JP4198468B2 - 生細胞および有機分子をカプセル封入するための方法およびゲル組成物 - Google Patents

Description

本発明は、生細胞、タンパク質、酵素、抗体、小有機分子など、生体物質をカプセル封入するのに有用なポリウレタンヒドロゲルを形成させる系および方法、ならびにそこから得られる組成物に関する。より詳細には、本発明は、生体適合性ポリマーと、中性のｐＨなどの生体適合性重合条件とを使用する重合方法であって、重合プロセスを通して水性環境が維持され、生理学的に妥当なモル浸透圧濃度が保たれる方法の配合法および使用、ならびに得られるそのような改良生成物を利用するバイオアッセイに関する。本発明は、所定の材料をカプセル封入する分野における意味ある進展を表明し、さらにこの出願の譲受人に譲渡された特許文献１に記載の方法について、ある観点から、重要な進歩を説くものである。

本出願は、２００１年４月３日出願の米国特許仮出願番号６０／２８１，２６８からの優先権を主張するものであり、この開示を参照により本明細書に組み込む。

酵素、抗体、ペプチド、またはたとえばアプタマーのような他の生物活性分子の使用は、バイオアッセイおよびプロテオミクスの分野で、スクリーニング用ツールとして注目されている。この進展の一環として、このような生物活性材料用にヒドロゲル担体を使用することについても重要性が高まってきている。ヒドロゲルとは、水分を含有するポリマーマトリックスであると定義される。特に、ヒドロゲルは、コーティングなど、他の分子レベルの結合を使用して、固体担体の表面にタンパク質または他の材料を直接に接着した場合に得られる、より変性した環境とは対照的に、自然の水性細胞環境により近い生体材料用担体になる。

ある種のヒドロゲルが生体分子および／または生細胞用のマトリックス担体としてすでに開示されており、これらには、アルギン酸塩、架橋が可能になるよう改変されたアルギン酸塩、アクリルアミドをベースとするヒドロゲル、およびポリエチレンオキシドをベースとするヒドロゲルが含まれる。しかし、一般に、ゲル重合およびカプセル封入の要件と、生細胞または所定の活性タンパク質の生存能力または活性を保つのに必須の穏やかな条件とを両立させるのは難しいことが多い。その上、このような穏やかな条件に適する材料の多く、たとえばアルギン酸塩ポリマーは、幅広い適用例に必要な構造上の要件および／または生体安定性を欠いている。

アルギン酸塩ゲルは、真核生物細胞およびタンパク質の固定化用に幅広く利用されている。一般に、この形態のヒドロゲルは、カプセル封入プロセスの間温和であり生体適合性であるが、構造安定性を欠くという欠点をもち得る。したがって、時にはアルギン酸塩を多価カチオンと組み合わせて、より安定なイオン架橋ゲルを生成する。しかし、生理学的に妥当な緩衝液および環境に曝すと、多価カチオンは、１価の化学種と交換する傾向があり、ポリマーはしばしば構造上の完全性を失う。その結果、アルギン酸塩は、生体分子および生細胞をカプセル封入するのに幾分望ましくないヒドロゲルとなる。さらに、アルギン酸塩ゲルを全体から見て製品化の可能性は困難であり、このようなゲル系の望ましさおよび適用可能性がさらに低下する。

ポリアクリルアミドヒドロゲル系も、生体分子を接着するマトリックスおよびカプセル封入媒体としてかなり注目されている。たとえば、非特許文献１は、メチレンブルーを光触媒として使用する、アクリルアミド／ビスアクリルアミド混合物の光開始重合によって生成したゲルパッドアレイを記載している。次いで、タンパク質は、グルタルアルデヒドと架橋するか、またはその後ゲル担体に化学結合できるよう、選択したタンパク質上に存在する炭水化物部分に化学修飾を行うことによって、マイクロマトリックスに適用した後で各ゲルパッドに共有結合させる。しかし、このような結合方法は、タンパク質の完全性および／または活性にとって潜在的に非常に有害であることがあり、どんなタンパク質にも遍在して見られるものでない糖残基の存在が必要となることがある。

ポリアクリルアミドをベースとするヒドロゲルの使用に代わる選択肢は、主にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）重合単位から構成されるポリマーを使用することである。このようなポリマーは、生体適合性、小分子の拡散、および製造プロセスの制御といった領域で、いくつかの異なる有利点をもたらし得る。たとえば、血清アルブミンにＰＥＯをグラフトすると、自然のアルブミンの免疫原性が有意に低下する（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ等、１９７７年）。Ｈｕｂｂｅｌｌ等（特許文献２および関連特許）は、染料をベースとして光開始されるフリーラジカルをベースとする重合プロセスを利用する細胞のカプセル封入に、ポリエチレングリコールポリマーを使用することを教示している。

前述のポリアクリルアミドまたはＰＥＧポリマーゲルでは、重合を開始するのに、別個の光活性可能触媒、および／またはポリマー成分もしくはポリマーサブユニットとは別で異なるフリーラジカル生成型重合促進剤を加える必要がある。ＣｈｕｄｚｉｋおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（特許文献３）は、重合可能な基に懸垂しており、したがって開始剤成分を別に加えなくて済むポリマー開始剤基の使用を教示している。

また混合式ポリマー／アルギン酸塩系が考案されて、単独の各々の系に固有の制限が克服されている。たとえば、Ｄｅｓａｉ等（特許文献４）は、イオン結合によって架橋された生体適合性成分と共有結合した成分との混合物を使用している。しかし、プロセス全体では、依然として光開始されるフリーラジカルをベースとする重合に頼っている。

