CN104777248B - 用于饮料中总皂苷含量检测的提纯及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法和对应的检测方法，采用固相萃取小柱提纯饮料样品中的总皂苷，并采用内标法和比色法相结合的方法进行检测。对于含酒精饮料，本发明先将酒精浓度稀释至一定范围以下再提纯。本发明所述的饮料中总皂苷的提纯方法具有操作步骤简单，且过程中损失量少的优点；将其用于饮料中总皂苷含量的检测可提高该检测方法的灵敏度，使该检测方法的适用范围更广；进一步地，在该检测方法中加入内标可将损失也计算在内，从而提高了检测方法的精确度。

Description

用于饮料中总皂苷含量检测的提纯及检测方法

技术领域

本发明属于深加工技术领域，具体涉及用于饮料(包括含酒精饮料)类食品中的总皂苷含量检测的提纯方法及其检测方法。

背景技术

皂苷是一类由甾体或是三萜类化合物作为苷元与糖分子缩合而成的低聚糖苷，在自然界分布很广，是很多中草药中的主要活性成分。在保健食品、保健中药和药食两用的食材中，总皂苷被认为是以多味中药为主原料的保健品中的主要功效成分，具有保护心血管、提高记忆力、抗疲劳、改善机体免疫力、抗菌等有价值的生物活性。因此对酒类食品基质中总皂苷含量的质量控制有重要意义。

关于总皂苷的纯化和测定方法有很多研究报道。采用大孔吸附树脂法，是目前提取分离纯化总皂苷的普遍方法。徐媛等人采用Amberlite XAD-2大孔树脂纯化保健酒样品，以期去除一定的杂质，提高酒类样品中总皂苷的含量(徐媛等，保健酒中总皂苷含量测定方法研究，药物研究，2014，30)。同样江长源等人也使用XAD-2大孔树脂对传统保健酒中的总皂苷进行纯化(江长源等人，传统保健酒中功效成分的检测和稳定性研究，酿酒科技，2008，3(165)：78-80)。利用传统的溶剂萃取也是提纯总皂苷的常用方法。任小虎等人采用无水乙醇和正丁醇反复沉淀，对保健酒类样品中的总皂苷进行提取分离(任小虎等，保健酒中人参皂苷含量的测定，酿酒，2012，39(3)，65-67)；李兆明等人采用正丁醇结合超声波提取，反复沉淀提纯保健酒中人参总皂苷，通过比色法测定含量(李兆明等，比色法测定保健酒中人参总皂苷含量，吉林中医药，2009，29(5)：425-426)。传统采用大孔树脂纯化样品后，直接使用比色法测定总皂苷含量。不同的前处理方法对保健食品中总皂苷含量的测定有明显的影响。选用不同的大孔树脂处理，结合比色法测定含量，对不同前处理对总皂苷的回收率进行比较，得出，D-101和D-941联用对总皂苷的纯化效果最好(彭维等，不同前处理方法对保健食品中总皂苷含量测定的影响，食品研究与开发，2014，35(8)：90-93)。固相萃取小柱处理也是一种常用的纯化富集总皂苷的方法。茅向军等人采用不同填料(Waters Oasis HLB柱，ODS小柱，Strata小柱)的固相萃取小柱，对血浆中人参皂苷Re进行纯化处理，结果表明Warers OasisHLB柱有较好的处理效果(茅向军等，不同填料的固相小柱对人参皂苷Re血浆样品萃取回收率的研究，中国重要杂志，2005，30(19)：1516-1518)。

目前常规的饮料中总皂苷含量的检测方法采用大孔树脂纯化法结合比色法，但是对于含酒精饮料，由于酒精的存在会在很大程度上造成皂苷的流失，从而影响含量的测定结果，因此在样品纯化前通常要先经过一步挥干步骤以除去酒精，但是挥干步骤不仅会增加皂苷的损失而且会使纯化检测变得复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法，所述方法操作简单，过程中总皂苷的损失少。

本发明的用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法包括以下步骤：

1)样品预处理：向饮料中加入其0-5倍体积的蒸馏水，混匀；

2)固相萃取小柱预处理：固相萃取小柱先用2-4BV的有机溶剂活化，再用2-4BV的蒸馏水洗涤；

3)样品纯化：将一定量的样品溶液缓慢加入已预处理的固相萃取小柱，先用2-3BV的蒸馏水洗涤，然后用一定量的有机溶剂洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液直接用于总皂苷含量的检测。

