JP2005514915A - 標的分子と結合する化合物の生成、選択および同定のための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は概して、ウイルスまたは細胞の表面での、低分子の生成、選択および提示のための新規な方法を提供する。これらの低分子を発現するウイルスまたは細胞をアッセイすることにより、標的分子と結合する低分子を選択しうる。
Description
発明の背景
本発明は一般的に、ウイルスまたは細胞の表面での、目的の生体分子標的(例えば、細胞、ウイルス、分子またはオルガネラ)と結合する化合物(例えば、低分子)の生成、選択および同定のための新規な方法を特徴とする。
本発明は一般的に、ウイルスまたは細胞の表面での、目的の生体分子標的(例えば、細胞、ウイルス、分子またはオルガネラ)と結合する化合物(例えば、低分子)の生成、選択および同定のための新規な方法を特徴とする。
現在の多くの薬剤開発パラダイムは、薬剤分子候補の大規模ライブラリーの利用を必要とする。例えば、百万種もの化合物を含むライブラリーが一般に用いられている。これらのライブラリーは通常、天然の源(例えば、細胞抽出物)から単離された化合物、またはコンビナトリアル化学を用いて生成された化合物から構成される。特定の標的と結合する化合物を単離する目的でこれらのライブラリーを入手およびスクリーニングするためには多大な時間および努力が求められる。これらの医薬品候補をひとたび単離した後にも、標的分子に対する親和性を高めるために、大きな労働力を要する医薬品化学の方法を用いてそれらを最適化しなければならないことがしばしばである。
最近、目的の標的に対する高い親和性を備えた核酸または修飾されていないタンパク質を同定する上で非常に有望なインビトロ進化の方法が開発された。これらの方法は、高い親和性を備えた候補化合物を同定する目的で多数回の選択を行うことを可能にする、リボソームディスプレイおよびファージディスプレイなどの提示戦略を含む。しかし、これらの進化の方法には、比較的大きな修飾されていない核酸およびタンパク質に限定されるという一般的な限界がある。
ほとんどの医薬品が低分子化合物(例えば、分子量が2,000ダルトン未満の化合物)であって、タンパク質にも核酸にも認められない、または化学合成が容易でない、官能基を一般に含むことを考えると、種々の複雑な官能基を含む低分子の生産に用いうる新たな方法が必要である。これらの方法は、新規化合物の生成およびアッセイを行うため、ならびに特定の標的と結合するものを選択する目的で天然の分子を選択するために用いうることが望ましい。加えて、これらの方法は、標的に対して極めて高い親和性(例えば、μM以下の親和性)を備えた医薬品候補の単離を可能にする反復選択に適していることが好ましい。さらに、種々のクラスの候補化合物、例えば脂質および糖質のように多様な化合物、ならびに種々のタイプの標的分子、例えばタンパク質、糖質、核酸、低分子および感染因子を同時に分析するために用いうる方法を開発することは非常に望ましいと考えられる。
発明の概要
本発明は、選択可能な化合物(例えば、低分子)の多様な集団の迅速な作製、ならびに、このような集団からの、標的分子と結合するまたは所望の活性(例えば、抗菌活性)を有する、提示ペプチド(display peptide)と結合した低分子の即時的な選択および同定のための新規な方法を提供する。本方法は、細胞過程を利用してウイルスまたは細胞(例えば、細菌または酵母細胞)の表面に低分子を生成および提示させ、その後に所望の標的分子に対する結合パートナーを提示するウイルスまたは細胞の選択を行う。好ましい方法において、ウイルスおよび細胞はその内部に、ゲノム中または人工DNA挿入物(例えば、プラスミド、コスミドまたは酵母人工染色体)中に、その表面に提示される分子の産生の原因となるタンパク質をコードする核酸を含む。この場合には、低分子の選択により、そのデザインをコードする遺伝情報も得られる。選択された低分子の一部分または全体を宿主ウイルスまたは細胞から回収することもできる。例えば、低分子を提示ペプチドから化学的または酵素的に切断することができる。回収した化合物を、必要に応じて、続いて質量分析またはNMRなどの標準的な方法を用いて同定することもできる。これらの化合物には、医薬品の開発、および、化合物とその標的分子との間の結合性相互作用の検討を含む、さまざまな用途がある。
本発明は、選択可能な化合物(例えば、低分子)の多様な集団の迅速な作製、ならびに、このような集団からの、標的分子と結合するまたは所望の活性(例えば、抗菌活性)を有する、提示ペプチド(display peptide)と結合した低分子の即時的な選択および同定のための新規な方法を提供する。本方法は、細胞過程を利用してウイルスまたは細胞(例えば、細菌または酵母細胞)の表面に低分子を生成および提示させ、その後に所望の標的分子に対する結合パートナーを提示するウイルスまたは細胞の選択を行う。好ましい方法において、ウイルスおよび細胞はその内部に、ゲノム中または人工DNA挿入物(例えば、プラスミド、コスミドまたは酵母人工染色体)中に、その表面に提示される分子の産生の原因となるタンパク質をコードする核酸を含む。この場合には、低分子の選択により、そのデザインをコードする遺伝情報も得られる。選択された低分子の一部分または全体を宿主ウイルスまたは細胞から回収することもできる。例えば、低分子を提示ペプチドから化学的または酵素的に切断することができる。回収した化合物を、必要に応じて、続いて質量分析またはNMRなどの標準的な方法を用いて同定することもできる。これらの化合物には、医薬品の開発、および、化合物とその標的分子との間の結合性相互作用の検討を含む、さまざまな用途がある。
したがって、第1の面において、本発明は、標的分子と結合する低分子の生成および選択のための方法を提供する。本方法は、ウイルス表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団において発現させることを含む。タンパク質融合物は、細胞をウイルスに感染させるよりも前、それと同時またはその後に細胞内で発現させる。タンパク質融合物の発現は、提示ペプチドが細胞内で低分子によって修飾されるのを可能にし、かつ感染細胞から放出されるウイルスの表面にタンパク質融合物が提示されることを可能にする条件下で行われる。ウイルスを標的分子と接触させ、標的分子と結合するウイルスを、低分子結合部分を提示するものとして選択する。本方法において、低分子は(i)提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している、(ii)非天然アミノ酸を有する、(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸もしくはアミノ酸以外の部分のいずれかを有する、または(iv)分子量が2,000ダルトン未満である。いくつかの態様において、低分子はビオチンではない。種々の態様においては、選択したウイルスを用いて別の細胞を感染させ、それによって所望の低分子を提示するさらなるウイルスを生じさせる。選択したウイルスの同一なコピーを作製するために、この選択および細胞感染の工程を反復することにより、ウイルスの集団を、標的に対して相対的に高い親和性を有する低分子を提示するウイルスによって選択的に富化することもできる。
本発明はまた、標的分子と結合する化合物を選択するための関連した方法も提供する。本方法では、細胞によって産生された候補化合物を、提示ペプチドが翻訳された後にタンパク質融合物の提示ペプチド成分に対して添加する。タンパク質融合物は、細胞をウイルスに感染させるよりも前、それと同時またはその後に細胞内で発現させる。これらの翻訳後修飾されたペプチドは、候補化合物を産生する感染細胞から放出されたウイルスの表面に提示され、続いて、ウイルスは、それらが標的分子と結合する候補化合物(すなわち、翻訳後修飾物(posttranslational modification))を提示するか否かを判定するためにアッセイされる。
このような1つの特定の方法においては、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を、提示ペプチドの細胞内での翻訳後修飾および細胞から放出されたウイルスの表面にタンパク質融合物が提示されることを可能とする条件下で、細胞の集団において発現させる。ウイルスを標的分子と結合させ、標的分子と結合するウイルスを、所望の翻訳後修飾物を提示するものとして選択する。いくつかの態様において、翻訳後修飾物はビオチンではない。種々の態様においては、ウイルスを、選択したウイルスの同一なコピーが生じるように細胞感染によって増幅させる。この選択および選択したウイルスの同一なコピーを生じさせるための細胞感染の工程を反復することにより、ウイルスの集団を、選択的には、標的に対して相対的に高い親和性を有する低分子を提示するウイルスに関して富化することができる。
以上のそれぞれの方法の好ましい態様では、選択および細胞増殖の工程を1回もしくは複数回反復する、ならびに/または、化合物(例えば、翻訳後修飾物または低分子の部分または全体)を選択したウイルスから回収する。このようにして、ウイルスの集団を、標的に対して相対的に高い親和性を有する低分子を提示するウイルスに関して富化する。好ましいウイルスには、繊維状バクテリオファージおよび非繊維状バクテリオファージ(M13、flおよびfdなど)が含まれる。バクテリオファージは、エシェリキア(Escherichia)(例えば、大腸菌)またはサルモネラなどの種々の細菌を感染させるために用いうる。表面タンパク質はウイルス外被タンパク質(例えば、pIIIまたはpVIII)であることが好ましい。他の好ましい態様において、提示される低分子または翻訳後修飾物の合成のために必要な1つのタンパク質またはすべてのタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸は、ウイルスのゲノム中に含まれる。さらに他の好ましい態様においては、ウイルスを、選択された低分子または翻訳後修飾物を提示するさらなるウイルスを生じさせる目的で他の細胞を感染させ、それによって選択した化合物の本質的に無限な供給をもたらすために用いる。
本発明の選択方法を、低分子または翻訳後修飾物を細胞の表面に提示することによって行うこともできる。このような1つの面において、本発明は、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団(例えば、種々の異なる分子を表面に提示しうる細胞の集団)において発現させることを含む。発現は、提示ペプチドが細胞内で低分子によって修飾され、細胞の表面にタンパク質融合物が提示されることを可能にする条件下で行われる。細胞を標的分子と接触させ、標的分子と結合する細胞を、所望の低分子結合性を示すものとして選択する。本方法において、低分子は、(i)提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している、(ii)非天然アミノ酸を有する、(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸もしくはアミノ酸以外の部分のいずれかを有する、または(iv)分子量が2,000ダルトン未満である。いくつかの態様において、低分子はビオチンではない。好ましい態様においては、選択した細胞を、細胞増殖を許容し、それによって所望の低分子を発現するさらなる細胞を生じさせる条件下で培養する。この選択および細胞増殖の工程を反復することにより、細胞の集団を、選択的には、標的に対して相対的に高い親和性を有する低分子を提示する細胞に関して富化することもできる。
1つの関連した面において、本発明は、標的分子と結合する翻訳後修飾物を生成および選択するための方法も提供する。本方法は、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を翻訳後修飾のために細胞の集団に発現させることを含む。発現は、提示ペプチドの細胞内での翻訳後修飾およびタンパク質融合物の細胞表面での提示を可能にする条件下で行われる。細胞を標的分子と接触させ、標的分子と結合する細胞を、所望の翻訳後修飾物を提示するものとして選択する。いくつかの態様において、翻訳後修飾物はビオチンではない。好ましい態様においては、選択した細胞を、細胞増殖を許容し、それによって所望の翻訳後修飾物を発現するさらなる細胞を生じさせる条件下で培養する。この選択および細胞増殖の工程を反復することにより、細胞の集団を、選択的には、標的に対して相対的に高い親和性を有する翻訳後修飾物を提示する細胞に関して富化することもできる。
細胞の集団を利用する、以上のそれぞれの方法の好ましい態様においては、選択および細胞増殖の工程を1回もしくは複数回反復する、ならびに/または、化合物(例えば、翻訳後修飾物物または低分子の部分または全体)を選択した細胞から回収する。他の好ましい態様において、細胞は細菌または酵母である。本発明に用いるためのその他の細胞には哺乳動物細胞が含まれる。好ましい表面タンパク質には、鞭毛タンパク質、受容体、および、細胞外ドメインを有する任意の他のタンパク質が含まれる。他の好ましい態様において、提示される低分子または翻訳後修飾物の合成のために必要な1つのタンパク質またはすべてのタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸は、細胞のゲノム中(例えば、細胞内のプラスミド、人工染色体または内因性染色体の中)に含まれる。さらに他の好ましい態様においては、選択された低分子または翻訳後修飾物を提示するさらなる細胞を生じさせるために細胞を増殖させる。
