CN103969383B - 一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，包括如下步骤：(1)样品的预处理：样品用体积比为2:1的2％甲酸溶液和乙腈作为溶剂涡旋振荡、超声提取，提取液经离心处理及Waters Oasis MCX混合型固相萃取小柱净化后得到净化液；(2)将所述净化液上机测定，采用液相色谱‑质谱/质谱的方法对目标物质进行定性及定量分析。本发明化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法准确、稳定性好、可靠且灵敏度高。

Description

一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法
技术领域
本发明涉及一种抗生素的测定方法，特别是涉及一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法。
背景技术
氟喹诺酮类抗生素，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮母核的抗菌药物，属于抗生素中的一大类。自1962年美国发现第一种氟喹诺酮药物萘啶酸(抗菌谱窄，已弃之不用)以来，发展历程大致可分为四个阶段，至今数以万计的氟喹诺酮类衍生物已被合成。由于其抗菌谱广、给药方便、活性强且价格低廉等特点而被广泛用于治疗各种感染性疾病。在祛痘化妆品中添加该类药物，可明显改善祛痘效果，但其对中枢神经系统及胃肠道可造成不良反应，而且痤疮内的细菌一旦对其产生耐药性，会造成严重后果。我国化妆品卫生规范及欧盟化妆品法规(EC1223/2009)等均规定，在化妆品中禁止添加氟喹诺酮类抗菌药物。因此，建立化妆品中该类抗生素的分析检测方法显得尤为必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种准确、稳定性好、可靠且灵敏度高的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法。
一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，包括如下步骤：
(1)样品的预处理：样品用体积比为2:1的2％甲酸溶液和乙腈作为溶剂涡旋振荡、超声提取，提取液经离心处理及Waters Oasis MCX混合型固相萃取小柱净化后得到净化液；
(2)将所述净化液上机测定，采用液相色谱-质谱/质谱的方法对目标物质进行定性及定量分析；
其中液相色谱条件为：采用Waters XBridge C18，3.5μm，2.1mm×150mm的色谱柱分离，以0.1％甲酸水溶液和含0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：35℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；
质谱条件为：电离方式：ESI+；毛细管电压：3.00kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：800L/hr；锥孔气流速：50L/hr；离子源温度：150℃；萃取电压：3.00V；射频透镜电压：0.10V；碰撞气体：氩气；数据采集模式：多反应监测。
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中所述方法能对化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素进行测定，所述16种氟喹诺酮类抗生素为：麻保沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、帕珠沙星、双氟沙星、沙拉沙星、加替沙星、司帕沙星和莫西沙星。
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中步骤(2)中流动相采用如表1所示的梯度洗脱程序，其中A为含0.1％甲酸的甲醇溶液，B为0.1％甲酸水溶液。
表1液相色谱梯度洗脱程序
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中步骤(2)中16种氟喹诺酮类抗生素化合物的质谱相关参数见表2。
表216种氟喹诺酮类化合物的分子式及质谱采集参数
注：*为定量离子