このようなプロセスの範囲内でフリーラジカルを必須要素として組み込む方法を利用することは、現在使用されているカプセル封入／重合技術の多くの一般に望ましくない特徴である。たとえば、アクリルアミドゲルを用いる細胞のカプセル封入では、「アクリルアミドの重合によって、熱およびフリーラジカルが生成し、固定化された細胞の化学浸透圧の完全性および酵素活性が失われる」（非特許文献２を参照されたい）。したがって、重合の開始にフリーラジカルを使用せず、それによってカプセル封入された細胞および生体分子に対する潜在的な害を回避する重合方法を提供することが望ましい。また、生物学的状況および用途で構造的耐久性および力学的耐久性の両方を有するポリマー、特に、真に生体適合性である、すなわちカプセル封入された生体分子もしくは細胞、および周囲の媒質もしくは宿主に対して非毒性であるポリマーを利用することが望ましい。

Ｗｏｏｄ等は、イソシアナート官能性プレポリマーから生成したポリウレタンをベースとするヒドロゲルを含む様々な架橋ポリマー系を使用して、微生物細胞をカプセル封入する架橋ポリマーを生成することを教示している（特許文献５および６）。ポリアゼチジンプレポリマーと、多価イオンと架橋できるカルボキシメチルセルロースとを使用する方法も記載されている。このようなポリウレタンをベースとするヒドロゲルでカプセル封入する際に、イソシアナートと微生物細胞が直接に接触し、他の潜在的に毒性のある条件に曝されることは、特定の敏感な生体材料のカプセル封入には適さないといえる。

特許文献１では、重合する間その構造の範囲内で、ポリウレタンをベースとするヒドロゲルプレポリマーを使用して、核酸プローブなどの生体分子を同時に誘導体化している。このような重合プロセスは、ＰＥＧをベースとするプレポリマーが使用でき、フリーラジカル、または重合を開始するために水を使用した結果として生じる他の物質を回避するのに好都合である。しかし、プレポリマーの生成、誘導体化、および／または可溶化に、有機溶媒がしばしば使用されるので、このプロセスは、生存哺乳動物細胞など、ある種の敏感な材料に対してはそれでも毒性がある。

簡潔に述べれば、敏感なタンパク質、酵素、抗体、生細胞など、特定の生体物質を、有用かつ経済的に実施可能な方法でカプセル封入する目的で、アッセイおよび他の適用例に好適な生成物をもたらし得る、真に温和で非毒性、かつ生体適合性で力学的に頑強なヒドロゲルポリマー、およびそれに関連する重合方法が依然として大いに求められている。

米国特許第６，１７４，６８３号 米国特許第５，５７３，９３４号 米国特許第６，１５６，３４５号 米国特許第５，３３４，６４０号 米国特許第４，４３６，８１３号 米国特許第４，７３２，８５１号 Arenkov, et al. (Anal. Biochem. 278, 123-131 (2000)) Poncelet De Smet, et al. in "Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization", Mattheus F.A. Goosen, editor, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993, p. 301

本発明の目的は、生体物質、すなわち生細胞、タンパク質、核酸、および小有機分子を含む他の生物活性材料および化合物を、直接または間接的にカプセル封入もしくはコーティングするため、イソシアナートで改変した生体適合性マクロマーを生体に適合するように重合させる方法を提供することである。

この重合プロセスは、有機溶媒を使用しないので正に生体適合性である。この新規のプロセスは、チオールをベースとする架橋剤を利用するものであり、ヒドロゲル内での生体材料の架橋を低減し、それによって、診断および治療での使用に特に適する形の生体材料、たとえば、タンパク質マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ、または高処理能試験用の他の有機化合物をカプセル封入し、接着することがこのプロセスでできるようになる。

この重合方法では、チオール含有架橋剤と、好ましい共役求核試薬（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）としてのアミンとは対照的なスルフヒドリル基の反応を優先的に選択する、重合の間水が存在する選択的な反応条件、具体的には中性のｐＨおよび水性緩衝液とを使用する。これによって、生体分子および生細胞にとって特に重要なものである緩やかなカプセル封入を可能にする穏やかな非ラジカル反応条件が提供される。カプセル封入用ポリマーの多孔度は、都合に合わせて様々でよく、このカプセル封入プロセスでは、結合剤を介して直接または間接的に、あるいはこのような生体物質を別々にカプセル封入する液滴または球体を形成することによって、細胞、タンパク質、または他の有機分子をカプセル封入しているスポット状または層状の分離したヒドロゲル液滴が、ガラス製スライドまたは他の表面上に沈着できるようになる。さらに、全体から見たカプセル封入／重合プロセスは、類似の方法よりも少ないステップしか含まず、それによってプロセスの開発が簡単かつ容易になる。得られるポリマーによって、抗体もしくは酵素アレイ、および生細胞のカプセル封入が可能になるので、バイオリアクター、バイオセンサー、バイオチップ、および人工臓器にこのような材料を使用する潜在性が高められる。そのようなカプセル封入細胞は、複雑な生体経路スクリーニングに向けたバイオアッセイ開発の必然的な伸展として役立つことが期待されており、カプセル封入細胞は、複雑な治療薬および材料を経済的に生成するためのバイオリアクター中のツールとして有用となる。さらに、カプセル封入生細胞は、変質した環境または毒性の環境に必要に応じて反応する人工臓器またはバイオセンサーとして働く潜在性をもつ。カプセル封入細胞または他のそのような生体物質のマイクロアレイは、高処理能の生物学的試験にも有用であろうと期待されている。

