링모이어티를 함유하는 중합반응성 하이드로겔층으로 상기 표면을 코팅하는 단계, 이 코팅된 기재를 경화시켜 상기 하이드로겔 층을 중합화하는 단계, 및 상기 경화된 하이드로겔 층 내에 존재하는 상기 앵커링모이어티에 상기 프로브를 결합시켜 밸개의 공간적 위치에서 상기 코팅된 표면에 복수의 상이한 프로브를 순차적으로 부착시키는 단계.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 구성요소를 함유하는 마이크로어레이를 제공한다: 유기 분자로 작용기화된 상부 표면을 보유한 기질, 표면의 어레이 영역을 완전히 덮기 위해서, 그 안에 전체적으로 균일하게 분포된 앵커링모이어티를 함유하는 중합화된 하이드로겔 층, 및 별개의 공간적 위치에서 표면 상의 하이드로겔 코팅층에 부착된 복수의 상이한 프로브로서, 이 프로브는 상기 중합화된 하이드로겔 층 내의 앵커링모이어티와 결합되고 상기 위치를 둘러싸는 코팅층의 영역은 본질적으로 프로브를 함유하지 않은 것인 복수의 상이한 프로브.
바람직한 구체예의 상세한 설명
기질은 화학 실험실에서 일반적으로 이용되는 임의의 적절한 물질로 제조될 수 있는 평편한 플레이트 또는 이의 유사체의 형태로 이용되는데; 기질의 예에는 유리, 석영, 규소, 실리카, 스테인리스강 및 비활성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴, 폴리카보네이트 및 이의 유사체가 포함되며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 플레이트는 선택적으로, 역시 당업계에 잘 알려진 반사층(reflective layer)으로 코팅될 수 있다. 이 반사층은 바람직하게는 프로브가 부착될 기질의 표면 영역, 즉 어레이 영역을 실질적으로 모두 덮어야만 하지만; 그러나, 종종 기질의 상부 표면 전체를 덮는 반사코팅이 제조상의 편의를 위하여 이용된다. 이 반사층은 반사성 금속일 수 있는데, 예를 들어 거울상의 층을 제공하는 알루미늄, 은, 금, 로듐 등일 수 있다. 반사성 금속이란 해당 파장, 일반적으로 직사광선(400-800nm), 및 가능하게는 보다 긴 파장인 근적외선(800-1100nm)에서의 입사광을 적어도 90% 반사시키고, 매질로 굴절되는 빛이 거의 없는(또는 거의 0%인) 금속을 의미한다. 그러한 얇은 금속층은 그러한 거울 코팅을 제공하기 위해 당업계에 잘 알려진 종래의 증기 코팅 또는 기타 코팅 방법 중 임의의 것을 이용하여 제공될 수 있다. 이 층의 두께는 연속성이 있는 한 특별히 고려의 대상은 아니나, 그러한 층을 포함할 경우에는 약 0.01미크론 내지 약 15미크론의 두께가 일반적으로 이용된다.
기질이 여기(excitation)와 동시에 또는 여기에 반응하여 빛을 방출하는 표지 또는 태그(tag), 예컨대 형광성, 발광성 또는 인광성 표지를 이용하는 미량분석(microassay)에 이용될 마이크로어레이를 제조하는데 이용될 경우에, 이러한 다양한 표지에서 방출되는 빛은 공지된 파장을 가질 것이다. 2003년 9월 16일에 출원되어, 계류중인 미국출원 제10/664,248호는 특정 파장의 실질적인 소거를 산출하는 반사성 금속층 최상부의 유전층을 이용함으로써 마이크로스팟 또는 기타 그러한 프로브 위치에서의 배경 인공방출이 매우 상당히 감소될 수 있다는 것을 교시하고 있다. 일산화규소 및/또는 이산화규소와 같은 물질로 제조된 투명한 유전층이 정상적으로는 약 0.1 내지 약 5미크론 사이의 두께 범위로 이용될 수도 있다. 만일 기질의 상부표면이 그러한 얇고, 금속성인 거울층으로 균일하지 않게 코팅되었다면, 바람직하게도 상부 표면 전체는 이러한 균일한 유전층으로 코팅된다. 증기성 대기로부터 실리카, 알루미나, 플루오르화 마그네슘 또는 이의 유사체의 매우 얇은 유전체막의 침착법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일단 그러한 얇은 유전층이 위치하게 되면, 유전층의 상부 표면은 바람직하게는 화학적으로 처리되어 프로브 또는 포획제의 어레이를 제공하는데 이용될 것인 하이드로겔의 강한 부착을 촉진한다. 바람직하게는, 유전체 표면은 차후에 반응성 분자의 강한 부착에 이용될 수 있는 표면에 매달린 아미노기로 전체 표면을 덮을 것인 PEI, 폴리라이신 또는 아미노알킬실란과 같은 적절한 시약으로 유도체화되는데, 이도 또한 당업계에 잘 알려져있다. 그러한 실란 결합제의 예에는 아미노프로필트리에톡시실란, N-β-(아미노에틸)-α-아미노프로필트리메톡시실란, 및 N-β-(아미노에틸)-α-아미노프로필메틸디메톡시실란이 포함된다.
