CN103884801A - 一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML和结合态CML的检测前处理；游离态CML检测前处理：取样，添加甲醇溶液稀释，漩涡混匀，C₁₈固相萃取柱净化，加甲醇溶液洗脱，经微滤膜过滤后制得待测样品1；结合态CML检测前处理：取样，硼氢化钠还原，透析袋分离多肽及蛋白，盐酸水解，真空除酸，C₁₈固相萃取柱净化，微滤膜过滤，真空干燥，复溶后制得待测样品2；接着，对待测样品1和2分别进行CML检测；CML总含量为游离态CML与结合态CML含量的加和。本发明样品前处理方法，具有排除干扰、保护色谱柱、安全可靠、能完整分析酱油中全部CML等特点。

Description

一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测食品中羧甲基赖氨酸（CML）的方法，尤其适用于酱油中CML含量的检测，体系中CML的总含量为游离态CML与结合态CML含量的加和。

背景技术

CML是食品和生物体中由美拉德反应产生的高度氧化的化合物，此外，还可由糖氧化、脂质氧化中间产物经复杂变化产生，分为游离态CML（糖基化氨基酸）和结合态CML（糖基化多肽及蛋白质）。现有研究表明，食源性CML可能与肾衰竭、糖尿病、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化、老年痴呆症等疾病的恶化有关，其中游离态CML对人体的危害更大。酱油是由大豆、小麦、水、盐等原料经长期发酵制得的调味品，体系中富含蛋白质及碳水化合物，长期的发酵过程可能使其含有大量的CML，对人体健康造成潜在危害。

已报道的CML检测方法主要有：ELISA、HPLC、GC-MS、LC-MS等。ELISA是CML检测最为简便、快速的方法，但由于在复杂的食品体系中，该技术特异性差、抗干扰能力差，因而其检测结果备受质疑；HPLC和GC-MS技术分别需要对待测样本进行荧光性和挥发性衍生处理，该过程耗时、操作复杂且会降低检测灵敏度；LC-MS技术由于其高特异性、可靠性、可直接检测不需衍生化处理等特性，被认为是CML检测的最优技术。

为了确保检测结果的准确性以及保护液-质系统，食品样品使用LC-MS进行CML检测前通常需要经过适当的前处理。目前还未有完善的酱油中CML检测的前处理方法。已报道的液-质联用检测食品中CML的前处理方法主要为：取样、硼氢化钠还原、三氯乙酸（TCA）沉淀分离蛋白、蛋白盐酸水解、干燥、复溶制得待测样品。中国专利文献CN103293243A公开了一种食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，并具体公开了脱脂、TCA沉淀分离蛋白、蛋白质盐酸水解、FMOC-CL衍生、浓缩、溶解的前处理步骤。

但是，酱油中总氮45%存在于低分子量多肽（1-5kDa）中，45%存在于游离氨基酸中，上述TCA法不能完全沉淀分离低分子量多肽（糖基化多肽），且无法沉淀分离游离氨基酸（糖基化氨基酸），故无法完整得到酱油体系中总的CML含量，严重影响检测结果的准确性和可靠性。

现在还没有专门针对酱油中游离态CML检测的前处理方法，也没有将透析法应用到酱油中结合态CML检测前处理技术中的报道。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种酱油中CML的定量检测方法；将酱油体系中CML的检测前处理分为游离态CML和结合态CML两部分，可准确地获得酱油中CML的完整含量。其中游离态CML检测前处理可有效除去体系中大分子杂质及色素，具有防止污染色谱柱、延长色谱柱使用寿命等特点；结合态CML检测前处理可完全分离酱油体系中蛋白质及多肽，具有可完整分析酱油中总的结合态CML含量的特点。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML的检测前处理和结合态CML的检测前处理；所述游离态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：

（1）向酱油样品中加甲醇溶液稀释，漩涡混匀；

（2）取上述稀释液使用C₁₈固相萃取柱净化，加入甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述每1mL稀释液对应甲醇溶液的添加量为5-8mL；

