CN104181268B - 一种同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，包括如下步骤：(1)样品的前处理：包括样品提取、净化及浓缩；(2)将经过前处理的样品采用超高效液相色谱-质谱/质谱法进行分析测定，所述方法同时测定15种禁用雄激素，分别为：肾上腺甾酮、群勃龙、勃地酮、氟甲睾酮、氧甲氢龙、雄烯二酮、诺龙、去氢甲睾酮、睾酮、去氢表雄酮、氯司替勃、雄诺龙、美雄诺龙、醋酸氯睾酮和丙酸睾丸素。本发明所述同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法准确、快速、灵敏，本发明建立的方法可以为化妆品的检验工作和日常生产的质量控制提供有效的科学依据及技术支持。

Description

一种同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法

技术领域

本发明涉及一种，特别是涉及一种用于同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法。

背景技术

近年来，随着国民经济的高速发展和人们生活水平的不断提高，我国已成为世界化妆品消费大国，广大消费者的消费理念更加理性，不仅仅单纯追求化妆品品牌效应，而且更多关注化妆品自身的安全性。雄激素属类固醇类激素，可直接作用于皮肤，短期内可以促进皮肤恢复弹性，减少皱纹，治疗粉刺，促进毛发生长等，但如果长期使用将导致色素沉积，皮肤萎缩变薄等副作用。我国化妆品卫生标准、化妆品卫生规范、欧盟化妆品法规均明确规定，雄激素为化妆品组分中禁用物质。因此，为避免消费者在不知情的情况下接触使用违规添加雄激素的化妆品，造成健康安全危害，开展化妆品中禁用雄激素的检验对于提高化妆品产品质量，确保化妆品的使用安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确、快速、灵敏的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法。

一种同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，包括如下步骤：

(1)样品的前处理：包括样品提取、净化及浓缩；

(2)将经过前处理的样品采用超高效液相色谱-质谱/质谱法进行上机测定，其中，

色谱分离条件如下：

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)；

流动相：A：含0.1％甲酸的甲醇溶液，B：0.1％甲酸水溶液(体积分数)；采用梯度洗脱程序；

柱温：30℃；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL。

质谱分析条件如下：

离子化方式：ESI⁺；

毛细管电压：+3.5kV；

脱溶剂气温度：500℃；

脱溶剂气流速：1000L/h；

锥孔气体流速：50L/h；

离子源温度：150℃；

萃取电压：+3.00V；

射频透镜电压：+0.10V；

碰撞气体：氩气；

数据采集模式：多反应监测(MRM)。

所述方法同时测定15种禁用雄激素，分别为：肾上腺甾酮、群勃龙、勃地酮、氟甲睾酮、氧甲氢龙、雄烯二酮、诺龙、去氢甲睾酮、睾酮、去氢表雄酮、氯司替勃、雄诺龙、美雄诺龙、醋酸氯睾酮和丙酸睾丸素。

本发明所述的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其中所述梯度洗脱程序的设置如表1所示：其中，百分数是体积百分数；

表1梯度洗脱程序

本发明所述的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其中所述15种雄激素的质谱分析相关参数如表2所示：

表215种禁用雄激素的质谱分析参数

注：^*为定量离子

本发明所述的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其中样品的前处理具体包括如下步骤：

准确称取化妆品试样1.0g，精确至0.001g，于10mL比色管中，加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取20min，将提取液转移至离心管中，以10000r/min离心10min后，取上清液用于固相萃取，OasisHLB固相萃取柱依次用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，先用5mL50％甲醇水溶液淋洗，再用5mL含0.1％甲酸的乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液于带刻度氮吹管中，缓慢氮气流吹扫浓缩至近干，最后用1mL初始流动相，即体积比为60:40的0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液，溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜后供测定。