하이드로겔의 3-차원 마이크로스팟이 프로브 또는 포획제를 위한 홀더(holder)로서 기능하도록 이용되는 마이크로어레이는 미국특허 제6,174,683호 및 발명의 명칭이"Three Dimesional Format Biochips"인 공개된 국제출원 WO 09/059372호, 및 발명의 명칭이 "Methods and Gel compostions For Encapsulating Living Cells and Organic Molecules"인 WO02/081662호에 게시되어 있다.
정선된 중합반응성 하이드로겔 코팅은 바람직하게는 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올을 이작용기성 및/또는 다작용기성(즉, 3 이상) 이소시아네이트 화합물과 반응시켜 제조된 이소시아네이트-작용성 부분중합체를 이용하여 제조된 것이다. 바람직한 부분중합체는 산화에틸렌 단위체 또는 산화에틸렌 단위체 및 산화프로필렌 또는 산화부틸렌 단위체의 혼합물을 함유하는 블록 또는 랜덤 공중합체를 함유하는 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올로 제조된 것이다. 그러한 블록 또는 랜덤 공중합체의 경우에는, 75%이상의 단위체가 바람직하게도 산화에틸렌 단위체이다. 그러한 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올의 분자량은 바람직하게는 500 내지 10,000달톤, 보다 바람직하게는 약 1,000 내지 6,000달톤이며, 어떤 경우에는 약 5,000 내지 6,000달톤의 분자량이 가장 바람직하다. 적절한 부분중합체는 선택된 폴리옥시알킬렌 디올 또는 폴리올을 폴리이소시아네이트와 반응시켜 제조될 수 있는데, 그 결과 본질적으로 모든 하이드록실기가 폴리이소시아네이트로 캡핑되며, 이는 이하 보다 자세히 설명한다. 일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 또는 이들의 공중합체가 바람직하다. 이소시아네이트-작용성 부분중합체는 바람직하게는 활성 이소시아네이트를 약 0.1meq/g 내지 약 1meq/g의 양으로, 보다 바람직하게는 약 0.2meq/g 내지 약 0.8meq/g의 양으로 함유한다. 만약 상대적으로 저분자량, 예컨대 2,000달톤 미만의 부분중합체가 이용된다면, 이들은 상대적으로 높은 이소시아네이트 함유량(약 1meq/g 또는 보다 많이)을 함유할 것이다. 그러나, 그러한 작은 부분중합체의 중합화 속도는 너무 급속한 중합화를 회피하기 위하여 보다 엄밀하게 제어할 필요가 있을 수 있다. 게다가, 상당히 높은 이소시아네이트 함유량을 보유한 부분중합체는 중합화 이후에 상대적으로 높은 함유량의 유리 아민을 보유할 수 있으며, 중성의 pH에서 그러한 아민의 작용기 상의 양전하는 높은 수준의 바람직하지 않은 배경 신호를 결과로 나타낼 잠재력을 가진 음으로 하전된 생물분자와의 비특이적 결합을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상대적으로 낮은 이소시아네이트 함유량을 함유한 보다 고분자량의 부분중합체가 일반적으로 선호될 수 있다.
그러한 고분자량의 부분중합체는 종종 두 가지 일반적인 방법 중의 하나에 의해 제조되나, 당업계에 알려진 다른 방법도 또한 이용될 수 있다: (1) 분자량이 2,000달톤 이상인 폴리올을 이소포론 디이소시아네이트와 같은 폴리이소시아네이트와 반응시키는 방법, 또는 (2) 분자량이 2,000달톤 이상인 디올을 폴리이소시아네이트 및 가교제, 예컨대 글리세롤, 트리메틸올프로판, 트리메틸올에탄, 트리에탄올아민 또는 유기 트리아민과 반응시키는 방법.