以上の任意の選択方法の好ましい態様において、低分子または翻訳後修飾物は、ビオチン、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン基、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、アルカロイド、テルペン、ポリケチドまたはポリペプチドである。いくつかの態様において、低分子、翻訳後修飾物または補欠分子族はビオチンではない。特定の態様において、脂質は、提示ペプチド(例えば、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーション(thiolation)ドメインまたはチオエステラーゼドメイン)中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している。他の態様において、脂質はパルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸またはステロイドである。好ましい糖質修飾には、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸またはケラタン硫酸の付加が含まれる。好ましい補欠分子族はヘムである。それぞれのウイルスまたは細胞は、同じタンパク質融合物の1つもしくは複数のコピーを提示してもよく、または異なるタンパク質融合物(2、3、4、5種またはそれ以上の異なるタンパク質融合物)の1つもしくは複数のコピーを提示してもよい。1つまたは複数の選択したウイルスまたは細胞が、新規な低分子または新規な翻訳後修飾物を提示することが好ましい。好ましい態様において、異なるタンパク質融合物を発現するウイルスまたは細胞は、異なる低分子または異なる翻訳後修飾物を発現する。
以上の面の他の態様においては、細胞内の核酸を、タンパク質融合物の発現の前に変異させる。変異させる核酸は内因性核酸でも異種核酸でもよい。また、変異させる核酸が内因性核酸の重複コピーであってもよい。好ましい変異誘発法は、核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる位置指定変異誘発または変異を含めるためのエラープローン(error-prone)PCRによって改変された核酸などの異種核酸によって置換することを含む。または、核酸配列の一部または全体を、シャッフリングまたは他の種類のDNA再配列法によって変異させてもよい。用いうるもう1つの変異誘発法は、細胞を変異誘発因子と接触させることを含む。変異させる核酸は、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードすることが好ましい。細胞が1つまたは複数の異種核酸の天然型を含んでもよい。例えば、細胞を、1つまたは複数の異種ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素または脂肪酸合成酵素の核酸を含むように遺伝的に改変することができる。
さらにもう1つの好ましい態様において、標的分子は固定化される。標的分子を固定化するために有用な固体支持体には、標的分子と反応するように誘導体化しうる任意の硬質表面または半硬質表面が含まれる。支持体は、膜、フィルター、チップ、磁性または非磁性ビーズ、およびポリマーを非制限的に含む、任意の多孔性または非多孔性の非水溶性材料でありうる。好ましい標的分子は検出可能な標識を含みうる、または親和性試薬と結合しうる。もう1つの好ましい態様において、標的分子は蛍光性であり、ウイルスまたは細胞は、それらが標的分子と接触した後の蛍光強度に基づいて選別される。本方法に用いうる標的化合物の例には、分子量が1000ダルトン未満、500ダルトン未満または250ダルトン未満の有機分子;タンパク質(例えば、抗体、ビルレンス因子、サイトカイン、ホルモン、リガンドまたは受容体);脂質;糖質;核酸;および感染因子(例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、原生動物または他の真核生物性病原体)が含まれる。種々の態様において、標的タンパク質は、ヘキサヒスチジン、マルトース結合タンパク質、FLAGまたはmycタグなどの精製用標識タグを含む。
本発明はまた、低分子または翻訳後修飾物を表面に発現するウイルスおよび細胞も提供する。これらのウイルスおよび細胞は、目的の標識分子と結合する、提示された化合物の選択のために有用である。
本発明のこの面によれば、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスが提供される。種々の態様において、提示ペプチドは、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、提示ペプチドは、(i)提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している、(ii)非天然アミノ酸を有する、(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸もしくはアミノ酸以外の部分を有する、または(iv)分子量が2,000ダルトン未満である、低分子によって修飾される。いくつかの態様において、低分子はビオチンではない。低分子は目的の標的分子と結合することが好ましい。
1つの関連した面において、本発明は、翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスを提供する。種々の態様において、提示ペプチドはビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、翻訳後修飾物はビオチンではない。提示ペプチドと結合した翻訳後修飾物は標的分子と結合することが好ましい。
もう1つの関連した面において、本発明は、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスを提供する。提示ペプチド中のホスホパンテテイン化アミノ酸には、脂質、ポリケチドまたはポリペプチドが共有結合している。提示ペプチドは、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーションドメインまたはチオエステラーゼドメインであることが好ましい。
以上の任意の面の好ましいウイルスには、繊維状バクテリオファージおよび非繊維状バクテリオファージ(M13、flおよびfdなど)が含まれる。ウイルスは、エシェリキア(Escherichia)(例えば、大腸菌)またはサルモネラなどの種々の細菌を感染させるために用いうる。表面タンパク質はウイルス外被タンパク質(例えば、pIIIまたはpVIII)であることが好ましい。他の好ましい態様において、提示される低分子または翻訳後修飾物は、ビオチン、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン基、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、アルカロイド、テルペン、ポリケチドまたはポリペプチドである。いくつかの態様において、低分子、翻訳後修飾物または補欠分子族はビオチンではない。特定の態様において、脂質は、提示ペプチド(例えば、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーションドメインまたはチオエステラーゼドメイン)中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している。他の態様において、脂質は、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸またはステロイドである。好ましい糖質には、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸が含まれる。好ましい補欠分子族はヘムである。ウイルスは新規な低分子または新規な翻訳後修飾物を提示することが好ましい。
ウイルスに関連する以上の任意の面の他の好ましい態様において、ウイルスの1つまたは複数の核酸は、低分子、翻訳後修飾物、脂質、ポリケチドまたはポリペプチドの合成のために必要なタンパク質をコードする。特定の態様において、核酸は、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする。核酸には変異があることが好ましい。
本発明はまた、好ましくは標的分子と結合する低分子または翻訳後修飾物を発現する細胞も提供する。このような1つの面においては、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞が提供される。種々の態様において、提示ペプチドは、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、提示ペプチドは、(i)提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している、(ii)非天然アミノ酸を有する、(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸もしくはアミノ酸以外の部分を有する、または(iv)分子量が2,000ダルトン未満である、低分子によって修飾される。いくつかの態様において、低分子はビオチンではない。低分子は目的の標識分子と結合することが好ましい。
1つの関連した面において、本発明は、翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞を提供する。種々の態様において、提示ペプチドは、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、翻訳後修飾物はビオチンではない。提示ペプチドと結合した翻訳後修飾物は標的分子と結合することが好ましい。
もう1つの関連した面において、本発明は、表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞を提供する。提示ペプチド中のホスホパンテテイン化アミノ酸には脂質、ポリケチドまたはポリペプチドが共有結合している。提示ペプチドは、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーションドメインまたはチオエステラーゼドメインであることが好ましい。
以上の任意の面の好ましい細胞には、細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)および酵母(例えば、出芽酵母(S. cerevisiae))が含まれる。本発明に用いるための他の細胞には哺乳動物細胞が含まれる。好ましい表面タンパク質には、鞭毛タンパク質、受容体、および細胞外ドメインを有する任意の他のタンパク質が含まれる。提示される低分子または翻訳後修飾物は、ビオチン、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン基、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、アルカロイド、テルペン、ポリケチドまたはポリペプチドであることが好ましい。いくつかの態様において、低分子、翻訳後修飾物または補欠分子族はビオチンではない。特定の態様において、脂質は、提示ペプチド(例えば、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオエステラーゼドメインまたはチオレーションドメイン)中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している。他の態様において、脂質はパルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸またはステロイドである。好ましい糖質には、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸が含まれる。好ましい補欠分子族はヘムである。細胞は新規な低分子または新規な翻訳後修飾物を提示することが好ましい。他の好ましい態様において、細胞の1つまたは複数の核酸は、低分子、翻訳後修飾物、脂質、ポリケチドまたはポリペプチドの合成のために必要なタンパク質をコードする。
以上の任意の面のその他の好ましい細胞は、自然発生的な変異または人工的に誘導された変異を有する1つまたは複数の核酸を含む。好ましい変異誘発法は、核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる位置指定変異誘発または変異を含めるためのエラープローンPCRによって改変された核酸などの異種核酸によって置換することを含む。または、核酸配列の一部または全体を、シャッフリングまたは他の種類のDNA再配列法によって変異させてもよい。用いうるもう1つの変異誘発法は、細胞を変異誘発因子と接触させることを含む。変異させる核酸は内因性核酸でも異種核酸でもよい。また、変異させる核酸が内因性核酸の重複コピーであってもよい。他の好ましい態様において、他の好ましい態様において、1つまたは複数の変異した核酸または異種核酸は、低分子または翻訳後修飾物の合成のために必要なタンパク質をコードする。変異させる核酸は、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードすることが好ましい。細胞が1つまたは複数の異種核酸の天然型を含んでもよい。例えば、細胞を、1つまたは複数の異種ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素または脂肪酸合成酵素の核酸を含むように遺伝的に改変することができる。
さらに、本発明は、表面タンパク質が、新規な低分子または新規な翻訳後修飾物の付加といった修飾用の提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を提供する。タンパク質融合物、およびそれらをコードする核酸を用いて、新規な分子または天然の分子をウイルスまたは細胞の表面に発現させることができる。
