CN108362795B - 干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法被适用于检测干血片样本内同型半胱氨酸的含量，以下步骤：获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线；检测样品的制备；高通量液相色谱分离同型半胱氨酸；串联质谱检测所述同型半胱氨酸；以及获取所述同型半胱氨酸的含量，所述方法具有检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性强且前处理过程较简单的优势，对临床上疾病的诊断和筛查具有重大意义。

Description

干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法适用高通量液相色谱串联质谱法快速高效地检测干血片中同型半胱氨酸的含量。

背景技术

同型半胱氨酸(Hyperhomocysteinemia，Hcy)是一种含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代谢循环中的重要中间产物，同型半胱氨酸Hcy的主要代谢去向如下：①释放至细胞外液之中②在蛋氨酸合成酶的作用下，以N5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，以维生素B12作为辅酶因子，最终生成四氢叶酸与蛋氨酸③和丝氨酸在胱硫醚β合成酶的参与作用下，缩合形成胱硫醚，然后进一步代谢形成胱氨酸。于是，在血液当中，总的同型半胱氨酸，简称为tHcy，包括游离的Hcy、Hcy与蛋白的蛋白结合物、Hcy-Hcy以及半胱氨酸-Hcy，其中约70％是以Hcy与蛋白的蛋白结合物的结合态形式存在，其中还原态的Hcy只占1-2％左右。

同型半胱氨酸Hcy参与的甲硫氨酸代谢循环对人体健康起着重大的影响作用，甲硫氨酸代谢循环的代谢紊乱会引起人体心血管疾病，轻度认知衰退，血管性痴呆和阿尔茨海默氏病等一系列疾病。流行病学统计中表明，高血压等相关疾病患者多伴有体内不同程度的同型半胱氨酸Hcy水平升高的现象。并且，高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化和冠心病的一个独立危险影响因素，因此同型半胱氨酸Hcy的测定对心血管疾病预防和辅助诊断有重要意义。

正是同型半胱氨酸Hcy对人体而言十分重要，现有技术中存有很多种针对同型半胱氨酸Hcy的测定方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用法、生化法、免疫法、液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)法等，目前临床检测中最常用的有HPLC法、生化法和免疫法，但以上测定方法都各有各不可避免的缺陷。比如，以HPLC法为例，在利用HPLC技术检测同型半胱氨酸Hcy含量时，需要先针对同型半胱氨酸Hcy进行样品前处理，而针对同型半胱氨酸Hcy前处理需要进行衍生化步骤，衍生化生化步骤处理麻烦，不能适用于快速检测同型半胱氨酸Hcy的含量。另外，生化法和免疫法的特异性不够理想，并且存在试剂较昂贵的问题。

总而言之，现有临床上尚未有得到被普遍认可的针对同型半胱氨酸Hcy的检测方法。因此，开发一种新的能普遍应用于临床上快速测定同型半胱氨酸Hcy含量的方法有着重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法应用高通量液相色谱串联质谱法快速高效地检测干血片中同型半胱氨酸的含量。

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中应用所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法检测同型半胱氨酸时，检测样品的前准备步骤简单易操作并且可操作性高。

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法不需要针对检测样品进行额外的衍生化处理步骤，从而简便了同型半胱氨酸的检测过程。

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法可定性且定量地检测同型半胱氨酸，同型半胱氨酸含量检测准确度高。

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中应用所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方检测时间短，检测通量高，灵敏度高且特异性好。

本发明的目的在于提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法中同型半胱氨酸含量使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，前处理步骤简单，并且可以有效去除干血片基质干扰，特异性好。

为达上述目的，本发明的主要技术解决手段是提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法被适用于检测干血片样本内同型半胱氨酸的含量，其特征在于，所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法包括以下步骤：

S1:获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线：

其中所述半胱氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的关系；

S2:检测样品的制备：

充分混合所述干血片样本，内标液以及还原剂形成一第一反应液，静置所述第一反应液，往所述第一反应液中添加萃取剂，得到一第二反应液，离心所述第二反应液，并获取所述第二反应液的上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液；