방향족, 지방족 또는 지환족 폴리이소시아네이트가 이용될 수 있는데; 폴리이소시아네이트는 디이소시아네이트 및 멀티-이소시아네이트를 포함하는 개념이다. 고분자량의 지방족 이소시아네이트로 캡핑된 부분중합체는 전형적으로 약 20 내지 90분이 지나면 겔 내지 수화된 중합체 상태가 되나, 반면에 방향족 폴리이소시아네이트로 캡핑된 부분중합체는 보다 빨리 겔화된다. 적절한 이작용기성 및 다작용기성 이소시아네이트는 하기와 같다: 4,4'-메틸렌비스-(페닐 이소시아네이트)(MDI), 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2,6-디이소시아네이트(이것의 이성질체의 혼합물은 TDI로서 시판중이다), 이소포론 디이소시아네이트(IPDI), 에틸렌 디이소시아네이트, 에틸리덴 디이소시아네이트, 프로필렌-1,2-디이소시아네이트, 사이클로벡실렌-1,2-디이소시아네이트(cyclobexylene-1,2-diisocyanate), 사이클로헥실렌-1,4-디이소시아네이트, -페닐렌 디이소시아네이트, 3,3"-디페닐-4,4"-비페닐렌 디이소시아네이트, 1,6-헥사메틸렌 디이소시아네이트, 1,4-테트라메틸렌 디이소시아네이트, 1,10-데카메틸렌 디이소시아네이트, 큐멘-2,4-디이소시아네이트, 1,5-나프탈렌 디이소시아네이트, 메틸렌 디사이클로헥실 디이소시아네이트, 1,4-사이클로헥실렌 디이소시아네이트, p-테트라메틸 자일릴렌 디이소시아네이트, p-페닐렌 디이소시아네이트, 4-메톡시-l,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-클로로-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-브로모-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 4-에톡실-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-l,3-페닐렌 디이소시아네이트, 2,4-디메틸-1,3-페닐렌 디이소시아네이트, 5,6-디메틸-l,3-페닐렌 디이소시아네이트, 1,4-디이소시아네이토디-페닐에테르, 4,4'-디이소시아네이토디-페닐에테르, 벤지딘(benzidine) 디이소시아네이트, 4,6-디메틸-l,3-페닐렌 디이소시아네이트, 9,10-안트라센 디이소시아네이트, 4,4'-디이소시아네이토디-벤질, 3,3'-디메틸-4,4'-디이소시아네이토페닐메탄, 1,6-디메틸- 4,4'-디이소시아네이토디페닐, 2,4-디이소시아네이토스티벤(2,4-diisocyanatostibene), 3,3'-디메톡시-4,4'-디이소시아네이토디페닐, 1,4-안트라센디이소시아네이트, 2,5-플루오론디이소시아네이트(2,5-fluoronediisocyanate), 1,8-나프탈렌 디이소시아네이트, 2,6-디이소시아네이토벤즈루란(2,6-diisocyanatobenzluran), 2,4,6-톨루엔 트리이소시아네이트, p,p',p"-트리페닐메탄 트리이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트의 삼작용기성 삼량체(trifunctional trimer)(이소시아누레이트(isocyanurate)), 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용기성 뷰렛, 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 삼작용기성 삼량체 (이소시아누레이트), 중합체성 4,4'-디페닐메탄 디이소시아네이트, 자일릴렌 디이소시아네이트 및 m-테트라메틸 자일릴렌 디이소시아네이트.
선택된 디올 또는 폴리올을 폴리이소시아네이트로 캡핑하여 부분중합체를 형성하는 것은 반응물을 화학양론적 양으로 이용하여 효과를 낼 수 있다. 이소시아네이트-대-하이드록실기의 비율은 당업계에 알려진 바와 같이 다양할 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 약 3, 및 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 2.2여야 한다. 캡핑 반응은 임의의 적절한 조건, 예컨대 약 20℃ 내지 약 150℃, 건조 질소 하에서, 약 2 시간 내지 약 14일 동안, 및 바람직하게는 촉매의 부존재 하에서 수행될 수 있다. 바람직한 온도는 약 60℃ 내지 100℃이며, 이소시아네이트의 농도가 대략적인 이론값에 근접했을 때 반응은 종료한다.
