CN105556297A - 利用表达用于检测糖的化学感受受体的细胞的生物传感器及包括其的阿尔茨海默病诊断设备 - Google Patents

利用表达用于检测糖的化学感受受体的细胞的生物传感器及包括其的阿尔茨海默病诊断设备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用表达用于检测糖的化学感受受体的细胞的生物传感器及包括其的阿尔茨海默病诊断设备。本发明的生物传感器及利用其的阿尔茨海默病诊断设备通过基因操作固定靶感应受体蛋白质过表达在细胞表面的果蝇细胞，来更低廉、迅速且敏感地检测存在于试样的特定糖，从而可有用地使用于阿尔茨海默病的诊断。

Description

利用表达用于检测糖的化学感受受体的细胞的生物传感器及包括其的阿尔茨海默病诊断设备
技术领域
本发明涉及利用表达用于检测糖的化学感受受体(chemosensoryreceptor)的细胞的生物传感器及包括其的阿尔茨海默病诊断设备。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease：AD)作为60岁以上人口的11％的人口中发病的退行性脑疾病，随着老龄化，发病急速增加，对生活质量的影响和医疗费的负担等经济损失极大(WHOReport，2010)。阿尔茨海默病治疗法和药物不是根本上治疗预防病，而是延迟病的进展，并减轻症状的方法，因而通过早期诊断可向患者提供适当的治疗，从而减轻患者本人的痛苦，并减轻社会费用消耗的必要性和重要性非常大。当前，利用基因检测、脑脊髓采集、正电子发射计算机断层扫描(PET)或磁共振成像(MRI)等作为诊断法，这种方法不仅需要高费用，而且由于侵袭，因而对患者非常有负担。并且，至今，众所周知的代表性的阿尔茨海默病生物标志物有沉着于脑而成为阿尔茨海默病发病的直接原因的β-淀粉样蛋白，但是，最近，应用先进分析设备来活跃地进行此外的生物标志物检索研究。
另一方面，对快速且同时检测很多生物物质，例如，天然发生脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、病毒、病菌等天然发生分子以及人工适配体、变形的蛋白质、毒素等的生物传感器的关心越高。并且，随着这种生物传感器技术发达，正在促进药剂的发现、基因突变检测及基因治疗效果的评价等的多种医学领域的发展。
利用1970年最初开发的场效应晶体管(fieldeffecttransistor，FET)的生物传感器使用场效应晶体管的源电极、漏电极及栅电极，从而以一个点为基准通过两点之间的电流变化检测环境的变化。观察其原理，则可知溶液和检测膜界面的电化学电位差根据溶液中的离子浓度发生变化，这种电位差的变化引起根据阈值电压变化的有效栅极区域电压的变化，这种变化改变通道电导率，从而引起漏电极电流的变化。可测定上述漏电极电流的变化来检测存在于溶液的特定离子的浓度变化，选择性地在特定离子中形成敏感的离子检测膜，从而可制备可测定各种离子的传感器。利用场效应晶体管的生物传感器可在一个芯片上集成很多传感器元件，因而可排列多个相同种类的传感器来实现多维化，可排列多个不同种类的传感器来实现多功能化。并且，可与智能电路一同集成来实现智能化，或一同集成有关电路及装置来实现系统化，因而以最尖端传感器受人瞩目。
另一方面，果蝇的嗅觉及味觉感应受体非常发达，且其遗传信息也被熟知，存在于细胞表面的化学感受受体对特殊的气味或味道的反应敏感，因而当使用这种细胞作为传感器物质时，可最大化灵敏度和选择性。
对此，本发明人为了检索非侵袭性阿尔茨海默病生物标志物，利用气相色谱-质谱法(GC-MS)来分析患者的唾液(saliva)，并找出作为在脑疾病患者中特异性且多样地出现的物质的糖成分，从而将这种物质选定为新的阿尔茨海默病的生物标志物，制备了基于果蝇细胞的离子敏场效应晶体管(ISFET，ion-sensitivefieldeffecttransistor)生物传感器，并确认上述生物传感器与糖成分之一的海藻糖敏感地反应，且在阿尔茨海默病患者的唾液中敏感地反应，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供生物传感器，上述生物传感器包含：细胞，用于表达用于检测糖的化学感受受体；以及场效应晶体管，用于固定上述细胞。
本发明的另一目的在于，提供阿尔茨海默病诊断设备，上述阿尔茨海默病诊断设备包括：传感部，包括由如下特定的细胞固定而成的生物传感器，上述细胞用于表达用于检测糖的化学感受受体；基准部，包括由如下特定的细胞固定而成的场效应晶体管，上述细胞不表达检测用于与上述生物传感器的电压或电流变化比较的糖的化学感受受体；以及控制部，用于比较上述传感部及上述基准部的电压或电流差异。
解决问题的手段