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中所述Waters Oasis MCX混合型固相萃取小柱的规格为3mL，含60mg填料，使用前采用3mL甲醇活化和3mL水平衡。
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中步骤(1)具体包括如下步骤：
分别称取水剂、膏霜类化妆品试样各0.5g于两支25mL比色管中，分别加入体积比为2:1的2％甲酸水溶液和乙腈的混合溶液至10mL刻度，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取30min，取出，静置至室温，将上清液全部转移至聚丙烯离心管中，在离心机上以5000r/min高速离心10min后，取2mL上清液至10mL氮吹管中，氮吹至近干，加入2mL0.1％甲酸水溶液重新溶解残渣形成复溶液，所述复溶液过预先用3mL甲醇活化和3mL水平衡的Waters Oasis MCX，3cc，60mg混合型固相萃取小柱；
先依次加入3mL2％甲酸水溶液和3mL甲醇分别淋洗，弃去淋洗液，再先后两次用1mL体积比为20：80的氨水和甲醇的混合溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱流速控制在1～2mL/min，合并两次所得洗脱液至同一10mL氮吹管中，将合并后的洗脱液氮吹至近干，残渣用1mL的体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液复溶，复溶后的溶液过0.22μm微孔滤膜后得到净化液，所述净化液供上机测定。
本发明所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其中所述方法还包括标准溶液的配制，包括如下步骤：
准确称取16种氟喹诺酮类抗生素标准品各25mg，精确至0.0001g，分别置于50mL容量瓶中，麻保沙星、双氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星、沙拉沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星、单诺沙星及氟罗沙星均用含1％甲酸的40％乙腈水溶液溶解，洛美沙星及司帕沙星用甲醇溶解，帕珠沙星用体积比为90：10的甲醇-氨水混合溶液溶解，分别用对应溶液溶解并定容至50mL刻度，分别得到浓度为500μg/mL的16种氟喹诺酮标准储备溶液；分别量取各标准储备溶液1mL置于同一50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，得到每种氟喹诺酮类抗生素的质量浓度均为10μg/mL的混合标准储备溶液，然后用体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液将其稀释成浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的系列混合标准工作溶液。
本发明化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法与现有技术不同之处在于：本发明化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法选取氟喹诺酮类抗生素各发展阶段中的典型代表药物(包括第二、三及四代分别1、13和2种)(图1括号内数字即表示该药物的代属)，建立了同时测定化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的液相色谱-质谱/质谱分析方法，经样品提取技术及净化方法的设计与优化，可有效消除基质效应；液相色谱分离与串联质谱检测条件的优化大大提高了氟喹诺酮抗生素的检出限及定量限，实验结果表明，该方法准确、稳定性好、可靠且灵敏度高，能够为化妆品中该类抗生素的风险监测提供技术保证及弥补监督管理上的空白。
