CN106248817A - 一种金银花质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金银花质量评价方法，该方法对金银花中绿原酸、木犀草苷和6种环烯醚萜苷类成分进行测定，其中，所述6种环烯醚萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛。本发明首次将金银花中的环烯醚萜苷类成分纳入金银花质量评价体系，为保障质量评价方法的可靠性和有效性，同时选取6种金银花中的代表性环烯醚萜苷类成分进行测定，并首次建立了分散固相萃取‑高效液相色谱(DSPE‑HPLC)法检测这6种不同结构环烯醚萜苷类成分，显著提高了对金银花质量评价的可靠性和有效性，从而进一步提高了金银花药材及相关成药质量控制水平，对于指导临床应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种金银花质量评价方法。
背景技术
金银花，别名双花、二花、土银花、忍冬花等，是忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或初开的花，广泛分布在我国各省，应用历史悠久，是我国常用的大宗中药材之一，首次记载于梁代陶弘景的《名医别录》，味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热的功能，主要用于治疗痈肿疔、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症。
影响金银花质量的因素有很多，主要有产地、种植环境、采收期、加工干燥、施肥等，而对于金银花成品质量的评价，传统认为绿原酸和木犀草苷是金银花的有效成分，对于金银花的质量评价研究则多围绕这两种成分进行，2015版《中国药典》金银花药材的质量评价和含量分析主要就是围绕绿原酸和木犀草苷进行。而目前已有对于金银花质量评价的研究报道，也多参照药典进行，评价标准成分较单一。但是绿原酸和木犀草苷并不能代表金银花中的所有成分。近年来研究发现，作为金银花的主要成分之一的环烯醚萜苷类具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等多种活性，因此开展金银花药材中环烯醚萜苷类成分的高效提取和分析方法研究，将其纳入质量评价体系，对进一步研究其作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种金银花质量评价方法，该方法不仅对绿原酸和木犀草苷含量进行测定，同时还检测金银花中6种主要环烯醚萜苷类成分，从而提高金银花质量评价方法的可靠性和有效性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金银花质量评价方法，该方法对金银花中绿原酸、木犀草苷和6种环烯醚萜苷类成分进行测定，其中，所述6种环烯醚萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，对6种环烯醚萜苷类成分测定步骤如下：
(1)将金银花粉碎，过筛，称取一定量金银花粉待用；
(2)向步骤(1)中的金银花中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液；
(3)向步骤(2)中的上清液中加入净化剂，涡流振荡；
(4)经步骤(3)处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液；
(5)分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品，加甲醇溶解，制成混合标准溶液；使用时，按一定比例逐级稀释，待用。
(6)将步骤(4)得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)；流速：0.5-1.0mL/min；检测波长：200-250nm；柱温：25-30℃；流动相：流动相为0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱；
(7)以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。
优选的，所述步骤(1)中过筛目数为20-40目，进一步优选的，所述过筛目数为40目；
优选的，所述步骤(2)中提取溶剂为50％乙醇；所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比1g:100-150ml，进一步优选的，所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比为1g:100ml；
优选的，所述步骤(2)中超声提取时间为15-25min，进一步优选的，超声提取时间为15min；
优选的，所述步骤(3)中加入的净化剂为硅藻土；所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g:1ml；进一步优选的，所述净化剂与上清液的质量体积比为50g:1ml；
优选的，所述步骤(3)中涡流振荡时间为0.5-2min；进一步优选的，所述涡流振荡时间为1min；
优选的，所述步骤(4)中微孔滤膜规格为0.22mm；
优选的，所述步骤(6)中流速为0.8mL/min；检测波长为240nm；柱温：25℃；
优选的，所述步骤(6)中梯度洗脱程序如下：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈；
优选的，所述绿原酸和木犀草苷的测定依照2015版《中国药典》中测定方法进行。
本发明首次将金银花中的环烯醚萜苷类成分纳入金银花质量评价体系，为保障质量评价方法的可靠性和有效性，同时选取6种金银花中的代表性环烯醚萜苷类成分进行测定，并首次建立了分散固相萃取-高效液相色谱(DSPE-HPLC)法检测6种不同结构环烯醚萜苷类成分(马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛)，使用该方法线性相关系数均大于0.999，检出限为0.026-0.057μg/mL，各目标成分回收率在90.5-102.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.85-1.74％范围内，本发明具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、目标物回收率高、灵敏度高易操作等特点。
本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对样品前处理方法和仪器检测条件进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛经过分散固相处理的前处理方式，同时使用高效液相色谱仪进行测定，大大节约了仪器设备与成本，可以满足不同条件实验室的工作需求。
(2)本发明样品前处理流程简单，大大缩短了每个测试样品的检测时间，降低了分析成本，有效避免死吸附现象发生，本发明采用分散固相萃取(DSPE)作为前处理技术，减少了有机溶剂的使用量，缩短了前处理时间，使实验操作更加简便、快捷。
(3)本发明具有检测灵敏度高、准确及重现性好等优点。
综上所述，本发明通过对金银花中三类有效成分的精确测定，显著提高了对金银花质量评价的可靠性和有效性，从而进一步提高了金银花药材及相关成药质量控制水平，对于指导临床应用具有重要意义。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
一种金银花质量评价方法，包括对金银花中绿原酸、木犀草苷和6种环烯醚萜苷类成分进行测定，其中，6种环烯醚萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛；绿原酸、木犀草苷测定方法依照2015版《中国药典》进行。如下详细列出检测6种环烯醚萜苷类成分的仪器材料、方法步骤。
1仪器与材料
Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KQ2400KDE型高功率数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；R201型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；BSA1245-CW型精密天平，德国Sartorius公司；Milli-Q(18.2MΩ)超纯水处理系统，美国Millipore公司。