进一步地，步骤1)中加入蒸馏水的量根据饮料中的酒精含量而定，以使稀释后的样品中的酒精度数在25度以内，更佳为在20度以内。

优选地，步骤1)中所述饮料为含酒精饮料。

优选地，步骤2)中固相萃取小柱为反相C18柱或HLB柱。

优选地，步骤2)和3)中所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

本发明人在研究中意外地发现在提纯含酒精饮料时，如果将饮料中的酒精浓度控制在一定的范围内，则饮料中原有的酒精就不会造成较大的皂苷流失影响，因此本发明的方法在提纯含酒精饮料之前将饮料进行稀释处理。

进一步地，将本发明的提纯方法应用于饮料中总皂苷含量的检测，所述检测采用常规的比色法检测样品中总皂苷的含量，为了提高检测方法的精确度，可在样品溶液中加入内标后再进行步骤3)的固相萃取操作，并在固相萃取之后增加内标得率的测定步骤：

将步骤3)得到的洗脱液采用高效液相色谱法测定内标峰面积，同样条件测定未经过固相萃取小柱处理的内标峰面积，利用面积比计算内标得率；

最后在常规比色法总皂苷含量的计算中将这个内标得率也计算在内(除以内标得率)，即得出最终的样品总皂苷含量值。

优选地，所述内标为三七皂苷R1。

优选地，内标得率的测定步骤中所述高效液相色谱法的检测程序为：流动相A相：纯水，B相：乙腈；梯度洗脱条件(v/v)：0-20min，15-40％B相，流速1mL/min；C18色谱柱；柱温20-40℃；DAD检测器；检测波长为203nm。

优选地，内标得率的测定步骤中样品溶液和内标溶液上高效液相色谱前先经过0.45μm滤膜过滤。

优选地，上述比色法检测总皂苷的步骤为：

A)显色反应：分别吸取200μL经上述提纯步骤得到的洗脱液和不同浓度的标准品溶液至不同的具塞试管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2mL的5％香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热15min，取出后迅速冰浴冷却5min，加入5mL冰乙酸稀释，混匀，静置2min；以不加样品或标准品的溶液为空白对照；

B)吸光度值测定：在400-700nm处扫描，确定最大吸收波长，在最大吸收波长下测定吸光度值；

C)样品总皂苷含量计算：根据步骤B)得到的吸光度值制作浓度-吸光度值回归曲线方程，利用标准曲线方程计算样品总皂苷含量。

优选地，步骤A)中所述标准品为人参皂苷Re。

本发明所述的饮料中总皂苷的提纯方法消除了饮料中的酒精对皂苷提纯得率的影响，具有操作步骤简单，且过程中损失量少的优点；采用固相萃取小柱进一步提高了总皂苷的得率。将该提纯方法用于饮料中总皂苷含量的检测可提高该检测方法的灵敏度，使该检测方法的适用范围更广；进一步，在该检测方法中加入内标可将损失也计算在内，从而提高检测方法的精确度；采用制作标准曲线的方法计算总皂苷含量也比常规标准方法中的比例法更精确，误差较小。

附图说明

图1显示的是实施例和对比例中测得的总皂苷含量的对比结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1)样品预处理：取33度保健酒，加入1倍体积的蒸馏水，充分混匀，得到酒精度为16.5度的样品溶液；

2)反相C18小柱预处理：先用3BV的甲醇冲洗活化柱子，再用3BV的蒸馏水冲洗，备用；

3)样品纯化：将2mL稀释后的样品溶液(含有100μL三七皂苷R1内标)加入已处理好的反相C18柱，先用4mL蒸馏水冲洗，再用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液；

4)高效液相色谱检测：将步骤3)中得到的样品以及未经固相萃取处理的三七皂苷R1配制成的相同浓度的溶液，等体积以同样的条件采用高效液相色谱法测定内标峰面积，具体步骤为：过0.45μm滤膜，使用程序1检测，记录峰面积；所述程序1中的流动相分别为A相：纯水，B相：乙腈，色谱纯；采用的梯度洗脱条件(v/v)：0-20min，15-40％B相；流速1mL/min，采用常规的C18色谱柱(250×4.6mm i.d.，5μm)；柱温20-40℃；DAD检测器；检测波长为203nm。得到峰面积，按照浓度-峰面积比，计算三七皂苷R1的得率为97.53％。