（3）将所述洗脱液经微滤膜处理，得到所需待测样品1；

所述结合态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：

（1）向酱油样品中加入硼酸缓冲液及硼氢化钠溶液进行还原处理，所述酱油取样量为3-7.5mg肽态氮含量当量；

（2）将还原后的样品于4℃条件下，采用截留分子量为500-1000Da的透析袋，每隔24h更换一次透析袋外液体，静置透析5-7d；

（3）取透析袋内液体，加12mol/L的HCl使体系中HCl的浓度达到6mol/L，然后在110℃下水解12～16h；

（4）真空干燥除酸，加蒸馏水复溶，使用C₁₈固相萃取柱净化，加5-8mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）将所述洗脱液经微滤膜处理，干燥、加100～300μL甲醇溶液复溶后制得待测样品2；

然后，将经过前处理的待测样品1和2分别进行CML检测。

所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（1），甲醇溶液的体积浓度为10%，稀释倍数为100倍。

所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（2），所述C₁₈固相萃取柱使用前经3mL无水甲醇活化处理。

所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（2），甲醇溶液的体积浓度为10%。

所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（3），所述微滤膜孔径为0.22μm。

所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（1），所述硼酸缓冲液（0.5mol/L,pH9.2）添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，所述硼氢化钠溶液（2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.1mol/L的氢氧化钠溶液）添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L。

所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（4），所述C₁₈固相萃取柱（2000mg/12mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）使用前经3mL无水甲醇活化处理，甲醇溶液的体积浓度为10%。

所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（5），所述微滤膜孔径为0.22μm。

所述结合态CML的检测前处理方法中复溶步骤，甲醇溶液的体积浓度为10%。

所述CML检测采用高效液相色谱-质谱。

所述高效液相色谱采用Waters1525机型，检测条件为：

色谱柱：Waters Atlantis C₁₈色谱柱4.6×150mm，5μm

柱温：30℃

流动相：甲醇：水=1：9

流速：0.5mL/min

进样量：10μL；

质谱为单重四级杆质谱，采用机型为Waters Micromass ZQ，检测条件为：

离子源：ESI^＋

毛细管电压：3.0kV

锥孔电压：20V

离子源温度：100℃

脱溶温度：300℃

扫描模式：单离子记录

CML质荷比：205（M⁺）。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明全面考虑酱油中游离态CML与结合态CML的含量，按照酱油样本的特性将其所含游离态CML、结合态CML分别提取、纯化，可准确获得酱油中总的CML含量。

（2）本发明所述的酱油中游离态CML的检测前处理方法，采用C₁₈固相萃取柱进行净化处理，能够除去待测样品中本身含有的蛋白质分子、脂肪分子以及与CML分子量相近的干扰分子，同时由于C₁₈是非极性吸附剂，而目标分子CML是极性分子，使用C₁₈固相萃取柱对样品进行净化处理，在吸附样品中杂质分子的同时，避免对目标分子的吸附，是一种安全可靠、成本低、操作简单的前处理方法，具有提高检测准确性、灵敏度，保护色谱柱及液-质系统的特点。

（3）本发明所述的酱油中结合态CML的检测前处理方法，当酱油取样量为3mg肽态氮含量当量（最适取样量范围较低值）时，结合态CML检测质谱响应信号良好，且可减少样品中硼酸缓冲液及硼氢化钠溶液的添加，从而减少杂质盐的引入；本实验采用截留分子量为500Da的透析袋，即分子量小于500的分子如游离态CML、硼酸钠、硼氢化钠、小分子色素等可自由进出半透膜，静置一段时间后透析袋内外的溶液小分子达到平衡，即内外小分子浓度相同，此时更换透析袋外液体，经7d透析处理后可基本除去透析袋内游离态CML及其它小分子物质，此外，酱油体系中蛋白质和多肽的分子量95%大于1000Da，因而会被阻挡在透析袋内，故此过程可分离酱油体系中游离态CML和结合态CML，并可完整获得结合态CML；本实验采用优选水解时间12h，该条件既可使结合态CML完全水解释放，又节省了能耗保证了实验的安全性。