イソシアナート官能性プレポリマーを硬化させ、またはその架橋を開始するためにしばしば水を加える。これは、プレポリマー単位間に共有結合を形成するのに適する反応種を生成するのに使用される、フリーラジカルをベースとする方法、たとえばＵＶ誘発型光重合を利用するプロセスとは対照的である。イソシアナート官能基を、選択したプレポリマーに共有結合させ、そのように水を加えることによって、若干のイソシアナート部分を変換させて、温度およびｐＨに基づき一定の頻度で活性な第１級アミンを得る。図１に示すように、その後その第１級アミンと別のプレポリマー単位に結合した別のイソシアナートとを反応させ、それによってプレポリマー単位を互いに共有結合させる。これは、一般に特許文献１で利用された所定の反応を表すものである。このプロセスでは、プレポリマーの反応性および反応条件が制御されて、気泡形成および／またはポリマーの沈殿が妨げられる限り、光学的に透明な尿素をベースとするヒドロゲルが生成する。この重合プロセスの間に、様々な生物学的存在または小分子、すなわち生体物質が存在していてよく、あるいは、これらを加えて生物学的に活性のあるヒドロゲルを生成してもよい。用語生体物質には、この特許出願の意図では、生細胞、抗体などのタンパク質、他の天然もしくは合成どちらもの生物活性材料、および生物活性によって機能する小有機分子が含まれると理解すべきである。したがって、生体物質の大きさは事実上様々でよく、以下で説明するように、小さなサイズの分子が、固定部分を備えていることが望ましいことがわかる。

特許文献１は、固体担体表面に接着したオリゴヌクレオチドアレイを得る目的で、イソシアナート官能性プレポリマーに、第１級アミンで誘導体化したオリゴヌクレオチドを加えることを記載している。この方法の有利な特徴は、イソシアナートプレポリマー単位同士の重合反応が完了する際、オリゴヌクレオチドがポリマーマトリックスに共有結合するようになることである。しかし、アミンとの結合に基づくこのような方法は、ある種の敏感な生体物質、たとえばある種のタンパク質や生細胞に適さないこともある。第１級アミンは、生細胞の表面上に存在するタンパク質、たとえば、リガンド受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、および細胞間の接着タンパク質を含むすべてのタンパク質の成分であるので、このようなアミンのイソシアナート官能性プレポリマーに対する直接の広範囲にわたる誘導体化または結合は、タンパク質を不活化し、変性させ、またはその官能基を変更する可能性がある。今回、この目的のためにアミンの代わりに主としてチオール基に頼る新規の架橋手法を利用することによってその可能性が最小限に抑えられることが判明した。

チオールをベースとする架橋剤は、アミン官能基を使用するのとは対照的に、異なるプレポリマーのイソシアナート基間の架橋反応を媒介する物として働く。当然、水性の環境では、一定割合のイソシアナート基が加水分解を受けるが、結果として生成する第１級アミンのｐＫａ値は、９〜１０の範囲である。ｐＨを中性に保つことによって、これらのアミンの大部分がプロトン化され、したがって重合反応に関与しなくなる。中性のｐＨとしては、６．５〜７．５が好ましく、６．６〜７．１がより好ましいが、ｐＨ約７．０が最も好ましい。このようなチオール含有化学種の存在は、未反応のイソシアナート基を架橋するので、重合プロセスが有効に実施される。

チオール架橋剤をそのように優先的に使用したことの１つの好都合な成果は、カプセル封入または固定化される生体物質との、マトリックスへの接着が望ましくない分子上の位置での反応が最小に抑えられることである。重合反応のｐＨを制御すると、チオール基でなくアミンの求核反応性が抑制され、マトリックス内のタンパク質への広範囲にわたる結合の形成が回避される。タンパク質は当然、種々のアミノ酸から構成されており、そうしたアミノ酸には、重合プロセス全体を通して潜在的に反応性のある側鎖の第１級アミンを含むものもある。しかし、そのようなアミン官能基への結合は、タンパク質の本来の挙動および配座をかなり妨げることがあり、生細胞の場合では、細胞外および原形質膜タンパク質のパターンおよび反応性を変更しそうである。本発明の方法は、そのような結合およびそのマイナスの側面が生じるのを実質的に制限するものである。

たとえば、アミノ酸リジン側鎖の第１級アミンのｐＫａ値は、かなり塩基性の約１０．５であり、アルギニンでは、それよりもはるかに塩基性、すなわち１２を上回る。重合混合物のｐＨがほぼ中性に保たれた場合、図１に示すものなど、求核性の付加に関係するのに適する遊離アミンの割合は、リジン側鎖によって表される第１級アミン集団全体の１／１０００を下回る。対照的に、チオール基は、中性のｐＨ値でも求核性であり、かつ非常に反応性のあるままである。タンパク質中のシステイン残基は、チオール側鎖を含んでいるが、タンパク質内のシステインの出現率は、一般にリジンの３分の１以下であり、存在した場合、システインはしばしば酸化して、未変性タンパク質中に分子内シスチン結合を形成し、それによって利用可能なスルフヒドリル基数がさらに減少する。全体として、包埋されたタンパク質もしくは細胞とポリマーマトリックス間の、変性を起こす可能性のある多数の結合の数が極めて実質的に減少する結果となり、したがって、ヒドロゲルプレポリマーのこのようなチオール介在性の架橋によって、敏感な生体分子および生細胞をカプセル封入するための改良された配合物が得られる。

