JP2007254397A - Ageを認識する分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細菌宿主細胞を用いて、組換え発現し調整した、特定の配列を有するビオチン化RAGEおよびそのホモログ、および組換え発現されたビオチン化RAGEおよびそのホモログを固相に固定化する受容体チップ。
【選択図】なし
Description
しかしながら、RAGEを高発現する細胞は、後期の糖尿病患者の細胞でありそのため、天然の供給源は、限られている。AGEを検出する物質(センサー)としてRAGEを用いる場合には、RAGEを組換え発現する必要がある。
山本 靖彦、外4名、「AGE−RAGE系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」、日薬理誌、日本薬理学会、2003年、121、49〜56 GeethaSrikrishna、外6名、N-Glycans on the receptor for advanced glycation end productsinfluence amphoterin binding and neurite outgrowth、Journal of Neurochemistry、InternationalSociety for Neurochemistry、2002、80、998−1008
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される、ポリペプチド。
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項5に記載のポリペプチド。
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;および
(2)該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
(1)請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;
(2)該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程;
(3)該培養した細胞から、該ポリペプチドを単離する工程、および
(4)該単離したポリペプチドを、固相に固定化する工程
を包含する、方法。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。。
coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli
HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium
glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp.D−0110などが例示される。
RAGE遺伝子の発現にT7プロモーターを用いる場合、T7 RNAの天然のインヒビターであるT7 リゾチウムを欠損する宿主細胞株を用いることが、好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、AD494(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI、BL21 trxB(DE3)、BLR(DE3)、B834(DE3)、HMS174(DE3)、Origami(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta(DE3)、Roseetta−gami(DE3)、RosettaBlue(DE3)、およびTuner(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)が挙げられるが、これに限定されない。
I:The Conformation of Biological Macromolecules(1980)を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には50〜350アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート(βストランドなど)およびα−ヘリックスのストレッチ(stretch)のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。
Jら (1987) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する)、液体SIMS(LSIMS−一次種がイオンであることを除いてFABと同様)、プラズマ脱着質量分析法(MeV一次イオンを用いることを除いてSIMSと同様)、大量クラスタ衝撃法(MCI−大きいクラスタの一次イオンを用いてSIMSと同様)、レーザ脱着/イオン化法(LDI−レーザ光を用いて、表面から種を脱着/イオン化する)、マトリクス補助型レーザ脱着/イオン化法(MALDI−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着/イオン化することを除いてLDIと同様)などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着/イオン化、飛行時間質量分光測定(TOF)を用いる方法が挙げられる。
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子(例えば、リガンドを含む混合物)の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと;前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと;前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、1つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと;前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと;このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子(例えば、受容体に特異的に結合するリガンド)のイオンの質量を検出することができる。
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、(1)封入体を形成しない(または少量のみの封入体を形成する)宿主細菌細胞の使用、(2)封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、(3)形成された封入体のリフォールディング、または、(4)これら(1)〜(3)の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、以下のように実施することが可能である。
一般的に、封入体は、組換えポリペプチド内での適切なジスルフィド結合が形成されずに、ポリペプチドの可溶性が低下することによって形成される場合が多い。そこで、細菌宿主細胞においてジスルフィド結合の形成を促進し、可溶性タンパク質としての発現の可能性を高める変異株を宿主として使用することによって、封入体の形成が抑制される。ジスルフィド結合の形成を促進する変異株としては、チオレドキシンリダクターゼ遺伝子、および/またはグルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損する細菌が挙げられるが、これに限定されない。E.coliのチオレドキシンリダクターゼ遺伝子としては、trxBが公知であり、グルタチオンリダクターゼ遺伝子としてはgorが公知である。従って、ジスルフィド還元系に変異を有するE.coliとしては、(i)trxB変異株、(2)gor変異株、および(3)trxB gor変異株が挙げられるが、これに限定されない。trxB変異を有するが、gor変異を有さないE.coli株としては、例えば、AD494(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)株が挙げられるが、これに限定されない。trxB変異およびgor変異の両方を有するE.coli株としては、例えば、Origami(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)、OrigamiB(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)、Roseetta−gami(DE3)(Novagen社、Madison,WI,USA)株が挙げられるが、これに限定されない。