本发明化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法中Waters XBridge C18色谱柱采用先进的键合技术与封端技术，从而对低pH条件具有良好的配体稳定性与色谱重现性，16种氟喹诺酮类物质的离子化方式均为ESI+模式，因此，在流动相中加入适宜浓度的甲酸可以有效改善峰形且能提高化合物的离子化效率，从而提高各组分的信号响应强度；流速经优化，选择0.2mL/min作为分析时的流速，此时，各化合物保留时间合理，离子化效率高，符合各目标物质分析测定时的要求。化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的定量限在0.1～0.4mg/kg之间，水剂基质样品中，16种氟喹诺酮类抗生素的回收率范围在80.3％～105.9％之间，相对标准偏差为1.2％～8.0％；膏霜基质样品中，各物质的回收率在80.6％～113.2％之间，相对标准偏差在1.6％～7.8％之间；方法标准曲线线性良好，检出限及定量限低，精密度及稳定性好，并且通过样品的净化，基质效应大大降低，抗干扰能力更强，更适用于背景干扰严重的实际样品分析。因此，本研究建立的化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的测定方法可以用于化妆品的实际检验工作，并且能够为我国化妆品的检验和日常生产的质量控制提供科学依据及技术支持。
下面结合附图对本发明的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中氟喹诺酮类抗生素的结构通式；
图2为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素的结构式，其中，各代号指代关系如下：1.麻保沙星 2.氟罗沙星 3.氧氟沙星 4.培氟沙星 5.依诺沙星 6.诺氟沙星 7.环丙沙星 8.恩诺沙星 9.单诺沙星 10.洛美沙星 11.帕珠沙星 12.双氟沙星 13.沙拉沙星 14.加替沙星 15.司帕沙星 16.莫西沙星；括号内数字即表示该药物的代属；
图3为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素的选择离子质量色谱图，序号及所代表物质与表2相同；
图4为本发明中司帕沙星及诺氟沙星氟喹诺酮类抗生素的质谱裂解规律；
图5为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素在3种不同色谱柱上的信号响应强度比较；
图6为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素在两种不同流动相体系下的信号响应强度比较；
图7为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素在不同色谱柱温度下的信号响应强度比较；
图8为本发明中不同提取溶剂对氟喹诺酮类抗生素提取回收率的实验结果(n＝3，图中选取6种)；
图9为本发明中不同提取时间下体积比为2:1的2％甲酸水溶液-乙腈混合溶液对目标物质的提取效果；
图10为本发明中16种氟喹诺酮类抗生素用Waters Oasis MCX(3mL，60mg)固相萃取柱依次以1、1、0.5及0.5mL洗脱溶剂洗脱时的回收率叠加图。
具体实施方式
实施例1
一、仪器、试剂与材料
ACQUITY液相色谱仪、XEVO TQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；电子天平(AB204-S，美国METTLER TOLEDO公司)；超纯水器(Milli-Q，美国Millipore公司)；高速冷冻离心机(CR21G，日本Hitachi公司)；MS2型涡旋振荡器(德国IKA公司)；固相萃取装置(美国SUPELCO公司)；色谱柱Waters XBridge C18(3.5μm，2.1mm×150mm，美国Waters公司)；混合型固相萃取小柱(Oasis MCX3mL/60mg，美国Waters公司)；超声波清洗器(KQ-600，江苏省昆山市超声仪器有限公司)；氮吹仪(N-EVAP112，美国Organomation公司)；通风柜(FC-150，大连莱博泰克实验室设备有限公司)；微孔滤膜(0.22μm，有机系，美国Pall公司)。
