KR20100124727A - 고분자량 아디포넥틴의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

다량체 아디포넥틴 중에서, 고활성형인 HMW 아디포넥틴을 분별 측정하는 방법을 제공한다.
프로테아제를 사용하여 다량체 아디포넥틴을 분별하여 면역학적으로 측정하는 방법이며, 다량체 아디포넥틴을 포함한 시료에, 키모트립신을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 시료중 고분자량 아디포넥틴의 측정 방법에 관한 것이다.

Description

고분자량 아디포넥틴의 측정 방법{HIGH-MOLECULAR-WEIGHT ADIPONECTIN MEASUREMENT METHOD}

본 발명은, 생체 시료 중에 포함되는 다량체 아디포넥틴 중, 고분자량(HMW) 획분을 분별하여 면역학적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.

아디포넥틴은, 지방조직 특이적으로 산생, 분비되어 항당뇨병 작용, 항동맥 경화 작용을 가지는 호르몬으로, 혈중에 비교적 풍부하게 존재한다. 근년, 비만을 초래하는 특히 내장 지방 축적에 의한 저아디포넥틴 혈증은, 당뇨병, 동맥 경화성 질환이나 고혈압 발증으로 연결된다고 생각되고 있다.

아디포넥틴은, 구조상 C1q(Complement　1q) 패밀리에 속하고, C1q 패밀리의 특징인 콜라겐 모양 도메인을 가지고 있기 때문에, 3량체를 기본으로 한 다량체를 형성하여 존재하고 있는 것이 보고되고 있다. 최근, 본 발명자들에 의해, 사람혈중에 존재하는 다량체 아디포넥틴의 형태(알부민 결합형을 포함하는 3량체, 6량체 및 HMW획분)가 해명되어 한층 더 당의 수확이나 지방산 연소를 촉진하는 AMPK(adenosine　monophosphate　actiｖated　protein　kinase)의 인산화를 지표로 한 다량체 아디포넥틴의 활성화 작용에 있어서는, HMW형이 가장 높은 활성을 나타내는 것도 보고됐다(비특허 문헌 1). 부가하여, 사람 유래 다량체 아디포넥틴을 포함하는 생체 시료에, 어떤 종류의 프로테아제를 작용시킴으로써, 측정 대상 이외의 획분을 선택적으로 소화하고, 잔존하는 아디포넥틴을 면역학적으로 측정함으로써, 직접 HMW 아디포넥틴 농도를, 또 간접적으로는 3량체나 6량체 획분을 각각 분별 측정하는 방법을 개시했다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 2).

게다가 본 분별 측정계를 이용한 당뇨병 및 관동맥 질환군에 있어서의 다량체 아디포넥틴의 임상 연구에서는, 인슐린 저항성이나 메타볼릭신드롬의 예지 지표로서 토탈 농도에 차지하는 HMW 아디포넥틴의 비율(HMWR)이 토탈 농도 이상으로, 감도·특이성이 높다고 하는 지견을 보고하고 있다(비특허 문헌 3). 따라서, 토탈 농도뿐만 아니라, 각 획분을 분별 측정하는 임상적 유용성에 대하여 기대되고 있다.

한편, 메타볼릭신드롬 관련 질병(당뇨병, 고혈압, 고지혈증)의 치료약 중에는, 아디포넥틴을 증가시키는 작용을 가지는 것이 있어 주목받고 있다. 예를 들면, 인슐린 저항성 개선약인 티아졸리딘 유도체는, HMW 아디포넥틴을 증가시키는 것이 보고되고 있다(비특허 문헌 4). 그 외에는, 최근 강압제의 엔지오텐신 수용체 길항약으로 분류되는 어떤 약제나, 고지혈증치료약의 일부 약제에서도, 아디포넥틴 증가 작용을 가지는 것이 보고되고(비특허 문헌 5), 메타볼릭신드롬을 나타내는 질환군에 고빈도로 인정되는 인슐린 저항성에 대하여, 개선이 기대되고 있다.

이와 같이, 메타볼릭신드롬 관련 질병에 대한 약제 개발에 있어서, 아디포넥틴 증가 작용을 가지는 것은, 유용한 부가가치이다. 게다가 약제 개발뿐만 아니라, 건강식품 분야에 있어서도 주목받고 있으며, 이 아디포넥틴 증강 작용을 가지는 기능성 식품의 탐색도 정력적으로 행해지고 있다.

약제나 기능성 식품의 효능 효과는, 통상 우선 마우스나 래트 등의 실험동물을 이용하여 행해지지만, 아디포넥틴 증가 작용에 관해서도, 실험동물의 혈중 아디포넥틴 농도의 변화를 지표로서 이용하는 것은 유용하다(예를 들면, 특허 문헌 2, 3). 마우스나 래트의 아디포넥틴 농도는, 이미 측정킷으로서 시판되고 있어 입수 가능하지만, 단지 총량을 측정하는 것만으로, 다량체 아디포넥틴을 분별할 수 있는 것은 아니고, 특히 고활성형인 HMW 아디포넥틴을 분별하여 측정할 방법이 요망되고 있었다.