このような1つの面において、本発明は、表面タンパク質が、低分子によって標識されうる提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を特徴とする。種々の態様において、提示ペプチドは、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、低分子は、(i)提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している、(ii)非天然アミノ酸を有する、(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸もしくはアミノ酸以外の部分を有する、または(iv)分子量が2,000ダルトン未満である。いくつかの態様において、低分子はビオチンではない。低分子は目的の標識分子と結合することが好ましい。
1つの関連した面において、本発明は、翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を提供する。好ましい態様において、提示ペプチドは、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、補欠分子族(ビオチン以外の)、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子によって修飾される。いくつかの態様において、翻訳後修飾物はビオチンではない。提示ペプチドと結合した翻訳後修飾物は標的分子と結合することが好ましい。
以上の任意の面の好ましいタンパク質融合物には、表面タンパク質成分としての、鞭毛タンパク質、細胞受容体またはウイルス外被タンパク質が含まれる。低分子または翻訳後修飾物は、ビオチン、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン基、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、アルカロイド、テルペン、ポリケチドまたはポリペプチドであることが好ましい。いくつかの態様において、低分子、翻訳後修飾物または補欠分子族はビオチンではない。特定の態様において、脂質は提示ペプチド(例えば、アシルキャリアータンパク質)中のアミノ酸のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している。他の態様において、脂質はパルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸またはステロイドである。好ましい糖質にはコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸が含まれる。好ましい補欠分子族はヘムである。タンパク質融合物は新規な低分子または新規な翻訳後修飾物を提示することが好ましい。
1つの関連した面において、本発明は、本発明のタンパク質融合物をコードする核酸を提供する。核酸はベクター中に含まれ、プロモーターと機能的に結合していることが好ましい。プロモーターは異種プロモーターでもよく、またはタンパク質融合物の部分である表面タンパク質に自然下で付随しているプロモーターであってもよい。
以上の任意の面の種々の態様において、細菌はエシェリキア属(例えば、大腸菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、シゲラ属(例えば、ソンネ赤痢菌)またはバシラス属(例えば、枯草菌)である。いくつかの態様において、細菌は枯草菌胞子などの細菌胞子である。好ましい酵母には出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)が含まれる。好ましい低分子または翻訳後修飾物には、環状ポリケチドなどの環状化合物、または非リボソーム的に合成されたポリペプチドが含まれる。他の好ましい態様において、提示ペプチドまたはタンパク質融合物はリン酸化されていない。
本発明の任意の面の種々の態様において、低分子または翻訳後修飾物は、1つまたは複数のアルキル基、炭素原子数が1〜5個、1〜10個、1〜20個、1〜50個または1〜100個の直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基を含む。アルキル基の例には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、オクチル基、デシル基およびテトラデシル基;ならびにシクロペンチル基およびシクロヘキシル基などのシクロアルキル基が含まれる。
他の態様において、低分子または翻訳後修飾物は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、炭素原子数が1〜5個、1〜10個、1〜20個、1〜50個または1〜100個の直鎖状または分枝状の炭化水素基などの、1つまたは複数のアルケニル基を有する。さらに他の態様において、低分子または翻訳後修飾物は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む、炭素原子数が1〜5個、1〜10個、1〜20個、1〜50個または1〜100個の直鎖状または分枝状の炭化水素基などの、1つまたは複数のアルキニル基を有する。
低分子または翻訳後修飾物中に存在しうるその他の基の例には、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基の1つまたは複数の炭素が窒素、硫黄、酸素またはリン酸などの別の原子によって置換された、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基およびヘテロアルキニル基が含まれる。アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基における水素の1つまたは複数は、選択的には、ヒドロキシ基、シアノ基、チオ基、ハロ基(例えば、クロロ基、フルオロ基、ヨード基またはブロモ基)、ニトロ基、アミノ基、アリール基、アルコキシ基またはアシル基によって置換されていてもよい。
さらに他の態様において、低分子または翻訳後修飾物は、少なくとも1つの環が自然状態で芳香族であって、選択的には以下の置換基:ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、チオアルキル基、ハロ基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基またはアシル基の1つによって置換されうる、1つまたは複数の環からなる一価芳香族炭化水素ラジカルなどのアリール基を有する。他の適した基には、環内の1つまたは複数の炭素が窒素、硫黄または酸素などの別の原子によって置換された、ヘテロアリール基が含まれる。他の適したアリール基は、1つまたは複数のニトロ置換基、ハロ置換基、アリール置換基、アルキル置換基、アルコキシ置換基またはアシル置換基が含まれる。
さらに他の態様において、低分子または翻訳後修飾物は、1つまたは複数のアルコキシ基またはアシル基を有する。好ましいアルコキシ基は式-ORを有し、模範的なアシル基は式-C(O)Rを有するが、ここでRは上で定義したアルキル基またはアリール基である。アルコキシ基の例には、メトキシ基、エトキシ基およびイソプロピル基が非制限的に含まれる。アシル基の例にはアセチル基およびベンゾイル基が含まれる。
低分子または翻訳後修飾物に含まれうる糖質基の例には、アルデヒド基を有する単糖(すなわち、アルドース)またはケト基を有する単糖(すなわち、ケトース)、二糖類および他のオリゴ糖がある。糖質は直鎖状でも分枝状でもよく、それらは種々の高次構造として存在しうる。他の糖質には、修飾されたもの(例えば、ヒドロキシル基の1つまたは複数がハロゲン、アルコキシ部分、脂肪族基によって置換されたもの、またはエーテル、エステル、アミンもしくはカルボン酸としての官能性を持たせたもの)が含まれる。修飾糖質の例には、メチルα-D-グルコピラノシドまたはメチルβ-D-グルコピラノシドなどのα-またはβ-グリコシド;N-グリコシルアミン;N-グリコシド;D-グルコン酸;D-グルコサミン;D-ガラクトサミン;およびN-アセチル-D-グルコサミンが含まれる。
また、タンパク質融合物の表面タンパク質成分を、タンパク質融合物の提示ペプチド成分の修飾の代わりに、または追加的に修飾してもよいと考えている。例えば、細胞受容体の全体または部分を含む表面タンパク質をグリコシル化してもよい。
本明細書で用いる場合、「タンパク質」という用語には、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、ペプチド結合によって連結された、任意の2つまたはそれ以上のアミノ酸またはアミノ酸の類似体もしくは誘導体が含まれる。この用語にはタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドが含まれる。
「表面タンパク質」とは、任意のウイルス外被タンパク質、または1つもしくは複数の細胞外ドメインを有する任意のタンパク質のことを意味する。表面タンパク質の細胞外ドメインは、例えば、グラム陽性細菌の細胞質膜の外表面、グラム陰性細菌の外膜、酵母の細胞壁または哺乳動物細胞の原形質膜上に発現されうる。好ましい表面タンパク質には、膜貫通型タンパク質が含まれる。他の好ましい表面タンパク質には、鞭毛タンパク質(例えば、FliC)、受容体、および細胞接着にかかわるタンパク質(例えば、Aga2p)が含まれる。好ましいウイルス外被タンパク質には、pIIIおよびpVIIIが含まれる。さらに他の好ましい表面タンパク質には、天然の内因性または異種表面タンパク質の配列との同一性が少なくとも50、60、70、80、90、95または100%である配列を有するタンパク質が含まれる。他の適した表面タンパク質には、好ましい表面タンパク質の対応領域(例えば、少なくとも25、50、100、200または500アミノ酸の領域)と同一であるが完全長配列よりは短い連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。
「提示ペプチド」とは、修飾されてウイルスまたは細胞の表面に発現されることが可能なペプチドのことを意味する。提示ペプチドは任意の数のアミノ酸を含みうる。例えば、提示ペプチドは50、40、30、20残基もしくはそれ未満という少ない残基を含んでもよく、または100、150、200残基もしくはそれ以上という多くの残基を含んでもよい。
「共有結合した」とは、一連の共有結合によって共有的に結合または連結していることを意味する。例えば、表面タンパク質は提示ペプチドと直接結合してもよく、または提示リンカー(例えば、少なくとも5、10、20または50アミノ酸のリンカー)を介してペプチドと連結してもよい。
「低分子」とは、本発明のタンパク質融合物を修飾しうる有機化合物または有機化合物由来の部分のことを意味する。通常、低分子はタンパク質融合物の提示ペプチド成分と共有結合している。好ましい低分子には、提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合した化合物または部分が含まれる。修飾されうるアミノ酸側鎖の例には、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはリジン残基の側鎖が含まれる。他の好ましい低分子は、1、2、3、4、5、6、8、10個またはそれ以上の非天然アミノ酸を有する。さらに他の好ましい低分子は、アミノ酸以外の部分(moiety)を有する。例えば、いくつかの態様において、低分子はすべてがアミノ酸からなるわけではない、またはペプチドではない。低分子は分子量が10,000、8,000、6,000、5,000、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、750、500、400、300、250、200または100ダルトン未満であることが好ましい。さらに他の好ましい態様において、低分子の分子量は以下の範囲のいずれかに含まれる:100〜4,000ダルトン、100〜3,000ダルトン;100〜2,000ダルトン;100〜1,000ダルトン;100〜750ダルトン;250〜4,000ダルトン、250〜3,000ダルトン;250〜2,000ダルトン;250〜1,000ダルトン;250〜750ダルトン;400〜4,000ダルトン、400〜3,000ダルトン;400〜2,000ダルトン;400〜1,000ダルトン;または400〜750ダルトン(上限と下限の数値自体も含む)。低分子の分子量は250〜2,000ダルトンであることがより好ましい。低分子は、提示ペプチドの翻訳中、提示ペプチドの翻訳後または全タンパク質融合物の翻訳後のいずれかの時点で提示ペプチドと結合しうる。低分子は天然の化合物でも非天然化合物でもよい。
「翻訳後修飾物(posttranslational modification)」とは、提示ペプチドの翻訳後、またはより好ましくは全タンパク質融合物の翻訳後に本発明のタンパク質融合物を修飾しうる、有機化合物または有機化合物由来の部分のことを意味する。翻訳後修飾物には、提示ペプチドまたはタンパク質融合物の翻訳中に提示ペプチドまたはタンパク質融合物のアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカルボン酸に付加される天然のLアミノ酸は含まれない。
「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中に認められる20種類の天然L-アミノ酸のいずれでもないアミノ酸またはアミノ酸類似体のことを意味する。例えば、非天然アミノ酸は、天然L-アミノ酸のD-異性体であってもよい。非天然アミノ酸の他の例には、非タンパク質性残基またはアミノ酸類似体、例えばβ-アミノ酸(例えば、β-アラニン)、ヒドロキシ酸、N-メチル化酸、シクロへキシアラニン、エチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、アロ-イソロイシン、ホモシステイン、ホモセリン、ホモフェニルアラニンおよび3-アミノ酪酸が含まれる(von Dohrenら、Chem. Biol. 10:R273-279, 1999)。
