CN114062520A - 一种硫酸羟氯喹及其有关物质的hplc分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其步骤包括：将被试物溶于含高氯酸的溶液中，进行HPLC检测，即可；其色谱条件为：流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为高氯酸溶液；所述流动相B为乙腈；色谱柱为苯基柱。本发明的方法可同时检测到硫酸羟氯喹和12种有关物质及其含量，实现了硫酸羟氯喹及其有关物质的有效分离；流动相体系简单且不会对仪器或色谱柱带来损伤，操作简单，精密度高，重现性好，灵敏度高，准确度高，成本低。

Description

一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法
技术领域
本发明涉及一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法。
背景技术
硫酸羟氯喹，化学名：2-[[4-[(7-氯-4-喹啉基)氨基]戊基]乙氨基]-乙醇硫酸盐，是一种抗疟疾剂，通常被用来治疗类风湿关节炎、全身红疮狼斑、结节病等疾病。硫酸羟氯喹的口服效果良好，能够快速且完全被人体吸收，因此硫酸羟氯喹是目前临床使用较广的一种类氯喹类抗疟疾药物。
目前，虽然有一些文献和药典报道过关于硫酸羟氯喹和有关物质的分析方法，但是其中存在一些缺陷。具体如下：欧洲药典(EP)采用UPLC液相方法测定硫酸羟氯喹中杂质含量，其采用含有三乙胺的庚烷磺酸钠离子对体系，该方法存在重现性差，检测的杂质只有6个，且杂质与杂质之间存在没有基线分离，灵敏度低且杂质分析范围窄(详见药品注册申请标准和药典中关于杂质检测的质量控制标准)。Richard R等(Richard R.Brown,RonaldM.Stroshane,David P.Benziger,Journal of Chromatography,377(1986)454-459)采用
Figure BDA0002609753640000011
CN柱(150*4.6mm,6μm)对硫酸羟氯喹血浆的代谢产物进行HPLC分析测试，选择UV320nm波长，流速1.2mL/min，流动相为0.06M二丁胺磷酸盐-0.05M磷酸氢二钠＝40:60(用磷酸调节pH至3.5)。结果该分析方法虽然成功实现了对血浆中的有关物质分析，但是存在问题是血浆样品浓度都较低，对于常规的有关物质，该方法无法实现分析；且氰基色谱柱自身生命周期相较于其他色谱柱周期本就较短，使用此浓度的磷酸盐对于氰基色谱柱伤害较大。此外，硫酸羟氯喹在生物样品中的分析相关文献报道较多，对于原料药或者制剂成品的硫酸羟氯喹的提供的参考价值较低。
综上所述，由于目前分析方法存在一定缺陷，因此迫切需要开发一种检测时间短，精密度高，重现性好，有效分离现有杂质(如表1所示，包括欧洲药典，市售工艺中间体或者降解杂质等)的硫酸羟氯喹HPLC(高效液相色谱)分析方法。
表1杂质化学名称和结构
Figure BDA0002609753640000021
Figure BDA0002609753640000031
注：硫酸羟氯喹杂质A、B、C、D、E、F和G命名与欧洲药典杂质命名一致。
上表中，硫酸羟氯喹与有关物质分离最困难的为杂质6，杂质9与主峰的分离。除此之外，杂质7，8与主峰或杂质5，6与主峰的分离也较难，且目前尚未有一种方法能够同时检测、分离上表中的12种杂质和硫酸羟氯喹。
发明内容
本发明为了解决现有技术中对于硫酸羟氯喹及有关物质的分析方法中，存在同时能够检测到的杂质数量少，流动相体系复杂且可能会对仪器或色谱柱带来不可逆的损伤等问题，而提供了一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法。
申请人发现，采用pH范围较宽的C18作为色谱柱，以磷酸水溶液-乙腈体系作为流动相，在适当的检测波长和流速可以将硫酸羟氯喹中的部分有关物质进行有效的色谱分析，然而分析过程会引起色谱峰较宽，影响个别杂质(例如欧洲药典中硫酸羟氯喹杂质D，硫酸羟氯喹杂质A，硫酸羟氯喹杂质B)的分离，无法准确分离分析硫酸羟氯喹及其有关物质。经过发明人的创造性劳动发现，采用含高氯酸的溶液作为溶媒，高氯酸和乙腈为流动相体系，苯基柱为色谱柱进行液相色谱方法分析，能够同时检测到硫酸羟氯喹和表1中12种有关物质及其含量，流动相体系简单且不会对仪器或色谱柱带来损伤，检测时间短，精密度高，重现性好，准确度高，成本低，该体系也可被用于后续的LC-MS测定，为硫酸羟氯喹后续的一些研究工作开展创造了有利条件。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其步骤包括：将被试物溶于含高氯酸的溶液中，进行HPLC检测，即可；