その上、チオール反応に依存するこのカプセル封入法は、小有機分子、たとえば、分子量が１００と２０００の間である有機分子、特に分子量が約５００を超えない有機分子を、ヒドロゲル中でその有効性が完全に保持されるように固定する非常に有効な手段ともなる。このような小分子は、小分子の二次構造または三次構造が妨害されない分子中の位置、たとえば一般に線状である分子の一端にチオール基が配列されるように誘導体化される。小分子は、この種類のカプセル封入用マトリックス中に必ずしも保持されない大きさであることもあるが、チオール基の存在によって、ポリマー上のイソシアナート基への結合が実現し、したがって小有機分子は、その正常な活性配座をとることができるようなやり方で、ゲル内またはゲル上に固定される。このやり方では、このカプセル封入方法を使用して、化学チップと呼ばれるようなものと同様に、タンパク質チップ、細胞チップなどをつくり出すことができる。

イソシアナート官能性プレポリマーは、多くの場合二官能性もしくは多官能性イソシアナート化合物と反応させた比較的高分子量のポリオキシアルキレンジオールもしくはポリオールから作製される。好ましいプレポリマーは、エチレンオキシド単位のホモポリマー、またはエチレンオキシド単位とプロピレンオキシドもしくはブチレンオキシド単位の混合物を含有するブロックもしくはランダムコポリマーを含むポリオキシアルキレンジオールもしくはポリオールから作製されたものである。ブロックもしくはランダムコポリマーの場合では、その単位の少なくとも７５％がエチレンオキシド単位であることが好ましい。そのようなポリオキシアルキレンジオールもしくはポリオールの分子量は、好ましくは２，０００〜３０，０００、より好ましくは５，０００〜３０，０００である。本質的にヒドロキシル基すべてがポリイソシアナートでキャッピングされるように、選択したポリオキシアルキレンジオールもしくはポリオールとポリイソシアナートを、イソシアナート対ヒドロキシルの比を約１．２〜約２．２として反応させることによって、適切なプレポリマーを調製することができる。重合がより制御しやすくなるので、芳香族よりも脂肪族のイソシアナートが好ましい。一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはこれらのコポリマーが好ましい。使用するイソシアナート官能性プレポリマーは、約０．１ミリ当量／ｇ〜約１ミリ当量／ｇ、より好ましくは約０．２ミリ当量／ｇ〜約０．８ミリ当量／ｇの活性イソシアナートを含有することが好ましい。比較的低分子量の、たとえば２，０００未満の分子量のプレポリマーを万一使用するのなら、プレポリマーが比較的高いイソシアナート含有量（約１ミリ当量／ｇまたはそれよりさらに高含有量）を含むことが好ましい。しかし、このようなより小さなプレポリマーの重合速度には、過度に速い重合を避けるためにより正確な制御が必要になるといえるので、マイクロアレイなどを作製するのにはあまり好ましくない。さらに、イソシアナート含有量のかなり高いプレポリマーは、重合後の遊離アミン含有量が比較的高いことがあり、中性ｐＨでのそのようなアミン官能基の正の電荷によって、負の電荷を帯びた生体分子の非特異的な結合が増加し、それと共に望ましくないバックグラウンドシグナルが高レベルになる可能性も高まるかもしれない。したがって、比較的低いイソシアナート含有量を含むより高分子量のプレポリマーが好ましい。

大きな生体分子の拡散性を高めるためには、最終的な配合物の全体積に対して低い比率のプレポリマー（３〜５％）を使用することが望ましいといえる。このような比較的低いパーセンテージは、アッセイ、バイオリアクターなどで使用するための所望の多孔度を有するヒドロゲル組成物の製造に役立つ。上で触れたように、閉じ込められた生体分子の生存度は、チオール官能基を有する架橋剤を使用し、高いパーセントのアミン（ｐＫａ＝約１０）がイソシアナート官能基と反応しないプロトン化された化学種として存在する約７．０の生理的ｐＨを維持して、アミン基の関与を最小にすることによって高められる。このような処置は、場合によっては、プレポリマーの硬化を潜在的に不完全にし得るが、イソシアナートに対するチオールの求核性活性はそのｐＨで影響を受けないので硬化を完了することができ、成果を全体から見れば、生体材料のカプセル封入用ＰＥＧおよび／またはＰＰＧをベースとするヒドロゲルの配合法における有意な進歩の１例である。

１，４−ジチオトレイトール（ｍｗ＝１５４）などの単鎖ジチオール架橋剤では、重合がかなり高スピードとなり、沈殿を避けるためにこれを遅くし、慎重に制御することが求められる。それよりも長いジチオール架橋剤によって、より制御しやすいヒドロゲル重合のための配合法が実現する。ＰＥＧおよび／またはＰＰＧ単位の主鎖を有する架橋剤は、生体適合性および構造上の有利点をもたらすジチオール類の１クラスであり、このような架橋剤で分子量が約５００と１０，０００の間であるものが好ましく、約２，０００と６，０００の間であるものがより好ましく、約３，０００と４，０００の間であるものが最も好ましい。たとえば、ｍｗ＝３，４００であり、鎖の両端にチオール基を有するＰＥＧ−（チオール）₂（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）は、Ｈｙｐｏｌ ＰｒｅＭａＧ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、脂肪族イソシアナート含有量が〜０．３５ミリ当量／ｇであるもの）と一緒に用いることが可能であり、この２種の出発材料の比を様々に変えることにより、一般に重合の速さがｐＨ７．０で有効に制御できることがわかった。（プレポリマーからの）イソシアナート対ジチオール架橋剤のモル比は、好ましくはイソシアナート１に対してジチオール約０．３以下であり、より好ましくは、イソシアナート１に対してジチオール約０．２以下である。