「ビオチンリガーゼ」とは、ビオチンまたはビオチン類似体と別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)との共有結合を触媒する、1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいビオチンリガーゼには、大腸菌BirA、およびBirAの対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。BirAのこの領域はBirAのアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」とは、4'-ホスホパンテテインまたはその類似体と別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)との共有結合を触媒する、1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいホスホパンテテイニルトランスフェラーゼには、4'-ホスホパンテテインとアシルキャリアータンパク質(ACP)または多ドメイン酵素のACP-ドメインとの結合を触媒するACP合成酵素、例えば、ポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素またはハイブリッド型ポリケチド/非リボソームペプチド合成酵素が含まれる。他の好ましいホスホパンテテイニルトランスフェラーゼには、4'-ホスホパンテテインと多ドメイン酵素のペプチジル担体タンパク質-ドメイン(PCP)との結合を触媒する酵素、例えばポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素またはハイブリッド型ポリケチド/非リボソームペプチド合成酵素が含まれる。さらに他の好ましいホスホパンテテイニルトランスフェラーゼには、大腸菌ACP合成酵素の対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。大腸菌ACP合成酵素のこの領域は、大腸菌ACP合成酵素のアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「アシルキャリアータンパク質(ACP)またはACP-ドメイン」とは、4'-ホスホパンテテインまたは4'-ホスホパンテテインの類似体の共有結合によって修飾されうる、タンパク質、または多ドメインタンパク質のドメインのことを意味する。脂肪酸合成時に、4'-ホスホパンテテインの遊離チオール基は脂肪酸または脂肪酸の成分の結合によって修飾される。ポリケチド合成時に、4'-ホスホパンテテインの遊離チオール基はアシル基、例えば補酵素A(CoA)またはCoA誘導体に由来する二炭素または三炭素部分を含むアシル基の結合によって修飾される(O'Hagan、「The polyketide metabolites」、Ellis Horwood(編)、Chichester, U.K., 1991)。例えば、アシル基はプロピオニル-CoAまたはメチルマロニルCoAに由来するものでよい。好ましいACPには、大腸菌ACP、アルファルファ根粒菌(Rhizobium meliloti)由来の根粒形成タンパク質(nodF)(アクセッション番号A24706)、インゲン菌(Rhizobium leguminosarum)由来の根粒形成タンパク質(nodF)(アクセッション番号CAA27355.1)、ミヤコグサ根粒菌(Mesorhizobium loti)由来のnodFタンパク質(アクセッション番号AP003005)、クフェア・ランセオラータ(Cuphea lanceolata)由来のアシルキャリアータンパク質(アクセッション番号X77621およびS42026)、ホウレンソウ(Spinacia oleracea)由来のアシルキャリアータンパク質I前駆体(アクセッション番号M17636および1410328A)、ホウレンソウ由来のアシルキャリアータンパク質II(アクセッション番号X52065)、コエンドロ(Coriandrum sativum)由来のアシルキャリアータンパク質(アクセッション番号AF083950)、カプシクム・キネンセ(Capsicum chinense)由来のアシルキャリアータンパク質(アクセッション番号AF127796)、グラウカモクマオウ(Casuarina glauca)由来のアシルキャリアータンパク質(アクセッション番号Y10994)およびフラガリア・ベスカ(Fragaria vesca)由来のアシルキャリアータンパク質(アクセッション番号AJ001446)が含まれる。
「ペプチジル担体タンパク質ドメイン(PCP)」とは、4'-ホスホパンテテインまたは4'-ホスホパンテテインの類似体の共有結合によって修飾されうる、多ドメインタンパク質のドメインのことを意味する。4'-ホスホパンテテインの遊離チオール基は一般にアミノ酸またはアミノ酸類似体の結合によって修飾される。
「脂肪酸合成酵素」とは、脂肪酸の形成のために必要な1つまたは複数の反応を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。例えば、脂肪酸合成酵素には、アシル基をホスホパンテテイン化ACPまたはACP-ドメインに転移させるものがある。好ましい脂肪酸合成酵素には、大腸菌脂肪酸合成酵素、分生子緑色色素合成酵素(アクセッション番号Q03149)、黒色アスペルギルス由来のポリケチド合成酵素または脂肪酸合成酵素と推定されるもの(アクセッション番号X65866)、および粘液細菌(Stigmatella aurantiaca)由来のタンパク質MxaC(アクセッション番号AF319998)が含まれる。脂肪酸合成酵素の他の例は、好ましい脂肪酸合成酵素の対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有する。実質的に同一なこの領域は、好ましい脂肪酸合成酵素のアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素および非リボソーム性ペプチド合成酵素の間に高度の相同性があることを考えると、ポリケチド合成酵素または非リボソーム性ペプチド合成酵素(例えば、本明細書に記載するもの)を脂肪酸合成酵素として用いることも考えられる。例えば、Metzらは、原核生物および真核生物の両方における、ポリケチド合成酵素による多価不飽和脂肪酸の生成を報告している(Science 293: 290-293, 2001)。
「ポリケチド合成酵素」とは、ポリケチドの形成のために必要な反応を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。ポリケチドには、β-ケトンの線状反復縮合によって合成されるβ-ケトンの線状反復縮合によって合成される多様な天然物の群が含まれる。例えば、ポリケチド合成酵素には、ポリケチドの合成において、中間生成物に対する新たな官能基(例えば、アシル基または置換アシル基)の共有結合を触媒するものがある。好ましいポリケチド合成酵素には、エクソフィアラ・デルマティティディス(Exophiala dermatitidis)由来のI型ポリケチド合成酵素(アクセッション番号AF130309)、分生子緑色色素合成酵素(アクセッション番号Q03149)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)由来のポリケチド合成酵素と考えられるもの(アクセッション番号S28353)、黒色アスペルギルス由来のポリケチド合成酵素または脂肪酸合成酵素と推定されるもの(アクセッション番号X65866)、アスペルギルス・パラシチクス(Aspergillus parasiticus)由来のポリケチド合成酵素(アクセッション番号L42766)、イネ馬鹿菌病菌(Gibberella fujikuroi)由来のポリケチド合成酵素(アクセッション番号AJ278141)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)由来のポリケチド合成酵素(アクセッション番号AF025541)、ノデュリスポリウム属(Nodulisporium sp.)ATCC74245由来のポリケチド合成酵素(アクセッション番号AF151533)、ウリ類炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)由来のポリケチド合成酵素(アクセッション番号D83643)、および粘液細菌(Stigmatella aurantiaca)由来のタンパク質MxaC(アクセッション番号AF319998)が含まれる。ポリケチド合成酵素の他の例は、好ましいポリケチド合成酵素の対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有する。実質的に同一なこの領域は、好ましいポリケチド合成酵素のアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素および脂肪酸合成酵素の間に高度の相同性があることを考えると、ポリケチド合成酵素または脂肪酸合成酵素(例えば、本明細書に記載するもの)をポリケチド合成酵素として用いることも考えられる。
「非リボソーム性ペプチド合成酵素」とは、非リボソーム的に合成されるポリペプチドの形成のために必要な1つまたは複数の反応を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。例えば、非リボソーム性ペプチド合成酵素には、非リボソーム的に合成されるペプチドの合成において、中間生成物へのアミノ酸またはアミノ酸類似体の共有結合を触媒するものがある。好ましい非リボソーム性ペプチド合成酵素には、チロシジン合成酵素、細菌および真菌の非リボソーム性ペプチド合成酵素、ならびに細菌非リボソーム性ペプチド合成酵素の対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。細菌非リボソーム性ペプチド合成酵素のこの領域は、細菌非リボソーム性ペプチド合成酵素のアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。非リボソーム性ペプチド合成酵素、ポリケチド合成酵素および脂肪酸合成酵素の間に高度の相同性があることを考えると、ポリケチド合成酵素または脂肪酸合成酵素(例えば、本明細書に記載するもの)を脂肪酸合成酵素として用いることも考えられる。
「ハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素」とは、ポリケチド合成酵素に通常認められるドメイン、および非リボソーム性ペプチド合成酵素に通常認められるドメインを有する、1つまたは複数の合成酵素のことを意味する。例えば、ハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素には、ポリケチドの合成において、中間生成物へのアミノ酸および低分子の共有結合を触媒するものがある。好ましいハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素には、細菌および/または真菌のハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素、ならびに細菌ハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素の対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。ハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素のこの領域は、細菌ハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素のアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「リポ酸リガーゼ」とは、リポ酸またはリポ酸類似体と別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)との共有結合を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいリポ酸リガーゼには、大腸菌LplA、および大腸菌LplAの対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。大腸菌LplAのこの領域は、大腸菌LplAのアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「グリコシルトランスフェラーゼ」とは、糖質の別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)への共有的転移を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいグリコシルトランスフェラーゼには、酵母グリコシルトランスフェラーゼ、および酵母グリコシルトランスフェラーゼの対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。酵母グリコシルトランスフェラーゼのこの領域は、酵母グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「ファルネシルトランスフェラーゼ」とは、ファルネシル基またはその類似体の別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)への共有的転移を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいファルネシルトランスフェラーゼには、酵母ファルネシルトランスフェラーゼ、および酵母ファルネシルトランスフェラーゼの対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。酵母ファルネシルトランスフェラーゼのこの領域は、酵母ファルネシルトランスフェラーゼのアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ」とは、ゲラニルゲラニル基またはその類似体と別のタンパク質またはペプチド(例えば、本発明のタンパク質融合物の提示ペプチド成分)との共有結合を触媒する1つまたは複数の酵素のことを意味する。好ましいゲラニルゲラニルトランスフェラーゼには、酵母ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、および酵母ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの対応領域と実質的に同一な連続したアミノ酸の領域を有するタンパク質が含まれる。酵母ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのこの領域は、酵母ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸の少なくとも60、70、80、90、95または100%を含むことが好ましい。