5)显色反应：分别吸取步骤3)中得到的洗脱液和不同浓度的标准溶液(人参皂苷Re)200μL至不同的具塞试管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2mL的5％香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热15min，取出后迅速冰浴冷却5min，加入5mL冰乙酸稀释，混匀，静置2min；以不加样品溶液为空白对照。

6)吸光度值测定：在400-700nm处扫描，确定最大吸收波长为545nm；在545nm测定步骤5)之后得到的样品溶液和不同浓度的标准品溶液(人参皂苷Re)的吸光度值；

7)总皂苷含量计算：根据步骤6)测定的不同浓度的人参皂苷Re的吸光度值，浓度-吸光度值回归得到标准曲线方程，根据标准曲线方程和步骤4)中得到的内标的得率计算样品中总皂苷含量，本实施例对样品进行了三次平行测定，其结果为32.8±1.9mg/100mL。

实施例2

1)样品预处理：取40度保健酒，加入2倍体积的蒸馏水，充分混匀，得到20度的样品溶液；

2)HLB小柱预处理：先用3BV的乙醇冲洗活化柱子，再用3BV的蒸馏水冲洗，备用；

3)样品纯化：将2mL稀释后的样品溶液(含有100μL三七皂苷R1内标)加入已处理好的HLB柱，先用4mL蒸馏水冲洗，再用2mL乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；

4)高效液相色谱检测：将步骤3)中得到的样品以及未经固相萃取处理的三七皂苷R1配制成的相同浓度的溶液，等体积以同样的条件采用高效液相色谱法测定内标峰面积，具体步骤为：过0.45μm滤膜，使用程序1检测，记录峰面积；所述程序1中的流动相分别为A相：纯水，B相：乙腈，色谱纯；采用的梯度洗脱条件(v/v)：0-20min，15-40％B相；流速1mL/min，采用常规的C18色谱柱(250×4.6mm i.d.，5μm)；柱温20-40℃；DAD检测器；检测波长为203nm。得到峰面积，按照浓度-峰面积比，计算三七皂苷R1的得率为96.76％。

5)显色反应：分别吸取步骤3)中得到的洗脱液和不同浓度的标准溶液(人参皂苷Re)200μL至不同的具塞试管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2mL的5％香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热15min，取出后迅速冰浴冷却5min，加入5mL冰乙酸稀释，混匀，静置2min；以不加样品溶液为空白对照。

6)吸光度值测定：在400-700nm处扫描，确定最大吸收波长为545nm；在545nm，测定步骤5)之后得到的样品溶液和不同浓度的标品溶液(人参皂苷Re)的吸光度值；

7)总皂苷含量计算：根据步骤6)测定的不同浓度的人参皂苷Re的吸光度值，浓度-吸光度值回归得到标准曲线方程，根据标准曲线方程和步骤4)中得到的内标的得率计算样品中总皂苷含量，本实施例对样品进行了三次平行测定，其结果为30.2±0.8mg/100mL。

对比例

1)样品预处理：33度酒类样品，吸取1mL于试管中在水浴中挥干，再用少量水溶解，此溶解液做柱层析用；

2)柱层析：选用10mL注射器作层析管，装入2cm，Amberlite XAD-2大孔树脂，再加入1cm中性氧化铝。先用25mL，70％乙醇冲洗柱子，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液；精确加入1mL已经过1)处理的样品溶液，用25mL水洗柱，弃去洗脱液，再用25mL，70％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，备用。

3)显色反应：取2)中已经挥干的样品，准确加入0.2mL，5％香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热10min，取出后迅速冰浴冷却5min，加入5mL冰乙酸稀释，混匀，静置2min；以不加样品溶液为空白对照。

4)吸光度值测定：在400-700nm处扫描，确定最大吸收波长为545nm；在545nm测定步骤3)之后得到的样品溶液的吸光度值，记为A1；

5)标准品测定：吸取人参皂苷Re(2.0mg/mL)标准溶液100μL于蒸发皿中，放在低于60℃的水浴中挥干，按照步骤2)柱层析，按照3)显色反应，按照步骤4)测定吸光度值，记为A2；

