JPWO2019221279A1 - 前立腺癌を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「(1)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型前立腺特異抗原であるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。
(2)α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質であるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法である、上記(1)に記載の前立腺癌を判定する方法。
(3)α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンである、上記(2)に記載の前立腺癌を判定する方法。
(4)レクチンがイヌエンジュレクチンである、上記(3)に記載の前立腺癌を判定する方法。
(5)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定する、前立腺癌の判定を行うためのデータを得る方法。
(6)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。
(7)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンとを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンとの複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。
(8)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとイヌエンジュレクチンとを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとイヌエンジュレクチンとの複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。
(9)(i)α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
(ii)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。
なお、本発明の前立腺癌を判定する方法は、医師等の診断を補助する方法として用いることができる。
本発明に係る「結合型PSA」とは、一般に「結合型PSA」と呼ばれるPSAである。すなわち、本発明に係る「結合型PSA」とは、「α1-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成したPSA」をいう。
本発明の前立腺癌を判定する方法は、「被検者由来試料中の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。」である。
本発明に係る被検者由来試料(以下、「被検試料」又は単に「試料」ともいう。)としては、被検者であるヒト由来の試料であって、例えば血液、血漿、血清、精液、膀胱洗浄物、尿、組織抽出液、前立腺組織切片、前立腺組織生検試料等、あるいはこれらから調製されたもの等が挙げられる。中でも血清、血漿等が好ましい。特に血清が好ましい。
本発明に係る比率1とは、被検者由来試料中の「遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率」である。
以下に、比率1に係る「遊離型PSA量」を測定する方法と「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」を測定する方法について説明する。
本発明に係る遊離型PSA量とは、試料中の遊離型PSAの総量である。α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和でも求められる。
(1)−1.試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法、又は
(1)−2.試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、その量の和から遊離型PSA量を求める方法
が挙げられる。
遊離型PSA量を直接測定する方法としては、公知の遊離型PSA量を測定する方法が挙げられる。例えば、遊離型PSAに特異的に結合する抗体を用いた公知の免疫学的測定法等が挙げられる。
抗PSA抗体が特に遊離型PSAに特異的に結合する抗体である場合には、「抗遊離型PSA抗体」と明記する。また、抗PSA抗体が、遊離型PSAと結合型PSAに結合できる抗体と抗遊離型PSA抗体を含む場合は、単に「抗PSA抗体」と記載する。
試料と検出可能な標識物質で標識した抗遊離型PSA抗体とを反応させ、標識抗遊離型PSA抗体と遊離型PSAとの複合体を生成させる。次いで、該複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。得られた測定値をもとに、常法により試料中の遊離型PSA量を求める。該複合体の量を測定する前に、遊離型PSAに結合しなかった標識抗遊離型PSA抗体を除去する操作を適宜行ってもよい。
試料と抗PSA抗体である第1抗体と、抗PSA抗体が検出可能な標識物質で標識された標識第2抗体とを反応させ、第1抗体と遊離型PSAと標識第2抗体との複合体を生成させる。次いで、該複合体を構成する標識第2抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。得られた測定値をもとに、常法により試料中の遊離型PSA量を求める。該複合体の量を測定する前に、遊離型PSAに結合しなかった第1抗体及び標識第2抗体を除去する操作を適宜行ってもよい。
上記の方法としては、例えばα(2, 3)糖鎖に親和性を有する物質(以下、「α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と略記する。」)を用いる方法、又は質量分析法等が挙げられ、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いる方法が好ましい。
上記の方法に用いられる本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とは、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する物質である。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖(例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖であるα(2, 6)糖鎖等)には親和性を有さない、α(2, 3)糖鎖に特異的な物質が好ましい。
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチンとしては、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチンが挙げられる。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖には親和性を有さない、α(2, 3)糖鎖に特異的なレクチンが好ましい。
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体としては、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する抗体が挙げられる。α(2, 3)糖鎖に特異的な親和性を有する抗体が好ましい。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖(例えばα(2, 6)糖鎖等)には親和性を有さない抗体が特に好ましい。
(1)−2−1.α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を別々に測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法、及び
(1)−2−2.α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方をワンステップで分別測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法、
が挙げられる。