「検出可能な標識」とは、ある分子の存在を標識または検出するための任意の手段のことを意味する。検出可能な標識は当技術分野で周知であり、これには放射性標識(例えば、32Pまたは35Sなどの同位体)および非放射性標識(例えば、化学発光標識または蛍光標識、例えば、フルオレセイン)が非制限的に含まれる。用いる標識はそれ自体を検出できてもよく(例えば、放射性同位体標識または蛍光標識)、または、酵素標識の場合には、補助化合物または組成物の検出可能な化学的変化を触媒してもよい。
「親和性試薬」とは、別の分子と共有的または非共有的に、特異的に結合する(例えば、親和性Ka>104M-1である)任意の分子のことを意味する。親和性試薬には、核酸、タンパク質および化合物(低分子など)が含まれ、さらに抗体-抗原(またはハプテン)対の構成要素、リガンド-受容体対、ビオチン-アビジン対、相補的塩基対を有するポリヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチドタグ)などが含まれる。
「ウイルスの集団または細胞」とは、複数のウイルスまたは細胞のことを意味する。ウイルスまたは細胞の集団は、任意の数の異なる低分子または翻訳後修飾物を発現しうる。例えば、集団は10種、102種、109種もしくは1011種程度の分子を発現してもよく、または1013種、1014種、1015種またはそれ以上もの異なる分子を発現してもよい。
「選択すること」とは、ウイルスまたは細胞を集団内の他のウイルスまたは細胞から実質的に区分することを意味する。区分により、選択段階の後に、集団内の所望の分子は所望でない分子と比べて少なくとも2倍、好ましくは30倍、より好ましくは100倍、最も好ましくは1,000倍に富化されることが好ましい。選択の段階を多数回反復してもよく、種々のタイプの選択段階を所定のアプローチで組み合わせてもよい。集団は少なくとも109個のウイルスまたは細胞、より好ましくは少なくとも1011個、1013個または1014個のウイルスまたは細胞、最も好ましくは少なくとも1015個のウイルスまたは細胞を含むことが好ましい。
「から回収した」とは、選択したウイルスまたは細胞によって発現される低分子または翻訳後修飾物の一部である部分(moiety)を、実質的に単離すること(すわなち、少なくとも2倍の精製)、または同定することを意味する。提示ペプチド上に残っている低分子または翻訳後修飾物は、質量分析またはNMRなどの標準的な技法によって特徴づけることができる。または、低分子または翻訳後修飾物の全体または一部を含む化合物を修飾された提示ペプチドから切断し、その後に特徴づけることもできる。必要に応じて、抽出、沈殿、カラムクロマトグラフィー、磁気ピーズ精製、およびプレートに結合させた標的分子とのパニングなどの標準的な方法を用いて、化合物をさらに精製してもよい。
「変異」とは、挿入、欠失、逆位またはヌクレオチド置換などの、天然の核酸配列または基準核酸配列の変化のことを意味する。好ましくは、この核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、天然の配列からの少なくとも1つのアミノ酸変化を有することが好ましい。細胞のゲノム配列を変化させるための組換えDNA技術の例には、別の生物体(例えば、別の細菌、酵母または哺乳動物の属または種)からのDNA配列をゲノム中に挿入すること、1つまたは複数のDNA配列を除去すること、DNA配列の再配列またはシャッフリングを行うこと、および1つまたは複数の塩基変異(例えば、位置指定変異またはランダム変異)を標的DNA配列に導入することが含まれる。
「実質的に同一な」とは、別の配列のものと少なくとも60、70、80、90または100%同一な配列を有することを意味する。配列同一性は一般に、配列分析ソフトウエア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)を、それに指定されたデフォールトのパラメーターで用いることによって計測される。このソフトウエアプログラムは、種々の置換、欠失および他の改変に対して相同性の程度を指定することにより、類似した配列同士を照合する。
本発明は、目的の標識分子と結合する化合物(例えば、低分子)の作製、選択および同定に関連してさまざまな利点を提供する。比較的大きな核酸および未改変ペプチドの作製および選択を一般に行う現行の方法とは対照的に、本方法は、種々の低分子候補化合物(例えば、直鎖状または分枝状の低分子)を作製するために用いうる。本方法は、本方法ではタンパク質融合物と共有結合した低分子によって多様性を生じさせるという点で、従来のディスプレイ法とは大きく異なる。ウイルスおよび細胞はその内部に、ゲノム中または人工的なDNA挿入物(例えば、プラスミド、コスミドまたは酵母人工染色体)中に、その表面に提示される分子の産生の原因となるタンパク質をコードする核酸を含むことが好ましい。この場合には、低分子の選択により、そのデザインをコードする遺伝情報も得られる。本方法は、非リボソーム的に合成される低分子をウイルスおよび細胞の表面に提示することを可能にする。例えば、これらの低分子には、脂肪酸合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、ポリケチド合成酵素、またはリボソーム合成に起因しない他の合成法によって産生されるものが含まれる。細胞またはウイルス提示を用いるリボソーム産物の提示と、本発明の非リボソーム性提示方法のいくかとの違いを図9に示している。本方法では、提示される分子は提示ペプチドから枝分かれする。これにより、従来のアプローチを用いたのでは提示が不可能な、非リボソーム由来の非常にさまざまな分子の提示が可能になる。このため、本方法は、作製し、提示して、標的分子に対する親和性に基づいて選択することができる候補化合物の多様性を大きく高める。多様なセットの低分子候補化合物を生成するこの能力は、ほとんどの医薬品は分子量が2,000ダルトン未満の化合物であること、または分子量が1,000ダルトン未満というそれよりもさらに低分子の化合物であることから重要である。
本方法はまた、多数の新規化合物の生成、提示および選択がなされる速度の点でも有益である。これらの新規化合物はウイルスまたは細胞の表面に提示されるため、化合物を、標的分子との結合能に関する試験を行う前に細胞内区画から単離する必要はない。多数回の選択を行うことにより、候補化合物の集団は強固な結合性があるものに関して富化され、この際、細胞破壊を行う必要性は全くない。さらに、薬剤候補分子の標的に対する親和性を、例えばμMの範囲からnMの範囲に高めるためには、多数回の選択は一般に、医薬品化学の技法よりも費用がかからない上に迅速である。本方法はまた、選択された細胞を大規模(発酵槽)に培養して、選択された低分子を大量に生産することが容易であることから、選択された化合物の理論的に無限な供給をもたらす。加えて、これらの方法は、種々の標的分子と結合する候補化合物を選択するために逐次的に行うことも同時に行うこともできる。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
詳細な説明
種々の有機分子(例えば、低分子)を、バクテリオファージなどのウイルスの表面、または細菌もしくは酵母細胞などの細胞の表面に提示するための新規な方法を開発した。詳細には、本方法は、(i)有機化合物によって修飾されうる提示ペプチド、および(ii)ウイルスまたは細胞の表面に通常発現されるタンパク質(例えば、ウイルス外被タンパク質、鞭毛タンパク質、細胞受容体または細胞接着分子)、を含むタンパク質融合物を発現させることを含む。これらのタンパク質融合物を発現させ、タンパク質融合物の提示ペプチド成分を細胞内で産生された有機分子によって修飾させる。例えば、ポリケチド抗生物質、脂肪酸、糖質、ステロイド、アルカロイドまたはアラキドン酸などの低分子を提示ペプチドに結合させうる。いくつかの態様においては、有機分子が提示ペプチドの翻訳後に翻訳後修飾物として付加される。続いて、改変されたタンパク質融合物は、細菌、酵母または哺乳動物細胞の表面へと輸送される。
種々の有機分子(例えば、低分子)を、バクテリオファージなどのウイルスの表面、または細菌もしくは酵母細胞などの細胞の表面に提示するための新規な方法を開発した。詳細には、本方法は、(i)有機化合物によって修飾されうる提示ペプチド、および(ii)ウイルスまたは細胞の表面に通常発現されるタンパク質(例えば、ウイルス外被タンパク質、鞭毛タンパク質、細胞受容体または細胞接着分子)、を含むタンパク質融合物を発現させることを含む。これらのタンパク質融合物を発現させ、タンパク質融合物の提示ペプチド成分を細胞内で産生された有機分子によって修飾させる。例えば、ポリケチド抗生物質、脂肪酸、糖質、ステロイド、アルカロイドまたはアラキドン酸などの低分子を提示ペプチドに結合させうる。いくつかの態様においては、有機分子が提示ペプチドの翻訳後に翻訳後修飾物として付加される。続いて、改変されたタンパク質融合物は、細菌、酵母または哺乳動物細胞の表面へと輸送される。
目的の化合物(例えば、標的分子と結合する低分子または翻訳後修飾物)を提示しているウイルスまたは細胞を選択するためには、非常にさまざまな異なる分子を提示しているウイルスの集団および/または細胞を、標的分子(例えば、磁性ビーズと結合した標的分子のような、固定化された標的分子)。それぞれのウイルスまたは細胞は、一意的な低分子の1つまたは複数のコピーを提示することが好ましい。標的分子に対する非特異的結合は、標的分子を修飾されたウイルスまたは細胞と接触させる前に、標的分子を誘導体化されていないウイルスまたは細胞と接触させることによって防ぐことができる。標的分子と高い親和性で結合するウイルスまたは細胞を選好的に捕捉し、大多数のウイルスまたは細胞から精製する。必要に応じて、高い親和性で結合するものに関して富化された新たなウイルスまたは細胞の集団を生じさせるために、選択したウイルスまたは細胞を再び培養してもよい。強固に結合するもの(例えば、μMからnMの結合性があるもの)が集団の大部分を占めるまで、結合および富化(enrichment)のサイクルを連続的に行う。原理的には、提示された1000億種の化合物の集団における1つの目的の化合物をこのようにして選択することができる。
本質的にあらゆる分子を、目的の化合物を選択するための標的分子として用いることができる。標的分子の例には、三次元構造が既知もしくは未知であるタンパク質、ミセル内に安定化された膜タンパク質、全細胞または全組織が含まれる。所望の標的と望ましくない標的の両方が得られる場合には、選択および対抗選択のサイクルを用いることで、所望の標的に対する特異性を向上させることができる。
標的分子と結合する目的の化合物の分子構造は標準的な方法を用いて決定しうる。例えば、修飾されて提示されたペプチドを酵素的または化学的に切断し、低分子によって誘導体化されたアミノ酸またはペプチド断片を作製することができる。これらのアミノ酸または断片は高分解能質量分析またはNMR法によって特徴づけることができる。または、化合物が切断可能な結合を介して提示ペプチドと結合している場合には、化合物と提示ペプチドとの間の結合を破壊して、提示ペプチド由来のアミノ酸を含まない化合物を生じさせることもできる。必要に応じて、結合に関する共通パターンを明らかにするために、単離された化合物の構造を比較することができる。この情報は、選択された高い親和性を持つ低分子のバリアントを提示する細胞および/またはウイルスのライブラリーを作製することによる、さらなる選択サイクルにおいて化合物をさらに最適化するために用いうる。相対的に高い親和性を持つ分子は、選択された低分子の合成の原因となるタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することによって入手しうる。
これらの方法は、さまざまな細菌、酵母および哺乳動物細胞によって産生される低分子を提示する目的で一般に適用しうる。さらに、特定の生合成経路における1つまたは複数の酵素または合成酵素を変異させることにより、新規な化合物を作製することもできる。例えば、ビオチン類似体は、ビオチン生合成経路における酵素を変異させることによって作製しうる。新規な脂質を、脂肪酸合成酵素を変異させることにより、または他のタンパク質のミリスチン化、ファルネシル化もしくはゲラニルゲラニル化のために必要な酵素を変異させることによって作製することもできる。同様に、新規なポリケチドはポリケチド合成酵素を変異させることによって作製しうる。