一般的に、細菌を低温で培養することによって、封入体の形成を抑制することが可能である。宿主細胞がE.coliの場合、E.coliの最適培養温度が通常37℃であるのに対して、封入体形成を抑制するのに十分低い培養温度は、約15〜30℃、好ましくは約20〜25℃、より好ましくは約25℃である。従って、このような低温で宿主細菌細胞を培養することによって、封入体形成を抑制することが可能である。
上記のように封入体形成を抑制する条件下で生成したRAGEは、正しい高次構造にフォールディングし、リガンド認識能を有しているので、そのまま、アビジンもしくはストレプトアビジン等を介して方向性を保った状態でチップ、キュベット等の固相上に固定し、これをセンサー(すなわち、受容体チップ)として使用することが可能である。
宿主細菌細胞としてOrigami(DE3)を用いた。図1に記載のように、目的RAGE遺伝子クローニングサイトとして、5’側はNdeI,3’側にはXhoI(BamHI,SmaI,HindIIIもまた使用可能)を使用する。その結果、目的タンパク質のC末側にビオチンリガーゼによって認識されるビオチン化アミノ酸配列が付加される。RAGEの場合、N末側が細胞外領域でありAGEの認識に必須な領域であるため、チップ化などに際してC末側で固定化が可能なように、C末側にビオチン化アミノ酸配列を付加した。この手順を用いて、配列番号1のアミノ酸配列のC末端側にビオチン化アミノ酸配列「GLNDIFEAQKIEWHE」(配列番号4)をコードする核酸配列を連結し、T7プロモーターの制御下に配置したプラスミドを作製した。用いたプラスミドのクローニング部位を図1に示す。図1中、「FXa」は第Xa因子の切断部位を示し、「rbs」はリボゾーム結合部位を示す。このプラスミドと、ビオチンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミド(ColE1系であるpETベクターと不和合性グループが異なるため同一細胞内で安定に共存しうるp15A系プラスミドであるpACベクターにビオチンリガーゼ遺伝子を挿入したプラスミド)の両方を用いて宿主細菌細胞を形質転換した。この形質転換した宿主細胞の培養に使用した培地は、50μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコール、15μg/mlカナマイシン、12.5μg/mlテトラサイクリンを添加した、改変LB培地(0.5% NaCl、0.5%酵母エキス、1%トリプトン)である。
菌体を収菌後、溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、150mM NaCl、10mM イミダゾール、pH 8.0)に懸濁し、超音波破砕した後、遠心した上清を租溶解液(可溶性画分)とした。N末端に存在するHisタグを利用しNiアガロースカラムに結合させ、FPLCシステムによるイミダゾール濃度勾配により溶出を行なった。可溶性ビオチン化RAGEを含む画分を回収し溶解緩衝液にて透析後、AviTag(C末)(「GLNDIFEAQKIEWHE」(配列番号4))を利用しストレプトアビジン ムテイン マトリックス(Roche社製)カラムに結合させた。10mM d−biotinにて溶出することにより精製可溶性ビオチン化RAGEを得た。1L当りの培養から、最終的に数mgの精製可溶性ビオチン化RAGEを得ることが可能であった。
実施例2に従って調製した組換えRAGEのAGE結合能を確認した。
AGEとしては、糖化BSAを用いた。糖化BSAは、以下の手順によって調製した。
1.5mlの遠心用チューブに粗精製sRAGE溶液(Lysis buffer:10mM イミダゾール、100mM NaH2PO4, 150mM NaCl;タンパク濃度は、2.5〜5mg/ml)300μlを分注した。次に20μlのストレプトアビジン−ムテインマトリックス50%スラリーを添加し、室温で回転混和により10分間反応させた。スイングローターにより500g×5 分間の遠心処理を行い、上清を除去し、sRAGEが固定化されたストレプトアビジン−ムテインマトリックス(SA−Mutein)を沈澱画分として回収した。300μlのLysis bufferを添加し、転倒混和、遠心処理によるsRAGE固定化SA−Muteinの回収を2回繰り返すことにより、非特異的にSA−Muteinに吸着しているタンパク質などを除去した。続いて、300μlのAGE−BSA(12週間糖化処理を行なったAGE−BSA、4mg/ml)を添加し、室温で回転混和により1時間反応させた。上述の遠心処理によりAGE−BSA−sRAGE−SA−Mutein複合体が回収された。この複合体を0.05%tween 20を含むPBS(1mM KH2PO4, 10mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7mM KCL, pH 7.4)を300μl添加し、転倒混和、遠心処理を2回繰り返す洗浄の作業を行ない、非特異的に吸着していた分子を除去した。最終的に回収されたAGE−BAS−sRAGE− SA−Mutein複合体を200μlのPBSに懸濁した後、96ウェルの無蛍光のマイクロタイタープレートに添加し、335nmで励起し、420nmの吸収波長で蛍光強度を測定した。コントロールとしてFruc−500−BSAの代わりにフルクトース非存在下で糖化処理区と同条件で37℃に放置したBSAを使用した。独立した3回の測定を行なった結果を以下の表に記す。
(実施例4:ドットブロット分析)
(実験条件)0.22μmのポアサイズのニトロセルロース膜上に1μlのリガンド溶液(20ng〜8μgの濃度勾配)を直接スポットすることにより吸着させた。リガンド溶液としては12週間反応のAGE−BSA、フルクトース非存在下で調製したBSA(コントロール)を用いた。スポットを完全に乾燥させた後、タンパク質の結合していない部分をブロックするため、ブロッキング緩衝液:5% スキムミルクを含むTBS−T(0.1% Tween 20, 20 mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0)中で、室温で1時間反応させた。続いて10μg/mlもしくは1μg/mlの濃度のhsRAGE、コントロールとして10μg/ml(いずれも最終濃度)BSAを含むTBS−T中で室温にて1時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜をTBS−T中にて15分間振とうする洗浄の過程、さらに同様の洗浄を1.5分で3回繰り返し、非特異的な結合を除去した。続いて室温にて1時間、一次抗体との反応を行なった。抗体は、抗RAGE抗体ウサギIgG(Santa Crua Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA )をTBS−Tにて1:1000に希釈して使用した。反応後の膜をTBS−Tにて上記同様に洗浄した。次に二次抗体との反応を行なった。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギIgG抗体(Bio Rad, Hercules, CA, USA)をTBS−Tにて1:1000に希釈して使用した。室温で1時間振とう反応させた後、上述の洗浄の過程を経て、最後の検出の段階に進んだ。検出はECL(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden )キットにより、X線フィルムへの露光により、各ドットに由来する発光を可視化した。
AGEなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へビオチン化RAGEを固定化し、実際のリガンドの結合を検討する。表面プラズモン共鳴装置としては、BIACORE杜製のBIACORE、並びに株式会社日立ハイテクノロジーズ製のIAsysを使用する。