麻保沙星(CAS号：11150-35-1，纯度97.5％)、盐酸洛美沙星(CAS号：98079-52-8，纯度99.0％)、盐酸双氟沙星(CAS号：91296-86-5，纯度97.5％)、司帕沙星(CAS号：111542-93-9，纯度99.0％)、诺氟沙星(CAS号：70458-96-7，纯度99.5％)、恩诺沙星(CAS号：93106-60-6，纯度98.0％)、盐酸莫西沙星(CAS号：151096-09-2，纯度96.1％)、盐酸沙拉沙星(CAS号：91296-87-6，纯度95.5％)、盐酸环丙沙星(CAS号：86393-32-0，纯度95.0％)及甲磺酸单诺沙星(CAS号：119478-55-6，纯度94.0％)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；培氟沙星(CAS号：70458-92-3，纯度71.0％)、依诺沙星(CAS号：74011-58-8，纯度91.1％)、加替沙星(CAS号：112811-59-3，纯度97.2％)、氧氟沙星(CAS号：82419-36-1，纯度98.8％)及氟罗沙星(CAS号：79660-72-3，纯度99.2％)购自中国食品药品检定研究院；帕珠沙星(CAS号：127045-41-4，纯度99.9％)购自德国Fluka公司。16种氟喹诺酮类抗生素的共同特点是在喹啉环(少数为萘啶环)的C6位上有氟原子，C7位上连接哌嗪基或吡咯基(如图1所示)，R1一般为哌嗪衍生物，R2为烃基，X通常为C或N。16种氟喹诺酮类化合物的化学结构式见图2。
甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯试剂(美国Fisher公司)；磷酸为分析纯试剂(北京化工厂，含量≥85.0％)。
水均为实验室一级水。
40％乙腈水溶液(含1％甲酸)的配制：取20mL水置于100mL容量瓶中，然后加入40mL乙腈及1mL甲酸，然后用水定容至刻度，摇匀，即得。
体积比为90:10的甲醇-氨水溶液的配制：取10mL氨水溶液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
体积比为20:80的氨水-甲醇溶液的配制：向100mL容量瓶中加入适量甲醇，然后加入20mL氨水，用甲醇定容至刻度，摇匀。即得。
2％甲酸水溶液的配制：向100mL容量瓶中加入适量水，然后加入2mL甲酸，用水定容至刻度，摇匀，即得。
体积比为2:1的2％甲酸溶液-乙腈混合溶液的配制：向250mL容量瓶中加入适量水，然后加入5mL甲酸，用水定容至刻度，摇匀即得2％甲酸水溶液。将上述溶液全部转移至500mL容量瓶，然后加入125mL乙腈，混合，摇匀，即得。
二、样品处理
分别称取水剂、膏霜类化妆品试样各0.5g于25mL比色管中，两个比色管做平行试验，分别加入体积比为2:1的2％甲酸水溶液和乙腈的混合溶液至10mL刻度，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取30min，取出，静置至室温，将上清液全部转移至聚丙烯离心管中，在离心机上以5000r/min高速离心10min后，取2mL上清液至10mL氮吹管中，氮吹至近干，加入2mL0.1％甲酸水溶液重新溶解残渣形成复溶液，所述复溶液过预先用3mL甲醇活化和3mL水平衡的Waters Oasis MCX，3cc，60mg混合型固相萃取小柱。
先依次加入3mL2％甲酸水溶液和3mL甲醇分别淋洗，弃去淋洗液，再先后两次用1mL体积比为20：80的氨水和甲醇的混合溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱流速控制在1～2mL/min，合并两次所得洗脱液至同一10mL氮吹管中，将合并后的洗脱液氮吹至近干，残渣用1mL的体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液复溶，复溶后的溶液过0.22μm微孔滤膜后得到净化液，所述净化液供上机测定。
三、色谱条件
色谱柱：Waters XBridge C18(3.5μm,2.1mm×150mm)
流动相：A：含0.1％甲酸的甲醇溶液；B：0.1％甲酸水溶液
柱温：35℃
流速：0.2mL/min
进样量：5μL
表1液相色谱梯度洗脱程序
四、质谱条件
电离方式：ESI+
毛细管电压：3.00kV
脱溶剂气温度：400℃
脱溶剂气流速：800L/hr
锥孔气流速：50L/hr
离子源温度：150℃
萃取电压：3.00V
射频透镜电压：0.10V
碰撞气体：氩气
数据采集模式：多反应监测
优化后的16种氟喹诺酮类抗生素化合物的质谱相关参数见表2，选择离子质量色谱图见图3。
表216种氟喹诺酮类化合物的分子式及质谱采集参数
注：*为定量离子
五、标准溶液的配制