S3:高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：

利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述上清液中分离同型半胱氨酸；

S4：串联质谱检测所述同型半胱氨酸：

通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取检测值；以及

S5：获取所述同型半胱氨酸的含量：

将所述检测值代入所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，计算得到该干血片中所述同型半胱氨酸的含量。

在一些实施例中，所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S11:标准溶液的制备：

将同型半胱氨酸标准品用超纯水稀释到若干个不同浓度备用以获取不同浓度的同型半胱氨酸溶液；

S12：血样本的制备：

以一定比例混合所述同型半胱氨酸溶液和全血溶液，并将制备得到的溶液风干为血样本；

S13:标准样品的制备：

充分混匀所述血样本，内标液和还原剂，静置反应后，加入萃取剂充分震荡，离心后取标准上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液；

S14：高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：

利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述标准上清液中分离同型半胱氨酸；以及

S15：串联质谱检测所述同型半胱氨酸：

通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取测试值；以及

根据所述测试值以及已知标准品和内标浓度值的比值获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线。

在一些实施例中，其中所述步骤S2中检测样品的制备的反应条件一致于所述S13中标准样品的制备；所述步骤S3当中高通量液相色谱分离同型半胱氨酸的反应条件也一致于S14中高通量液相色谱分离同型半胱氨酸的反应条件；所述步骤S4当中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件液要一致于所述步骤S15中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件。

在一些实施例中，所述内标液与所述还原剂的体积比为2:1。

在一些实施例中，所述萃取剂被实施为三氟乙酸和甲酸的乙腈溶液。

在一些实施例中，所述标记同型半胱氨酸被实施为氘代同型半胱氨酸。

在一些实施例中，所述内标液的浓度为4umol/L，所述还原剂的浓度为0.5mol/L。

在一些实施例中，所述液相色谱分离条件为：色谱柱为Primesep100，色谱柱柱温：50℃；进样量：10μL；流速：0.55mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸-水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液。

在一些实施例中，所述质谱检测条件为：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为正离子模式。

在一些实施例中，所述步骤S1中，所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线可被实施为反映测试值和不同浓度的半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的函数关系的定量校正方程。

附图说明

图1是本发明的一实施例的干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法的检测步骤示意图。

图2到图4是根据本发明的所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法的具体实施方式示意图。

图5是根据本发明的所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法的色谱洗脱出峰的绝对保留时间示意图。

图6是根据本发明的所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法的同型半胱氨酸定量标准矫正曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

同型半胱氨酸的英文名为“Hyperhomocysteinemia”，可简称为Hcy。同型半胱氨酸对人体健康来说意义十分重要，研究表明，人体内同型半胱氨酸一旦含量不正常会引发很多人体疾病，比如心血管疾病，轻度认知衰退，血管性痴呆和阿尔茨海默氏病等一系列疾病。现有技术中常用高效液相色谱法(HPLC)检测同型半胱氨酸Hcy，但是这种检测技术需要先针对同型半胱氨酸Hcy进行样品前处理，而针对同型半胱氨酸Hcy前处理需要进行衍生化步骤，衍生化生化步骤存在操作繁琐，费时费力等问题，不能适用于快速检测同型半胱氨酸Hcy的含量。

为了解决现有技术中检测同型半胱氨酸Hcy的缺陷，本发明提供一干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法应用高通量液相色谱串联质谱法快速高效地检测干血片中同型半胱氨酸的含量，检测样品的前准备步骤简单易操作并且可操作性高，并且可以有效去除干血片基质干扰，特异性好。

本发明提供的所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法可直接快速地检测同型半胱氨酸Hcy，其主要原理是先以已知浓度的同型半胱氨酸Hcy以及其他辅助试剂以一定的方法获得一同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，随后以相同方法检测检测样品得到一检测值，将所述检测比值代入到所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线内，以计算获取所述同型半胱氨酸Hcy的含量。值得注意的是，所述同型半胱氨酸含量快速检测方法以高通量液相色谱串联质谱法检测特定浓度同型半胱氨酸Hcy对应的检测值，从而获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，并且，值得一提的是，当所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法被应用于检测同型半胱氨酸时，不需要针对检测样品进行额外的衍生化处理步骤，检测样品的前准备步骤简单易操作并且可操作性高。