본 발명자들은, 사람 생체 시료 중에 존재하는 다량체 아디포넥틴에 대하여, 특정 프로테아제를 작용시키는 것으로, 다량체 아디포넥틴의 분별 측정 방법을 찾아냈지만(특허 문헌 1, 비특허 문헌 2), 흥미로운 것은 이때 이용한 프로테아제를 마우스 유래의 다량체 아디포넥틴의 분별 측정으로의 적용을 시도했을 경우, 특히 HMW획분의 정확한 측정에는 적합하지 않는 것이 판명되었다.

한편, Pajvani들은, 변형 발현시킨 마우스 유래 아디포넥틴을 이용하여, 트립신의 소화 특이성을 보고하고 있지만, 저분자량 획분(LMW)은 소화하지만, 중분자량 획분(MMW)이나 HMW 획분은 소화되지 않는 것이 나타나 있고, HMW 아디포넥틴의 분별 측정에는 적합하지 않다(비특허 문헌 6).

선행 기술 문헌

특허 문헌 1 국제 공개　WO2005/038457 공보

특허 문헌 2 특개 2005－232150호 공보

특허 문헌 3 특개 2006－56836호 공보

비특허 문헌 1 Hada　Y, et　al. Biochem　Biophys　Res　Commun. 356：487－493, 2007.

비특허 문헌 2 Ebinuma　H, et　al. Clinica　Chimica　Acta. 372：47－53, 2006.

비특허 문헌 3 Hara　K, et　al. Diabetes　Care. 29：1357－1362, 2006.

비특허 문헌 4 Tsuchida　A, et　al. Diabetes. 54：3358－3370, 2005.

비특허 문헌 5 Nakano　S, et　al. Am　J　Physiol　Endocrinol　Metab. 292：1213－1222, 2007.

비특허 문헌 6 Pajvani　UB, et　al. J　Biol　Chem. 278：9073－85, 2003.

본 발명은, 다량체 아디포넥틴 중에서, 고활성형인 HMW 아디포넥틴을 분별 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한바, 다량체 아디포넥틴을 함유하는 시료에 대하여, 여러 가지 프로테아제 중, 키모트립신을 작용시킴으로써, 마우스나 래트 등에 있어서도 HMW획분 이외의 아디포넥틴을 선택적으로 소화할 수 있는 것 및 키모트립신에 의한 소화 처리 후, 남은 HMW 아디포넥틴을 면역학적으로 측정하면, HMW 아디포넥틴이 분별 측정할 수 있는 것을 찾아냈다.

즉, 본 발명은, 프로테아제를 사용하여 다량체 아디포넥틴을 분별하여 면역 학적으로 측정하는 방법이여서, 다량체 아디포넥틴을 포함하는 시료에 키모트립신을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중 HMW 아디포넥틴의 분별 측정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 사람뿐만 아니라, 마우스나 래트 등의 다량체 아디포넥틴 중, HMW 아디포넥틴을 분별하여 측정할 수 있기 때문에, 개발된 약제나 기능성 식품 등의 아디포넥틴 증강 작용을, 보다 정확하게 평가할 수 있다.

도 1은, 키모트립신의 마우스 유래 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성을 나타내는 도면이다.
도 2는, 키모트립신의 래트 유래 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성을 나타내는 도면이다.
도 3은, 트립신의 마우스, 래트 및 사람 유래 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성을 나타내는 도면이다. A는 마우스 혈청, B는 래트 혈청, C는 사람 혈청이다.
도 4는, 프로테이나제 K의 사람 및 마우스 유래 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성을 나타내는 도면이다. A는 사람 혈청, B는 마우스 혈청이다.
도 5는, 키모트립신의 사람 유래 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성을 나타내는 도면이다.
도 6은, 겔 여과 분리 검출법에 의한 마우스 고분자량 아디포넥틴의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은, ELISA 측정과 겔 여과 분리 검출법과의 상관성을 나타내는 도면이다.
도 8은, 키모트립신 처리법과 프로테이나제 K처리법에 있어서의 사람 유래 고분자량 아디포넥틴 측정 결과의 상관성을 나타내는 도면이다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 시료로서는, 포유류 유래 다량체 아디포넥틴을 함유하는 것이면 모두 대상이 되며, 포유류로부터 얻어진 혈액, 소변 등의 액체, 조직 추출액이나 조직 유래의 세포의 배양 상청액 등을 들 수 있다. 여기서, 포유류로서는, 마우스나 래트 등 설치류 및 사람 등을 들 수 있다. 이들 중, 개발된 약제나 기능성 식품 등의 아디포넥틴 증강 작용을, 보다 정확하게 평가하기 위한 시료로서는, 마우스 또는 래트의 혈액(혈청, 혈장), 특히 마우스의 혈액이 매우 적합하다. 또, 당뇨병 등의 진단을 위한 시료로서는 사람의 혈액(혈청, 혈장)이 매우 적합하다.