さらなる目的の化合物を、他の生物体における特定の生合成経路からの1つまたは複数の異種タンパク質を発現させることによって生成させることもできる。例えば、種々の細菌、例えば臨床的に価値のあるポリケチド抗生物質を自然下で産生する細菌由来のポリケチド合成酵素を、異なる異種ポリケチド合成酵素によって産生される成分とのハイブリッド型ポリケチドの作製のために大腸菌で発現させることができる。DNAシャッフリング法を用いて、異なる細菌および/または酵母由来の合成酵素ドメインをコードする核酸を組み合わせて新規なポリペプチド、ポリケチドおよび脂肪酸を生じさせることもできる。
本方法の大きな利点は、選択したウイルスまたは細胞を、標的分子と結合する選択した化合物の本質的に無限な供給を得るために培養しうることである。例えば、本発明の1つの方法では、選択したウイルスを用いてさらなる細胞を感染させ、それによって所望の低分子を提示するさらなるウイルスを作製する。これらのウイルスは新規な低分子を表面に提示し、これらの低分子の産生に必要な情報をゲノム中に有する。これにより、それぞれが低分子の一意的なバリアントを提示している非常に多数のウイルスをスクリーニングし、それでもなお、選択された低分子の産生をコードする遺伝情報を回収することが可能になる。選択した標的と相互作用する低分子を提示するウイルスは、その標的に対するそれらの親和性によって選択的に捕捉しうる(例えば、バイオパニング(biopanning)により)。その後に、ウイルスを、選択したウイルスの同一なコピーを生じさせるために細胞感染によって増幅することができる。選択およびウイルス富化の工程を反復することにより(後者は、選択したウイルスの同一なコピーを生じさせるための細菌の感染による)、標的分子に対して相対的に高い親和性を有する低分子を選択しうる。
または、選択したウイルスが、それが提示する低分子の合成の原因となる核酸のすべては含んでいない場合には、そのウイルスを用いて、低分子の合成の必要な残りの核酸またはすべての核酸を含む細菌(例えば、同一の細菌のコロニー)を感染させることができる。本方法により、所望の低分子を細菌に産生させ、その後に、感染した細菌から放出されたウイルスの表面に提示させることが可能になる。
考えられるもう1つの方法では、標的に対する親和性を有する低分子のバリアントを提示させるために細胞を用いる。これらの細胞は新規な低分子を表面に提示し、これらの低分子の産生のために必要な遺伝情報をゲノム内部(例えば、プラスミド中)に有する。これにより、それぞれが低分子の一意的なバリアントを提示している非常に多数の細胞をスクリーニングすることが可能になり、それでもなお、選択された低分子の産生をコードする遺伝情報を回収することが可能である。選択した標的と相互作用する低分子を提示する細胞を、その標的に対するそれらの親和性によって選択的に捕捉し(例えば、バイオパニング(biopanning)により)、その後にさらなる増殖によって増幅することができる。選択および富化の工程を反復することにより(後者は、選択したウイルスの同一なコピーを生じさせるための細菌の感染による)、標的分子に対して相対的に高い親和性を有する低分子を選択することができる。
または、選択した化合物の合成に関与する酵素をコードする核酸の1つまたは複数を選択したウイルスまたは細胞から単離し(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅によって)、選択した化合物の大規模生産のために、一般に用いられる実験用株などのさらなるウイルスまたは細胞に移行させてもよい。必要に応じて、核酸の単離および移行は、核酸が、表面タンパク質をコードする核酸と機能的に結合しなくなるように行ってもよい。すなわち、選択した化合物を可溶型として発現させた上で、細胞によって分泌させるか、または細胞抽出物から単離することができる。
これらの方法を用いて作製された化合物は、治療薬として用いてもよく、または、ヒトもしくは獣医学的な関心が持たれる動物に用いるための治療薬の開発のためのリード化合物として用いてもよい。例えば、酵素の活性または膜貫通性チャンネルのコンダクタンスを変化させる化合物を単離し、リード化合物として用いることが考えられる。さらに複数回の選択を用いて、これらの化合物を最適化し、標的分子に対する親和性がより高く、他の分子に対する親和性がより低い化合物を得ることもできる。その結果得られた治療薬は、標準的な方法を用いて対象に投与しうる。例えば、化合物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤とともに、単位投薬式剤形として投与してもよい。製剤を作製するための当技術分野で周知の方法は、例えば、「レミントン:薬学の理論および実践(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)」(第19版)、A.R. Gennaro AR.編, 1995, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されている。
以下の実施例は本発明を例示するために提供されるものである。これらの実施例は、細菌、酵母、哺乳動物細胞またはバクテリオファージの表面に任意の目的の化合物を提示させるために容易に改変しうる。それらは決して本発明を限定するものではない。
実施例1
バクテリオファージ上でのビオチンおよびビオチン類似体の提示
ビオチン化タンパク質融合物の発現および提示
ビオチン(ビタミンHとしても知られる245ダルトンの分子)またはビオチン類似体によって修飾しようとする提示ペプチドを含むバクテリオファージ外被タンパク質融合物を作製するためには、Fowlkesら(Biotechniques 3: 422-428, 1992)によって記載されたものと類似した手順で、大腸菌ビオチンリガーゼBirAによって認識されるアミノ酸ペプチドをコードする核酸を、pIII外被タンパク質の部分または全体をコードする核酸の5'末端と融合させる。BirAによってビオチン化されるペプチドの例は、23アミノ酸(Schatz、Bio/Technology 11: 1138-1143, 1993)または14アミノ酸(Beckettら、GLNDIFEAQKIEWH、配列番号:1;Protein Sci, 8: 921-929, 1999)を含む。用いうるその他の提示ペプチドには、ビオチンカルボキシラーゼまたはデカルボキシラーゼなどのビオチンカルボキシル担体タンパク質の全体または部分が含まれる。このような提示ペプチドの例には、緑膿菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(BCCP)(アクセッション番号AE004898)、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、コレラ菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AE004117)、アセチル-CoAカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.2)、インフルエンザ菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(Rd KW20株;アクセッション番号E64105)、家禽コレラ菌(Pasteurella multocida)由来のタンパク質AccB(アクセッション番号AE006150)、シネココッカス属由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(PCC 7942株;アクセッション番号U59235)、アクイフェックス・エオリクス(Aqufex aeolicus)由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AE000736およびD70418)、アナベナ属由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号L14863)、枯草菌由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼサブユニット(ビオチンカルボキシル担体サブユニット)(アクセッション番号Z99116)、シロイヌナズナ由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼ前駆体のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AB005242)および髄膜炎菌Z2491由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼビオチンカルボキシル担体タンパク質と推定されるもの(アクセッション番号AL162753)が含まれる。
バクテリオファージ上でのビオチンおよびビオチン類似体の提示
ビオチン化タンパク質融合物の発現および提示
ビオチン(ビタミンHとしても知られる245ダルトンの分子)またはビオチン類似体によって修飾しようとする提示ペプチドを含むバクテリオファージ外被タンパク質融合物を作製するためには、Fowlkesら(Biotechniques 3: 422-428, 1992)によって記載されたものと類似した手順で、大腸菌ビオチンリガーゼBirAによって認識されるアミノ酸ペプチドをコードする核酸を、pIII外被タンパク質の部分または全体をコードする核酸の5'末端と融合させる。BirAによってビオチン化されるペプチドの例は、23アミノ酸(Schatz、Bio/Technology 11: 1138-1143, 1993)または14アミノ酸(Beckettら、GLNDIFEAQKIEWH、配列番号:1;Protein Sci, 8: 921-929, 1999)を含む。用いうるその他の提示ペプチドには、ビオチンカルボキシラーゼまたはデカルボキシラーゼなどのビオチンカルボキシル担体タンパク質の全体または部分が含まれる。このような提示ペプチドの例には、緑膿菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(BCCP)(アクセッション番号AE004898)、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、コレラ菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AE004117)、アセチル-CoAカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.2)、インフルエンザ菌由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(Rd KW20株;アクセッション番号E64105)、家禽コレラ菌(Pasteurella multocida)由来のタンパク質AccB(アクセッション番号AE006150)、シネココッカス属由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(PCC 7942株;アクセッション番号U59235)、アクイフェックス・エオリクス(Aqufex aeolicus)由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AE000736およびD70418)、アナベナ属由来のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号L14863)、枯草菌由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼサブユニット(ビオチンカルボキシル担体サブユニット)(アクセッション番号Z99116)、シロイヌナズナ由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼ前駆体のビオチンカルボキシル担体タンパク質(アクセッション番号AB005242)および髄膜炎菌Z2491由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼビオチンカルボキシル担体タンパク質と推定されるもの(アクセッション番号AL162753)が含まれる。
23アミノ酸の提示ペプチドを含む外被タンパク質融合物を作製するためには、ペプチド
をコードするとともにXhoIおよびXbaI制限酵素切断部位を5'および3'末端に含む(下線部)核酸
を、pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むベクターM655(Fowlkesら、前記)中のXhoIおよびXbaIクローニング部位に挿入する。または、提示ペプチドを、pVIII外被タンパク質の全体または部分を含むタンパク質融合物として発現させてもよい。バクテリオファージは多数のpVIIIタンパク質を発現し、外被タンパク質融合物はバクテリオファージ外被の相対的にわずかな部分を占めるに過ぎないため、この融合物はバクテリオファージの構築には影響を及ぼさない(Malikら、Nucleic Acids Res. 25(4): 915-916, 1997)。
をコードするとともにXhoIおよびXbaI制限酵素切断部位を5'および3'末端に含む(下線部)核酸
を、pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むベクターM655(Fowlkesら、前記)中のXhoIおよびXbaIクローニング部位に挿入する。または、提示ペプチドを、pVIII外被タンパク質の全体または部分を含むタンパク質融合物として発現させてもよい。バクテリオファージは多数のpVIIIタンパク質を発現し、外被タンパク質融合物はバクテリオファージ外被の相対的にわずかな部分を占めるに過ぎないため、この融合物はバクテリオファージの構築には影響を及ぼさない(Malikら、Nucleic Acids Res. 25(4): 915-916, 1997)。
