JP2012225762A - 糖化タンパク質の検出方法および糖化タンパク質の検出のためのバイオセンサーチップ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ガレクチンまたはガレクチンのCRDへの糖化タンパク質の結合量を測定することを含んでなる、糖化タンパク質の検出方法であって、ガレクチンがガレクチン−3であり、糖化タンパク質が、糖化反応の前期反応生成物、カルボキシメチルリジン若しくはカルボキシエチルリジンが付加した糖化反応の後期反応生成物、またはグルコース、メチルグリオキサール若しくはグリセルアルデヒド由来の糖化反応の後期反応生成物である。ガレクチンまたはそのCRDへの糖化タンパク質の結合量を表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス測定法、反射干渉分光法、プロテインチップ法若しくは半導体接触型バイオセンサー法または電気化学的方法により測定する。
【選択図】なし
Description
(1)ガレクチンまたはその炭化水素認識領域(Carbohydrate Recognition Domain;以下、単に「CRD」ということがある)への糖化タンパク質の結合量を測定することを含んでなる、糖化タンパク質の検出方法(以下、「本発明の検出方法」という)。
(2)ガレクチンがガレクチン−3である上記(1)に記載の方法。
(3)糖化タンパク質が、糖化反応の前期反応生成物、カルボキシメチルリジン若しくはカルボキシエチルリジンが付加した糖化反応の後期反応生成物、またはグルコース、メチルグリオキサール若しくはグリセルアルデヒド由来の糖化反応の後期反応生成物である、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)ガレクチンまたはそのCRDへの糖化タンパク質の結合量を表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス測定法、反射干渉分光法、プロテインチップ法若しくは半導体接触型バイオセンサー法または電気化学的方法により測定する、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)血糖値、糖化LDLまたは糖化Aβの測定方法である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)ガレクチンまたはそのCRDが固定化された固体支持体からなる、バイオセンサーチップ。
(7)ガレクチンがガレクチン−3である、上記(6)に記載のバイオセンサーチップ。
(8)糖化タンパク質の検出に使用するための、上記(6)または(7)に記載のバイオセンサー。
(9)糖化タンパク質が糖化反応の前期反応生成物、カルボキシメチルリジン若しくはカルボキシエチルリジンが付加した糖化反応の後期反応生成物、またはグルコース、メチルグリオキサール若しくはグリセルアルデヒド由来の糖化反応の後期反応生成物である、上記(8)に記載のバイオセンサーチップ。
(10)血糖値の測定に使用するための、上記(6)〜(9)のいずれかに記載のバイオセンサーチップ。
(11)担体にガレクチンまたはそのCRDを結合させてなる、アフィニティーカラム。
(12)上記(11)に記載のアフィニティーカラムを用いて、糖化タンパク質を精製する方法。
(1)ガレクチン−3およびガレクチン−3のCRDの調製
ガレクチン−3発現プラスミドで形質転換した大腸菌Escherichia coli BL−21(DE3)株を、10%(重量/体積)のグルコースおよび100μg/mLのアンピシリンを添加した1Lの2×YT培地を用いて、37℃で培養し、O.D.600を0.7とした。この培養液に最終濃度が0.1mMとなるようにイソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加え、融合タンパク質の発現を誘導し、さらに37℃にて2時間培養した。遠心分離により培地を取り除き、大腸菌のペレットを100mLの細胞破砕溶液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.5M NaCl、5mM β−メルカプトエタノール、1mM EDTA、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF))で懸濁し、氷上で4分間の超音波処理を行った。次いで、最終濃度1%(重量/体積)となるようにTriton X−100を添加し、4℃で30分間攪拌した。遠心分離の後に、上澄み液をラクトース−アガロースアフィニティークロマトグラフィー(生化学工業社、東京、日本)(Matsushita et. al. 2000; Nishi et. al., 2003)により、更に精製した。なお、ガレクチン−3発現プラスミドは、ガレクチン−3をコードするヒトJurkat細胞由来のポリヌクレオチド(配列番号1)またはガレクチンのCRDをコードするポリヌクレオチド(配列番号1の340番〜750番のヌクレオチド配列)を含有するpET11−aベクタ−から構成されている。
本実施例においては、AGEとして、サイクレックス社(長野、日本)から購入したNε−(カルボキシメチル)リジン−HSA(CML−HSA)(カタログ番号:CY−R2066)、Nε−(カルボキシエチル)リジン−HSA(CEL−HSA)(カタログ番号:CY−R2067)、グリオキサール−AGE−BSA(カタログ番号:CY−R2064)、グリコールアルデヒド−AGE−BSA(カタログ番号:CY−R2060)、グリセルアルデヒド−AGE−BSA(カタログ番号:CY−R2058)、メチルグリオキサール−AGE−BSA(カタログ番号:CY−R2062)、グルコース−AGE−BSA(カタログ番号:CY−R2056)を用いた。