HMW 아디포넥틴을 분별하여 면역을 측정하기 위한 방법에 대하여 설명한다. 다량체 아디포넥틴이 포함되는 시료에 키모트립신을 작용시켜, HMW획분 이외의 아디포넥틴을 소화하고, 키모트립신에 의해 소화처리 후, 남은 HMW 아디포넥틴을, 항아디포넥틴 항체를 이용하여 면역학적으로 측정한다. 본 발명에 사용되는 키모트립신은, 정제된 것이 시판품으로서 입수되지만, 본 발명이 성립될 정도로 거칠게 정제된 것도 이용할 수 있다. 또, 유전자변형 기술에 의해 얻어진 것이어도 지장이 없다. 또 키모트립신 활성을 가지는 한, 화학 수식을 실시해도 좋다.

생체 시료의 키모트립신에 의한 처리는, 인산, 트리스, 굿 등의 완충액 중, 4~60℃에서, 바람직하게는 4~45℃에서 5분~24시간 행하는 것이 바람직하다. 키모트립신의 사용 농도는, 반응온도 및 반응시간 등을 고려하여 결정되지만, 대체로 0.1~1000u/mL의 범위에서 사용되며, 또한 바람직하게는, 1~100u/mL의 범위에서 사용된다. 키모트립신 처리에 있어서의 키모트립신의 사용 농도, 반응온도 및 반응시간은, 시료의 동물종에 의해 상위하기 때문에, 예비 시험에 의해 시료 중의 HMW 아디포넥틴만을 소화하지 않는 조건을 확인해 두는 것이 바람직하다. 여기서 말하는 키모트립신의 활성(u)은, pH7.8의 조건하 25℃에서, N－벤조일-L－타이로신에틸에스테르(BTEE)가, 1분간 당 1μmole 가수분해되는 양을 나타낸다.

키모트립신에 의해 사전 처리된 시료 중 다량체 아디포넥틴은, 키모트립신 소화에 의해 HMW 아디포넥틴이 잔존하므로, 당해 시료 중 아디포넥틴 농도를 항아디포넥틴 항체를 이용하는 면역측정을 행하면, HMW 아디포넥틴만이 분별 측정할 수 있다. 따라서, 키모트립신 처리된 시료의 면역학적 측정은, 항아디포넥틴 항체를 이용하는 통상의 수단에 의하여 행할 수가 있다.

시료를 키모트립신으로 처리하고, 잔존하는 HMW 아디포넥틴을 측정하기 위한 항체로서는 아디포넥틴을 인식하는 항체를 사용할 수가 있다. 항아디포넥틴 항체는, 단일클론 항체 및 다클론 항체의 어느 것도 이용할 수 있어 공지의 수법에 의하여 적당한 동물에 면역하여 얻을 수 있지만, 시판품으로서 입수하는 것도 가능하고, 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 항 마우스 아디포넥틴 항체는, 「Anti－mouse　Adiponectin　monoclonal　antibody」나 「Anti－mouse　Adiponectin　polyclonal　antibody, Goat」(R＆D　Systems사), 「Anti－mouse　Adiponectin, mAd(MADI04)」(AdipoGen사), 「Anti－mouse　Adiponectin　monoclonal　antibody」(CHEMICON사) 등을 들 수 있고, 항 래트 아디포넥틴 항체는, 「Anti－rat　Adiponectin　polyclonal　antibody, Goat」(R＆D　Systems사), 「Anti－rat　Adiponectin　monoclonal　antibody」나 「Anti－rat　Adiponectin　polyclonal　antibody, Rabbit」(CHEMICON사) 등을 들 수 있다. 항 사람 아디포넥틴 항체로서는, Goat　α　human　Acrp30　antibody(코스모바이오사, GT사), rabbit　α　hu　adiponectin－PoAb(코스모바이오사, chemicon사), hu　Acrp30－MoAb(藤澤藥品工業社, BD사), Mouse　α　hu　Adiponectin　MoAb(코스모바이오사, chemicon사), 항 사람 ACRP30 단일클론 항체(AX773, AX741, Ne, Na, 和光純藥工業社) 등을 들 수 있다. 이들 항체는, 각각 단독 또는 적당히 조합하여 사용할 수가 있다. 또, 시판의 아디포넥틴 총량을 측정하는 킷도 사용하는 것도 가능하게 된다. 그 밖에, 생체 시료를, 환원제, 산 또는 그 염, 계면활성제 및 키모트립신 이외의 프로테아제 중 적어도 1개 혹은 2개 이상의 조합을 아디포넥틴에 작용시켜, 다량체 아디포넥틴을 일정한 형태로 변환시켜 면역학적으로 측정하는 본 발명자들이 개발한 방법(WO2005/038458)도 이용할 수 있다.