其色谱条件为：
流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为高氯酸溶液；所述流动相B为乙腈；
色谱柱为苯基柱。
本发明中，所述含高氯酸的溶液较佳地为含高氯酸和乙腈的水溶液，其中，高氯酸：乙腈：水的体积比较佳地为0.05:(10～30)：(70～90)，例如为0.05:10:90、0.05:20:80或0.05:30:70。
本发明中，所述HPLC检测时，所述被试物在溶解后，得到的溶液的浓度较佳地为0.00002～0.5mg/mL，更佳地为0.0001～0.24mg/mL，例如为0.2mg/mL。当得到的溶液的浓度为0.0001～0.24mg/mL时，分离度可达1.5以上。
本发明中，所述流动相A较佳地为体积分数为0.1％～0.3％的高氯酸溶液，更佳地为体积分数为0.1％的高氯酸溶液。当所述流动相A为体积分数为0.1％的高氯酸溶液时，分离度可达1.7以上。
本发明中，所述色谱柱较佳地为苯丁基键合色谱柱，其型号可为YMC-TriartPhenyl 150*4.6mm ID S-3um，12nm。
本发明中，所述色谱柱的长度较佳地为150mm～250mm，例如为150mm。所述色谱柱的内径较佳地为4.6mm。所述色谱柱的填料的颗粒的粒径较佳地为3μm～5μm。所述色谱柱的微孔孔径较佳地为12nm。
本发明中，所述流动相的流速较佳地为0.8～1.2mL/min，例如为1.0mL/min。
本发明中，所述HPLC检测中，检测波长较佳地为220nm～300nm，例如为220nm。
本发明中，所述HPLC检测中，柱温较佳地为20～30℃，例如为25℃。
本发明中，所述HPLC检测中，进样体积较佳地为5～20μL，例如为10μL。
本发明中，所述HPLC检测中，洗脱方式较佳地为梯度洗脱。更佳地，所述梯度洗脱中，以所述流动相的总体积为100％计；在0min时，所述流动相A的体积分数为50％～88％，进一步更佳地为88％，能够在保证基线分离的前提下，缩短分析时间，提高分析效率。一具体实施方式中，所述梯度洗脱中，以所述流动相A的总体积为100％计；在0min时，所述流动相A的体积分数为88％；在0～6min时，所述流动相A的体积分数为88％；在6～26min时，所述流动相A的体积分数递减至80％；在26～31min时，所述流动相A的体积分数递减至65％；在31～36min时，所述流动相A的体积分数为65％；在36～37min时，所述流动相A的体积分数递减至50％，在37～40min时，所述流动相A的体积分数为50％；在40～40.1min时，所述流动相A的体积分数递增至88％；在40.1～45min时，所述流动相A的体积分数为88％。
本发明中，将被试物溶于含高氯酸的溶液后，必要时还可进行离心和/或过滤。所述离心的条件可为本领域常规，所述离心的时间一般为5～10min，例如为5min，所述离心的转速一般为5000～8000转/min，例如为5000转/min。所述过滤的条件可为本领域常规，一般可采用微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的材质较佳地为尼龙Nylon、聚四氟乙烯PTFE或聚偏二氟乙烯PVDF。
本发明还提供了一种如前所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法的应用，其用于原料药和相关制剂产品(例如片剂、胶囊剂、软膏剂等)的分析。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明采用含高氯酸的溶液作为溶媒，高氯酸和乙腈为流动相体系，苯基柱为色谱柱进行液相色谱方法分析，通过外标法测定硫酸羟氯喹含量和主成分自身对照法测定硫酸羟氯喹的有关物质含量，可同时检测到硫酸羟氯喹和表1中的12种有关物质及其含量，实现了硫酸羟氯喹及其有关物质的有效分离；流动相体系简单且不会对仪器或色谱柱带来损伤，操作简单，精密度高，重现性好，灵敏度高，准确度高，成本低。
本发明的优选实施方式中，可改善硫酸羟氯喹需要较高浓度进行含量检测，含量峰型不对称问题，分离度好。
附图说明
图1为实施例1的HPLC色谱图。
图2为实施例2的HPLC色谱图。
图3为实施例3的HPLC色谱图。
图4为实施例4的HPLC色谱图。
图5为对比例1的HPLC色谱图。
图6为对比例2的HPLC色谱图。
图7为对比例3的HPLC色谱图。
图8为对比例4的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所使用的仪器和药品如下：