바람직한 부분중합체에는 그 말단이 톨루엔 디이소시아네이트로 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜; 산화에틸렌 및 산화프로필렌(선택적으로 트리메틸올프로판과 함께) 및 톨루엔 디이소시아네이트의 공중합체; 톨루엔 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜-트리메틸올프로판, 메틸렌 디이소시아네이트-메틸렌 균일중합체; 중합체성 메틸렌 디이소시아네이트-폴리에틸렌 글리콜; 산화에틸렌-산화프로필렌-트리메틸올프로판 및 이소포론 디이소시아네이트의 중합체, 및 폴리에틸렌 글리콜 트리락테이트(trilactate) 및 톨루엔 디이소시아네이트가 포함된다. 상기 형태의 적절한 부분중합체는 다우 케미칼 컴패니(Dow Chemical Company)에서 HYPOL PreMA® G-50, HYPOL® 2000, HYPOL® 3000, HYPOL® 4000 및 HYPOL® 5000으로 시판중인데; 이러한 배합물은 일반적으로 산화폴리에틸렌의 공중합체 및 분자량이 약 6,000달톤인 소량의 산화폴리프로필렌을 함유한다. 이외에도 엔바이로켐 테크놀로지즈(EnviroChem Technologies)에서 상표명 Urepol로 공급되며, 이에 상응하는 부분중합체가 상업적으로 시판되는 공급원료로부터 제조될 수 있다.
고려되는 모든 것들에 있어서, 하이드로겔 중합체의 주쇄는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체로 구성된다. 비이온성이고 친수성의 특징을 가진 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 하이드로겔은 하이드로겔에 대한 분석대상물의 비특이적 결합을 낮은 수준으로 제공하며 또한 하이드로겔에 고정화될 수 있는 생물학적 분자와의 양호한 융화성을 제공하여 그 결과 생물학적분자 천연의 구조 및 생물학적 반응성을 유지할 수 있다. 이러한 일반적인 형태의 폴리우레탄-기반 이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 미국 특허 제3,939,123호(Mathews, et al.), 제4,110,286호(Vandegaer, et al.) 및 제4,098,645호(Hartdegan, et al.)에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 마이트로어레이를 위한 기질은 수-활성(water-active) 디이소시아네이트로 캡핑된, 고분자량의 산화폴리에틸렌, 산화폴리프로필렌, 또는 산화폴리에틸렌과 산화폴리프로필렌의 공중합체의 디올 또는 트리올 기반인 이소시아네이트-작용성 하이드로겔을 이용하여 제조되는데, 선택적으로 이 이소시아네이트-작용성 하이드로겔은 적절한 가교제로 약간만 가교결합될 수도 있다. 이전에 설명한 바와 같이, 부분중합체 내에 존재하는 활성 이소시아네이트의 양은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1meq/g인 것이 바람직하다. 일반적으로 선호되는 디이소시아네이트에는 방향족-기반 디이소시아네이트, 톨루엔 디이소시아네이트(TDI) 및 메틸렌 디페닐이소시아네이트(MDI) 및 지방족 디이소시아네이트, 이소포론 디이소시아네이트가 포함된다. 부분중합체 내에 약 0.01% 내지 약 15%의 반응성 이소시아네이트는 일반적으로 기질에 코팅을 결합하기 위해 이용되며, 기질은 고정화 앵커링 엔티티(entity)를 위한 넓은 지점을 남겨둔다. 부분중합체는 수-비혼화성 유기 용매 내에서 예비배합될 수 있으며, 중합반응은 일반적으로 물의 단순한 첨가 즉시 발생하는 우레아 결합의 형성에 의해 일어난다.
도포되는 하이드로겔 코팅은 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티를 함유하고, 이 모이어티는 마이크로어레이의 일부분으로서 프로브를 직접 또는 간접적으로 고정시키기 위해 이용된다. 이들은 수용액에 용해될 수 있으며 부분중합체와 혼합되어 중합화 반응을 개시할 수 있다. 적절한 앵커링모이어티의 예에는 유기 킬레이트제 및 유기 링커가 포함되며, 링커는 스트렙타비딘과 비오틴 같이 상보적인 링커 한쌍의 1/2일 수 있고, 이후 이 한쌍 중 나머지 구성요소는 해당 프로브에 부착된다. 유기 길레이트제가 중합화가능 층의 일 구성성분으로서 혼합될 경우에(따라서 경화된 층에 전체적으로 균일하게 분산되면), 이 중합화가능 층의 경화에 이어서 코팅은 수용액 내에서 수용성 금속이온으로 처리되며, 그 결과 금속 양이온이 유기 킬레이트제에 통상 3 또는 4 포인트로 결합하게된다. 이러한 시스템이 이용될 경우에는, 프로브는 마찬가지로 경화된 코팅층에 활성화된 킬레이트제를 보유한, 금속 이온과 착물을 형성할 것인 유기 분자에 부착될 것이다.