因此，本发明的目的在于，提供生物传感器，上述生物传感器包含：细胞，用于表达用于检测糖的化学感受受体；以及场效应晶体管，用于固定上述细胞。
并且，本发明提供阿尔茨海默病诊断设备，上述阿尔茨海默病诊断设备包括：传感部，包括由如下特定的细胞固定而成的生物传感器，上述细胞用于表达用于检测糖的化学感受受体；基准部，包括由如下特定的细胞固定而成的场效应晶体管，上述细胞不表达检测用于与上述生物传感器的电压或电流变化比较的糖的化学感受受体；以及控制部，用于比较上述传感部及上述基准部的电压或电流差异。
发明的效果
本发明的生物传感器及利用其的阿尔茨海默病诊断设备通过基因操作固定靶感应受体蛋白质过表达在细胞表面的果蝇细胞，来更低廉、迅速且敏感地检测存在于试样的特定糖，从而可有用地使用于阿尔茨海默病的诊断。
附图说明
图1为分析包含于阿尔茨海默病患者的唾液的糖成分及量的结果。
图2为将作为化学感受受体的Gr5a转导于果蝇细胞的过程及确认已转导的结果。
图3为表示本发明的生物传感器的图。
图4为表示本发明的生物传感器的氧化层的结构的图。
图5为表示本发明的阿尔茨海默病诊断设备的一实施例的示意图。
图6及图7为评价本发明的生物传感器的检测膜(氧化层)的特性的图。
图8为简要表示本发明的基于细胞的双重离子敏场效晶体管的图。
图9为表示根据固定于生物传感器的细胞种类及海藻糖的流入浓度的电压变化的图。
图10为在将阿尔茨海默病患者的唾液流入于生物传感器的情况下，根据固定于生物传感器的细胞的种类表示电压变化的图。
图11为在将阿尔茨海默病患者[(A)及(B)]或正常(C)的唾液流入于生物传感器的情况下，根据固定于生物传感器的细胞种类表示电压变化的图。
具体实施方式
本发明提供生物传感器，上述生物传感器包含：细胞，用于表达用于检测糖的化学感受受体；以及场效应晶体管，用于固定上述细胞。
以下，详细说明本发明。
本发明的细胞可来源于果蝇细胞。上述果蝇细胞可向不能检测糖的S2细胞(DrosophilaSchenider2)转导化学感受受体的基因来使用，上述基因的转导方法可利用本领域中公知的方法。上述化学感受受体优选为敏感地检测糖的Gr5a蛋白质，但不局限于此。
上述场效应晶体管优选为离子选择性场效应晶体管(ion-sensitivefield-effecttransistor)。
如图3所示，本发明的生物传感器100包括硅层110、氧化层120、漏电极130及源电极140。
上述硅层110可位于基板上(未图示)，上述基板可由选自由硅、锗、玻璃、金属塑料、氧化物及它们的混合物组成的组中的物质制备而成。
硅层110可由石墨烯(graphene)、硅构成，优选地，硅层110由硅构成。为了有效地施加电压，硅层110可蒸镀或探针可与上述硅层110欧姆接触(ohmiccontact)的金属物质，来形成接触层(contactlayer)，从而可用作电极。
氧化层120起到氢离子浓度检测膜的作用，可起到调节形成于通道层的电导率的栅极绝缘层的作用，优选地，氧化层120的厚度可以为10nm～1000nm。如图4所示，上述氧化层120可由氧化硅层122、氧化铪层124及氧化铝层126构成。在本发明中，氧化硅层122的厚度优选为3至7nm，更优选为5nm。并且，氧化铪层124的厚度优选为5至10nm，更优选为7.8nm。并且，氧化铝层126的厚度优选为10至16nm，更优选为13.8nm。
源电极130及漏电极140蒸镀或探针可进行欧姆接触(ohmiccontact)的金属物质来形成接触层(contactlayer)，从而可用作电极，可由本领域中公知的物质构成源电极及漏电极。
可在氧化层120上集中固定本发明的过表达用于检测糖的化学感受受体的细胞。若使需要反应的生物学试样等流入电解质170内，则与包含上述细胞表达的化学感受受体的海藻糖或食糖的糖成分反应，从而发生离子，根据发生的上述离子，氧化层(检测膜)和细胞之间的电化学电位差发生变化，其根据在生物学试样中是否存在糖成分及浓度来改变电位差。上述电位差的变化带来阈值电压(Vt)的变化，阈值电压的变化可引起有效栅极电压(Vgd)的变化。通过此时发生的场效应，通道层的电导系数与栅极电压成正比地发生变化，可测定漏电极电流(Ids)的变化来检测糖成分的存在及浓度。
并且，若在规定的栅极电压(Vds)中，电解质170内糖成分的浓度发生变化，则为了维持规定的漏电极电流(Ids)，栅极电压发生变化，可测定上述变化量来检测是否存在糖成分及浓度变化。
并且，本发明的生物传感器还可包括壁体150及基准电极160，电解质170溶液可被关在上述壁体150内，上述基准电极160为电压测定的基准。
本发明中的糖可包含所有种类的糖，优选为海藻糖(trehalose)或食糖(sugar)。