HPLC仪器为安捷伦1260，紫外检测器为DAD，色谱柱为YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um，12nm，电子分析天平(梅特勒XS105分析天平，十万分之一；梅特勒XRP2分析天平，百万分之一)，数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，超纯水仪(MerckMillipore Direct 8/16纯水系统)，硫酸羟氯喹原料药(上海上药中西制药有限公司，批号为S180201)，高氯酸，乙腈以及硫酸羟氯喹空白辅料，滤膜型号：PVDF(聚偏二氟乙烯膜，25mm*0.45μm)，PTFE(聚四氟乙烯膜，25mm*0.45μm)，尼龙(聚酰胺，25mm*0.45μm)。
以下实施例中，待测样品溶液的制备过程和测试方法如下：
1)将硫酸羟氯喹标准品用溶媒配制成浓度为0.1μg/mL～200μg/mL的溶液。通过色谱分析，得到硫酸羟氯喹的浓度随面积的变化关系；
2)将硫酸羟氯喹，或者硫酸羟氯喹和有关物质用溶媒配制成一定浓度的硫酸羟氯喹(或者硫酸羟氯喹和有关物质)的溶液。通过色谱分析，得到样品中硫酸羟氯喹或有关物质的峰面积；
3)将硫酸羟氯喹用溶媒稀释成2μg/mL的对照溶液。
取步骤(1)制备好的待测样品溶液1)，2)，3)分别注入HPLC，检测后得到图谱并进行分析，用外标法得到硫酸羟氯喹的含量；通过自身对照法得到硫酸羟氯喹中有关物质的含量。其中，待测样品溶液1)，2)，3)中的“溶媒”的成分需一致。
实施例1
考察不同滤膜对试验结果影响
配制0.2mg/mL的硫酸羟氯喹的溶液，用离心机离心取上清液(5000转，离心5分钟)和0.45μm不同材质的微孔滤膜(聚偏二氟乙烯膜PVDF的尺寸和孔径为25mm*0.45μm，聚四氟乙烯膜PTFE的尺寸和孔径为25mm*0.45μm，聚酰胺Nylon的尺寸和孔径为25mm*0.45μm)过滤。此处溶解硫酸羟氯喹的溶媒为含高氯酸的溶液(高氯酸：乙腈；水＝0.05:10:90；v/v/v)。
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为：0.1％高氯酸-乙腈进行梯度洗脱，洗脱程序为：
时间(min) A(％) B(％)
0.00 88.0 12.0
6.00 88.0 12.0
26.00 80.0 20.0
31.00 65.0 35.0
36.00 65.0 35.0
37.00 50.0 50.0
40.00 50.0 50.0
40.10 88.0 12.0
45.00 88.0 12.0
检测波长为220nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，得到色谱分析图。
试验结果说明：PVDF、PTFE以及Nylon滤膜均没有吸附，含量结果均在98.0％-102.0％(如下表2和图1所示)。
表2
名称 峰面积 回收率(％)
供试品(仅离心) 8524.76 N/A
供试品(PVDF滤膜过滤) 8538.94 100.2
供试品(PTFE滤膜过滤) 8543.75 100.2
供试品(Nylon滤膜过滤) 8551.70 100.3
注：“N/A”表示不适用。
实施例2
考察溶媒对于硫酸羟氯喹及其有关物质的分离的影响。
配制0.2mg/mL的硫酸羟氯喹和有关物质的溶液(杂质溶液浓度为20μg/mL)，用不同的溶媒a～d溶解后，用离心机离心取上清液(5000转，离心5分钟)，进行测试。
溶媒：a)H2O：ACN：HClO4＝80：20：0.05(v/v/v)；b)H2O：ACN：HClO4＝90：10：0.05(v/v/v)；c)H2O：ACN＝90：10(v/v)；d)H2O：ACN：HClO4＝70：30：0.05(v/v/v)。
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为：0.1％高氯酸-乙腈进行梯度洗脱，洗脱程序为：
时间(min) A(％) B(％)
0.00 88.0 12.0
6.00 88.0 12.0
26.00 80.0 20.0
31.00 65.0 35.0
36.00 65.0 35.0
37.00 50.0 50.0
40.00 50.0 50.0
40.10 88.0 12.0
45.00 88.0 12.0
检测波长为220nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，得到色谱分析图。
试验结果发现，以含高氯酸的溶液为溶媒时，可有效分离12种杂质，且分离度良好。然而，如图2和表3所示，在采用不含高氯酸的溶媒c时，绝大多数杂质可以实现有效的基线分离，但是个别杂质(表3中杂质编号对应于表1的化学名称和结构，编号10/11两个杂质，即表1中杂质4,7-二氯喹啉和硫酸羟氯喹杂质F)无法分离。
表3
Figure BDA0002609753640000091