본 발명의 면역학적 측정 방법으로서는, 아디포넥틴에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 불용성 담체에 결합시키고, 그것에 의하여 아디포넥틴을 포착하며, 시료 중에 존재하는 아디포넥틴 유무의 확인(정성) 또는 정량하는 방법이 사용된다. 그 중에서도, LTIA(라텍스 면역비탁법), ELISA(효소면역 측정법), CLEIA(화학발광효소 면역 측정법), RIA(방사면역 측정법)등 이라고 하는 방법을 들 수 있다. 이 중, LTIA는 아디포넥틴과 특이적으로 결합하는 항체를 담지시킨 불용성 담체와 미리 키모트립신을 작용시켜 잔존하는 HMW 아디포넥틴을 혼합함으로써, 아디포넥틴을 거친 불용성 담체의 가교(응집)가 일어나, 그 결과 생기는 탁함을 광학적으로 측정하는 것으로 아디포넥틴 유무의 확인(정성) 또는 정량하는 방법이며, HMW 아디포넥틴을 간편, 신속하고 정확하게 측정하는데 바람직하다.

본 발명에 사용되는 불용성 담체로서는, 통상의 면역학적 측정 시약에 사용되어 공업적으로 대량생산 가능한 유기계의 불용성 담체가 사용된다. LTIA에 있어서는 항체의 흡착성이 뛰어나고 또한 생물학적 활성을 장기간 안정적으로 보관 유지할 수 있는 폴리스티렌계의 라텍스 입자나 ELISA에 있어서는 폴리스티렌 등의 96공의 마이크로 플레이트가 바람직하다.

상기 불용성 담체의 표면에 항체를 담지시키는 수법은 여러 가지 알려져 있으며, 본 발명에 있어서 적당히 이용할 수 있다. 예를 들면, 담지(감작) 방법으로서 불용성 담체 표면에 항체를 물리적으로 흡착시키는 방법이나, 관능기를 가지는 불용성 담체 표면에 기존의 방법인 물리 결합법이나 화학 결합법에 의해 항체를 효율적으로 감작하는 방법을 들 수 있다.

항체를 담지시킨 항체 불용성 담체와 아디포넥틴과의 반응은, 항원 항체 반응이 일어날 수 있는 조건이면, 그 반응조건은 특히 한정되지 않는다. 반응액으로서는, 아디포넥틴과의 항원 항체 반응이 일어날 수 있는 용액이면 어떠한 것이어도 좋다. 예를 들면, pH를 제어하기 위한 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액 등의 완충 성분, 비특이 반응을 회피하기 위한 계면활성제나 염화 나트륨 등, 안정화제로서의 소 혈청알부민, 자당, 고분자 다당류 등, 반응성을 제어하는 상기 물질 외에 덱스트란 등의 수용성 다당류, 환원제나 산의 중화제, 프로테아제의 불활성화제 등의 첨가제를 적당히 용해시켜도 좋다.

상기 한 LTIA나 ELISA에 있어서의 검출 방법으로서는, 다음의 방법을 들 수 있다. LTIA에 있어서의 불용성 담체의 응집 정도를 측정하는 방법은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 응집을 정성적 내지 반정량적으로 측정하는 경우는, 기존 농도 시료의 탁도 정도와 측정 시료의 탁도 정도와의 비교로부터, 응집의 정도를 목시에 의해 판정하는 것도 가능하다. 또, 이 응집을 정량적으로 측정하는 경우는, 간편성 및 정밀도의 점에서는, 광학적으로 측정하는 것이 바람직하다. 응집의 광학적 측정법으로서는, 공지의 방법이 이용 가능하다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 이른바비탁법(응집덩어리의 형성을 탁도의 증가로서 파악한다, 입도 분포에 의한 측정법(응집덩어리의 형성을 입도분포 내지는 평균 입경의 변화로서 파악한다), 적분구탁도법(응집덩어리의 형성에 의한 전방 산란광의 변화를 적분구를 이용하여 측정하고, 투과광 강도와의 비를 비교한다) 등의 여러 가지의 방식이 이용 가능하다. ELISA에 있어서의 효소 표지 항체의 효소 활성에 유래하는, 기질과 효소의 반응 생성물을 측정하는 방법은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 효소 반응 생성물 고유의 파장, 예를 들면 HRP 표지 항체의 효소 활성을 기질로서 오쏘페닐렌디아민 염산염과 과산화 수소를 이용하여 검출하는 경우 등에서는, 492nm에 있어서의 흡광도로서 96공 마이크로 플레이트 리더로 읽어내는 것이 가능하다.