准确称取16种氟喹诺酮类抗生素标准品各25mg，精确至0.0001g，分别置于50mL容量瓶中，麻保沙星、双氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星、沙拉沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星、单诺沙星及氟罗沙星均用含1％甲酸的40％乙腈水溶液溶解，洛美沙星及司帕沙星用甲醇溶解，帕珠沙星用体积比为90：10的甲醇-氨水混合溶液溶解，分别用对应溶液溶解并定容至50mL刻度，分别得到浓度为500μg/mL的16种氟喹诺酮标准储备溶液；分别量取各标准储备溶液1mL置于同一50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，得到每种氟喹诺酮类抗生素的质量浓度均为10μg/mL的混合标准储备溶液，然后用体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液将其稀释成浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的系列混合标准工作溶液。
本发明中各个条件的优化及选择：
1、氟喹诺酮类抗生素标准溶液的配制
实验中配制标准品溶液时，发现某些化合物在甲醇、乙腈等常见有机溶剂中难以溶解。由于氟喹诺酮类抗生素属于酸碱两性化合物，因此，在溶剂中加以适宜浓度的酸或碱促进其溶解性。如帕珠沙星用甲醇、乙腈等有机溶剂均难以溶解，在甲醇中加入10％体积的氨水即可完全溶解；诺氟沙星、麻保沙星、盐酸双氟沙星、恩诺沙星及盐酸莫西沙星等氟喹诺酮类化合物以40％乙腈-水(含1％甲酸)作溶剂，可完全被溶解并可延长标准品溶液的贮存时间。
2、质谱分析条件的优化
用体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液，即初始流动相稀释每种标准储备溶液浓度至1μg/mL，进行质谱采集参数的优化。用蠕动泵以10μL/min的流速连续注射，分别将16种氟喹诺酮类物质的标准溶液注入电喷雾离子源中。根据该类物质的化学电离性质，选择在ESI+离子化模式下进行一级质谱分析，得到准分子离子[M+H]+信息，然后对准分子离子给予碰撞能量，进行二级质谱分析，得到碎片离子信息。
氟喹诺酮化合物母核结构中均含羧基，在ESI+软电离模式下，该类化合物的二级质谱子离子碎片以中性丢失一分子水、CO2形成脱水峰[M+H-H2O]+、脱羧峰[M+H-CO2]+以及脱羧后哌嗪环发生结构重排丢失CHR的碎片峰[M+H-CO2-CHR]+为主，选择合理丢失、丰度较大且干扰较小的两个碎片离子作为辅助定性离子，以其中丰度较大者作为定量离子。关于16种氟喹诺酮化合物的典型质谱碎片以司帕沙星及诺氟沙星为例，它们分别以失去一分子CO2和-C3H7N及H2O和CO2为主要离子碎片(图4)。关于氟喹诺酮化合物其它质谱分析参数的优化结果见表2。
3、色谱分离条件的优化
(1)色谱柱
本研究中主要针对XBridge C18、XSelect CSH C18、XBridge Phenyl(规格均为3.5μm I.D.，2.1mm×150mm，)三种通用型的反相色谱柱进行了考察，结果见图5。XBridge C18色谱柱采用先进的键合技术与封端技术，从而对低pH条件具有良好的配体稳定性与色谱重现性，从图中可明显看出每种化合物均在XBridge C18色谱柱上信号响应强度最高，且峰形对称性良好。因此，选择XBridge C18色谱柱作为进样分析检测时的色谱柱。
(2)流动相
16种氟喹诺酮类物质的离子化方式均为ESI+模式，因此，在液相色谱流动相中加入适宜浓度的甲酸可以有效改善峰形且能提高化合物的离子化效率，从而提高各组分的信号响应强度。本研究考察了含0.1％甲酸的甲醇溶液-0.1％甲酸水溶液及含0.1％甲酸的乙腈溶液-0.1％甲酸水溶液两种常见流动相体系对16种化合物信号响应强度的影响，记录各化合物定量离子的峰面积，结果见图6。在两种流动相体系中，除沙拉沙星(14)的信号响应值后者较前者稍大外，其它各物质的信号响应值均为前者大于后者，而且，实验中发现使用前者作为流动相时的色谱峰形要明显优于后者。因此，本实验选择含0.1％甲酸的甲醇溶液-0.1％甲酸水溶液体系作为氟喹诺酮类抗生素分离洗脱时的流动相体系。
(3)色谱柱温度