Figure BDA0002609753640000101
注：“N/A”表示不适用。
实施例3
考察硫酸羟氯喹浓度对硫酸羟氯喹及其有关物质的分离的影响
配制0.5mg/mL的硫酸羟氯喹溶液(实施例中采用的硫酸羟氯喹原料药中均含表1中杂质6，即欧洲药典中硫酸羟氯喹杂质D)，用离心机离心取上清液(5000转，离心5分钟)。此处溶解的溶媒为含高氯酸的溶液(高氯酸：乙腈；水＝0.05:10:90；v/v/v)。
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为：0.1％高氯酸-乙腈进行梯度洗脱，洗脱程序为：
Figure BDA0002609753640000102
Figure BDA0002609753640000111
检测波长为220nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，得到色谱分析图。
硫酸羟氯喹溶液的浓度为0.5mg/mL时，可实现基线分离，12种有关物质基本实现分离。然而，如图3和表4(表4中杂质编号对应于表1的化学名称和结构)所示，其峰形相较于实施例4差，峰前延，拖尾因子为3.0，主峰HCQ前杂质(杂质6，即硫酸羟氯喹杂质D)与主峰分离度为1.1，硫酸羟氯喹峰面积高达21000。
表4
峰名称 保留时间 分离度
杂质6 23.165 N/A
硫酸羟氯喹HCQ 23.725 1.1
实施例4
配制0.2mg/mL的硫酸羟氯喹和有关物质的溶液(杂质溶液浓度为20μg/mL)。此处溶解溶媒为含高氯酸的溶液(高氯酸：乙腈；水＝0.05:10:90；v/v/v)。
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为：0.1％高氯酸-乙腈进行梯度洗脱，洗脱程序为：
Figure BDA0002609753640000112
Figure BDA0002609753640000121
检测波长为220nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL，得到色谱分析图。
如图4和表5(表5中杂质编号对应于表1的化学名称和结构)所示，硫酸羟氯喹的有关物质最小分离度为1.7，实现基线分离，分析时间适中，实现了硫酸羟氯喹的有关物质的分析。
表5
杂质编号 保留时间 分离度
杂质1 11.702 N/A
杂质2 18.763 19.9
杂质3 20.214 4.0
杂质4 21.133 2.6
杂质5 22.237 3.2
杂质6 23.162 2.4
硫酸羟氯喹HCQ 24.010 1.7
杂质7 26.811 5.8
杂质8 27.746 2.4
杂质9 31.010 10.3
杂质10 36.474 23.5
杂质11 37.220 2.6
杂质12 38.921 5.0
注：“N/A”表示不适用。
实施例5
对本发明测定硫酸羟氯喹的有关物质的方法学考察
1.专属性考察
配制0.2mg/mL的硫酸羟氯喹溶液，用离心机离心取上清液，分别取空白溶剂，空白辅料溶液以及供试品溶液各10μL，注入液相色谱系统，采用实施例4的分析方法，试验结果发现空白溶剂，空白辅料峰均不干扰硫酸羟氯喹的峰与有关物质的峰，能够给达到完全基线分离。此处溶解溶媒为高氯酸：水：乙腈＝0.05:90:10(v/v/v)。
2.线性关系考察
分别配制以0.2mg/mL为100％，线性水平分别为120％，100％，80％以及2％，1.5％，1％，0.5％，0.05％浓度的硫酸羟氯喹溶液，按照实施例4色谱条件进行检测，进样量为10μL。硫酸羟氯喹的浓度与峰面积在0.05％～120％线性范围内呈现良好的线性关系，相关度系数满足不低于0.997。此处溶解溶媒为高氯酸：水：乙腈＝0.05:90:10(v/v/v)。
3.检测限考察
配制以0.2mg/mL为100％的0.01％的检测限浓度硫酸羟氯喹溶液，浓度为0.02μg/mL的检测限浓度供试品，按照实施例4的色谱条件进行检测，进样体积为10μL，分别配制3份，检测限信噪比大于3，表明该分析方法良好且重现性高。此处溶解溶媒为高氯酸：水：乙腈＝0.05:90:10(v/v/v)。
4.分析方法准确度考察
配制其中响应最低的杂质，配制其0.05％定量限浓度的杂质溶液(浓度为：0.0001mg/mL)，平行配制三份，加标样品的回收率平均值为101.3％，单份回收率最低为98.8％。说明该分析方法准确度结果良好且重现性也较高。此处溶解溶媒为高氯酸：水：乙腈＝0.05:90:10(v/v/v)。
对比例1
采用C18色谱柱，流动相为：0.1％磷酸-乙腈进行梯度洗脱。其余操作和测试条件同实施例4，结果如图5所示。
结果发现硫酸羟氯喹与实施例4中的杂质6无法分离。
对比例2
采用C18色谱柱，流动相为：磷酸二氢钾-乙腈进行梯度洗脱。其余操作和测试条件同实施例4，结果如图6所示。