イソシアナート１に対するジチオールの比が０．１よりかなり低い、たとえば０．０５以下である配合物は、ｐＨ７．０では補助架橋剤を含まなければ即座におよび／または完全に重合しないことがある。したがって、イソシアナート１に対するジチオールの比が約０．１より若干低い配合物は、２個の異なるイソシアナート反応性官能基を有し、その一方が好ましくはチオール、たとえば、側鎖チオール基、および当然このような条件下ではαカルボキシルよりも求核性であるそれほど反応性でない第１級αアミン基を有するシステインである、二座補助架橋剤と共に供給することが好ましい。他の使用してよい二剤架橋剤には、２−メルカプトエタノール、２−アミノエタンチオール、ホモシステイン、２−メルカプトプロパノール、およびチオール基ともう１個の求核基とを有する他の短鎖化合物が含まれる。さらに、ジチオール架橋剤の量が十分である場合でさえ、望ましい時限内で完全に重合を行い、安定で、水分含量が高く、構造強度の優れたヒドロゲル組成物を得ることにおいて、二座補助架橋剤の供給が、重合反応の制御に有利となり得ることが判明した。したがって、比較的高分子量、たとえば約２，０００〜６，０００ｍｗのジチオール架橋剤とそれよりはるかに低分子量、好ましくは約３００ｍｗ未満の二座架橋剤とを組み合わせて使用することが好ましい。図２に概略を示すように、２個の異なる反応性基を有する穏和化二座架橋剤（たとえばシステイン）をこのように加えることによって、重合を有効に制御することのできる新規で強力な手段が得られることが判明したが、このことは、このようにして架橋すると、さもなければ正常な架橋の際に発生するはずの大量のＣＯ₂がなくなることも示唆している。このような補助架橋剤を使用する場合は、一般に、ジチオールモル量の約１〜３倍、好ましくはジチオール架橋剤のモルの約１．５〜約２．５倍のモル量を使用するが、この量は、重合反応を緩やかにし、かつ十分な硬化をもたらすことがわかっている。

この一般的な種類のプレポリマーに固有の反応性によって、化学的に機能する表面を使用して、重合の際に、ポリマーを基板にも共有結合を介して接着することが可能になる。そのような表面は、基板上に設けることができ、これによって、重合ヒドロゲルおよびカプセル封入生体物質の取扱や装着検査、たとえば、そのような基板上に既知のパターンで配列された重合ヒドロゲルの個々のスポットまたは領域中にカプセル封入された異なる生物活性材料を含むマイクロアレイの作製が容易になる。

一般には１０ｍＭ〜８０ｍＭのＮａＣｌを補充した５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いて、重合プロセスを通して中性のｐＨを保つことが好ましく、浸透圧は、生理的レベル、すなわち約３００ミリオスモルを保つことが好ましい。イソシアナート誘導体化プレポリマーをリン酸緩衝液／ＮａＣｌ中にすばやく混合し、次いで細胞もしくはタンパク質とジチオール架橋剤をリン酸緩衝液／ＮａＣｌに予め混合した溶液をすぐに加えることによって、有機溶媒を使用せずにこのような配合物を作製できることがわかっている。そしてこの重合プロセスは、一般に２０〜６０分以内、通常は３０分かからずに起こり、この時間の間、細胞もしくはタンパク質は、水和状態、かつ生理的ｐＨで浸透バランスの取れた状態にあるままである。ｐＨおよび重量モル浸透圧濃度は、それぞれ６．９〜７．６の間および２５０〜４００ミリオスモル／ｋｇの間に保つことが好ましい。硬化してしまえば、カプセル封入された生体物質を含有するポリマー部位の洗浄および操作は容易である。

このようなチオール架橋ヒドロゲルの光学的検査によって、このゲル配合物のものであるバックグラウンド蛍光のない光学的透明度、および特許文献１に記載のヒドロゲル配合物と一般に類似の光学的性質が明らかになっている。しかし、特許文献１のプロセスでは、ＣＯ₂放出率を慎重に制御して、若干の不透明を避けることがしばしば非常に重要であった。ジチオール架橋剤と二座調節剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を組み合わせて使用する本発明のプロセスでは、図２に関して前に触れたように、本質的にＣＯ₂放出が最小に抑えられ、本質的に難なく光学的に透明なヒドロゲルを製造することができる。