경화된 하이드로겔 층 또는 슬라브의 두께는 약 1미크론 내지 약 1000미크론까지 다양할 수 있는데; 적어도 약 5미크론 두께인 것이 바람직하다. 예를 들어, 이미노디아세트산(IDA) 또는 니트릴로트리아세트산(NTA)와 같은 세자리(tridentate) 또는 네자리 유기 킬레이트제가 이용될 경우, 이들은 어레이의 영역을 덮을 것인 전체 코팅층에 전체적으로 균일하게 분산된 이러한 앵커링모이어티의 적절한 양일 것인, 약 50mM 내지 약 1mM의 농도로 코팅 조성물에 함유될 수 있다.
일단 하이드로겔 층 또는 슬라브가 도포되면, 배합물이 본질적으로 완전히 가교결합될 때까지 경화되도록 둔다. 도포 및 경화가 폐쇄된 조건 하에서 수행될 수 있으므로, 용매의 증발과 관계된 문제는 본질적으로 제거될 수 있고(평편한 플레이트 상에 통상적인 패턴의 마이크로스팟을 침착하는 상황과는 반대된다); 따라서, 환경적 또는 기타 제조상의 난점에 봉착하지 않으면서도 보다 넓은 범위의 용매 및 하이드로겔 배합물이 이용가능하다. 마찬가지로, 코팅되는 플레이트 사이에는 가변성이 거의 없어야 하는데, 왜냐하면 주조/몰딩/코팅 단계가 극단적으로 균일하게 만들어질 수 있고, 대량의 플레이트가 일시에 코팅될 수 있어서, 기계적 스팟팅 고유의 여러 제한점이 미연에 방지되어야 하기 때문이다.
일단 슬라이드가 완전히 경화되면, 즉 가교결합이 본질적으로 완료되면, 하이드로겔과 결합하지 않은 임의의 유기 킬레이트제 또는 기타 유기 링커를 제거하고, 또한 코팅 조성물을 배합 및/또는 도포하는데 이용된 용매를 제거하기 위해서 슬라이드가 세척된다. 앵커링모이어티가 유기 킬레이트제일 경우에, 코팅된 기질은 예컨대 질산구리 또는 질산니켈의 용액으로 배양될 수 있다. 결과적으로 그러한 용액에서 유래한 구리 또는 니켈 이온은 킬레이트제와 결합하게 되고, 이를 당업계에서는 킬레이트를 활성화시킨다고 말한다. 이후, 코팅된 기질은 선택적으로 건조되고 미정의 기간동안 저장된다. 만약, 그러한 단계가 효과가 있다면, 모든 코팅 또는 적어도 마이크로스팟이 위치할 영역의 복원(rehydration)은, 바람직하게는 마이크로어레이가 제조되기 전에 또는 제조와 동시에 수행될 것이다.
포획제 또는 프로브로 이용되는 생물학적 물질은 당업계에 잘 알려진 광범위한 종류 중 임의의 하나가 될 수 있다. 이들은 DNA 서열 및 펩타이드에서부터 보다 큰 분자, 예컨대 항체까지의 전범위에 해당될 수 있으며; 심지어는 살아있는 세포가 적절한 상보적인 링커를 이용하여 다공성 하이드로겔의 별개의 공간적 위치에 부착될 수 있다. 본원에서 언급한 킬레이트제 및 비오틴-아비딘 이외에도, 기타 결합쌍이 전술한 특허 및 공개된 국제출원에 게시되어 있다.