上記の提示ペプチド中のリジン残基(「K」)にビオチンを共有結合させる大腸菌BirAをコードする核酸は、VentまたはPfu DNAポリメラーゼ(Barkerら、J. Mol. Biol.、146: 451-467, 1981;Howardら、Gene 35: 321-331, 1985)を用いる、大腸菌株ATCC番号11303の染色体DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅によって得られる。このBirA核酸は、Invitrogen社のプラスミドpTrcHis2中のpTrcプロモーターの調節下に置かれる(Tsaoら、Gene 169: 59-64, 1996)。標準的な形質転換法を用いて、バクテリオファージによる感染を可能とするF'エピソーム(DH5αまたはTG1)を有する大腸菌株にこのプラスミドを挿入する(例えば、Ausubelら、前記を参照)。このプラスミドを含む大腸菌細胞を、プラスミド中のアンピシリン耐性遺伝子に起因するアンピシリンに対する耐性に基づいて選択する。選択された大腸菌を、BirAの過剰発現を誘発するためにIPTGにより誘導する(図1)。細胞の形質転換に続いて、BirAタンパク質によって認識されてビオチンを提示するバクテリオファージを生じさせる、23アミノ酸のペプチド配列が遺伝子IIIと融合したものを含む改変バクテリオファージへの感染を行わせる。
バクテリオファージの構築前のビオチン化タンパク質融合物の発現
ビオチン修飾がなされた提示ペプチドを、提示ペプチド中のリジン残基が確実にビオチン化されるようにBirAと同時発現させることができる。すなわち、提示ペプチドをコードする核酸を、遺伝子IIにアミノ酸置換を含むバクテリオファージをコードするベクター(例えば、Amersham Pharmacia BiotechのpCANTAB5E)中の遺伝子IIIと融合させる。この変異を有するバクテリオファージはバクテリオファージ構築のためにヘルパーファージを必要とするため、この戦略により、提示ペプチドのビオチン化のために必要なだけの時間をかけることが可能になる。
ビオチン修飾がなされた提示ペプチドを、提示ペプチド中のリジン残基が確実にビオチン化されるようにBirAと同時発現させることができる。すなわち、提示ペプチドをコードする核酸を、遺伝子IIにアミノ酸置換を含むバクテリオファージをコードするベクター(例えば、Amersham Pharmacia BiotechのpCANTAB5E)中の遺伝子IIIと融合させる。この変異を有するバクテリオファージはバクテリオファージ構築のためにヘルパーファージを必要とするため、この戦略により、提示ペプチドのビオチン化のために必要なだけの時間をかけることが可能になる。
詳細には、大腸菌株に対して、BirAを過剰発現するプラスミド、および外被タンパク質融合物を有するバクテリオファージをコードするベクターによる形質転換を行う。大腸菌細胞がバクテリオファージをコードするベクターおよびBirA発現プラスミドの両方を保有することを確認するために、これらの2つの構築物は異なる抗菌マーカーを含んでいる。外被タンパク質融合物の調節はpCANTAB5Eベクター中のpLacプロモーターの制御下にあるため、BirAはアラビノースBADなどの異なるプロモーターの制御下で調節されることが好ましい。細菌内でのBirAの過剰発現はアラビノースによって誘導される。所望の量の提示ペプチドがビオチン化されたところで(例えば、30、60または90分後)、ビオチンを提示するバクテリオファージを作製するために大腸菌細胞をヘルパーファージM13K07に感染させる。
BirAによってビオチン化される提示ペプチドの量をできるだけ多くするために用いうる代替的な手順は、同じプラスミドを用いて、BirAと提示ペプチドを含む外被タンパク質融合物とを同時発現させることを含む。この手順は、プラスミドpDW363を用いて、本質的には以前に記載された通りに実施しうる(Tsaoら、前記)。簡潔に述べると、BirAおよび外被タンパク質融合物の過剰発現をIPTGによって誘導する。外被タンパク質融合物がビオチン化された後に、提示ビオチンを表面に提示するバクテリオファージ子孫を作製するために大腸菌細胞をバクテリオファージに感染させる。細菌の感染に用いられるバクテリオファージは、外被タンパク質融合物をコードする上記のバクテリオファージでもよく、または任意の他のバクテリオファージでもよい(例えば、野生型pIIIをコードするもの)。細菌の感染に用いられるバクテリオファージが提示ペプチドを含む外被タンパク質融合物の代わりに野生型pIIIタンパク質をコードする場合であっても、形質転換プラスミドによってコードされた大量の過剰発現された外被タンパク質融合物は、バクテリオファージによってコードされる野生型pIII外被タンパク質と有効に競合し、バクテリオファージ子孫として構築される。
新規なビオチン類似体の合成および提示
大腸菌細胞によって合成されるビオチン類似体の量および多様性を増大させるために、ビオチンの合成に関与するタンパク質をコードする1つまたは複数の内因性核酸を変異させ、基質特異性または触媒効率が変化したタンパク質を作製することができる(実施例8)。ビオチン合成に関与する変異させうる酵素の例には、以下のクラスに属する酵素が含まれる:6.2.1.14、2.3.1.47、2.6.1.62、6.3.3.3および2.8.1.6(Marquetら、Vitam. Horm. 61: 51-101, 2001)。BirAなどのビオチンリガーゼを、それらがビオチン類似体を認識し、それらを提示ペプチドの翻訳後修飾に用いる能力を高めるために変異させることもできる。または、他の生物体のビオチン生合成経路由来の異種タンパク質を大腸菌細胞で発現させてもよい。続いて細胞を、標準的な手順を用いて、上記の外被タンパク質融合物を含む改変バクテリオファージに感染させる。
大腸菌細胞によって合成されるビオチン類似体の量および多様性を増大させるために、ビオチンの合成に関与するタンパク質をコードする1つまたは複数の内因性核酸を変異させ、基質特異性または触媒効率が変化したタンパク質を作製することができる(実施例8)。ビオチン合成に関与する変異させうる酵素の例には、以下のクラスに属する酵素が含まれる:6.2.1.14、2.3.1.47、2.6.1.62、6.3.3.3および2.8.1.6(Marquetら、Vitam. Horm. 61: 51-101, 2001)。BirAなどのビオチンリガーゼを、それらがビオチン類似体を認識し、それらを提示ペプチドの翻訳後修飾に用いる能力を高めるために変異させることもできる。または、他の生物体のビオチン生合成経路由来の異種タンパク質を大腸菌細胞で発現させてもよい。続いて細胞を、標準的な手順を用いて、上記の外被タンパク質融合物を含む改変バクテリオファージに感染させる。
ビオチン生合成経路のこの操作のために、天然のビオチンの量が減少することによって大腸菌細胞の増殖が抑制される場合には、ビオチンの合成のために必要な1つまたは複数の酵素の重複コピーを大腸菌に導入して、大腸菌に天然ビオチンおよびビオチン類似体の両方を産生させる。大腸菌に導入しうる、ビオチン合成に関与する酵素の例には、以下のクラスに属するものが含まれる:6.2.1.14、2.3.1.47、2.6.1.62、6.3.3.3および2.8.1.6。
標的分子と結合するビオチン類似体の検出、選択および同定
バクテリオファージの表面にビオチンまたはビオチン類似体が存在することは、ビオチンのストレプトアビジンに対する親和性に基づいて検出しうる。例えば、ストレプトアビジンが酵素(例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシターゼ)と結合したものを、固定化されたバクテリオファージの集団に対して適用する。結合していないか結合の弱いストレプトアビジンを除去するためにバクテリオファージを洗う。バクテリオファージの表面のビオチンまたはビオチン類似体と結合したままのストレプトアビジンは、ストレプトアビジンと結合したタンパク質と基質との反応によって生じる呈色または化学発光に基づいて検出される。
バクテリオファージの表面にビオチンまたはビオチン類似体が存在することは、ビオチンのストレプトアビジンに対する親和性に基づいて検出しうる。例えば、ストレプトアビジンが酵素(例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシターゼ)と結合したものを、固定化されたバクテリオファージの集団に対して適用する。結合していないか結合の弱いストレプトアビジンを除去するためにバクテリオファージを洗う。バクテリオファージの表面のビオチンまたはビオチン類似体と結合したままのストレプトアビジンは、ストレプトアビジンと結合したタンパク質と基質との反応によって生じる呈色または化学発光に基づいて検出される。
または、ビオチンまたはビオチン類似体を表面に発現するバクテリオファージを、ストレプトアビジンを被覆した磁性ビーズを用いて検出すること、および、pVIII外被タンパク質がアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシターゼと結合したものに対する抗体を用いて検出することもできる(Chaietら、Arch. Biochem. Biophys. 106: 1-5, 1964;Bayerら、Methods Enzymol. 184: 49-51, 1990;Bayerら、J. Chromatogr. 510: 3-11, 1990;Brakelら、Methods Enzymol. 184: 437-442, 1990)。ストレプトアビジン変異体を、所望の結合親和性を有するビオチン類似体を選択するために用いることもできる。ビオチンおよびビオチン類似体を標準的な方法を用いて提示ペプチドから切断し、標準的な質量分析またはNMR分析を用いて同定することもできる。
実施例2
バクテリオファージ上でのビオチンの提示
実施例1で考察した通りに、ビオチンを、バクテリオファージの表面のタンパク質との共有結合によって提示しうる有機分子の一例として用いた。322アミノ酸のBirAビオチンリガーゼを、バクテリオファージ(M13)の表面に発現された提示ペプチド上の特定のリジン残基にビオチンを固定化するために用いた。1つの例示的なアプローチでは、これを以下の通りに行った。
バクテリオファージ上でのビオチンの提示
実施例1で考察した通りに、ビオチンを、バクテリオファージの表面のタンパク質との共有結合によって提示しうる有機分子の一例として用いた。322アミノ酸のBirAビオチンリガーゼを、バクテリオファージ(M13)の表面に発現された提示ペプチド上の特定のリジン残基にビオチンを固定化するために用いた。1つの例示的なアプローチでは、これを以下の通りに行った。
実験の詳細
M13外被タンパク質を標的としてビオチンを結合させるために、M13外被タンパク質pIII、および、BirAによってビオチン化される23残基のペプチドを含むタンパク質融合物を作製した。十分なビオチンおよびBirAが確実に得られるように、細胞培地にビオチンを添加し、細胞内部でBirAを過剰発現させた。TOP10F'大腸菌細胞をM13用の宿主として選択した。これらの細胞は、M13による感染、およびアラビノースプロモーターの調節によるBirAの過剰発現の両方を可能にする。
M13外被タンパク質を標的としてビオチンを結合させるために、M13外被タンパク質pIII、および、BirAによってビオチン化される23残基のペプチドを含むタンパク質融合物を作製した。十分なビオチンおよびBirAが確実に得られるように、細胞培地にビオチンを添加し、細胞内部でBirAを過剰発現させた。TOP10F'大腸菌細胞をM13用の宿主として選択した。これらの細胞は、M13による感染、およびアラビノースプロモーターの調節によるBirAの過剰発現の両方を可能にする。
BirAによって認識されるペプチドおよびBirAによって認識されない対照ペプチドのクローニング
ビオチンによって修飾しようとする提示ペ、プチドを含むバクテリオファージ外被タンパク質融合物を作製するために、BirAによって認識される23アミノ酸の配列
の後方にヘキサヒスチジンタグ(H)6(配列番号:7)およびエンドプロテアーゼ第Xa因子によって認識されるペプチド(IEGR;配列番号:8)が続くものからなる33残基のペプチドをコードする核酸を、バクテリオファージベクターM13mp18(New England Biolabs)の遺伝子IIIのシグナルペプチダーゼ切断部位の直後に融合させた。BirAにより認識されるリジンのコード部分がグリシンによって置換されている点を除いて同一なM13ベクターを対照ペプチドとして用いた。各構築物は、以下の通りに構築した2つの断片を連結することによって入手した。
ビオチンによって修飾しようとする提示ペ、プチドを含むバクテリオファージ外被タンパク質融合物を作製するために、BirAによって認識される23アミノ酸の配列
の後方にヘキサヒスチジンタグ(H)6(配列番号:7)およびエンドプロテアーゼ第Xa因子によって認識されるペプチド(IEGR;配列番号:8)が続くものからなる33残基のペプチドをコードする核酸を、バクテリオファージベクターM13mp18(New England Biolabs)の遺伝子IIIのシグナルペプチダーゼ切断部位の直後に融合させた。BirAにより認識されるリジンのコード部分がグリシンによって置換されている点を除いて同一なM13ベクターを対照ペプチドとして用いた。各構築物は、以下の通りに構築した2つの断片を連結することによって入手した。
断片1は、プライマーBspHI-FW
およびBiopep-1-OUTSIDE-BK
を用いるM13mp18のPCR増幅によって入手した。その結果得られた断片1を精製し、プライマーBspHI-FW
およびBiopep-1-INSIDE-BK
を用いてさらに増幅した。この断片を断片-1-FINALと命名した。断片2は、プライマーA1wNI-BK
およびBiopep-1-OUTSIDE-FW
を用いるM13mp18のPCR増幅によって入手した。その結果得られた断片2を精製し、プライマーA1wNI-BK
およびBiopep-1-INSIDE-FW