如图5所示，本发明的阿尔茨海默病诊断设备A包括传感部10、基准部20及控制部30。
上述传感部10包括由如下特定的细胞固定而成的生物传感器100，上述细胞用于表达用于检测糖的化学感受受体，若在上述传感部流入包含患有阿尔茨海默病的患者的唾液的生物学试样，则生物传感器的漏极电流或栅极电压发生变化，若在上述传感部流入包括未患有阿尔茨海默病的正常人的唾液的生物学试样，则生物传感器的漏极电流或栅极电压不发生显著变化。
基准部20包括由如下特定的细胞固定而成的生物传感器100，上述细胞不表达用于检测糖的化学感受受体，若在上述基准部流入包含正常人或患有阿尔茨海默病的患者的唾液的生物学试样，则生物传感器的漏极电流或栅极电压没有显著的变化。
控制部30用于比较上述传感部和基准部的漏极电流或栅极电压的差异，若传感部10和基准部20存在电流或电压差异，则可诊断为患有阿尔茨海默病。
以下，通过实施例更详细地说明本发明。以下实施例只是用于说明本发明的一个例示，本发明的发明要求保护范围不局限于实施例。
实施例1.针对阿尔茨海默病的生物标志物的开发
1-1.阿尔茨海默病患者的唾液的收集
在采集阿尔茨海默病患者的唾液之前，使患者绝食4小时以上后，在处理了作为防腐剂的2％的叠氮化钠(sodiumazide)的1.7ml的已消毒的小瓶中吐1ml的唾液，以1500rpm的速度将上述唾液离心分离5分钟来分离上清液后，放入新的小瓶中，并在4℃温度下进行了保管。长时间保管时在-80℃温度下进行了保管。
1-2.阿尔茨海默病患者的唾液的气相色谱-质谱法分析
使用气相色谱-质谱联用仪(GasChromatographMassSpectrometer；GS/MS，Agilent：column-HP-5，Inlettemp250℃，Columnflow1.0ml/min，Masrange50～600m/z，Fiber65umPDMS/DVBpink/plain)来分析53名阿尔茨海默病患者、作为对照组的23名帕金森病患者、7名轻度认知障碍、12名正常人，一共101名的唾液，从而分析物质的定性和定量，并通过数据挖掘(mining)检索了生物标志物。在图1中表示其结果。
如图1所示，确认在阿尔茨海默病患者中检测多的糖成分，从而确认到将其用作对阿尔茨海默病的生物标志物。
实施例2.表达对糖成分敏感的Gr5a蛋白质的果蝇细胞的制备
在制备果蝇味觉受体之一的Gr5a表达细胞株时，使用了利用不能检测糖的DrosophilaSchneider2(S2)细胞的果蝇表达系统(DrosophilaExpressionSystem；Invitrogen)方法(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/des_man.pdf)。将Gr5acDNA克隆在pAC载体后，在无血清的施耐德培养基(Schneidermedium)(英杰生命技术有限公司(Invitrogen))中，利用聚乙烯亚胺(PEI，polyethylenimine)，来将2ug的克隆的质粒和200ng的作为具有潮霉素(hygromycin)抵抗性的筛选用载体的pCoHygro共-转导于S2细胞株中。针对表达Gr5a的稳定的细胞株，以每隔4天在包含有潮霉素的培养基中培养细胞株培养6次以上的方式进行了构建。在图2中表示了表达上述Gr5a的细胞株的制备过程及确认其的结果。
如图2所示，确认到S2细胞中转导了Gr5a基因。
实施例3.基于离子选择性场效应晶体管(ISFET，ionsensitvefieldeffecttransitor)的生物传感器的制备
通过低压力化学气相沉积(LPCVD，lowpressurechemicalvapor)真空装置，在P型硅基板上蒸镀高浓度的多结晶硅膜，利用光刻和干法刻蚀方法，来以隔开的方式形成了源电极及漏电极。在硅层上蒸镀了由氧化硅层(SiO2)、氧化铪层(HfO2)及氧化铝层(Al2O3)构成的氧化层，上述氧化铪层位于上述氧化硅层上，上述氧化铝层位于上述氧化铪层上。为了依次活性化源电极和漏电极及氧化层，在N2/O2气体气氛下，实施了快速热处理(850℃，30秒钟)。在快速热处理后，利用电子束(e-beam)蒸镀器来蒸镀了金属电极。之后，由聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane)构成壁体，并在壁体内放入电解质，来制备了基于离子敏场效应晶体管的生物传感器。
在图3中表示了制备的上述基于离子敏场效应晶体管的生物传感器，在图4中表示了上述氧化层的结构，并在图5中表示了以其为基板制备的阿尔茨海默病诊断设备的示意图。
实施例4.本发明的生物传感器的特性评价