게다가 또, 생체 시료를, 키모트립신 처리하지 않는 경우는, 아디포넥틴의 총량이 측정되기 때문에, 키모트립신을 처리하는 것으로 산출되는 HMW 아디포넥틴의 비율을 간단하게 구할 수도 있다.

[실시예 1]

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하등 이것으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1　마우스 혈청 중 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성

마우스 혈청 10μL에, α－키모트립신(TypeI－S；No. C7762, 시그마 앨드리치사(社))를 10u/mL가 되도록, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 용해한 효소액을 100μL 부가하고, 37℃에서 20분간 가온했다. 그 반응액에, BSA－PBST(1%　소 혈청알부민 및 0.05%　Tween　20을 포함하는 20mM 인산 완충액, pH7.2)를, 400μL 첨가한 후, 전량을 Superde×200(GE 헬스케어 바이오 사이언스사(社))을 이용하여, 겔 여과 크로마토그래피를 실시했다. 용리액에는, PBS(20mM 인산 완충액, pH7.2)를 이용하여, 1mL씩 분취했다. 대조로서 상기 조건에서 키모트립신을 포함하지 않는 그외는, 동일 조건에서 겔 여과 크로마토그래피를 실시한 획분을 준비했다.

각 획분 중 아디포넥틴의 검출은, 다음과 같이 행하였다. Anti－mouse Adiponectin　monoclonal　antibody(R＆D　Systems사(社))를 PBS로 2.5μg/mL에 희석한 후, ELISA용 플레이트에 1웰 당 50μL를 첨가하고, 하룻밤 감작했다. PBST(0.05% Tween20을 포함하는 PBS액, pH7.4)에서 플레이트를 세정 후, BSA－PBST를 100μL첨가하여 블로킹했다. 계속하여, 각 획분을 BSA－PBST로 2배 희석한 것을 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, BSA－PBST로 1.0μg/mL에 희석한 Goat　anti－mouse　Adiponectin　polyclonal antibody(R＆D　Systems사)를 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, BSA－PBST로 1/2000배 희석한 Rabbit　anti－goat　Ig＇s　HRP 표지 항체액(DAKO사)을 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, 기질액(2mg/mL 오쏘페닐렌디아민 염산염, 0.02% 과산화수소를 포함하는 250mM 시트르산 완충액, pH5.0)을 50μL첨가하여, 실온에서 10분간 반응시키고, 정지액(1.5N황산, 1mM　EDTA－2 Na)을 50μL 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 492nm의 흡수를 측정했다. 측정 결과를 도 1에 나타냈다.

키모트립신 소화 처리를 실시하고 있지 않는 경우에서는, 마우스 혈청 중 다량체 아디포넥틴은, 3개의 피크로 분리되었다. 한편, 마우스 혈청을 키모트립신으로 처리했을 경우에서는, 알부민 결합형(Alb－) LMW를 포함하는 MMW 아디포넥틴 용출피크(2번째)나 LMW 아디포넥틴 용출피크(3번째)는 사라진 것에 대해, HMW 아디포넥틴 용출피크(1번째)는 잔존하고 있었다. 이 결과로부터, 마우스 유래 다량체 아디포넥틴을 포함한 시료에, 키모트립신을 작용시키는 것으로, HMW 아디포넥틴만을 소화하지 않고 잔존시킬 수 있기 때문에, 이 처리액 중 아디포넥틴을 측정함으로써, HMW 아디포넥틴의 농도가 산출된다.

실시예 2　래트 혈청중 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성

래트 혈청 50μL에, α－키모트립신(TypeI－S；No. C7762, 시그마 앨드리치사(社))을 100u/mL가 되도록, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 용해한 효소액을 100μL 첨가하여 37℃에서 20분간 가온했다. 그 반응액에, BSA－PBST를, 400μL 첨가한 후, 전량을 Superde×200(GE 헬스케어 바이오 사이언스사(社))을 이용하여, 겔 여과 크로마토그래피를 실시했다. 용리액에는, PBS를 이용하여, 1mL씩 분취했다. 대조로서 상기 조건에서 키모트립신을 포함하지 않는 이외는, 같은 조건에서 겔 여과 크로마토그래피를 실시한 획분을 준비했다.