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質をアガロースビーズ等の固相に固定化した充填剤を充填したカラムに流す。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは充填剤上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せずにカラムから溶出される。そこで、溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」が得られる。次いで、カラムを適当な緩衝液で洗浄後、そのカラムに約2〜5倍のカラム容量の乳糖含有緩衝液(0.4M)を流し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを溶出させる。溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」が得られる。
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固定化したマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の固相と接触させる。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは固相上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合する。α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せず、液相中に存在する。固相と液相を分離し、液相中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」が得られる。次いで、固相に結合した遊離型PSA量を測定すれば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量が得られる。
1)試料と、標識物質で標識された標識抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体及び第2複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
1)試料と、抗PSA抗体が標識物質で標識された標識第1抗体と、抗PSA抗体である第2抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体及び第2複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体が標識物質で標識された標識第1抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第2抗体(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質1)と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質2)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とレクチンとの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体及び第2複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
1)試料と、抗PSA抗体である第1抗体と、抗PSA抗体である第2抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体である第1抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第2抗体(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質1)と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質2)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とレクチンとの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
該方法としては、以下の方法が挙げられる。
(2)−1.試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を直接測定する方法、
(2)−2.試料中の遊離型PSA量からα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を差し引いた値をα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とする方法。
当該方法としては、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法」が挙げられる。
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質をアガロースビーズ等の固相に固定化した充填剤を充填したカラムに流す。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは充填剤上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せずにカラムから溶出される。カラムを適当な緩衝液で洗浄後、カラムに5倍のカラム容量の乳糖含有緩衝液(0.4M)を流し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを溶出させる。溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」が得られる。
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固定化したマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の固相と接触させる。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは固相上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合する。固相と液相を分離し、固相に結合した遊離型PSA量を測定すれば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量が得られる。
1)試料と、標識物質で標識されたα(2, 3)糖鎖に親和性を有する標識第1抗体(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質1)と、抗遊離型PSA抗体である第2抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質2)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とレクチンとの複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)第1複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
1)試料と、標識物質で標識された標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と、抗遊離型PSA抗体とを接触させて、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)第1複合体を構成する標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
1)試料と、標識物質で標識された標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と、抗PSA抗体である第1抗体と、抗PSA抗体である第2抗体とを接触させて、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第1抗体と第2抗体との複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第1抗体と第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)第1複合体を構成する標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
1)試料と、標識物質で標識された標識抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