具体而言，所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法被适用于检测干血片内同型半胱氨酸的含量，包括以下步骤：

S1:获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线：

其中所述半胱氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的关系；

S2:检测样品的制备：充分混合干血片样本，内标液以及还原剂形成一第一反应液，静置所述第一反应液，往所述第一反应液中添加萃取剂，得到一第二反应液，离心所述第二反应液，并获取所述第二反应液的上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液；

S3:高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述上清液中分离同型半胱氨酸；

S4：串联质谱检测所述同型半胱氨酸：通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取检测值；以及

S5：获取所述同型半胱氨酸的含量：将所述检测值代入所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，计算得到该干血片中所述同型半胱氨酸的含量。

值得特别注意的是，当使用人员通过所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法检测所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法快速检测干血片中同型半胱氨酸的含量时，需要先获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线。在一些实施例中，可直接获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，在另一些实施例中，所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线需要使用人员自行制备。

以下将结合图2到图6详细解释所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线的制备过程，所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的关系。

如图2所示，所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S11:标准溶液的制备：将同型半胱氨酸标准品用超纯水稀释到若干个不同浓度备用以获取不同浓度的同型半胱氨酸溶液；

在本发明的具体实施例中，所述同型半胱氨酸溶液的浓度被控制在200umol/L～0.36μmol/L。换言之，在标准溶液的制备时，需制备不同浓度的同型半胱氨酸溶液，而所述同型半胱氨酸溶液的浓度被控制在200umol/L～0.36μmol/L。

如图2所示，一具体实施例以操作过程图的形式被详细展示。所述同型半胱氨酸用超纯水稀释到不同浓度，比如“200umol/L,100umol/L，1umol/L，0.2umol/L，0.36umol/L”等，不同浓度的同型半胱氨酸溶液被置于不同的反应管内，静置以备用。为了避免不必要的因素对实验产生干扰，不同反应管优选在相同反应条件下进行反应。

不同浓度同型半胱氨酸溶液随后被制备为血样本，换言之，所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S12：血样本的制备：以一定比例混合所述同型半胱氨酸溶液和全血溶液，并将制备得到的溶液风干为血样本。

具体而言，所述S12的步骤被实施为将制备得到的溶液滴于干净的干纸片上，随后将干纸片置于通风橱，在室温条件下放置一段时间，待其风干后密封保存于4℃备用。在本发明的一具体实施例中，所述干纸片被置于室温条件下过夜。值得一提的是，所述全血溶液包括但不限于人血，还可被实施为动物血液。

所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S13:标准样品的制备：充分混匀所述血样本，内标液和还原剂，静置反应后，加入萃取剂充分震荡，离心后取标准上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的内标工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液。

值得注意的是，在本发明的实施例中，所述内标工作溶液控制为4umol/L，另外，所述还原剂的浓度为0.5mol/L，但熟悉该项技术的人应该明白，所述内标液以及所述还原剂的浓度仅仅作为一具体实施例，而不作为限制，并且所述内标液与所述还原剂的体积比为2:1。

另外，所述萃取剂被实施为三氟乙酸和甲酸的乙腈溶液，在一实施例中，所述萃取剂为含0.025％三氟乙酸和0.1％甲酸的乙腈溶液。但熟悉该项技术的人应该明白，所述萃取剂包括但不限于该实施例。

另外，在本发明的一具体实施例中，所述离心条件为：离心力为12000g，离心温度为4℃，离心时间为10min。

所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S14：高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：

利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述标准上清液中分离同型半胱氨酸。

具体而言，在一具体实施例中，所述步骤S14中高通量液相色谱分离条件为：

色谱柱选自SIELC Primesep100Column:pore size

particle size 5μm,2.1mm×150mm；色谱柱柱温：50℃；进样量：10μL；流速：0.55mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸-水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液。

采用等度洗脱方式，其中所述等度洗脱方式的参数值见表1；

表1

所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S15:串联质谱检测所述同型半胱氨酸：

通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取测试值；以及

根据所述测试值以及已知标准品和内标浓度值的比值获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线。

值得注意的是，在获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线之后，可进一步获取定量校正方程，所述定量校正方程反映测试值和不同浓度的半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的函数关系。