甲醇(色谱纯)购于美国Tedia公司；乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司；其余试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2MΩ)。硅藻土(分析纯)购置于天津大茂化学试剂厂；聚酰胺(30～60目，柱色谱)均购置于国药集团化学试剂有限公司。
本实验所采用的金银花Lonicera japonica Thunb.药材购于山东省济南市漱玉平民大药房，并经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定。6种环烯醚萜苷化合物对照品马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛)均由实验室分离制备，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。
2.样品提取液制备
金银花药材粉碎，过40目筛，准确称取0.3g置于具塞三角瓶中，加30mL50％乙醇，超声提取15min，取2mL上清液，加硅藻土100mg，涡流振荡1min，0.22μm微孔滤膜过滤得样品提取液。
3.对照品溶液的制备
分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品2.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加50％甲醇溶解，定容，摇匀，制成浓度为200μg/mL混合标准溶液。使用时，按比例逐级稀释，待用。
4.高效液相色谱条件
HPLC分析，进样体积3μL。具体色谱条件为：Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈。检测波长240nm，流速0.8mL/min，进样量3μL，柱温25℃。
5.测定结果计算
以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。实验结果如表1所示。
表1样品中环烯醚萜苷的测定结果
依照2015《中国药典》所述方法对金银花1号样品中的绿原酸、木犀草苷进行测定：绿原酸含量为26.8mg/g，木樨草甘含量为0.608mg/g。
6.方法学考察
在本研究优化的测定条件下，以金银花提取物中各环烯醚萜苷类成分的保留时间和峰面积为考察指标，对该方法的精密度、重复性、稳定性和加标回收率分别进行了考察。精密度试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于0.95％，峰面积的RSD值均低于1.51％，结果表明仪器精密度良好。6次重复性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于1.23％，峰面积的RSD值均低于4.21％，结果表明方法的重复性良好。24h内稳定性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值在0.08％～0.65％，峰面积的RSD值在0.85％～1.74％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。精密称取已知各目标化合物量的金银花样品0.30g，分别准确加入对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理6份，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率，结果表明，各目标成分加标回收率在90.5％～102.1％，RSD值在0.67％～2.27％。以上数据说明，该方法具有较好的精密度、稳定性和重现性，可以用于金银花中环烯醚萜苷类成分的准确测定。
实施例2
如实施例1所述，选择另一金银花样品2，实验结果见表2。
表2样品中环烯醚萜苷的测定结果
依照2015《中国药典》所述方法对金银花2号样品中的绿原酸、木犀草苷进行测定：绿原酸含量为31.5mg/g，木樨草甘含量为0.815mg/g。
实施例3
如实施例1所述，选择另一金银花样品3，实验结果见表3。
表3样品中环烯醚萜苷的测定结果
依照2015《中国药典》所述方法对金银花2号样品中的绿原酸、木犀草苷进行测定：绿原酸含量为28.6mg/g，木樨草甘含量为0.735mg/g。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述方法对金银花中绿原酸、木犀草苷和6种环烯醚萜苷类成分进行测定，其中，所述6种环烯醚萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，对6种环烯醚萜苷类成分测定步骤如下：
(1)将金银花粉碎，过筛，称取一定量金银花粉待用；
(2)向步骤(1)中的金银花中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液；
(3)向步骤(2)中的上清液中加入净化剂，涡流振荡；
(4)经步骤(3)处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液；
(5)分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品，加甲醇溶解，制混合标准溶液；使用时，按一定比例逐级稀释，待用；
(6)将步骤(4)得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：KromasilC18(4.6×250mm，5μm)；流速：0.5-1.0mL/min；检测波长：200-250nm；柱温：25-30℃；流动相：0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱；
(7)以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。
2.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中过筛目数为20-40目，进一步优选的，所述过筛目数为40目。
3.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取溶剂为50％乙醇；所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比1g:100-150ml，优选的，所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比为1g:100ml。
4.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中超声提取时间为15-25min，进一步优选的，超声提取时间为15min。
5.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入的净化剂为硅藻土；所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g:1ml；进一步优选的，所述净化剂与上清液的质量体积比为50g:1ml。
6.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(3)中涡流振荡时间为0.5-2min，优选的，所述涡流振荡时间为1min。
7.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(4)中微孔滤膜规格为0.22mm。
8.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(6)中流速为0.8mL/min；检测波长为240nm；柱温：25℃。
9.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述步骤(6)中梯度洗脱程序如下：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈。
10.如权利要求1所述的一种金银花质量评价方法，其特征在于，所述绿原酸和木犀草苷的测定依照2015版《中国药典》中测定方法进行。
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