1)試料と、抗PSA抗体が標識物質で標識された標識第1抗体と、抗PSA抗体である第2抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体が標識物質で標識された標識第1抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第2抗体(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質1)と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質2)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とレクチンとの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)第1複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
1)試料と、抗PSA抗体である第1抗体と、抗PSA抗体である第2抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体との複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
1)試料と、抗遊離型PSA抗体である第1抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第2抗体(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質1)と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン(α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質2)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体とレクチンとの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量を測定する工程。
「試料をα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させる。次いで、該複合体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合しなかったα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを含有する溶液を分離する。分離した溶液中の遊離型PSA量を測定することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を求める。」
本発明に係る比率1を決定する方法としては、「試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率を算出し、決定する方法」があげられる。
(a)遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量)、
又は
(b)α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量に対する遊離型PSA量の比率(遊離型PSA量/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量)
が挙げられる。
・[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積/(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積)]、又は
・[(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積)/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積]
を、比率1とすればよい。
・[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量/(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量)]、又は
・[(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量)/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量]
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離(分別)する。
3)該第1複合体及び第2複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する。
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和(遊離型PSA量)を求め、その和と上記3)の工程で得られた第1複合体の量との比率を求めることにより、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定する。
第1抗体と第2抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第1抗体は、抗遊離型PSA抗体であることが好ましい。
キャピラリー電気泳動によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率(比率1)を決定する方法としては、例えばまずPSAを含有する試料と、本発明に係る抗遊離型PSA抗体を標識物質で標識した標識抗遊離型PSA抗体とを接触・反応させ、得られた反応液中の[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体とを、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA](第1複合体)由来の標識物質の量、及び[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA](第2複合体)由来の標識物質の量を測定する。試料中の遊離型PSA量は、第1複合体と第2複合体の標識物質の量の和とする。そして、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率を求める。
核酸鎖と抗体を結合させる方法としては、例えば特許第4214779号、特許第4862093号等に開示された公知の方法が挙げられる。
・[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積/(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積)]、又は
・[(α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積+α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積)/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積]
を求めることにより得られる。
表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモンが金属/液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance = SPR)の光学現象を利用して生体分子間の相互作用を解析する分子間相互作用解析システムである。表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモン共鳴分光装置を用いて、2分子間の結合と解離にともなってセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化をSPR シグナルとして検出する。生体分子間の相互作用をリアルタイムにモニターするので、生体分子間の結合・解離が早い・遅いというカイネティクス情報が得られる。
産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター等の開発したレクチンマイクロアレイ法も、本発明に用いることができる。
通常の免疫学的測定法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率(比率1)を決定する方法としては、例えば以下の[方法a]及び[方法b]が挙げられる。