本发明同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法与现有技术不同之处在于：

本发明采用新的超高效液相色谱-质谱/质谱法同时测定化妆品中15种禁用雄激素，与现有技术中的仅检测极少数量的雄激素方法有较大区别，可以实现化妆品中禁用雄激素的系统、广谱、高灵敏、高通量的普查。如果要检测15种禁用雄激素，在保证检测到每一种雄激素的基础上，还要考虑如何设置各种参数使每个激素的检测效果达到最好，要考虑的问题更多，更复杂，这是现有技术不能解决的问题。本发明测定化妆品中15种禁用雄激素的方法准确、快速、灵敏，本发明建立的方法可以为化妆品的检验工作和日常生产的质量控制提供有效的科学依据及技术支持。

本发明同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法中，采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色谱柱对15种禁用雄激素的信号响应强度高，分离度好；15种禁用雄激素在流动相体系中的色谱峰形及对称性最佳；试验证明，雄激素类化合物信号的响应值和分离度在色谱柱柱温为30℃及流速为0.3mL/min时获得了最好的测试结果。

下面结合附图对本发明的测定化妆品中15种雄激素的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明方法中15种禁用雄激素类化合物的超高效液相色谱-质谱/质谱分析图谱；

图2为本发明实施例中不同提取溶剂的提取效果比较图；

图3为本发明实施例中不同固相萃取柱的净化比较图；

图4为本发明实施例中不同洗脱溶剂回收率的比较图。

本发明附图中，各个编号与雄激素的对应关系如下：1.肾上腺甾酮；2.群勃龙；3.勃地酮；4.氟甲睾酮；5.氧甲氢龙；6.雄烯二酮；7.诺龙；8.去氢甲睾酮；9.睾酮；10.去氢表雄酮；11.氯司替勃；12.雄诺龙；13.美雄诺龙；14.醋酸氯睾酮；15.丙酸睾丸素。

具体实施方式

实施例

一、仪器、试剂与材料

ACQUITY超高效液相色谱仪、WatersXEVOTQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；CR21G型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；KQ-600超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；MS2型涡旋振荡器(德国IKA公司)；AB204-S型电子天平(美国METTLERTOLEDO公司)；N-EVP112型氮吹仪(美国OrganomationAssociatesInc)；0.22μm微孔滤膜(美国Pall公司)；OasisHLB(60mg，3mL)固相萃取柱(美国Waters公司)；甲醇、乙腈及甲酸均为色谱纯试剂(美国Fisher公司)。

15种禁用雄激素类物质的结构式及相关信息见表3。

以甲醇为溶剂，配置每种化合物的标准储备液以及全混储备液。随后的稀释及混合溶液同样以甲醇为溶剂，保存在棕色瓶中，-4℃条件下保存。

表315种雄激素的CAS号、生产厂商及化学结构式

二、色谱分离条件：

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)；

流动相：A：含0.1％甲酸的甲醇溶液，B：0.1％甲酸水溶液(体积分数)；采用梯度洗脱程序；

柱温：30℃；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL。

表1梯度洗脱程序

三、质谱分析条件：

离子化方式：ESI⁺；

毛细管电压：+3.5kV；

脱溶剂气温度：500℃；

脱溶剂气流速：1000L/h；

锥孔气体流速：50L/h；

离子源温度：150℃；

萃取电压：+3.00V；

射频透镜电压：+0.10V；

碰撞气体：氩气；

数据采集模式：多反应监测(MRM)。

本发明中，15种禁用雄激素化合物的质谱分析相关参数见表2，超高效液相色谱-质谱/质谱分析图谱见图1。

表215种禁用雄激素的质谱分析参数

注：^*为定量离子

四、标准溶液的配制：

称取15种雄激素标准品各10mg(精确至0.0001g)，分别置于10mL容量瓶中。用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度均为1.0mg/mL的雄激素标准储备液。

分别量取各标准储备液1mL置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，得到每种雄激素浓度均为10μg/mL的混合标准储备溶液，再用初始流动相将其稀释成不同浓度的标准工作溶液，4℃下保存，现用现配。