6)总皂苷含量计算：

X＝A1/A2×C×V×100

式中：

X：样品中总皂苷含量(以人参皂苷Re计)，mg/100mL；

A1：样品溶液的吸光度值；

A2：标准品溶液的吸光度值；

C：标准品人参皂苷Re的量，mg/mL；

V：样品稀释倍数；

按照上式计算，样品中总皂苷含量为17.3±7.9mg/100mL。

上述实施例和对比例的结果如图1所示，实施例1和2中采用固相萃取小柱纯化，结合高效液相色谱和比色法，测得样品中总皂苷的含量分别为32.8和30.2mg/100mL，标准误差分别为1.9和0.8。对比例中采用《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)总皂苷含量测定的标准方法：液体样品蒸干(除去酒精)后，再溶解经大孔树脂进行纯化，最后用比色法测定总皂苷的含量。其结果为17.3mg±7.9mg/100mL，平行样标准误差大。由此可见，由本发明的纯化方法可以提高总皂苷的得率，检测方法的准确度和精确度均有提高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品预处理：向饮料中加入其0-5倍体积的蒸馏水，混匀；

2)固相萃取小柱预处理：固相萃取小柱先用2-4BV的有机溶剂活化，再用2-4BV的蒸馏水洗涤；

3)样品纯化：将一定量的样品溶液缓慢加入已预处理的固相萃取小柱，先用2-3BV的蒸馏水洗涤，然后用一定量的有机溶剂洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液直接用于总皂苷含量的检测；

其中，步骤1)中加入蒸馏水的量根据饮料中的酒精含量而定，以使稀释后的样品中的酒精度数在25度以内。

2.如权利要求1所述的用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法，其特征在于，步骤1)中所述饮料为含酒精饮料。

3.如权利要求1所述的用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法，其特征在于，步骤2)中所述固相萃取小柱为反相C18柱或HLB柱。

4.如权利要求1所述的用于饮料中总皂苷含量检测的提纯方法，其特征在于，步骤2)和3)中所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

5.一种包括权利要求1所述的提纯方法的饮料中总皂苷含量的检测方法，其特征在于，采用常规的比色法检测样品中总皂苷的含量，并在步骤3)之前的样品溶液中加入内标，在步骤3)的固相萃取之后增加内标得率的测定步骤：

将步骤3)得到的洗脱液采用高效液相色谱法测定内标峰面积，同样条件测定未经过固相萃取小柱处理的内标峰面积，利用面积比计算内标得率；

最后在常规比色法总皂苷含量的计算中将这个内标得率也计算在内(除以内标得率)，即得出最终的样品总皂苷含量值。

6.如权利要求5所述的饮料中总皂苷含量的检测方法，其特征在于，所述内标为三七皂苷R1。

7.如权利要求5所述的饮料中总皂苷含量的检测方法，其特征在于，内标得率的测定步骤中所述高效液相色谱法的检测程序为：流动相A相：纯水，B相：乙腈；梯度洗脱条件(v/v)：0-20min，15-40％B相，流速1mL/min；C18色谱柱；柱温20-40℃；DAD检测器；检测波长为203nm。

8.如权利要求5所述的饮料中总皂苷含量的检测方法，其特征在于，所述常规比色法检测总皂苷的步骤为：

A)显色反应：分别吸取200μL经上述提纯步骤得到的洗脱液和不同浓度的标准品溶液至不同的具塞试管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2mL的5％香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热15min，取出后迅速冰浴冷却5min，加入5mL冰乙酸稀释，混匀，静置2min；以不加样品或标准品的溶液为空白对照；

B)吸光度值测定：在400-700nm处扫描，确定最大吸收波长，在最大吸收波长下测定吸光度值；

C)样品总皂苷含量计算：根据步骤B)得到的吸光度值制作浓度-吸光度值回归曲线方程，利用标准曲线方程计算样品总皂苷含量。

9.如权利要求8所述的饮料中总皂苷含量的检测方法，其特征在于，步骤A)中所述标准品为人参皂苷Re。