上記(1)で調製したガレクチン−3(配列番号2)またはガレクチン−3のCRD(配列番号2のアミノ酸配列の114番〜250番)を、製造会社の取扱説明書に従い、アミノカップリング反応により、Birecore3000(ビアコア社、ピスカタウェイ、NJ)用のセンサーチップCM5(研究グレード)上に固定化した。固定化するタンパク質量は5000共鳴単位(RU)とした。流速を10μL/分とし、30℃にて、10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)中で、N−ヒドロキシ−スクシニミド/1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドカップリング反応により固定化した。
ガレクチン−3およびガレクチン−3のCRDとAGEとの結合特性は、表面プラズモン共鳴(SPR)現象に基づく相互作用解析装置Birecore3000を用いて分析した。SPR分析は30℃、流速10μL/分にて行った。すべての試料は20μLずつ分析に供し、ガレクチン−3固定化CM5センサーチップまたはおよびガレクチン−3のCRD固定化CM5センサーチップ上で120秒間接触させて、ガレクチン−3またはガレクチン−3のCRDとAGEとの結合をモニターした。その後、センサーチップをランニング緩衝液(10mM Hepes(pH7.4)、3mM EDTA、150mM NaClおよび0.005%界面活性剤P20)中に溶解した70μLの20mM乳酸溶液で120秒間処理し、センサーチップからのAGEの解離をモニターした。溶出処理後の残留AGE量を%RUとして計測した。また、結合速度定数(Kon)および解離速度定数(Koff)は、BIAevaluation4.1ソフトウェアパッケージ(GEヘルスケア、ピスカタウェイ、NJ)を用いて決定した。平衡定数(Kd)はKoffをKonで除して求めた。
ガレクチン−3と各AGEとの結合のセンサーグラムは図2に示される。ガレクチン−3は、グルコース−AGE−BSA(AGE−1、図2−A)、CEL−HSA(図2−B)、グリセルアルデヒド−AGE−BSA(AGE−2、図2−C)、メチルグリオキサール−AGE−BSA(AGE−4、図2−D)のいずれとも結合能を有することが分かった。それぞれの結合速度定数(Kon)および解離速度定数(Koff)を図4に示す。また、ガレクチン−3と様々なAGEとの結合能を調べたところ、ガレクチン−3は、グルコース−AGE−BSA、CEL−HSA、メチルグリオキサール−AGE−BSA、グリセルアルデヒド−AGE−BSAとは結合したが、グリオキサール−AGE−BSA、CML−HSA、グリコールアルデヒド−AGE−BSAとは結合しなかった(表1)。このように、ガレクチン−3は特定のAGEとの結合特異性を有することが示唆された。
ガレクチン−3のCRDと各AGEとの結合のセンサーグラムを図2に示す。ガレクチン−3のCRDは、グルコース−AGE−BSA(AGE−1、図2−A)、CEL−HSA(図2−B)、グリセルアルデヒド−AGE−BSA(AGE−2、図2−C)、メチルグリオキサール−AGE−BSA(AGE−4、図2−D)のいずれとも結合能を有することが分かった。それぞれの結合速度定数(Kon)および解離速度定数(Koff)を図5に示す。
ガレクチン−3が認識するAGEの部位を特定するために、ガレクチン−3とグリセルアルデヒドとの結合特性をSPRにより分析した。ガレクチン−3はグリセルアルデヒド−AGE−BSA(AGE−2)とは結合する(図6−B、d)のに対して、グリセルアルデヒドそのものとは結合しない(図6−B、c)ことが分かった。ガレクチン−3はBSAそのものとも結合能を有さない(データ未掲載)。このことは、ガレクチン−3とAGEとの結合には、タンパク質部分と付加部分の両方が必要であること、すなわち、ガレクチン−3は糖化タンパク質のみを広く認識することができることを示唆する。
Claims (12)
- ガレクチンまたはその炭化水素認識領域(CRD)への糖化タンパク質の結合量を測定することを含んでなる、糖化タンパク質の検出方法。
- ガレクチンがガレクチン−3である請求項1に記載の方法。
- 糖化タンパク質が、糖化反応の前期反応生成物、カルボキシメチルリジン若しくはカルボキシエチルリジンが付加した糖化反応の後期反応生成物、またはグルコース、メチルグリオキサール若しくはグリセルアルデヒド由来の糖化反応の後期反応生成物である、請求項1または2に記載の方法。
- ガレクチンまたはそのCRDへの糖化タンパク質の結合量を表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス測定法、反射干渉分光法、プロテインチップ法若しくは半導体接触型バイオセンサー法または電気化学的方法により測定する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 血糖値、糖化LDLまたは糖化Aβの測定方法である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ガレクチンまたはその炭化水素認識領域(CRD)が固定化された固体支持体からなる、バイオセンサーチップ。
- ガレクチンがガレクチン−3である、請求項6に記載のバイオセンサーチップ。
- 糖化タンパク質の検出に使用するための、請求項6または7に記載のバイオセンサー。
- 糖化タンパク質が、糖化反応の前期反応生成物、カルボキシメチルリジン若しくはカルボキシエチルリジンが付加した糖化反応の後期反応生成物、またはグルコース、メチルグリオキサール若しくはグリセルアルデヒド由来の糖化反応の後期反応生成物である、請求項8に記載のバイオセンサーチップ。
- 血糖値の測定に使用するための、請求項6〜9のいずれか一項に記載のバイオセンサーチップ。
- 担体にガレクチンまたはその炭化水素認識領域(CRD)を結合させてなる、アフィニティーカラム。
- 請求項11に記載のアフィニティーカラムを用いて、糖化タンパク質を精製する方法。
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