五、样品的前处理：

准确称取化妆品试样1.0g(精确至0.001g)于10mL比色管中，加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取20min，将提取液转移至离心管中，以10000r/min离心10min后，取上清液用于固相萃取。OasisHLB固相萃取柱依次用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，先用5mL50％甲醇水溶液淋洗，再用5mL含0.1％甲酸的乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液于带刻度氮吹管中，缓慢氮气流吹扫浓缩至近干，最后用1mL初始流动相溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜后供测定。

六、结果：

(1)方法学验证：线性范围、相关系数及定量限

将一系列不同质量浓度的15种禁用雄激素类化合物混合标准溶液依次进样，以峰面积(y)对质量浓度(x)绘制标准工作曲线。实验结果显示，15种雄激素在各自线性范围内线性关系良好，其线性范围、相关系数及方法定量限见表4。

表415种禁用雄激素的线性范围、相关系数及方法定量限

(2)回收率及精密度

分别称取水剂和膏霜空白化妆品样品1.0g，精确至0.001g，分别添加低、中、高三个浓度的混合标准溶液，按照本实验确立的方法进行分析测定，结果见表3。15种雄激素化合物的平均回收率范围在75.7％～91.0％之间，相对标准偏差在1.34％～9.83％之间，结果见表5。

表515种禁用雄激素的平均回收率及相对标准偏差(n＝6)

本发明所述测定方法主要从以下几个方面进行考虑的：

(1)质谱分析条件的优化

用蠕动泵以10μL/min的流速，分别将15种雄激素标准溶液(浓度为1μg/mL)注入ESI离子源中，根据雄激素类化合物的化学电离性质，选择在ESI⁺离子化模式下进行一级质谱分析，得到准分子离子[M+H]⁺信息。根据欧盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法须达到4个确证点的要求，应在确定母离子的基础上选择至少两个子离子。在确定母离子后，再对母分子进行子离子扫描的二级质谱分析，得到碎片离子信息，选择合理丢失且丰度较大的的两个碎片离子作为辅助定性离子，以其中丰度最大的碎片离子作为定量离子。在此过程中，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量、离子源温度等参数进行了优化。

(2)样品提取、净化方法的选择

由于化妆品中基质较为复杂，本研究采用了超声提取结合固相萃取的样品前处理方法。分别考察了甲醇、乙腈、四氢呋喃等不同提取溶剂的提取效率，及OasisHLB、Sep-Pak、Sep-PakSilica等固相萃取柱的净化效果。图2为不同提取溶剂的提取效果比较图；图3为不同固相萃取柱的净化比较图；附图中，各个编号与雄激素的对应关系如下：1.肾上腺甾酮；2.群勃龙；3.勃地酮；4.氟甲睾酮；5.氧甲氢龙；6.雄烯二酮；7.诺龙；8.去氢甲睾酮；9.睾酮；10.去氢表雄酮；11.氯司替勃；12.雄诺龙；13.美雄诺龙；14.醋酸氯睾酮；15.丙酸睾丸素。综合考虑雄激素类化合物极性偏小及化妆品样品中油水比例各异的特点，选用甲醇作为提取溶剂，OasisHLB固相萃取柱进行净化的前处理步骤，并比较了甲醇、乙腈、含0.1％甲酸的甲醇和含0.1％甲酸的乙腈等不同洗脱溶液的洗脱效果。

(3)色谱柱的选择：

分别对规格均为(2.1mm×50mm,1.7μm)的BEHC₁₈、BEHAmide、BEHHILIC、BEHRPC₁₈和BEHphenyl五种选择性不同的色谱柱进行了考察，实验结果表明，BEHC₁₈和BEHRPC₁₈色谱柱对15种雄激素均可以实现较好的分离，但BEHC₁₈色谱柱对15种雄激素的信号响应强度更好，因此最终选择BEHC₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)色谱柱。