リフォールディングにより得られたsRAGEをBIACOREのセンサーチップSA上に固定化した。実施例3に従って調製された、異なった濃度のフルクトースにより糖化処理を行なったAGE−BSAをインジェクションした。その結合と解離を測定したセンサーグラムを図4に示す。0秒でAGE−BSAを添加し、180秒後に緩衝液による洗浄を開始した。流速を20μl/分とした。sRAGEを固定化していないフローセルをリファレンスセルとし、リファレンスセルの値との差を応答(RU)として示した。図4中、応答(RU)値の大きい順に、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/mlの糖化処理AGE−BSAを用いたセンサーグラムの結果が示されている。
反応速度論的解析は、BIACOREの解析ソフトBIAevaluation 3.0によった。解析は、センサーグラムを非線形最小二乗法により直接curve fitting させ解析する非線形解析(Non linear fitting)によった。さらに非線形解析の内、結合相と解離相のグラフに対して同時にカーブフィッティングする同時解析(Simulteneous fitting)により、結合速度定数と解離速度定数を算出した。さらに、フィッティングに際して、RAGEとAGE−BSAの結合反応様式のモデルとして、1対1の反応を前提とした 1:1ラングミュア結合(langumuir binding)を採用した。
RAGEポリペプチドまたはそのホモログを、AGEなどを検出するセンサーとして使用する目的で、水晶発振子マイクロバランスにより検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチン化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を測定する。装置としては、Intium社製のAffinixQを使用する。
配列番号2 RAGEタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号3 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号4 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号5 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号6 ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号7 ビオチンリガーゼのアミノ酸配列
配列番号8 FactorXaの認識配列
配列番号9 エンテロキナーゼの認識配列
配列番号10 トロンビンの認識配列
配列番号11 pET16−aviTagのクローニング部位
Claims (15)
- 糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、AGEと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下:
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(c)配列番号2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(d)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(e)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(f)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;ならびに、
(g)配列番号1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下:
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、配列番号6に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列KIG、アミノ酸配列KI、アミノ酸配列KIA、アミノ酸配列KIE、アミノ酸配列KLG、または、アミノ酸配列KVG
(j)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列;
(k)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてBLOSUM−62を使用し、フィルターとしてLow−complexityのみを使用するBlast解析を行った場合に、E値が1e−20以下であるポリペプチドのアミノ酸配列;
(l)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(m)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(n)配列番号3に記載されるアミノ酸配列、配列番号4に記載されるアミノ酸配列、配列番号5に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの保存的置換、および、1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択される、ポリペプチド。 - 細菌宿主細胞によって組換え発現されたポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記細菌宿主細胞が、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記レセプター由来の配列が配列番号2に記載されるアミノ酸配列であり、前記ビオチン化配列が配列番号4に記載されるアミノ酸配列である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞である、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が:
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項5に記載のポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下:
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;および
(2)該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記細菌宿主細胞が、配列番号7に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する、請求項7に記載の方法。
- 前記請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子がT7プロモーターと作動可能に連結している、請求項7に記載の方法。
- 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が:
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。 - 前記細胞培養工程が15℃〜37℃で行われる、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドが、ビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。
- 表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドがビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。
- 以下の工程を包含する、受容体チップの作製方法:
(1)請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;
(2)該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程;
(3)該培養した細胞から、該ポリペプチドを単離する工程、および
(4)該単離したポリペプチドを、固相に固定化する工程
を包含する、方法。
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