另外，所述:串联质谱利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测同型半胱氨酸，最终根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，从而得到所述测试值，比对所述测试值和已知标准品和内标浓度值，从而获取标准曲线图并得到定量校正方程。

在本发明的一具体实施例中，在所述步骤S15当中，质谱检测条件为电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为正离子模式，多重反应监控。

质谱多重反应监控参数，如表2所示：

表2

值得注意的是，为了保证实验数据的准确性，所述步骤S2当中，在本发明的一具体实施例中，所述内标工作溶液控制为4umol/L，另外，所述还原剂的浓度为0.5mol/L，但熟悉该项技术的人应该明白，所述内标液以及所述还原剂的浓度仅仅作为一具体实施例，而不作为限制，并且所述内标液与所述还原剂的体积比为2:1。

另外，所述萃取剂被实施为三氟乙酸和甲酸的乙腈溶液，在一实施例中，所述萃取剂为含0.025％三氟乙酸和0.1％甲酸的乙腈溶液。但熟悉该项技术的人应该明白，所述萃取剂包括但不限于该实施例。

另外，在本发明的一具体实施例中，所述离心条件为：离心力为12000g，离心温度为4℃，离心时间为10min。

换言之，所述步骤S2中检测样品的制备的反应条件要一致于所述S13中标准样品的制备。

相同地，所述步骤S3当中高通量液相色谱分离同型半胱氨酸的反应条件也要一致于S14中高通量液相色谱分离同型半胱氨酸的反应条件。

所述步骤S4当中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件液要一致于所述步骤S15中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件。以上反应条件，在此不再赘诉。

本发明提供一具体实施例，在本该具体实施例中，同型半胱氨酸标准品(Homocysteine)以及同位素标记的内标物(Homocysteine-D4)分别采购于Sigma和IsoSciences公司。同型半胱氨酸标准品用超纯水进行溶解，然后分装保存在-80℃，需要配制同型半胱氨酸定量标准矫正曲线时，用超纯水将上述同型半胱氨酸标准品稀释至0.2-200uM，按一定比例加入至全血中，进一步制成血样本，内标氘代同型半胱氨酸用甲醇稀释至4umol/L作为内标工作液。

(1)血样本制备：分别取2个孔的6个不同浓度的同型半胱氨酸标准品到1.5mL EP管中，再分别加入40uL低温保存的内标液和20uL还原剂，用旋涡混合器充分混合后，静置反应15min，然后加入300uL萃取剂，涡旋混匀后，12000g离心10min取上清液100uL于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；

(2)液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在Primesep100分析柱上对样品中同型半胱氨酸进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出同型半胱氨酸；

其中所述洗脱条件控制如下：

色谱柱：SIELC Primesep100Column:pore size

particle size 5μm,2.1mm×150mm；色谱柱柱温：50℃；进样量：10μL；流速：0.55mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸-水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液。洗脱梯度如表1所示。

(3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的同型半胱氨酸进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测同型半胱氨酸的含量，并获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线；

色谱上分离后的同型半胱氨酸进入到Waters Xevo TQD质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式，特异性地检测同型半胱氨酸；同型半胱氨酸的保留时间为3.8min。样品通过超高压液相色谱分离后，同型半胱氨酸在特定的洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，如图5所示。

质谱为Waters Xevo TQD IVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.0kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为负离子模式，多重反应监控，每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量。

另外值得一提的是，多重反应监控通过两次筛选，即第一个四级杆进行特定母离子筛选，第二个四级杆进行母离子碎裂产生子离子，第三个四级杆进行特定子离子筛选，具有非常好的检测特异性。可以通过选择反应监控检测到的离子流，以及对应的保留时间，来确定同型半胱氨酸的检测，再利用添加已知量的氘代同型半胱氨酸内标进行定量。

检测限定义为信噪比>3，定量限定义为信噪比>10，保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间，所有检测物质的相关系数R²均>0.99，每种同型半胱氨酸的保留时间，检出限，定量限，线性范围以及定量校正方程分别如表3所示；通过三日的精密度测试，包括低、中、高三个浓度，日内日间精密度RSD均小于15％，表明检测结果准确，可重复。