(4)流动相的选择：

研究考察了不同种类的流动相：(I)乙腈-水(含0.1％甲酸)、(II)乙腈-水(含0.2％甲酸)、(III)乙腈-水(含0.3％甲酸)、(IV)甲醇-水(含0.1％甲酸)、(V)甲醇-水(含0.2％甲酸)、(VI)甲醇-水(含0.3％甲酸)、(VII)甲醇-水、(VIII)乙腈-水等不同流动相的分离效果。图4为不同洗脱溶剂回收率的比较图。附图中，各个编号与雄激素的对应关系如下：1.肾上腺甾酮；2.群勃龙；3.勃地酮；4.氟甲睾酮；5.氧甲氢龙；6.雄烯二酮；7.诺龙；8.去氢甲睾酮；9.睾酮；10.去氢表雄酮；11.氯司替勃；12.雄诺龙；13.美雄诺龙；14.醋酸氯睾酮；15.丙酸睾丸素。结果表明，15种雄激素类化合物在含0.1％甲酸的甲醇-水流动相体系中的色谱峰形和对称性最佳。

(5)流速及柱温的优化：

在液相色谱或液相色谱-质谱分析时，流速大小的设置在色谱峰分离及峰形方面也起着一定作用，流速过大(在色谱柱的耐受范围之内)，色谱峰分离不开；流速太小，容易造成拖尾峰，也会造成分析时间过长，降低工作效率。尤其在液相色谱-质谱分析时，流速大小的选择还应考虑离子化效率的问题。实验中分别考察了不同流速下目标物质的保留时间、分离度及信号响应强度的情况，最终确定0.3mL/min作为流动相的流速。

色谱柱的温度也会对所分离物质的保留值、信号响应强度以及选择性有不同程度的影响。本研究考察了30℃、35℃、40℃、45℃及50℃等不同柱温条件下，雄激素混合标准溶液经BEHC₁₈色谱柱分离后信号响应及分离效果，经比较，最终选择30℃的柱温条件。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)样品的前处理：包括样品提取、净化及浓缩；

(2)将经过前处理的样品采用超高效液相色谱-质谱/质谱法进行分析测定，其中，

色谱分离条件如下：

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈，2.1mm×50mm,1.7μm；

流动相：A：含0.1％甲酸的甲醇溶液，B：0.1％甲酸水溶液，百分数为体积百分数；采用梯度洗脱程序；

柱温：30℃；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

质谱分析条件如下：

离子化方式：ESI⁺；

毛细管电压：+3.5kV；

脱溶剂气温度：500℃；

脱溶剂气流速：1000L/h；

锥孔气体流速：50L/h；

离子源温度：150℃；

萃取电压：+3.00V；

射频透镜电压：+0.10V；

碰撞气体：氩气；

数据采集模式：多反应监测MRM；

所述梯度洗脱程序的设置如表1所示，其中，百分数为体积百分数；

表1梯度洗脱程序

所述方法同时测定15种禁用雄激素，分别为：肾上腺甾酮、群勃龙、勃地酮、氟甲睾酮、氧甲氢龙、雄烯二酮、诺龙、去氢甲睾酮、睾酮、去氢表雄酮、氯司替勃、雄诺龙、美雄诺龙、醋酸氯睾酮和丙酸睾丸素。

2.根据权利要求1所述的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其特征在于：所述15种禁用雄激素的质谱分析相关参数如表2所示：

表215种禁用雄激素的质谱分析参数

注：^*为定量离子。

3.根据权利要求1所述的同时测定化妆品中15种禁用雄激素的方法，其特征在于：样品的前处理具体包括如下步骤：

准确称取化妆品试样1.0g，精确至0.001g，于10mL比色管中，加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取20min，将提取液转移至离心管中，以10000r/min离心10min后，取上清液用于固相萃取，OasisHLB固相萃取柱依次用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，先用5mL50％甲醇水溶液淋洗，再用5mL含0.1％甲酸的乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液于带刻度氮吹管中，缓慢氮气流吹扫浓缩至近干，最后用1mL初始流动相，即体积比为60:40的0.1％甲酸的甲醇溶液和0.1％甲酸水溶液的混合溶液，溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜后供测定。