このようなポリウレタンヒドロゲルが広範囲にわたる生体物質のカプセル封入に適することを示すため、生存真核生物細胞のカプセル封入を最初に調べた。生細胞カプセル封入の成果の１基準は、継続的な細胞生存能度の評価であり、一般に、トリパンブルー排除は、細胞生存度を容易に決定するために生物学者がたびたび好んで用いる技術である。しかし、このヒドロゲルは、かなりの量のトリパンブルー染料を吸収するので、この方法を用いて細胞の色および細胞内の染色強度を判定することは確実でなかった。その代わりとして、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｔｒｅｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、代謝過程によって還元されると、蛍光になる染料である。トリパンブルー排除によって、細胞混合物内に生細胞と死亡細胞の両方が存在していることが判明したヤギリンパ球を選択し、プレポリマーおよび細胞懸濁液／ジチオール架橋剤／二座架橋剤を混合した。リンパ球は、混合物の液滴がガラス製スライド上にスポット（直径約３００〜１，０００ミクロン、高さ２０ミクロン以上）として沈着したとき、チオール架橋ヒドロゲル内にカプセル封入され、そこで室温の高湿度室中で硬化させた。混合および硬化には２０分未満しかかからなかった。相対湿度（ＲＨ）は、少なくとも約９０％であることが好ましく、約９５％以上であることがより好ましい。ガラス製スライドにしっかりと接着したスポットと一緒に、スライドをＲＰＭ１６４０培地と共に３７℃で３時間インキュベートした後、ＲＰＭ１６４０培地と１対２０で混合してあるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）染料と共に１．５時間インキュベートした。暗所でスライドを３０分間放置した後、エピ蛍光顕微鏡を使用してスポットを可視化すると、それほど蛍光性でないヒドロゲルバックグラウンドに対して鮮やかに染色された個々の細胞が現れた。可視光線によって鮮やかには染色されていないゲル内の細胞が現れたが、これは、細胞懸濁液内にすでに存在していた前述の死亡細胞であると推測された。同様にして処理したヒドロゲルのみのスポットでは、可視蛍光がなかった。したがって、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）は、このようなポリウレタン−ＰＥＧヒドロゲル内での細胞生存度を評価する有用なツールであるように思われ、ヒドロゲルそのものおよび重合プロセスは、生細胞が維持されたことによって生体適合性であることが示された。

本質的に前で述べたとおりにゲルを調製して、タンパク質のカプセル封入も調べた。タンパク質のカプセル封入は、重合中にゲルマトリックス内で抗トランスフェリン抗体を隔絶／カプセル封入することによって実証した。抗体の機能性の検証は、蛍光色素で標識したトランスフェリンが抗トランスフェリン抗体含有部位に特異的に結合し、異なる抗体を含むか、または抗体を含まない他の部位では結合しないことによって実証された。

追加の実施形態として、ガラス製スライドなどの担体表面上、または標準の９６穴、３８４穴、もしくは１５３６穴マイクロタイタプレート中に存在するなど、マイクロウェル内もしくはマイクロチャンバー内に、このようなチオール架橋ヒドロゲル内のカプセル封入生細胞および／またはタンパク質が、スポットまたは領域として沈着していてもよい。双方の手法には別個の有利点がある。単一表面上に多数の個別のスポットを沈着する場合、各スポットは、異なる存在物を含んでいてもよく、１回のインキュベーションの後に、すべてのスポットに同時に接触するように洗浄液を供給することが可能になろう。個々のマイクロチャンバーを使用すれば、プレートをロボット工学によって取り扱うことが可能になり、各ウェルの個々の試験溶液を少ない体積で使用できるようになるはずである。これら２種の手法を組み合わせ、それによって、標準の９６ウェルアレイまたは同様の形態にアレンジされた個々のチャンバーのそれぞれに、異なる存在物を含む１種または複数のヒドロゲルスポットを供給してもよい。

このようなアレイを使用する装置は、関連のタンパク質もしくは他の生体分子への結合について選択的である、コンビナトリアルな化学物質もしくは薬物スクリーニング装置、抗体アレイ、ペプチドアレイ、細胞アレイ、酵素活性アレイ、ＤＮＡもしくは他のポリヌクレオチドアレイとして使用されよう。さらに、ミクロキャピラリー管の壁にコートされたカプセル封入細胞もしくは生体分子は、単一または複数のチャネルを有するフロースルー装置として機能し、液体クロマトグラフィーや「ラボ・オン・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」装置など、スクリーニング装置としてまたはシステム上のバイオセンサーとして使用されよう。このような装置からのシグナル解読は、（おそらくは追加のアレイを使用する）後続の抗体検出法によって測定することになる、蛍光性タンパク質または抗体の結合を介して、あるいは検出可能な化学種の形成、たとえば酵素による基質から蛍光色素分子への変換、または特定の薬品に曝すことによって生じる電気的性質、たとえば細胞および／または周囲マトリックスの導電率の変化をもたらす、内在性の生体経路との反応を介することになろう。特に、ゲルへの酸化還元剤の添加または導電ポリマーの添加によって、電気的な非フォトニック手段によるシグナルの検出が可能になるかもしれない。

以下の実施例は、本発明の特殊な特徴を具体化する配合法およびカプセル封入法を提供することが現在知られている最良の方式を含むが、以下で述べる特許請求の範囲によって当然規定される本発明の範囲の制限を設けるものでないことを理解すべきである。