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固相に固定化する。試料を該固相と接触させ、反応させる。固相を洗浄処理した後、抗遊離型PSA抗体を検出可能な標識物質で標識した標識抗遊離型PSA抗体を、固相と接触させ、反応させて、固相上にα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体との複合体を生成させる。未反応の標識抗遊離型PSA抗体を洗浄等により除去した後、標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に応じた測定方法で標識物質の量を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で、同じ試料中の遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率(比率1)を求める。
[方法b]
抗遊離型PSA抗体を固相に固定化する。試料を、該固相と接触させ、反応させる。固相を洗浄処理した後、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を検出可能な標識物質で標識した標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を、固相と接触させ、反応させて、固相上に抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させる。未反応の標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を洗浄等により除去した後、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に応じた方法で標識物質を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で、同じ試料中の遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率(比率1)を求める。
なお、本発明に係る比率1を求める更に別の方法として、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法を用いた方法が挙げられる。例えば、多段階タンデム質量分析装置や高速液体クロマトグラフ質量分析計を用いた質量分析方法が挙げられる。
前立腺体積(prostate volume:PV)は、通常の超音波検査、磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging、MRI)検査等の、非侵襲的方法により測定することができる。超音波検査により行うのが好ましい。
超音波検査の方法は何等限定されない。通常超音波を発信する装置を、下腹部からあてる、あるいは肛門から挿入する、いずれかの方法で行われればよい。
本発明に係る比率2とは、上記「2.比率1を決定する方法」の項に記載された方法で得られた比率1と、比率1を求めるために使用した試料を採取した被検者と同じ被検者の前立腺の体積との比率である。
(i)[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量]/[前立腺の体積]、
(ii)[遊離型PSA量/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量]/[前立腺の体積]、
(iii)[前立腺の体積]/[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量]、
(iv)[前立腺の体積]/[遊離型PSA量/α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量]。
比率1=[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量]
比率2=[比率1/前立腺の体積]
比率2=[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量]/[比前立腺の体積]
=0.80
となる。
本発明の前立腺癌を判定する方法は、「被検者由来試料中の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。」である。
以下に、比率2として上記(i)[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量]/[前立腺の体積]を用いた場合の判定方法を例にとって説明する。
すなわち、当該比率2の値の増加が認められたという検査結果が得られた場合には、前立腺癌へ病態が進行した(あるいは前立腺癌の悪性度が増した)、又は前立腺癌への病態の進行の兆候が認められる(あるいは前立腺癌の悪性度が増す兆候が認められる)との判定が行える。
また、当該比率2の変動が認められないという検査結果が得られた場合には、前立腺癌の病態に変化はないとの判定が可能である。
更にまた、当該比率2の減少が認められたという検査結果が得られた場合には、前立腺癌の病態が改善されたとの判定が可能である。
次に、常法通り、ROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点すなわち「感度 % −(100−特異度 %)」(「Sensitivity % - (100-Specificity %)」)が最大となる値を求める。その値をカットオフ値とすればよい。
(1)非癌者由来試料を用いて比率2を決定する。
(2)被検者由来試料を用いて比率2´を決定する。
(3)該比率2´を該比率2と比較し、該比率2´が該比率2と同じ又はそれより高い場合に、試料を提供した被検者は前立腺癌に罹患している(前立腺癌陽性)、またはその可能性が高いと判定する。
(1)非癌者由来試料中を用いて比率2を決定し、該比率2に基づいて前立腺癌を判定するための、該比率2のカットオフ値を設定する。
(2)被検者由来試料中を用いて比率2を決定する。
(3)該比率2を上記(1)で設定したカットオフ値と比較し、該比率2が該カットオフ値と同じかそれより高い場合に、試料を提供した被検者は前立腺癌に罹患している(前立腺癌陽性)、またはその可能性が高いと判定する。
なお、適切なカットオフ値を定めれば、被検者の判定の度に改めてカットオフ値を設定する必要はない。
不要な生検を回避できる確率は「生検回避率」で示される。「生検回避率」とは、「診断感度90%を維持した状態での特異度」のことをいう。
本発明に係る前立腺癌判定用キットは、
「(1)α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
(2)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。」
である。
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、適当な緩衝液中に懸濁させた懸濁液等の溶液状態の試液での形態であってもよく、若しくは凍結品や凍結乾燥品であってもよい。
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が試液の形態である場合、本発明に係る抗PSA抗体は、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を含有する試液中に共存させてもよいし、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とは別の試液、凍結品、又は凍結乾燥品として含んでいてもよい。
前立腺癌(PCa)であると診断された患者174名、及び非癌であり且つ前立腺肥大症(BPH)であると診断された患者94名から採取した血清を試料として用いた。各患者の前立腺の生検を行って、組織病理学的診断を行った。
患者の背景(年齢、トータルPSA値、病理組織学的悪性度分類(生検グリーソンスコア、術後グリーソンスコア等)を表1に示す。
prostate biopsy GS: prostate biopsy Gleason score
pathological GS: Gleason Score after PR
各患者の前立腺の体積を、超音波診断による測定で求めた。診断は汎用超音波画像診断装置 プロサウンドα7(日立アロカメディカル(株))を用い、前立腺の体積(cm3)は、プロサウンドα4に付属のソフトによって求めた。
体外診断用医薬品であるアーキテクトTM トータルPSA・アボット(アボット・ジャパン(株))を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。
(i)DNA標識抗PSA抗体の調製
図2に示した手順に従って、DNAが結合したPSA抗体Fab’フラグメントを調製した。
Anti PSAモノクローナル抗体 PSA10とは異なるPSAのエピトープを認識し、遊離型PSAのみと特異的に結合する抗ヒトPSAモノクローナル抗体 PSA12(Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)製)を常法により処理して、抗PSA抗体PSA12 Fab'フラグメントを得た。得られたフラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647(AnaSpec社製)を導入して、HiLyte647標識抗遊離型PSA抗体PSA12 Fab'フラグメント(以下、「蛍光標識抗遊離型PSA抗体」と略記する。)を得た。