각 획분 중 아디포넥틴의 검출은, 다음과 같이 행하였다. Goat　anti－rat　Adiponectin　polyclonal　antibody(R＆D　Systems사)를 PBS로 0.5μg/mL에 희석한 후, ELISA용 플레이트에 1웰 당 50μL를 첨가하여 하룻밤 감작했다. PBST로 플레이트를 세정 후, BSA－PBST를 100μL 첨가하여 블로킹 했다. 계속해서, 각 획분을 BSA－PBST로 2배 희석한 것을 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, BSA－PBST로 1.0μg/mL에 희석한 Rabbit　anti－mouse　globular　Adiponectin　polyclonal　antibody(WO2005－038457)를 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, BSA－PBST로 1/2000배 희석한 Goat　anti－rabbit　Ig＇s　HRP 표지 항체액(BIOSOUCE사)을 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, 기질액(2mg/mL 오쏘페닐렌디아민 염산염, 0.02% 과산화 수소를 포함한, 250mM 시트르산 완충액, pH5.0)을 50μL 첨가하여, 실온에서 10분간 반응시키고, 정지액(1.5N황산, 1mM　EDTA－2Na)을 50μL 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 492nm의 흡수를 측정했다. 측정 결과를 도 2에 나타냈다.

키모트립신 소화 처리를 실시하고 있지 않는 경우에서는, 래트 혈청중 다량체 아디포넥틴은, 2개의 피크로 분리되었지만, HMW 아디포넥틴을 나타내는 용출피크(1번째)는 매우 적었다. 래트 혈청을 키모트립신으로 처리했을 경우에서는, 알부민 결합형(Alb－) LMW를 포함한 MMW 아디포넥틴 용출피크(2번째)는 소실한 것에 대해, HMW 아디포넥틴 용출피크(1번째)는 잔존하고 있었다. 이 결과로부터, 래트 유래 다량체 아디포넥틴을 포함한 시료에, 키모트립신을 작용시키는 것으로, HMW 아디포넥틴만을 소화하지 않고 잔존시킬 수가 있기 때문에, 이 처리액 중 아디포넥틴을 측정하는 것에 의해, HMW 아디포넥틴의 농도가 산출된다.

참고예 1　트립신을 이용한 다량체 아디포넥틴의 소화 특이성

마우스 혈청, 래트 혈청 및 사람 혈청 각각 10μL에, 트립신(No. T1426, 시그마 앨드리치사(社))을 0~50u/mL가 되도록, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 용해한 효소액을 100μL 첨가하고 37℃에서 20분간 가온했다. 그 반응액에, BSA－PBST를, 400μL 첨가했다. 그 일부를 비변성계의 폴리 아크릴 아미드 전기 영동(natiｖe－PAGE)으로 분리 후, 세미드라이브롯팅에 의해 PVDF막에 전사 후, 면역 염색을 행했다. 순서는, 전사막을 BSA－PBST로 블로킹 후, PBST로 세정하고, Goat　anti－mouse　Adiponectin　polyclonal　antibody(R＆D　systems사) 0.1μg/mL를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 충분히 세정한 후, Vector　ABC　kit(Goat) 및 DAB 기질 킷(후나코시사)을 이용하여 발색시켰다. 각 혈청의 면역 염색 결과는, 도 3(A：마우스, B：래트, C：사람)에 나타냈다.

트립신 활성이 0u/mL의 경우는, 대략 영동거리의 짧은 쪽에서, HMW획분, 6량체(MMW)획분, 알부민 결합 3량체(Alb－LMW)를 포함하는 3량체획분(LMW)으로 분리되었다(래트 혈청은, MMW획분이 주이며, HMW나 LMW획분은 적고 명확한 염색 밴드로서는 보이지 않았다). 10~50u/mL 트립신 활성에서의 소화 후에서는, LMW획분은 소화되고 있지만, MMW나 HMW획분은 소화되어 있지 않은 것이 관찰되었다. 이 결과로부터, 트립신은, 동물 혈청 중 HMW 아디포넥틴의 분별 소화 측정에는 이용할 수 없는 것이 판명되었다.

참고예 2　프로테이나제 K를 이용한 다량체 아디포넥틴의 소화 특이성

참고예 1의 방법에 준하여, 프로테아제를 7.5u/mL의 프로테이나제 K로 바꾸고, 사람 또는 마우스 혈청의 소화를 행하고, 그 반응액의 일부를 면역 염색했다(도 4, A：사람, B：마우스).

사람 혈청에서는, HMW획분만이 소화되지 않고 잔존하고 있지만, 마우스 혈청에서는, HMW획분을 포함하는 모든 획분이 소화되고 있는 것이 관찰되었다. 이 결과로부터, 프로테이나제 K는, 마우스 혈청 중 HMW 아디포넥틴의 분별 소화 측정에는 이용할 수 없는 것이 판명되었다.