（4）本发明所述样品前处理方法，采用孔径为0.22μm微滤膜进行过滤，以防止样品中含有大粒径杂质分子而对色谱系统造成损坏，同时也在一定程度上起到净化样品的作用。

附图说明

图1为CML标准品的色谱图；

图2为CML浓度和质谱信号峰面积关系的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式做详细说明。

取不同品牌日本酱油、不同品牌中国酱油采用实施例1的方法分别对其进行游离态、结合态CML的液-质检测前处理；从上述酱油中选取代表性酱油等体积混合（混合酱油），分别采用实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的方法对混合酱油样品进行游离态、结合态CML的液-质检测前处理。

实施例1

分别对不同品牌日本酱油、不同品牌中国酱油及混合酱油进行CML检测的前处理，具体包括如下步骤：

a、游离态CML的检测前处理，并具体包括如下步骤：

（1）取0.1mL酱油样品，用10%甲醇溶液稀释至10mL，漩涡混匀；

（2）取1mL稀释液，使用活化后的C₁₈固相萃取柱净化，加5mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（3）取1mL洗脱液经0.22μm微滤膜处理，得到所需待测样品1。

在混合酱油样品检测的同时，进行除杂效果分析，具体包括如下步骤：

采用紫外可见分光光度计（50Conc,VARIAN,USA），在294nm及420nm处测定经上述前处理后混合酱油样品的吸光度值，以用10%甲醇溶液稀释同等倍数的混合酱油作为对照组，评价上述方法的除杂效果。

进一步说明，CML溶液为无色透明液体且不具有紫外吸收，而酱油中含有一定量的具有紫外吸收的物质以及棕色物质，这些物质含量的变化可以作为净化效果的指示。

在混合酱油样品检测的同时，进行添加回收实验，取样完毕后，按以下添加水平50μg/mL、100μg/mL添加CML标准品，以同样的方法进行处理测定其回收率。

b、结合态CML的检测前处理，并具体包括如下步骤：

（1）取3mg肽态氮含量当量的酱油，加入硼酸缓冲液（0.5mol/L,pH9.2），添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，并加入硼氢化钠溶液（2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.1mol/L的氢氧化钠溶液），添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L，4℃下还原12h。

（2）将还原后的样品转移至下端封闭的透析袋（截留分子量500Da）中，将透析袋上端扎紧，置于烧杯中，加入100mL的蒸馏水，于4℃条件下，静置透析5d，每24h更换一次透析袋外蒸馏水；

（3）取出透析袋内液体转移至10mLPE管中，加入12mol/L的HCl，添加后使体系中HCl的最终摩尔浓度达到6mol/L，置于110℃油浴中水解12h；

（4）采用真空干燥除去多余的HCl，加3mL蒸馏水复溶后采用C₁₈固相萃取柱净化，并添加5mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）将所述洗脱液经0.22μm微滤膜处理，干燥后添加100μL10%甲醇溶液复溶，制得待测样品2。

最后，使用高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪，采用下述检测条件对制得的待测样品1、2进行检测。

所述高效液相色谱（Waters1525）检测条件为：

色谱柱：Waters Atlantis C₁₈色谱柱4.6×150mm，5μm

柱温：30℃

流动相：甲醇：水=1：9

流速：0.5mL/min

进样量：10μL

所述单重四级杆质谱（Waters Micromass ZQ）的检测条件为：

离子源：ESI^＋

毛细管电压：3.0kV

锥孔电压：20V

离子源温度：100℃

脱溶温度：300℃

扫描模式：单离子记录

CML质荷比：205（M⁺）

采用外标法对CML定量。

使用上述高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪，采用上述检测条件对CML标准品溶液进行检测，得到CML标准品的色谱图如图1所示，并进一步得到CML浓度和质谱信号峰面积关系的标准曲线（图2）。