통상의 분석에 있어서, 마이크로어레이는 혼성화/결합 조건 하에서 용액, 일반적으로는 생물학적 물질의 표본을 함유하는 수성 용액에 노출되며; 이 용액은 보고자(reporter) 또는 신호 물질 또는 링커로 태그 또는 표지된 잠재적 표적을 함유하는데, 이 잠재적 표적은 순차적으로 보고자 물질과 격리되고 배양될 것이다. 표지 또는 태그는 표적, 예컨대 핵산 서열에 부착될 수 있는 치환체를 의미하는데, 이는 표적의 검출 및/또는 정량을 가능하게 한다. 그러한 표지의 예에는 32P, 33P, 및 35S와 같은 방사선표지; 형광, 화학발광 또는 착색 화합물과 같은 비색적 표지; 비오틴과 같은 리간드; 및 질량 또는 기타 분광학적 특성에 의해 구별가능한 화학기(chemical group)가 포함된다. 적절한 표지의 보다 구체적인 예에는 잔틴(xanthine) 염료, 로다민(rhodamine) 염료, 나프틸아민, 벤즈옥사디아졸, 스틸벤, 피렌, 아크리딘(acridines), 시아닌 3(Cy-3) 및 시아닌 5(Cy-5)가 포함된다. 표적이 핵산일 경우에, 표지는 바람직하게는 분석대상 핵산에 프라이머의 일부분으로서 직접적인 혼합에 의해 주입되나; 화학반응 또는 효소적 반응에 의한, 또는 중간체 리간드로 표지를 혼성화 또는 어닐링함에 의한 간접적인 첨가 방법도 또한 이용될 수 있다. 단순성 및 효율성을 위해서는, 혼성화 단계에서 형광, 방광 또는 인광의 빛-방출 표지를 사용될 분석대상물의 표본에 이용하는 것이 바람직하다. 아비딘-비오틴과 같은 결합쌍이 순차적으로 표지를 첨가하기 위해 이용될 수 있을지라도, 이러한 기질은 배양 단계에서 이용될 표본 용액 내의 표적 생물학적 물질에 표지가 미리 공유적으로 결합된, 분석용 마이크로어레이를 제조하는데 특히 유리한 효과를 제공할 수 있다. Cy-3 및 Cy-5와 같은 형광 표지는 일반적으로 이용되는 그러한 표지의 예이다.
표본 용액으로 적절한 기간 동안 마이크로어레이를 배양한 후에, 당업계에 잘 알려져 있고 일반적인 것처럼 세척이 일반적으로는 반복적으로 수행되며; 이후, 이 마이크로어레이는 일반적으로 이미지화에 적용되기 이전에 건조된다. 동시적으로 또는 자극을 받았을 때 빛을 방출하는 표지가 이용될 경우에, 상업적으로 시판 중인 여러 광도계가 이미지화를 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,672,880호에는 방출된 형광성 빛을 수집하고 이 수집된 빛을 광검출기로 보내어 신호를 생성하며, 형광을 자극하기 위해 레이저 빔을 사용하는 형광 이미지화 시스템이 게시되어 있다. 공개된 미국출원 2002/0109841호에는 높은 처리량의 형광 검출을 위한 주사 분광광도계가 게시되어있는데, 여기서 빛은 수집되어 처리 유닛으로 신호를 공급하는 광증배관(PMT)으로 전송된다.
하기의 실시예는 본 발명을 수행하는데 현재 알려진 가장 최적의 형태를 제공하기 위해 제시된 것이지만; 그러나, 이러한 실시예는 오직 예증의 목적을 위해서만 제시된 것이고 본 명세서의 끝부분에 제공한 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 제한하는 임의의 방법으로 여겨져서는 안된다는 것은 이해되어야 한다.
실시예 1
반사성 알루미늄층 위에 이산화규소의 얇은 층으로 코팅된 실험실용 표준 슬라이드 글래스를 이용했으며, 이 슬라이드 글래스를, 전체적으로 분산된 앵커링모이어티를 보유하는 하이드로겔 부분중합체의 연속층으로 코팅했다. 용액 A는 Hypol PreMa G-50(다우 케미칼 컴패니) 0.075g 및 아세토니트릴 0.225g과 N-메틸-2피롤리돈 0.225g의 용액을 혼합하여 제조했다. 용액 B는 pH 8.2에서 수성 붕산염 버퍼 50mM에 유도체화된 NTA 킬레이트제 0.5μM로서 제조했다. 이 킬레이트제는 가교결합된 하이드로겔 내에서 공유적으로 결합하는 1차아민이다. 이후, 용액 A 약 200μL를 용액 B 50μL와 혼합하여 중합화가 개시되도록 했으며, 수득된 조성물을 아민으로 처리한 슬라이드 글래스에 코팅했다. 킬레이트제를 함유하는 이 하이드로겔 코팅은 탈수를 회피하기 위하여 약 95%RH 및 실온의 습기상자(humidity box)에서 주의를 기울여 중합화했다. 이 배합물을 실온에서 약 2시간 이내로 중합화했다. 경화단계 이후에, 하이드로겔 슬라브의 두께는 약 50미크론이었으며, 물리적으로 안정했고, 슬라이드 글래스에 강하게 부착되어 있었다. 이후, 이 경화된 슬라이드를, 약 50μM의 농도로 질산을 함유하고 있는 수용액으로 실온에서 약 2시간 동안 처리하여 구리 양이온이 다공성 하이드로겔 슬라브에 전체적으로 균일하게 분산된 킬레이트제 분자에 의해 격리되도록 했다. 이러한 방법으로 킬레이트제를 활성화한 후, 0.1M KNO3를 함유하는 50μM 아세트산(pH4)으로 슬라이드를 1시간 동안 세척했고, 이어서 탈이온 H2O로 세척했다. 이후, 이것을 건조하여 시험용 마이크로어레이로 제작하기 위한 마이크로스팟팅을 위해 준비시켰다.