실시예 3　사람 혈청중 다량체 아디포넥틴에 대한 소화 특이성

사람 혈청 10μL에, 키모트립신(TypeII；No. C4129, 시그마 앨드리치사(社))을 0~100u/mL가 되도록, 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 용해한 효소액을 100μL 첨가하고, 37℃에서 20분간 또는 60분간 가온했다. 그 반응액에, BSA－PBST를 400μL 첨가했다. 그 일부를 비변성계의 폴리 아크릴 아미드 전기 영동(natiｖe－PAGE)으로 분리 후, 세미드라이브롯팅에 의해 PVDF막에 전사 후, 면역 염색을 행하였다. 순서는, 전사막을 BSA－PBST로 블로킹 후, PBST로 세정하고, Goat　anti－human　Adiponectin　polyclonal　antibody(R＆D　systems사) 0.1μg/mL를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 충분히 세정한 후, Vector　ABC　kit(Goat) 및 DAB 기질 킷(후나코시사)을 이용하여 발색시켰다. 각 혈청의 면역 염색 결과는, 도 5에 나타냈다.

키모트립신 소화 시간이 20분간의 경우는, 25u/mL농도에서도 MMW 이하의 화 분이 약간 남지만, 50~100u/mL농도에서는, HMW만 잔존하고 있었다. 한편, 소화 시간이 60분간의 경우는, 10u/mL농도에서는, 소화는 거의 진행되고 있지 않지만, 25~50u/mL농도에서는, HMW만 잔존하고 있었다. 한편, 100u/mL에서는 HMW를 포함한 모든 획분이 소화되었다.

참고예 3　마우스 혈청 유래 다량체 아디포넥틴(Ms－mAd)의 정제

항마우스글로브러 아디포넥틴 항체 결합 수지(WO2005－038457)에, 마우스 혈청 180mL를 첨가하고, 0.5M　NaCl를 포함하는 100mM 트리스 염산 완충액(pH8.5)으로 충분한 양 세정한 후, 또한, 0.5M　NaCl를 포함한 100mM 초산 완충액(pH5.0)으로 세정했다. 다음으로, 100mM 글리신 염산 완충액(pH2.5)으로 마우스 아디포넥틴획분을 용출하고, 용출획분에 2M　트리스 염산 완충액(pH8.0)을 1/10량 첨가하여 중화했다. 게다가 중화 한 용출획분을, Protein　A수지에 첨가하여, Protein　A수지로의 비흡착획분을 정제 Ms－mAd로서 회수하고, PBS에서 투석 후, 「마우스/래트 아디포넥틴 ELISA 킷」(오오츠카 제약사)에 의해 아디포넥틴 함량을 측정했다.

참고예 4　항마우스 아디포넥틴 래트 단일클론 항체의 제작

참고예 3에서 얻은 정제 Ms－mAd　50μg을 등량의 플로이드의 컴플리트 콘프리트 아쥬반트와 혼합하고, 래트(F344/Jcl)에 2주간 걸러서 2회 면역을 행한 후, 면역 한 래트로부터 비장 및 림프절 세포를 적출하여, 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 통상법에 의해, sp2/o 미에로머 세포와 세포 융합을 행하였다. 항마우스 아디포넥틴 단일클론 항체 산생 융합 세균의 선택은, ELISA법에 의해 리컨버넌트 마우스 아디포넥틴(rMs－Ad)(BioVender사)과 반응성이 높은 웰을 선택하고, 그 다음으로 한계 희석법으로 선택하는 통상법에 의해 행하였다. 항마우스 아디포넥틴 단일클론 항체는, 선택한 융합 세포를 프리스탄(pristane) 처리한 누드 마우스 복공 내에 투여하여 복수(腹水)로서 회수했다. 복수로부터의 특이 항체(IgG)의 정제는, 50% 포화유안침전을 회수하여, 20mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 투석한 후, DEAE 이온교환 수지(도소 사(社))에 첨가하여, NaCL의 농도 변동(0~200mM)에 의한 경사용출에 의해, 정제 IgG를 얻었다(MoAb83201R).

참고예 5　항마우스 아디포넥틴 토끼 다클론 항체의 제작 및 비오틴 표지

참고예 3에서 조제한 정제 Ms－mAd120μg을 등량의 플로이드의 컴플리트 콘프리트 아쥬반트와 혼합하여, 토끼에 2주간 걸러서 5회 면역하여, 항혈청을 제작했다. 항혈청 중 특이 항체(IgG)의 정제는, 멜론 겔(Melon　Gel)(피어스 사(社))를 이용하여 통상법에 의해 행했다. 게다가 EZ－Link　Sulfo－NHS－LC－Biotin(피어스 사(社))를 정제 IgG에 혼합하여 비오틴 표지를 실시했다(Biotinylated　PoAb).

실시예 4　마우스 아디포넥틴 총량 및 HMW의 ELISA 측정과 겔 여과 분리 검출법과의 비교

1－1)검체의 사전 처리

HMW 측정용：마우스 혈청(n=10) 10μL에, 키모트립신 35u/mL를 포함한 프로테아제 용해액(50mM 트리스 염산 완충액, pH8.0) 100μL를 첨가하여, 37℃에서 20분간 가온했다. 게다가 검체처리액(100mM 붕산 완충액, pH11.0)을 700μL 첨가한 것을, HMW 측정용의 처리검체액으로 했다.