实验中考察了色谱柱温度为30℃、35℃、40℃、45℃和50℃时对16种氟喹诺酮类抗生素化合物信号响应强度的影响，结果见图7。这说明各物质随温度的变化并不呈现一致趋势，但总体看来，大多数化合物的响应强度在35℃柱温时，要高于其他温度下的响应值，而且45℃与50℃这种相对较高的温度作为色谱柱温度，长时间分析会降低色谱柱的柱效，缩短色谱柱的寿命。因此，综合考虑，选择35℃作为样品分析检测时的色谱柱温度。
(4)流速
流速经优化，选择0.2mL/min作为分析时的流速，此时，各化合物保留时间合理，离子化效率高，符合各目标物质分析测定时的要求。
4、提取方法的优化
(1)提取溶剂的选择
根据16种氟喹诺酮类物质的分子疏水常数(log Kow)及酸度系数(pKa)可知，该类物质属于中等极性物质或非极性化合物，且在酸性溶剂条件下溶解度较好。而且，依据已有文献，喹诺酮类化合物在多在乙腈环境条件下提取效果较好。因此，本研究考察了室温环境中2％甲酸水溶液与乙腈在不同体积配比条件(1:1、1:2、1:3、1:4、3:2及2:1)下对16种氟喹诺酮类抗生素进行超声提取的效果，结果见图10。实验结果表明，2％甲酸水溶液-乙腈(体积比为2:1)提取效果最佳，各物质回收率也较高。且该方法简便，易操作。
(2)提取时间的优化
为考察提取溶剂在不同时间下对目标物质的提取效率，本实验设计了六个时间点，分别为10min、20min、30min、40min、50min及60min，考察2％水甲酸溶液-乙腈(体积比为2:1)在不同时间点下对目标物质的提取效果，结果见图9。从图9中可明显看出，随提取时间的延长，不同物质的提取效果呈不同趋势，但总体在30min时，各物质的定量离子的信号相应强度最大，说明此时绝大部分目标物质已被提取，因此，选择30min作为提取溶剂进行超声提取时的时间。
5、净化技术的优化
(1)固相萃取柱的选择
氟喹诺酮类化合物分子结构式中包含一个羧基和一个哌嗪基团(帕珠沙星分子结构中喹诺酮骨架7位引入1-氨基环丙基取代哌嗪基，而莫西沙星7位则为S,S-2,8-重氮-二环[4.3.0]壬基)，pKa约5.5～6.6，为两性化合物。因此，本研究比较了常用的反相固相萃取小柱WatersOasis HLB SPE柱及混合型的阳离子固相萃取小柱Oasis MCX SPE(3mL，60mg及6mL，150mg)柱。HLB柱填料的主要成分是二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物,与普通的以硅胶为基质的C18反相固相萃取小柱相比,其保留能力强,操作性能也较稳定，能基本保留氟喹诺酮化合物，但在洗涤杂质阶段，少量极性较强的化合物会被淋洗出，从而造成回收率下降。Waters Oasis MCX混合型固相萃取柱是最有效的净化柱，其结合了反相柱和离子交换柱的保留机制，能吸附全部氟喹诺酮类化合物，而且在甲醇洗涤化妆品中的基质时，目标化合物也会牢牢结合在填料上，不会被清洗下来，可达到有效去除基质的目的，但3mL，60mg及6mL，150mg两种规格的固相萃取柱，后者较前者洗脱体积大，考虑到后续处理氮吹步骤的方便性，因此，本研究选择Oasis MCX(3mL，60mg)柱作为净化柱。
(2)洗脱溶剂的选择
为选择合适的溶剂洗脱全部目标物质，不同体积比的氨水-甲醇(5:95、10:90、20:80、30:70、40:60)作为洗脱溶剂进行洗脱(流速控制在1～2mL/min)，氨水的作用为中和目标物质，因此，氨水浓度较低时，中和目标物质需较大体积的洗脱溶剂；而当氨水浓度过高时，目标物质被中和后需甲醇洗脱，由于甲醇浓度较低，洗脱体积也较大，而且氨水浓度较大，水含量相应也较高，不便于后续氮吹等处理步骤。因此，综合实验结果，本实验选择氨水-甲醇(体积比为20:80)作为洗脱溶剂。
(3)洗脱体积的优化
为使用尽可能较小体积的洗脱溶剂洗脱全部目标化合物，1mL、1mL、0.5mL及0.5mL氨水-甲醇(体积比为20:80)依次分别进行上柱进行洗脱(流速控制在1～2mL/min)，单独收集各次洗脱液，进行回收率计算(图10)。由图可看出，在经第1mL洗脱溶剂洗脱后，全部目标物质的绝大部分(大于93％)被洗脱下来，第2mL洗脱后，所有物质的99％以上被洗脱。因此，本实验选择2mL氨水-甲醇(体积比为20:80)(分两步，各1mL)进行洗脱。
6、方法学验证
(1)基质效应的评价与消除