5μL 유리 미세모세관 튜브를 이용해서 마이크로스팟팅을 수행하여 활성화된 하이드로겔 슬라브의 표면에 규칙적인 형태의 마이크로스팟을 형성했다. 시험의 목적을 위하여, 이 튜브 각각에 프로브를 자극하기 위한 녹색의 형광 단백질을 함유했는데, 이는 구리와 착물을 형성하는 히스티딘-풍부 펩타이드로 태그되었다. 마이크로스팟을 수행한 표면을 실온에서 약 2시간동안 배양하여 경화된 하이드로겔 슬라브의 표면에 걸쳐 존재하는 이러한 규칙적인 패턴의 마이크로스팟 내에 이들 프로브가 유효하게 부착하도록 하였다.
이 마이크로어레이를 세척하여 임의의 과량의 프로브를 제거한 후, 전하 결합 카메라(charge coupled camera)로 스캔하였다. 이를 이미지화하자 어레이 표면에 걸친 규칙적인 패턴 내에 균일하게 빛을 보이는 마이크로 스팟과 함께 마이크로 스팟 사이에 영역에서는 유효한 형광이 방출되지 않는 것이 나타났으며; 이는 하이드로겔 슬라브에 대하여 비특이적 결합은 문제되지 않았다는 것 및 기질이 고민감성 마이크로어레이의 제조에 상당히 적합하다는 것을 나타내는 것이었다.
실시예 2
실시예 1에 설명한 절차를 비슷한 이소시아네이트-캡핑된 폴리우레탄 부분중합체를 이용하여 반복했다. 그러나, 이번에는 pH 8.2에서 50mM 수성 붕산염 버퍼 내에 스트렙타비딘 0.5mM 용액으로서 용액 B를 제조했다. 다시, 용액 A 약 200μL와 용액 B 약 50μL를 혼합하고, 수득된 조성물을 아민으로 처리한 슬라이드 글래스 상에 연속 층으로 코팅했고 전술한 바와 같이 중합화하도록 두었다.
경화 후에, 5μL 유리 미세모세관 튜브를 이용해서 마이크로스팟팅을 수행하여 하이드로겔 슬라브 표면 상에 마이크로스팟의 규칙적인 패턴 형태로 마이크로어레이를 제조했다. 본 시험을 위해서, 튜브 각각은 프로브로서 이용될 것인 프로스테이트-특이적(prostate-specific) 항원(PSA)에 대한 비오티닐화된 항체를 함유했는데, 이는 당업계에 잘 알려진 것이다. 마이크로스팟팅을 수행한 표면을 25℃에서 약 60분간 배양하여 이들 프로브가 경화된 하이드로겔 슬라브의 표면에 걸쳐 존재하는 규칙적인 패턴 내에서 비오틴-아비딘 부착이 효과를 나타내도록 하였다. 25℃에서 약 60분간 배양한 후에, 이 어레이를 세척하고, 그 다음 레이저 스캐너(ScanArray® Lite, Perkin Elmer)를 이용해서 이미지화 하여 마이크로어레이의 표면에 대한 형광 이미지를 수득했다. 이를 이미지화하자 어레이 표면에 걸친 규칙적인 패턴 내에 균일하게 빛을 보이는 마이크로 스팟과 함께 마이크로 스팟 사이에 영역에서는 유효한 형광이 방출되지 않는 것이 나타났으며; 이는 하이드로겔 슬라브에 대하여 비특이적 결합은 문제되지 않았다는 것 및 기질이 고민감성 마이크로어레이의 제조에 상당히 적합하다는 것을 나타내는 것이었다.