表1：不同品牌日本酱油经本发明所述方法前处理后测得的CML含量

表2：不同品牌中国酱油经本发明所述方法前处理后测得的CML含量

所述混合酱油游离态CML的检测前处理除杂效果如下表3所示。

表3

*对照组为用10%甲醇溶液稀释同等倍数的混合酱油

通过添加回收试验测得混合酱油游离态CML的检测前处理回收率如下表4所示。

表4

所述混合酱油经CML的检测前处理后，样品中游离态CML含量为747.04±22.00μg/mL，结合态CML含量为2.09±0.02μg/mL。

实施例2

a、游离态CML的检测前处理，其具体步骤为：

（1）取0.1mL酱油样品，用10%甲醇溶液稀释至10mL，漩涡混匀；

（2）取1mL稀释液，使用活化后的C₁₈固相萃取柱净化，加8mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（3）取1mL洗脱液经0.22μm微滤膜处理，得到所需待测样品1。

b、结合态CML的检测前处理，其具体步骤为：

（1）取7.5mg肽态氮含量当量的酱油，加入硼酸缓冲液（0.5mol/L,pH9.2），添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，并加入硼氢化钠溶液（2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.1mol/L的氢氧化钠溶液），添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L，4℃下还原12h。

（2）将还原后的样品转移至下端封闭的透析袋（截留分子量1000Da）中，将透析袋上端扎紧，置于烧杯中，加入100mL的蒸馏水，于4℃条件下，静置透析7d，每24h更换一次透析袋外蒸馏水；

（3）取出透析袋内液体转移至10mLPE管中，加入12mol/L的HCl，添加后使体系中HCl的最终摩尔浓度达到6mol/L，置于110℃油浴中水解16h；

（4）采用真空干燥除去多余的HCl，加3mL蒸馏水复溶后采用C₁₈固相萃取柱净化，并添加8mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）将所述洗脱液经0.22μm微滤膜处理，干燥后添加300μL10%甲醇溶液复溶，制得待测样品2。

本实施例所述酱油样品为实施例1的混合酱油样品，采用与实施例1完全相同的高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪及检测方法对所述待测样品1、2含有的CML进行检测，且除杂效果检测方法及加标回收率测定方法与实施例1完全相同。

所述混合酱油游离态CML的检测前处理除杂效果如下表5所示。

表5

*对照组为用10%甲醇溶液稀释同等倍数的混合酱油

通过添加回收试验测得混合酱油游离态CML的检测前处理回收率如下表6所示。

表6

所述混合酱油经CML的检测前处理后，样品中游离态CML含量为749.21±33.91μg/mL，结合态CML含量为1.95±0.04μg/mL。

对比例1

a、游离态CML的检测前处理

本对比例所述酱油样品为实施例1所述混合酱油样品，采用与实施例1完全相同的高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪及检测方法对所述待测样品含有的CML进行检测，且混合酱油总的稀释倍数、除杂效果检测方法及加标回收率测定方法相同，区别仅在于使用75%甲醇溶液沉淀净化法代替实施例1中C₁₈固相萃取柱净化处理。

其具体步骤为：

（1）取5mL酱油添加15mL无水甲醇，使甲醇在其中的比例达到75%，漩涡混匀，静置30min；

（2）将静置后样本于3000g下离心5min；

（3）取0.1mL上述上清液，加10%甲醇溶液定容至15mL，漩涡混匀；

（4）取1mL定容后样本，经0.22μm微滤膜处理，得到所需待测样品。

b、结合态CML的检测前处理

本对比例所述酱油样品为实施例1所述混合酱油样品，采用与实施例1完全相同的高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪及检测方法对所述待测样品含有的CML进行检测，区别仅在于采用传统的TCA沉淀法代替实施例1中透析袋法进行蛋白质的分离处理。