同型半胱氨酸的保留时间、检测限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数如下：

表三

(4)干血片中同型半胱氨酸的检测：

血样本制备：分别取2个孔的干血片样本到1.5mL EP管中，再分别加入40uL低温保存的工作内标溶液和20uL还原剂，用旋涡混合器充分混合后，静置反应15min，然后加入300uL萃取剂，涡旋混匀后，12000g离心10min取上清液100uL于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；

液相色谱串联质谱分析同步骤(2)和(3)，质谱检测得到同型半胱氨酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到干血片中同型半胱氨酸的含量。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法被适用于检测干血片样本内同型半胱氨酸的含量，其特征在于，所述干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法包括以下步骤：

S1:获取同型半胱氨酸定量标准矫正曲线：

其中所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的同型半胱氨酸与已知浓度的标记同型半胱氨酸的实际比值之间的关系，其中同型半胱氨酸定量标准校正曲线的线性范围为0.36-199.79µmol/L，其中制备同型半胱氨酸定量标准矫正曲线中的各类反应条件同于实际检测时的条件；

S2:检测样品的制备：

充分混合所述干血片样本，内标液以及还原剂形成一第一反应液，静置所述第一反应液，往所述第一反应液中添加萃取剂，得到一第二反应液，离心所述第二反应液，并获取所述第二反应液的上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液；

S3:高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：

利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述上清液中分离同型半胱氨酸，其中高通量液相色谱分离条件为：色谱柱为Primesep100，色谱柱柱温：50℃；进样量：10µL；流速：0.55 mL/min；流动相组成：A相为0.1%甲酸-水溶液，B相为0.1%甲酸-乙腈溶液；采用等度洗脱方式，其中所述等度洗脱方式的参数值为:流速：0.55 mL/min；A%为80；B%为20；

S4：串联质谱检测所述同型半胱氨酸：

通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取检测值，其中质谱检测条件为：电喷雾针电压： 3.0 kV，去溶剂气流速：800 L/h，去溶剂气温度：400 ℃，锥孔气流速：50 L/h，检测为正离子；以及

S5：获取所述同型半胱氨酸的含量：

将所述检测值代入所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线，计算得到该干血片中所述同型半胱氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括以下步骤：

S11:标准溶液的制备：

将同型半胱氨酸标准品用超纯水稀释到若干个不同浓度备用以获取不同浓度的同型半胱氨酸溶液；

S12：血样本的制备：

混合所述同型半胱氨酸溶液和全血溶液，并将制备得到的溶液风干为血样本;

S13:标准样品的制备：

充分混匀所述血样本，内标液和还原剂，静置反应后，加入萃取剂充分震荡，离心后取标准上清液，其中所述内标液被实施为已知浓度的标记同型半胱氨酸溶于甲醇形成的工作溶液，所述还原剂被实施为二硫苏糖醇标准品用超纯水稀释形成的溶液;

S14：高通量液相色谱分离同型半胱氨酸：

利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述标准上清液中分离同型半胱氨酸;以及

S15：串联质谱检测所述同型半胱氨酸：

通过串联质谱针对性检测同型半胱氨酸，获取测试值；以及

根据所述测试值以及已知标准品和内标浓度值的比值获取所述同型半胱氨酸定量标准矫正曲线。

3.根据要求2所述的干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法，其中所述步骤S2中检测样品的制备的反应条件一致于所述S13中标准样品的制备的反应条件；所述步骤S3当中高通量液相色谱分离所述同型半胱氨酸的反应条件也一致于S14中高通量液相色谱分离所述同型半胱氨酸的反应条件；所述步骤S4当中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件也一致于所述步骤S15中串联质谱检测所述同型半胱氨酸的反应条件。

4.根据权利要求1到3任一所述的干血片同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述内标液与所述还原剂的体积比为2:1。

5.根据权利要求4所述的干血片同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述萃取剂被实施为三氟乙酸和甲酸的乙腈溶液。

6.根据权利要求5所述的干血片同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述标记同型半胱氨酸被实施为氘代同型半胱氨酸。

7.根据权利要求6所述的干血片同型半胱氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述内标液的浓度为4 umol/L，所述还原剂的浓度为0.5 mol/L。

Images