따라서, 그러한 연속적인 하이드로겔의 슬라브를 보유한 기질의 이용이 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티를 이용하여 제조될 수 있는 마이크로어레이와 함께 그 효율을 실질적으로 증가시킬 수 있다는 것이 관찰되었다고 할 수 있 다.
본 발명이 바람직한 구체예에 관련하여 기술하였지만, 이하 첨부된 청구의 범위에 설명된 본 발명의 범주에서 벗어남이 없이 다양한 변화 및 변형이 당업자에게는 자명할 것이라는 것이 이해되어야 한다.

Claims (18)

  1. 유기 분자로 작용기화된 상부 표면을 보유하는 기질을 제공하는 단계,
    표면의 어레이 영역을 완전하게 덮도록, 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티를 함유하는 중합반응성 하이드로겔 층으로 상기 표면을 코팅하는 단계,
    이 코팅된 기질을 경화시켜 상기 하이드로겔 층을 중합화하는 단계, 및
    이어서, 상기 경화된 하이드로겔 층 내에 존재하는 상기 앵커링 모이어티에 프로브(probe)를 결합시켜, 상기 코팅된 표면상의 별개의 공간적 위치에 복수의 상이한 프로브를 부착시키는 단계를 포함하는, 마이크로어레이의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 앵커링모이어티는 상기 중합반응성 층의 구성성분과 혼합된 유기 킬레이트제인 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 경화 단계 후에, 상기 킬레이트제를 수용액 내에 수용성 금속 이온으로 처리하여 활성화시키는 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 상기 금속 이온에 강하게 결합하는 화합물로 유도체화된 분자인 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프로브가 히스티딘-풍부 펩타이드로 유도체화된 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로브가 상기 부착 단계 동안에 상기 앵커링모이어티에 직접 결합하는 상보적인 링커로 유도체화된 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커 및 상기 앵커링모이어티는 각각 비오틴 및 스트렙타비딘인 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합반응성 하이드로겔은 PEG 또는 PPG 또는 이들의 공중합체를 함유하는 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중합반응성 하이드로겔은 폴리이소시아네이트 가교제를 함유하는 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 가교제에는 지방족 또는 방향족 폴리이소시아네이트가 포함되는 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 경화 후에 상기 코팅된 기질이 건조되고, 이후 프로브가 부착될 위치가 복원(rehydrate)되는 것이 특징인, 마이크로어레이의 제조방법.
  12. 유기 분자로 작용기화된 상부 표면을 보유한 기질,
    상기 표면의 어레이 영역을 완전히 덮는 중합화된 하이드로겔 층으로서, 전체적으로 균일하게 분산된 앵커링모이어티를 함유하는 중합화된 하이드로겔 층, 및
    상기 표면상의 별개의 공간적 위치에서 상기 하이드로겔 코팅층에 부착된 복수의 상이한 프로브로서, 이 프로브는 상기 중합화된 하이드로겔 층 내의 앵커링모이어티에 결합되고, 별개의 위치를 둘러싸는 상기 코팅층의 영역은 본질적으로 프로브를 함유하지 않는 것인 복수의 상이한 프로브를 함유하는, 마이크로어레이.
  13. 제12항에 있어서, 상기 앵커링모이어티는 금속 이온으로 활성화되는 유기 킬레이트제인 것이 특징인, 마이크로어레이.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브가 히스티딘-풍부 펩타이드로 유도체화된 것이 특징인, 마이크로어레이.
  15. 제12항에 있어서, 상기 프로브는 상기 앵커링모이어티에 직접 결합하는 상보적인 링커로 유도체화된 것이 특징인, 마이크로어레이.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프로브는 비오티닐화된 것이고, 상기 앵커링모이어티는 스트렙타비딘인 것이 특징인, 마이크로어레이.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합화된 하이드로겔은 PEG 또는 PPG 또는 이들의 공중합체의 반응 생성물을 함유하는 것이 특징인, 마이크로어레이.
  18. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합화된 하이드로겔은 (a) 분자량이 약 1,000 내지 약 6,000달톤 사이인 PEG 또는 PPG 또는 이들의 공중합체 및 (b) 다작용기성 이소시아네이트의 반응 생성물을 함유하는 것이 특징인, 마이크로어레이.
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