基质是指样品中除被分析物以外的组分，在分析过程中由于共洗脱常对目标物的分析存在显著的干扰作用，从而影响结果的精密度与准确度，这些结果及影响被称为基质效应。液相色谱-质谱/质谱联用技术中，待测组分与样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程中会产生竞争，其结果会显著降低(基质抑制效应)或提高(基质增强效应)目标离子的生成效率及离子强度。虽然串联质谱技术以特异性强著称，但越来越多的数据表明质谱检测同样需要注意避免基质效应，否则，将影响数据的准确性。
本研究采用比较不同基质标准曲线斜率的方法考察基质效应对方法定量能力的影响。分别用处理过的空白水剂和膏霜类样品配制浓度为5、10、50、100、250及500μg/L的系列标准溶液，以定量离子峰的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线，分别比较标准溶液曲线与空白水剂和膏霜类样品基质匹配标准曲线的斜率来考察基质效应，斜率比值R为1，表明样品中不存在基质效应。由表3可以看出，经合适的预处理后，水剂和膏霜类样品中均不存在明显的基质效应(R值为0.87～1.12)。
(2)精密度及稳定性
本研究中，将精密度实验分为日内精密度及日间精密度，前者由在0、2、4、8、12及24hr下依次进6针相同浓度的空白加标溶液测得，后者由连续3天进样分析相同浓度的空白加标溶液(每针两个平行)测得，计算每种物质的峰面积。以上实验结果均以相对标准偏差来表示。由表3可看出目标物质的日内精密度值在1.3％～9.4％之间，日间精密度在4.4％～10.6％之间，说明氟喹诺酮类化合物在室温条件下的稳定性良好(以上操作均在无光直接照射的条件下进行)。
本实验以空白加标样品，设置以下3种条件：a.在4℃冰箱下存放一周；b.室温下避光放置一个月来考察该类物质在化妆品中的稳定性。由表3可看出，在a，b两种条件下，氟喹诺酮类化合物稳定性的RSD值分别在3.7％～9.5％和7.7％～11.7％之间，说明该类化合物在以上两种环境下有着良好的稳定性。
表316种氟喹诺酮类物质的精密度、稳定性实验结果及基质效应
a在4℃冰箱下存放一周；
b室温下避光放置一个月；
c基质效应由基质匹配标准曲线斜率/溶液标准曲线算得
(3)线性关系、检出限及定量限
用体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液，即初始流动相将10μg/mL混合标准储备溶液依次稀释成系列浓度的混合标准工作溶液，在优化后的色谱质谱条件下进行测定，以各组分的定量离子峰面积(y)对浓度(x)绘制标准工作曲线，16种氟喹诺酮类化合物的线性方程、相关系数、检出限及定量限见表4。
表416种氟喹诺酮类抗生素的线性关系、检出限及定量限
(4)回收率及精密度
称取经测定不含16种氟喹诺酮类抗生素的空白化妆品，分别添加低、中、高三个不同浓度的标准混合溶液，按照本研究确定的实验方法进行测定，每种类型的样品每个浓度添加水平下平行测定6次，进行回收率实验，计算每个目标化合物的回收率及精密度值，结果见表5。
表5化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的添加回收率及精密度(n＝6)
本研究建立了同时测定化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的液相色谱-质谱/质谱分析方法。通过优化质谱及色谱分析参数，确定了目标物质的色谱分离及质谱分析条件；通过优化提取过程中的主要参数，确定了最佳提取溶剂及提取时间；样品净化步骤中，采用固相萃取方法进行，根据氟喹诺酮类化合物的性质，选择混合型阳离子交换小柱，然后为最大限度的洗去杂质及保留目标物质，优化了淋洗及洗脱溶剂的种类和用量，从而大大消除了样品中存在的基质效应。本方法标准曲线线性良好，检出限及定量限低，精密度及稳定性好，并且通过样品的净化，基质效应大大降低，抗干扰能力更强，更适用于背景干扰严重的实际样品分析。综上所述，本方法准确、稳定性好、可靠且灵敏度高，适用于化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素的检测分析，能够为化妆品中该类药物的风险监测提供技术保证及弥补监督管理上的空白。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)样品的预处理：样品用体积比为2:1的2％甲酸溶液和乙腈作为溶剂涡旋振荡、超声提取，提取液经离心处理及Waters Oasis MCX混合型固相萃取小柱净化后得到净化液；