Ｈｙｐｏｌ ＰｒｅＭａ Ｇ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）０．０７５ｇと、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭ水性リン酸緩衝液１．５ｍＬとを混合して溶液Ａを調製した。３０ｍｇのＰＥＧ−（チオール）₂（ｍｗ＝３，４００）および２ｍｇの遊離塩基性システイン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ｍｗ＝１２１）を、６０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬ中に溶解させて、溶液Ｂを調製した。１００μＬの溶液Ｂとヤギリンパ球が入ったダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水１０μＬとを混合して溶液Ｃを調製した。最後に、２００μＬの溶液Ａと５０μＬの溶液Ｃを混合し、得られた溶液を、５本のマイクロタイターガラスマイクロキャピラリー管を用いて、アミン処理ガラス（Ｓｉｌａｎａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅｓ、Ｃｅｌｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）上にマイクロスポットした。脱水を避けるために約９５％ＲＨの湿潤箱中でヒドロゲルスポットを慎重に重合させた。配合物は、５〜１０分以内で重合した。重合後、ヒドロゲルスポットは、物理的に安定であり、ガラス製スライドに強固に接着した。ヒドロゲルスポットを直ちにダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水で処理し、ＲＰＭ１６４０細胞培地中、室温または３７℃で約３時間インキュベートした。先に記載したＡｌａｍａｒＢｌｕｅ染色法によってリンパ球の生存度を調べた。染料を加えたＲＰＭ１６４０培地と共にリンパ球を１．５時間インキュベートし、次いで光学顕微鏡で調べた。生存カプセル封入細胞が観察された。

０．１ｇのＨｙｐｏｌ ＰｒｅＭａ Ｇ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）と、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬとを混合して溶液Ａを調製した。溶液Ｂは、実施例１と同じ手順で調製した。４０μＬの溶液Ｂとヤギリンパ球が入ったダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水７０μＬを混合して、溶液Ｃを調製した。最後に、１００μＬの溶液Ａと１００μＬの溶液Ｃを混合し、実施例１と同じ手順を使用して、得られた溶液をマイクロスポットした。配合物が５分で重合し、そしてヒドロゲルスポットをダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水で処理し、ＲＰＭ１６４０細胞培地中、３７℃で１日〜３日間インキュベートした。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して光学顕微鏡でリンパ球の生存度を調べ、これによって生存カプセル封入細胞が実証された。

０．１ｇのＨｙｐｏｌ ＰｒｅＭａ Ｇ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）と、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬを混合して溶液Ａを調製した。溶液Ｂは、実施例１と同じ手順で調製した。４０μＬの溶液Ｂと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が入ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中７０μＬを混合して溶液Ｃを調製した。最後に、１００μＬの溶液Ａと１００μＬの溶液Ｃを混合し、得られた溶液を使い捨て培養管に入れた。配合物が５分で重合し、そしてヒドロゲルをダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水で処理し、ＲＰＭ１６４０細胞培地中、３７℃で１日インキュベートした。１日後にヒドロゲルの混濁度を観察して、大腸菌の生存度および成長を確認した。

０．１ｇのＨｙｐｏｌ ＰｒｅＭａ Ｇ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）と、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬとを混合して溶液Ａを調製した。３０ｍｇのＰＥＧ−（チオール）₂（ｍｗ＝３，４００）および２ｍｇの遊離塩基性システインを、６０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬ中に溶解させて、溶液Ｂを調製した。２５μＬの溶液Ａ、１０μＬの溶液Ｂ、脱イオン水中５０％トレハロース５μＬ、および１０μＬの抗トランスフェリン抗体（ヤギ抗ヒトトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌ、タンパク質Ｇで精製したもの）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を混合し、直径が３００μｍ〜１，０００μｍ、かつ高さが少なくとも２０μｍのスポットが形成されるよう、得られた溶液をアミン処理ガラス製スライド上にマイクロスポットした。他の同様のスポットは、抗トランスフェリン抗体を加えずに作製した。室温かつ９５％ＲＨの湿潤箱中、ヒドロゲルのスポットを慎重に重合させ、重合後、ヒドロゲルスポットが物理的に安定であり、ガラス製スライドによく接着することがわかった。室温において、スライドを、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するＰＢＳ緩衝液で１時間かけて処理した。ヒドロゲル中の抗トランスフェリンと、Ｃｙ３標識トランスフェリン（１％ウシ血清アルブミン、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中１μｇ／ｍｌが入ったリン酸緩衝生理食塩水）とを１時間かけて相互に反応させ、次いで可視化すると、蛍光染料で標識したトランスフェリンが、抗トランスフェリン抗体含有部位では特異的に結合するが、異なる抗体を含むか、または抗体を含まない他の部位では結合しなかったことが示された。

０．１ｇのＨｙｐｏｌ ＰｒｅＭａ Ｇ−５０（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）と、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬとを混合して溶液Ａを調製した。実施例１と同じ手順によって、塩を含まない溶液Ｂを調製した。４０μＬの溶液Ｂと、２３４μｍのＬ−α−システイン−Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロ−アクリジン−９−イルアミノ）−オクチル］−アミド（ｍｗ＝４２８．２６）が入ったｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液、すなわちアセチルコリンエステラーゼ阻害剤７０μＬとを混合して溶液Ｃを調製した。最後に、１００μＬの溶液Ａと１００μＬの溶液Ｃを混合し、得られた溶液を、実施例１と同じ手順を使用してマイクロスポットした。配合物が５分で重合し、そしてヒドロゲルのマイクロスポットをｃｙ−３標識アセチルコリンエステラーゼ処理した。この試験によって、ヒドロゲル中のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の存在および機能性が確認された。