・泳動用試料Aの調製
試料2μL、上記(ii)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を1μL、及び泳動緩衝液1[5% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01% BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MESを含有する]7μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
上記反応で得られた、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−遊離型PSA]複合体を含有する反応液(10μL)を、泳動用試料Aとした。
なお、この反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。
4.5% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3%(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 % BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA(VECTOR社製)を終濃度4mg/mLとなるように添加・混合したものを調製し、泳動緩衝液2とした。
・泳動緩衝液3の調製
2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、0.01 % BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HClを含有するバッファー(pH調製なし)を、泳動緩衝液3とした。
・泳動緩衝液4の調製
2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、0.01 % BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、泳動緩衝液4とした。
・DNA標識抗体液(DNA標識抗PSA抗体含有)の調製
上記(i)1)で得られたDNA標識抗PSA抗体 100nMを含有するバッファー[2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、0.5mM EDTA(2Na)、3%(w/v) グリセロール、50mM NaCl、0.01 % BSA、75mM BisTris(pH 6.0)を含有する。]を調製し、DNA標識抗体液とした。
・蛍光液の調製
30nM HiLyte647、20%(w/v) グリセロールを含有する50mM BisTris(pH 6.0)を、蛍光液とした。蛍光液は測定装置(ミュータスワコー i30)の検出部での位置確認等の調整のために用いられる。
全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30(和光純薬工業(株)製)を用い、装置の取扱説明書に従い、以下に示した手順にてマイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
すなわち、上記(iii)で調製した泳動用試料A 5.4μLを、ミュータスワコー i30専用マイクロチップの所定ウェル(SPウェル)に分注した。次いで、下記のように該マイクロチップの各ウェルに上記(iii)で調製した各試液を分注した。
・R2ウェル(R2(FLB)ウェル、R2(LB)ウェル):泳動緩衝液2(MAA含有)を10.0μLずつ、
・R3ウェル:泳動緩衝液3を10.0μL、
・R4ウェル:泳動緩衝液4を5.4μL、
・C1ウェル:DNA標識抗体液を3.0μL、
・FDウェル:蛍光液を7.0μL。
使用したマイクロチップのチップ内流路を模式化したものを図4に示す。
図4において、WはWasteウェルを示す。R3ウェル側が陰極、R2(LB)ウェル側が陽極になる。また、図4において、泳動用試料A及び各ウェルの試液の配置部分を点部分と白部分(点のない部分)とに色分けして示す。
・遊離型PSA量=[第1複合体の画分のピーク面積]+[第2複合体の画分のピーク面積]
・遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率(%)(比率1)
=[第1複合体の画分のピーク面積]/[遊離型PSA量]×100
・比率2:前立腺体積に対する比率1の比率(%)
=[(第1複合体の画分のピーク面積/遊離型PSA量)×100]/前立腺体積
=比率1(%)/前立腺体積
結果を図5に示す。
しかし、トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する方法は特異度が低いため、トータルPSA値がカットオフ値未満であっても、他の症状から前立腺癌が疑われる場合がある。その場合にはトータルPSA値がカットオフ値未満であっても、確定診断に供されるケースが大半を占める。そのため、実際の臨床診断の現場では、トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する方法の生検回避率は、20%よりもかなり低いと考えられる。
Cutoff:Gittelman M et al. J Urol 2013;190:64-9、Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8。
AUC:Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52、
NPV(%):Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、
Risk of Pca(%):Gittelman M et al. J Urol 2013;190:64-9、Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52、
Avoided Biopsies (%):Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52。
AUC:Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
PPV(%):Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
NPV(%):Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
Risk of missing Pca(%):Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、De la Calle C et al. J Urol 2015;194:65-72、
Avoided Biopsies (%):Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39。
Claims (6)
- 被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型前立腺特異抗原であるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質であるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法である、請求項1に記載の前立腺癌を判定する方法。
- α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンである、請求項2に記載の前立腺癌を判定する方法。
- レクチンがイヌエンジュレクチンである、請求項3に記載の前立腺癌を判定する方法。
- 被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定する、前立腺癌の判定を行うためのデータを得る方法。
- (1)α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
(2)被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率1を決定し、該比率1と当該被検者の前立腺の体積との比率2を決定し、得られた比率2を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。
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