其具体步骤为：

（1）取3mg肽态氮含量当量的酱油，加入硼酸缓冲液（0.5mol/L,pH9.2），添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，并加入硼氢化钠溶液（2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.1mol/L的氢氧化钠溶液），添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L，4℃下还原12h；

（2）向上述体系中添加60%的三氯乙酸溶液，使三氯乙酸在样品中的含量达到20%，静置30min；

（3）将上述混合样品于5000g下离心15min，弃去上清液，得到分离的蛋白质；

（4）添加1mL6mol/L的HCl，置于110℃油浴中水解12h；

（5）采用真空干燥除去多余的HCl，加3mL蒸馏水复溶后采用C₁₈固相萃取柱净化，并添加5mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（6）将所述洗脱液经0.22μm微滤膜处理，干燥后添加100μL10%甲醇溶液复溶，制得待测样品。

所述混合酱油游离态CML的检测前处理除杂效果如下表7所示。

表7

*对照组为用10%甲醇溶液稀释同等倍数的混合酱油

通过添加回收试验测得混合酱油游离态CML的检测前处理回收率如下表8所示。

表8

因此，采用上述样品前处理方法，虽能显著（P<0.05）除去样品中杂质，但将会导致回收率偏低，测量误差较大，经由所述前处理后样品中游离态CML含量为575.94±23.89μg/mL。

酱油中总氮45%存在于低分子量多肽（1-5kDa）中，而所述TCA沉淀法对低分子量多肽的沉淀比率仅为21.32%-78.89%，故不能完全沉淀分离结合态CML，经由所述方式前处理后的样品中结合态CML含量低于检出限，测量误差较大。

对比例2

a、游离态CML的检测前处理

本对比例所述酱油样品为实施例1所述混合酱油样品，采用与实施例1完全相同的高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪及检测方法对所述待测样品含有的CML进行检测，且混合酱油总的稀释倍数、除杂效果检测方法及加标回收率测定方法相同，区别仅在于使用75%甲醇溶液沉淀联合C₁₈固相萃取柱进行样品净化处理代替实施例1中C₁₈固相萃取柱净化处理。

其具体步骤为：

（1）取5mL酱油添加15mL无水甲醇，使甲醇在其中的比例达到75%，漩涡混匀，静置30min；

（2）将静置后样本于3000g下离心5min；

（3）取0.4mL上清液，加10%甲醇溶液定容至10mL，漩涡混匀；

（4）取1mL定容后样本，使用活化后的C₁₈固相萃取柱净化，加5mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）取1mL洗脱液经0.22μm微滤膜处理，得到所需待测样品。

b、结合态CML的检测前处理

本对比例所述酱油样品为实施例1所述混合酱油样品，采用与实施例1完全相同的高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪及检测方法对所述待测样品含有的CML进行检测，区别仅在于采用传统的超滤离心（截留分子量3000Da）浓缩法代替实施例1中透析袋法进行蛋白质的分离处理。

其具体步骤为：

（1）取3mg肽态氮含量当量的酱油，加入硼酸缓冲液（0.5mol/L,pH9.2），添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，并加入硼氢化钠溶液（2mol/L的硼氢化钠溶液溶于0.1mol/L的氢氧化钠溶液），添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L，4℃下还原12h；

（2）将还原后样本转移至超滤离心管（截留分子量为3000Da）中，于5000g下离心15min，得到浓缩蛋白、多肽液；

（3）添加1mL6mol/L的HCl，置于110℃油浴中水解12h；

（5）采用真空干燥除去多余的HCl，加3mL蒸馏水复溶后采用C₁₈固相萃取柱净化，并添加5mL10%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（6）将所述洗脱液经0.22μm微滤膜处理，干燥后添加100μL10%甲醇溶液复溶，制得待测样品。