本発明をある好ましい実施形態に関して述べてきたが、本明細書に添付される特許請求の範囲で述べる本発明の範囲から逸脱することなく、当分野の技術者に明らかとなるような変更および修正を加えてもよいことを理解すべきである。上述のポリマーに追加のポリマーまたは修正が含められれば、マトリックス内での細胞の増殖、または選択細胞型の生存度の増強が可能になるかもしれない。たとえば、そのようなポリマー内のペプチド結合を、カプセル封入細胞によって産生された細胞外基質プロテアーゼに曝されると溶解するように特別に作製し、それによって細胞の伸張および増殖が可能になるのに必要なだけポリマーマトリックスを溶解させることもできる。あるいは、コラーゲンなどの他のポリマーまたは作用物質をこのようなポリマーブレンドに加えて、カプセル封入細胞と周囲の担体の間で特別な接着因子および／または結合法を利用すると細胞の生存を促進することもできよう。ヒドロゲル組成物を固体表面上にスポットするのとは対照的に、生体物質をカプセル封入するヒドロゲルマイクロビーズを形成してもよい。一例として、プレポリマーと架橋剤および生体物質を混合した後、油などの非混和性液体にこのポリマー／細胞（またはタンパク質）ミックスを加え、硬化が起こると同時に、様々な寸法のマイクロビーズが形成される。油または他の懸濁性液体から分離すると、バイオリアクター、アッセイ装置、人工臓器、バイオセンサーなどでの使用に適するビーズのスラリーが得られる。さらに、カプセル封入された細胞、タンパク質、または他の生物活性分子の多重層を使用して、全体で特有な特性を備えた複合材料を構築することもできよう。あるいは、不均一な細胞混合物を使用する場合、その後カプセル封入された細胞型を同定するのを容易にするためにカプセル封入用ポリマーに染料または他の薬品を加えてもよい。このような細胞同定の仕組みは、加えられた薬品に対しての、特定の細胞の発色団（ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒｅ）または蛍光に基づく応答、たとえば、リガンドまたは薬物による特定の細胞シグナル伝達経路の活性化に応じて、緑色の蛍光性タンパク質が発現されることと組み合わせれば、不均一な細胞の大きな集団を迅速かつ容易なやり方でスクリーニングできるようになる。

これまでに述べたすべての米国特許の開示を参照により本明細書に組み込む。本発明の特定の特徴は、特許請求の範囲で述べる。

ヒドロゲル生成のためのプレポリマー重合プロセスを示す図である。 ２個の異なる反応性基を有する穏和化二座架橋剤を用いた、ヒドロゲル生成のためのプレポリマー重合プロセスを示す図である。

Claims (10)

1. 生体物質をカプセル封入したヒドロゲル組成物の調製方法であって、
   （ａ）イソシアナート官能性ヒドロゲルプレポリマー、生体物質、および前記イソシアナート官能性ヒドロゲルプレポリマーと反応する少なくとも２個のチオール基を有する架橋剤を用意するステップ、
   （ｂ）前記イソシアナート官能性ヒドロゲルプレポリマー、前記生体物質、および前記架橋剤を水溶液中で混合するステップ、および
   （ｃ）前記生体物質を重合ヒドロゲル内にカプセル封入して、前記生体物質が生物活性を維持するようにステップ（ｂ）の混合物を６．５と７．５の間のｐＨに維持するステップ
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記水溶液が、２種の異なるイソシアナート反応性求核基を有する水溶性二座架橋剤も含有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記チオール官能性架橋剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそのコポリマーを含み、分子量が２，０００と６，０００の間にあることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ヒドロゲルプレポリマーを、基板の予め特定した多数の領域上に繰り返し分配し、アレイとして配列した、個別のスポットを形成し、既知の位置にある前記スポットが、少なくとも２種の異なる生体物質を含有し、そして、前記生体物質が、重合するヒドロゲルに固定化されるためのチオール反応性基を含有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 生体物質をカプセル封入したヒドロゲル組成物であって、
   イソシアナート官能性ヒドロゲルプレポリマー、生体物質、および少なくとも２個のチオール基を有する架橋剤を含み、
   前記イソシアナート官能性ヒドロゲルプレポリマーが、生理的条件下の水溶液中での前記架橋剤との反応によって、前記生体物質の存在下で架橋されており、前記架橋の結果、前記生体物質が生物活性を維持するように６．５と７．５の間のｐＨに維持された、安定な重合ヒドロゲル内にカプセル封入されていることを特徴とするヒドロゲル組成物。
6. 前記プレポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそのコポリマーを含み、かつ、イソシアネート末端基を有し、前記生体物質が、タンパク質、核酸、生細胞、および分子量が１００と２０００の間にある有機分子からなる群から選択され、そして、前記架橋剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそのコポリマーの主鎖を含み、かつ分子量が２，０００と６，０００の間にあることを特徴とする請求項５に記載のヒドロゲル組成物。
7. 前記安定な重合ヒドロゲルが、光学的に透明であり、かつ、前記生体物質が、タンパク質、核酸、生細胞、および分子量が１００と２０００の間にある有機分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項５または６に記載のヒドロゲル組成物。
8. １個のチオール基およびもう１個の異なるイソシアナート反応性基を有する二座架橋剤を更に含むことを特徴とする請求項５、６、または７のいずれか１項に記載のヒドロゲル組成物。
9. 請求項５のヒドロゲル組成物が、基体に結合した複数の個別のスポットとして形成され、前記スポットが空間的に配列されてアレイを形成し、かつ複数のスポットが、前記アレイ内の既知の位置に少なくとも２種の異なる生体物質を含有するいくつかのスポットを含むことを特徴とするバイオチップ。
10. （ａ）請求項９によるバイオチップを提供するステップ、
    （ｂ）バイオチップを分析物溶液に接触させるステップ、および
    （ｃ）バイオチップと分析物溶液の相互作用を検出するステップ
    を含むことを特徴とするバイオアッセイ方法。

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