총량 측정용：마우스 혈청 10μL에, 키모트립신을 포함하지 않는 프로테아제 용해액 100μL를 부가하고 게다가 검체처리액을 700μL 부가한 것을, 총량 측정용의 처리검체액으로 했다.

1－2) ELISA 측정

ELISA용 플레이트에 참고예 4에서 제작한 항마우스 아디포넥틴 단일클론 항체(83201 R)를 PBS로 5μg/mL에 희석한 후, 감작 했다. 다음으로, BSA－PBST로 블로킹 후, 각각의 처리검체액을 한층 더 BSA－PBST에서 101배 희석한 희석검체액을 플레이트에 50μL 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정 후, 참고예 5에서 제작한 비오틴 표지 항마우스 아디포넥틴 다클론(Biotinylated PoAb) 50μL를 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정하고, 한층 더 BSA－PBST로 2000배 희석한 HRP－Avidin을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. PBST로 플레이트를 세정하고, OPD 발색액(2mg/mL 오쏘페닐렌디아민 염산염, 0.02% 과산화수소를 포함하는 250mM 시트르산 완충액, pH5.0)에 의해 발색시키고, 정지액(1.5N황산, 1mM　EDTA－2Na)을 첨가하고 반응을 정지시킨 후, 492nm의 흡수를 측정했다. 표준품으로서 리컨버넌트 마우스 아디포넥틴(rMs－Ad)을 표준품으로서 이용하여, 검체 중 아디포넥틴 농도의 산출을 행했다.

2) 겔 여과 분리 검출법

상기 1－1)과 같은 마우스 혈청(n=10) 각각 50μL분에 대하여, 실시예 1과 같은 조건에서, 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 획분을 준비했다. 각 획분 중 아디포넥틴의 검출은, BSA－PBST에 의해 21배 희석한 후, 상기 1－2)의 ELISA 측정에 따라서 실시했다(도 6).

3) 총량에 대한 HMW의 비율값(HMWR)의 비교

1－2)에서 구해진 HMW 및 총량 농도로부터, HMWR를 산출했다. 한편, 2)에서 검출된 3개의 아디포넥틴 용출피크 중에서, 최초의 피크가 HMW에 상당하기 때문에, 그 획분 농도의 합계를, 아디포넥틴 전(全)획분의 합계 농도로 나누는 것으로 HMWR를 산출했다. 각각의 HMWR를 비교한 결과, 양법에서의 검출에는, 지극히 강한 상관성이 얻어지며, 한편 HMWR 값도 거의 일치했다(도 7). 이 결과로부터, 본 발명의 키모트립신을 이용하여, 검체처리함으로써, 상당히 간단하고 정확한 마우스 HMW 아디포넥틴의 측정이 가능하다고 말할 수 있다.

실시예 5　사람 혈청 중 HMW 아디포넥틴 분별 측정으로의 키모트립신의 이용

사람 혈청(n=14) 10μL에, 키모트립신 50u/mL를 포함하는 프로테아제 용해액(50mM 트리스 염산 완충액, pH8.0) 100μL를 첨가하여, 37℃에서 20분간 가온했다. 게다가 검체처리액(100mM 붕산 완충액, pH11.0)을 700μL 첨가한 것을, 사람 HMW 측정용 처리검체액으로 했다. 대상으로서, 키모트립신 대신에, 프로테이나제 K 7.5u/mL로, 동일 검체처리를 실시했다. 각 처리검체 중 아디포넥틴 농도는, 처리검체액을 BSA－PBST로 한층 더 10배로 희석 후, 실시예 3의 방법과 동일하게 측정했다. 측정 결과를 도 8에 나타냈다.

사람 혈청중 HMW 아디포넥틴을 분별 측정하는데에 이용되고 있는 프로테이나제 K처리 후의 잔존하는 아디포넥틴량을 나타내는 흡광도와, 키모트립신 처리 후의 측정 흡광도가 거의 완전하게 일치했기 때문에, 키모트립신도 사람 혈청 중 HMW 아디포넥틴의 분별 측정에 이용할 수 있는 것이 나타났다.

Claims (2)

1. 프로테아제를 사용하여 다량체 아디포넥틴을 분별하여 면역학적으로 측정하는 방법이며, 다량체 아디포넥틴을 포함한 시료에, 키모트립신을 작용시키는 것을 특징으로 하는 시료중 고분자량 아디포넥틴의 측정 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   시료가, 사람, 마우스 또는 래트의 혈청 또는 혈장인 측정 방법.
   

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