所述混合酱油游离态CML的检测前处理除杂效果如下表9所示。

表9

*对照组为用10%甲醇溶液稀释同等倍数的混合酱油

通过添加回收试验测得混合酱油游离态CML的检测前处理回收率如下表10所示。

表10

因此，采用上述样品前处理方法，虽能显著（P<0.05）除去样品中杂质，但将会导致回收率偏低，测量误差较大，经由所述前处理后样品中游离态CML含量为537.97±16.95μg/mL。

酱油中总氮45%存在于低分子量多肽（1-5kDa）中，而截留分子量为3000Da的超滤离心管（目前市售截留分子量最小的超滤离心管）不能完全截留目标多肽，经由所述方式前处理后的样品中结合态CML含量低于检出限，测量误差较大。

通过对实施例1、实施例2、对比例1及对比例2的检测结果比较可知，本发明中游离态CML的检测前处理可显著（P<0.05）除去酱油样本中干扰杂质，且具有相对较高的回收率，说明其不但能够除去色素、颗粒物质、蛋白质等物质的干扰，而且还能够有效的保留目标物质，是可靠、便捷的前处理方法；本发明中结合态CML的检测前处理可完全分离获得酱油体系中所有的结合态CML，使检测结果更为准确、可靠。

因为高效液相色谱-单重四级杆质谱联用仪法对进样的要求较高，本发明的前处理方法适用于液-质检测，自然也适用于其它检测方法的前处理。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于，首先，进行酱油体系中CML的检测前处理，包括游离态CML的检测前处理和结合态CML的检测前处理；所述游离态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：

（1）向酱油样品中加甲醇溶液稀释，漩涡混匀；

（2）取上述稀释液使用C₁₈固相萃取柱净化，加入甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述每1mL稀释液对应甲醇溶液的添加量为5-8mL；

（3）将所述洗脱液经微滤膜处理，得到所需待测样品1；

所述结合态CML的检测前处理方法的具体步骤如下：

（1）向酱油样品中加入硼酸缓冲液及硼氢化钠溶液进行还原处理，所述酱油取样量为3-7.5mg肽态氮含量当量；

（2）将还原后的样品于4℃条件下，采用截留分子量为500-1000Da的透析袋，每隔24h更换一次透析袋外液体，静置透析5-7d；

（3）取透析袋内液体，加12mol/L的HCl使体系中HCl的浓度达到6mol/L，然后在110℃下水解12～16h；

（4）真空干燥除酸，加蒸馏水复溶，使用C₁₈固相萃取柱净化，加5-8mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）将所述洗脱液经微滤膜处理，干燥、加100～300μL甲醇溶液复溶后制得待测样品2；

然后，将经过前处理的待测样品1和2分别进行CML检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（1），稀释倍数为100倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（2），所述C₁₈固相萃取柱使用前经3mL无水甲醇活化处理。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游离态CML的检测前处理方法中步骤（3），所述微滤膜孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（4），所述C₁₈固相萃取柱使用前经3mL无水甲醇活化处理。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（5），所述微滤膜孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合态CML的检测前处理方法中步骤（1），所述硼酸缓冲液0.5mol/L,pH9.2添加后使体系中硼酸钠最终摩尔浓度达到0.2mol/L，所述硼氢化钠溶液添加后使体系中硼氢化钠的最终浓度达到0.1mol/L。

8.根据权利要求1～7所述的方法，其特征在于，所有步骤中甲醇溶液的体积浓度均为10%。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CML检测采用高效液相色谱-质谱。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用Waters1525机型，检测条件为：

色谱柱：Waters Atlantis C₁₈色谱柱4.6×150mm，5μm

柱温：30℃

流动相：甲醇：水=1：9

流速：0.5mL/min

进样量：10μL；

质谱为单重四级杆质谱，采用机型为Waters Micromass ZQ，检测条件为：

离子源：ESI^＋

毛细管电压：3.0kV

锥孔电压：20V

离子源温度：100℃

脱溶温度：300℃

扫描模式：单离子记录

CML质荷比：205（M⁺）。

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