(2)将所述净化液上机测定，采用液相色谱-质谱/质谱的方法对目标物质进行定性及定量分析；
其中液相色谱条件为：采用Waters XBridge C18，3.5μm，2.1mm×150mm的色谱柱分离，以0.1％甲酸水溶液和含0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：35℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；
质谱条件为：电离方式：ESI+；毛细管电压：3.00kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：800L/hr；锥孔气流速：50L/hr；离子源温度：150℃；萃取电压：3.00V；射频透镜电压：0.10V；碰撞气体：氩气；数据采集模式：多反应监测；
所述方法能对化妆品中16种氟喹诺酮类抗生素进行测定，所述16种氟喹诺酮类抗生素为：麻保沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、帕珠沙星、双氟沙星、沙拉沙星、加替沙星、司帕沙星和莫西沙星；
步骤(2)中流动相采用的梯度洗脱程序为：
其中，A为含0.1％甲酸的甲醇溶液，B为0.1％甲酸水溶液；
步骤(2)中16种氟喹诺酮类抗生素化合物的分子式及质谱采集参数为：
注：*为定量离子；
所述Waters Oasis MCX混合型固相萃取小柱的规格为3mL，含60mg填料，使用前采用3mL甲醇活化和3mL水平衡；
步骤(1)具体包括如下步骤：
分别称取水剂、膏霜类化妆品试样各0.5g于两支25mL比色管中，分别加入体积比为2:1的2％甲酸水溶液和乙腈的混合溶液至10mL刻度，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取30min，取出，静置至室温，将上清液全部转移至聚丙烯离心管中，在离心机上以5000r/min高速离心10min后，取2mL上清液至10mL氮吹管中，氮吹至近干，加入2mL 0.1％甲酸水溶液重新溶解残渣形成复溶液，所述复溶液过预先用3mL甲醇活化和3mL水平衡的Waters Oasis MCX，3cc，60mg混合型固相萃取小柱；
先依次加入3mL 2％甲酸水溶液和3mL甲醇分别淋洗，弃去淋洗液，再先后两次用1mL体积比为20：80的氨水和甲醇的混合溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱流速控制在1～2mL/min，合并两次所得洗脱液至同一10mL氮吹管中，将合并后的洗脱液氮吹至近干，残渣用1mL的体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液复溶，复溶后的溶液过0.22μm微孔滤膜后得到净化液，所述净化液供上机测定。
2.根据权利要求1所述的化妆品中氟喹诺酮类抗生素的测定方法，其特征在于：所述方法还包括标准溶液的配制，包括如下步骤：
准确称取16种氟喹诺酮类抗生素标准品各25mg，精确至0.0001g，分别置于50mL容量瓶中，麻保沙星、双氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星、沙拉沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星、单诺沙星及氟罗沙星均用含1％甲酸的40％乙腈水溶液溶解，洛美沙星及司帕沙星用甲醇溶解，帕珠沙星用体积比为90：10的甲醇-氨水混合溶液溶解，分别用对应溶液溶解并定容至50mL刻度，分别得到浓度为500μg/mL的16种氟喹诺酮标准储备溶液；分别量取各标准储备溶液1mL置于同一50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，得到每种氟喹诺酮类抗生素的质量浓度均为10μg/mL的混合标准储备溶液，然后用体积比为25:75的含0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液将其稀释成浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的系列混合标准工作溶液。
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