合成了作为本发明的生物传感器的最重要的要素的检测膜(氧化层)的特性得到提高的物质，并利用新开发的检测膜来制备了离子敏场效应晶体管生物传感器，以便可以敏感地检测细胞和反应物质之间的信号，从而通过对上述生物传感器的元件的灵敏度和稳定性的特性和电特性分析，评价了元件的转移(transfer)特性。
在图6及图7中表示了其结果。
如图6及图7所示，在pH缓冲液中，检测膜的漂移率为1.17mV/h，灵敏度为34.9mV/pH，线性度为99.4％，确认到检测膜非常稳定。
实施例5.利用本发明生物传感器的阿尔茨海默病患者
如图8所示，开发了可区分实验组和对照组来传感的一对离子敏场效应晶体管(pairISFET)结构，根据作为糖的一种的海藻糖(trehalose)浓度，在图9中表示了一对离子敏场效应晶体管的电压变化，在流入阿尔茨海默病患者的唾液的情况下，在图10中表示了一对离子敏场效应晶体管(传感部：由过表达Gr5a的果蝇细胞固定的生物传感器；基准部：由S2细胞或细胞培养液固定的生物传感器)的电压变化，在将阿尔茨海默病患者或正常人的唾液流入上述一对离子敏场效应晶体管的情况况下，在图11中表示了电压变化。
如图9所示，在由表达对糖敏感的Gr5a的果蝇细胞株固定的生物传感器部分(传感部)流入海藻糖的情况下，确认到电压根据海藻糖流入浓度明显增加。与此相反，在固定S2细胞或一般培养液的生物传感器部分(基准部)处理海藻糖的情况下，确认到电压根据海藻糖流入浓度几乎无变化。
如图10所示，在传感部中流入阿尔茨海默病患者的唾液的情况下，确认到电压上升，但在基准部中流入阿尔茨海默病患者的唾液的情况下，确认到电压无变化。
如图11所示，在将阿尔茨海默病患者的唾液(图11(A)及图11(B))流入于传感部或基准部的情况下，确认到传感部中的电压变化明显，但基准部中无电压变化，在将正常的唾液(图11(C))流入于传感部或基准部的情况下，确认到传感部及基准部中均无电压变化。
因此，确认到可利用上述一对离子敏场效应晶体管来诊断阿尔茨海默病。
附图标记的说明
A：阿尔茨海默病诊断设备
10：传感部
20：基准部
30：控制部
100：生物传感器
110：硅层
120：氧化层
122：氧化硅层
124：氧化铪层
126：氧化铝层
130：漏电极
140：源电极
150：壁体
160：基准电极
170：电解质溶液

Claims (9)

1.一种生物传感器，其特征在于，包含：
细胞，用于表达用于检测糖的化学感受受体；以及
场效应晶体管，用于固定上述细胞。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，上述化学感受受体为果蝇的Gr5a蛋白质。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，上述细胞为由Gr5a基因转导而过表达Gr5a蛋白质的果蝇细胞。
4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，上述场效应晶体管为离子选择性场效应晶体管。
5.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，
上述离子选择性场效应晶体管包括：
硅层；
源电极及漏电极，以隔开的方式位于上述硅层上；以及
氧化层，形成于上述硅层、源电极及漏电极上，
在上述氧化层固定有用于表达用于检测糖的化学感受受体的细胞。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其特征在于，上述氧化层包括：
氧化硅层；
氧化铪层，位于上述氧化硅层上；以及
氧化铝层，位于上述氧化铪层上。
7.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，
上述细胞为过表达Gr5a蛋白质的果蝇细胞，
上述场效应晶体管为离子选择性场效应晶体管，
上述离子选择性场效应晶体管包括：
硅层；
源电极及漏电极，以隔开的方式位于上述硅层上；以及
氧化层，形成于上述硅层、源电极及漏电极上，
在上述氧化层固定有过表达Gr5a蛋白质的果蝇细胞，
上述氧化层包括：
氧化硅层；
氧化铪层，位于上述氧化硅层上；以及
氧化铝层，位于上述氧化铪层上。
8.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，上述糖为海藻糖或食糖。
9.一种阿尔茨海默病诊断设备，其特征在于，包括：
传感部，包括权利要求1至8中任一项所述的生物传感器；
基准部，包括由如下特定的细胞固定而成的场效应晶体管，上述特定的细胞不表达检测用于与上述生物传感器的电压或电流变化比较的糖的化学感受受体；以及
控制部，用于比较上述传感部及上述基准部的电压或电流差异。
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