结果发现硫酸羟氯喹与实施例4中的杂质6无法分离。
对比例3
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为：0.1％三氟乙酸-乙腈进行梯度洗脱。其余操作和测试条件同实施例4，结果如图7所示。
结果发现硫酸羟氯喹与实施例4中杂质6和9无法分离。
对比例4
采用YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um,12nm为色谱柱，流动相为0.1％磷酸-乙腈进行梯度洗脱。其余操作和测试条件同实施例4，结果如图8所示。
结果发现硫酸羟氯喹与-实施例4中的杂质6无法分离。

Claims (10)

1.一种硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，其步骤包括：将被试物溶于含高氯酸的溶液中，进行HPLC检测，即可；
其色谱条件为：
流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为高氯酸溶液；所述流动相B为乙腈；
色谱柱为苯基柱。
2.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述含高氯酸的溶液为含高氯酸和乙腈的水溶液；其中，高氯酸：乙腈：水的体积比较佳地为0.05:(10～30)：(70～90)，例如为0.05:10:90、0.05:20:80或0.05:30:70。
3.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述HPLC检测时，所述被试物在溶解后，得到的溶液的浓度为0.00002～0.5mg/mL，较佳地为0.0001～0.24mg/mL，例如为0.2mg/mL。
4.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述流动相A为体积分数为0.1％～0.3％的高氯酸溶液，较佳地为体积分数为0.1％的高氯酸溶液。
5.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述色谱柱为苯丁基键合色谱柱；
和/或，所述色谱柱的长度为150mm～250mm；
和/或，所述色谱柱的内径为4.6mm；
和/或，所述色谱柱的填料的颗粒的粒径为3μm～5μm；
和/或，所述色谱柱的微孔孔径为12nm；
和/或，所述色谱柱的型号为YMC-Triart Phenyl 150*4.6mm ID S-3um，12nm。
6.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min；
和/或，所述HPLC检测中，检测波长为220nm～300nm；
和/或，所述HPLC检测中，柱温为20～30℃；
和/或，所述HPLC检测中，进样体积为5～20μL；
和/或，所述HPLC检测中，洗脱方式为梯度洗脱。
7.如权利要求6所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，以所述流动相的总体积为100％计；在0min时，所述流动相A的体积分数为50％～88％，较佳地为88％。
8.如权利要求7所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，以所述流动相A的总体积为100％计；在0min时，所述流动相A的体积分数为88％；在0～6min时，所述流动相A的体积分数为88％；在6～26min时，所述流动相A的体积分数递减至80％；在26～31min时，所述流动相A的体积分数递减至65％；在31～36min时，所述流动相A的体积分数为65％；在36～37min时，所述流动相A的体积分数递减至50％，在37～40min时，所述流动相A的体积分数为50％；在40～40.1min时，所述流动相A的体积分数递增至88％；在40.1～45min时，所述流动相A的体积分数为88％。
9.如权利要求1所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于，将被试物溶于含高氯酸的溶液后，进行离心和/或过滤；
较佳地，所述离心的时间为5～10min；
较佳地，所述离心的转速为5000～8000转/min；
较佳地，采用微孔滤膜进行过滤，其中，所述微孔滤膜的材质较佳地为尼龙Nylon、聚四氟乙烯PTFE或聚偏二氟乙烯PVDF。
10.一种如权利要求1-9任一项中所述的硫酸羟氯喹及其有关物质的HPLC分析方法的应用，其特征在于，其用于原料药和相关制剂产品的分析。
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