を用いてさらに増幅した。この断片を断片-2-FINALと命名した。断片-1-FINALおよび断片-2-FINALを連結し、所望のサイズの断片を単離した。この単離した断片をBspHIおよびA1wNIで消化し、M13mp18の同じ部位間で連結した。対照ペプチドを、上記のすべての段階でプライマーBiopep-1-INSIDE-BKの代わりにBiopep-1-INSIDE-BK-CNTRLを用いた点を除いて、同じ様式で作製した。これらの構築物をDNAシークエンシングによって確認した。
およびBiopep-1-OUTSIDE-BK
を用いるM13mp18のPCR増幅によって入手した。その結果得られた断片1を精製し、プライマーBspHI-FW
およびBiopep-1-INSIDE-BK
を用いてさらに増幅した。この断片を断片-1-FINALと命名した。断片2は、プライマーA1wNI-BK
およびBiopep-1-OUTSIDE-FW
を用いるM13mp18のPCR増幅によって入手した。その結果得られた断片2を精製し、プライマーA1wNI-BK
およびBiopep-1-INSIDE-FW
を用いてさらに増幅した。この断片を断片-2-FINALと命名した。断片-1-FINALおよび断片-2-FINALを連結し、所望のサイズの断片を単離した。この単離した断片をBspHIおよびA1wNIで消化し、M13mp18の同じ部位間で連結した。対照ペプチドを、上記のすべての段階でプライマーBiopep-1-INSIDE-BKの代わりにBiopep-1-INSIDE-BK-CNTRLを用いた点を除いて、同じ様式で作製した。これらの構築物をDNAシークエンシングによって確認した。
BirAのクローニング
大腸菌BirAをコードする核酸は、Stratagene社のPfu DNAポリメラーゼを用いる、大腸菌株ATCC番号11303の染色体DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅によって入手した(Barkerら、J. Mol. Biol., 146: 451-467, 1981;Howardら、Gene 35: 321-331, 1985)。このBirA核酸をpBADプロモーターの調節下に置いた。この遺伝子をプラスミドpBADHISA(Invitrogen)のXhoI部位とHindIII部位との間に挿入した。この結果得られたベクターをpBAD-BirA'2'と命名した。このベクターの構築に用いたプライマーはBirA-FW
およびBirA-BK
であった。
大腸菌BirAをコードする核酸は、Stratagene社のPfu DNAポリメラーゼを用いる、大腸菌株ATCC番号11303の染色体DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅によって入手した(Barkerら、J. Mol. Biol., 146: 451-467, 1981;Howardら、Gene 35: 321-331, 1985)。このBirA核酸をpBADプロモーターの調節下に置いた。この遺伝子をプラスミドpBADHISA(Invitrogen)のXhoI部位とHindIII部位との間に挿入した。この結果得られたベクターをpBAD-BirA'2'と命名した。このベクターの構築に用いたプライマーはBirA-FW
およびBirA-BK
であった。
宿主細胞
宿主菌株TOP10F'(Invitrogen)は2xTYおよび15ug/mlのテトラサイクリン中で増殖させた。この菌株にpBAD-BirA'2'による形質転換を行い、15ug/mlテトラサイクリンおよび100ug/mlアンピシリン(37℃)中で選択した。BirA遺伝子は常に20%アラビノース原液を最終濃度0.2%にしたものを用いて誘導した。
宿主菌株TOP10F'(Invitrogen)は2xTYおよび15ug/mlのテトラサイクリン中で増殖させた。この菌株にpBAD-BirA'2'による形質転換を行い、15ug/mlテトラサイクリンおよび100ug/mlアンピシリン(37℃)中で選択した。BirA遺伝子は常に20%アラビノース原液を最終濃度0.2%にしたものを用いて誘導した。
細胞増殖およびバクテリオファージ感染
TOP10F'pBADBirA'2'細胞をファージ感染用に調製するために、細胞を、濃度100μg/mlのビオチン+15μg/mlのテトラサイクリンおよび100μg/mlのアンピシリンの存在下で約10mlの2xTY(37℃)中にて一晩(約16時間)増殖させた。続いて、一晩増殖させた細胞0.25mlを、100μg/mlビオチン、15μg/mlテトラサイクリンおよび100μg/mlアンピシリンを含む新たな10mlの2xTYに添加し、600nmの光学密度が0.5に達するまで増殖させた。続いて細胞を最終濃度0.2%のアラビノースによって誘導し、30分間増殖させた。次に、誘導した細胞0.25ml、およびBirAによって認識されるペプチドをコードする約105個のバクテリオファージ粒子(「バクテリオファージK」)または認識されないもの(「バクテリオファージG」)を、0.2%アラビノース、15μg/mlテトラサイクリン、100μg/mlアンピシリンおよび100mg/mlビオチンを含む10mlの2x TYに対して別個に添加した。これらの培養物を6時間増殖させた後に、バクテリオファージを含む上清を回収した。
TOP10F'pBADBirA'2'細胞をファージ感染用に調製するために、細胞を、濃度100μg/mlのビオチン+15μg/mlのテトラサイクリンおよび100μg/mlのアンピシリンの存在下で約10mlの2xTY(37℃)中にて一晩(約16時間)増殖させた。続いて、一晩増殖させた細胞0.25mlを、100μg/mlビオチン、15μg/mlテトラサイクリンおよび100μg/mlアンピシリンを含む新たな10mlの2xTYに添加し、600nmの光学密度が0.5に達するまで増殖させた。続いて細胞を最終濃度0.2%のアラビノースによって誘導し、30分間増殖させた。次に、誘導した細胞0.25ml、およびBirAによって認識されるペプチドをコードする約105個のバクテリオファージ粒子(「バクテリオファージK」)または認識されないもの(「バクテリオファージG」)を、0.2%アラビノース、15μg/mlテトラサイクリン、100μg/mlアンピシリンおよび100mg/mlビオチンを含む10mlの2x TYに対して別個に添加した。これらの培養物を6時間増殖させた後に、バクテリオファージを含む上清を回収した。
バクテリオファージの力価および感染
バクテリオファージKおよびバクテリオファージGの力価は、バクテリオファージの感染を可能にするF'エピトープを含む宿主菌株TG1を用いて2〜5×1010pfu/mlと判定された。バクテリオファージKおよびバクテリオファージGを用いた結合実験から得られた結果を比較しうるように、感染の前にこれらのバクテリオファージをエンドプロテアーゼ第Xa因子で処理した。この酵素は配列IEGR(配列番号:8)を認識して「R」の後方で切断することによってpIIIのシグナルペプチダーゼ部位の後方に付加された挿入物を除去し、バクテリオファージKおよびバクテリオファージGを同一にする。この戦略はバクテリオファージKおよびバクテリオファージGの粒子数を算定する目的のみに用いた。感染前の第Xa因子によるバクテリオファージKおよびバクテリオファージGの処理は感染性を高めることが観察された。この結果は以下の実験の項にまとめている。
バクテリオファージKおよびバクテリオファージGの力価は、バクテリオファージの感染を可能にするF'エピトープを含む宿主菌株TG1を用いて2〜5×1010pfu/mlと判定された。バクテリオファージKおよびバクテリオファージGを用いた結合実験から得られた結果を比較しうるように、感染の前にこれらのバクテリオファージをエンドプロテアーゼ第Xa因子で処理した。この酵素は配列IEGR(配列番号:8)を認識して「R」の後方で切断することによってpIIIのシグナルペプチダーゼ部位の後方に付加された挿入物を除去し、バクテリオファージKおよびバクテリオファージGを同一にする。この戦略はバクテリオファージKおよびバクテリオファージGの粒子数を算定する目的のみに用いた。感染前の第Xa因子によるバクテリオファージKおよびバクテリオファージGの処理は感染性を高めることが観察された。この結果は以下の実験の項にまとめている。
バクテリオファージKまたはバクテリオファージGの保存液の1/106希釈物からの50μlのアリコートを、100mM NaCl、2mM CaCl2および10mM Tris-HCl pH 8.0中で別個にインキュベートし、TG1細胞の感染に用いた。第Xa因子とのインキュベーションに用いた試料には、総容積52μl中に2μgの第Xa因子を含めた。
K=BirAによって認識されるペプチドを提示しているファージ
G=BirAによって認識されないペプチドを提示しているファージ
第Xa因子で処理していないK=バクテリオファージ187個
第Xa因子で処理したK=バクテリオファージ477個
第Xa因子で処理していないG=バクテリオファージ23個
第Xa因子で処理したG=バクテリオファージ239個
G=BirAによって認識されないペプチドを提示しているファージ
第Xa因子で処理していないK=バクテリオファージ187個
第Xa因子で処理したK=バクテリオファージ477個
第Xa因子で処理していないG=バクテリオファージ23個
第Xa因子で処理したG=バクテリオファージ239個
これらのデータに基づき、第Xa因子には感染に対して有利な効果があり、特にバクテリオファージGの場合にそうであることが示された。この効果はバクテリオファージGおよびKの両方にも生じたため、この効果は、細菌宿主細胞に対する第Xa因子の効果ではなく、第Xa因子とバクテリオファージタンパク質との相互作用によって引き起こされた可能性が高いと考えられる。
KおよびGは融合タンパク質におけるアミノ置換K→Gを除けば同一であるため、pIIIのペプチダーゼ切断シグナルの後方に挿入されたペプチドの除去は明らかに感染性を向上させた。
ビオチンの提示
バクテリオファージの表面にビオチンを提示させるために、宿主細胞を上記の通りに増殖させた。誘導から6時間後に、培養物を約7000×gで遠心して上清を採取した。続いて、バクテリオファージKまたはGの104希釈物(10mM Tris-HCl pH8.0中)の20μlを、ストレプトアビジン被覆ビーズ(Dynal)5μl(約15ピコモル)および175μlの10mM Tris-HCl pH 8.0とともに、1,400rpmで振盪しながら30分間インキュベートした。次に、200μlの10mM Tris-HCl pH 8.0および0.1%Nonident P-40を添加し、ビーズを収集した。ビーズを500μlの10mM Tris-HCl pH 8.0および0.1%Nonident P-40で3回洗った。続いてビーズを200μlの10mM Tris-HCl pH 8.0、0.1%Nonident P-40および2mM CaCl2中に懸濁化し、その後に4μl(4μg)の第Xa因子を添加した。第Xa因子は外被タンパク質融合物を切断し、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合したバクテリオファージをビーズから分離するために用いたため、ビオチンを提示していてストレプトアビジン被覆ビーズと結合したバクテリオファージの数を決定することが可能であった。反応物を一晩(約16時間)インキュベートし、続いて一晩培養物から溶出したバクテリオファージをTG1細胞を用いてプレーティングした。ストレプトアビジン被覆ビーズとの結合後にTG1細胞を感染させることができたファージの数を以下の表Iに挙げた;これらの数は、バクテリオファージがストレプトアビジン被覆ビーズと結合するのに十分な量のビオチンを提示したバクテリオファージの数を表している。
バクテリオファージの表面にビオチンを提示させるために、宿主細胞を上記の通りに増殖させた。誘導から6時間後に、培養物を約7000×gで遠心して上清を採取した。続いて、バクテリオファージKまたはGの104希釈物(10mM Tris-HCl pH8.0中)の20μlを、ストレプトアビジン被覆ビーズ(Dynal)5μl(約15ピコモル)および175μlの10mM Tris-HCl pH 8.0とともに、1,400rpmで振盪しながら30分間インキュベートした。次に、200μlの10mM Tris-HCl pH 8.0および0.1%Nonident P-40を添加し、ビーズを収集した。ビーズを500μlの10mM Tris-HCl pH 8.0および0.1%Nonident P-40で3回洗った。続いてビーズを200μlの10mM Tris-HCl pH 8.0、0.1%Nonident P-40および2mM CaCl2中に懸濁化し、その後に4μl(4μg)の第Xa因子を添加した。第Xa因子は外被タンパク質融合物を切断し、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合したバクテリオファージをビーズから分離するために用いたため、ビオチンを提示していてストレプトアビジン被覆ビーズと結合したバクテリオファージの数を決定することが可能であった。反応物を一晩(約16時間)インキュベートし、続いて一晩培養物から溶出したバクテリオファージをTG1細胞を用いてプレーティングした。ストレプトアビジン被覆ビーズとの結合後にTG1細胞を感染させることができたファージの数を以下の表Iに挙げた;これらの数は、バクテリオファージがストレプトアビジン被覆ビーズと結合するのに十分な量のビオチンを提示したバクテリオファージの数を表している。
これらの結果から、ビーズに対する固定化の程度がはるかに低いバクテリオファージGと比較して、バクテリオファージKがストレプトアビジン被覆ビーズとの結合によって明らかに選好的に固定化されることが示された。これらの結果は、バクテリオファージKの約1%がビオチンを提示することを示唆する。
ビオチンの外因性添加がビオチン化に及ぼす影響
外因性に添加したビオチンがビオチン化に及ぼす影響を計測するために、細胞をビオチンの存在下および非存在下で増殖させることにより、以上の実験におけるビオチン化の程度を計測した。比較のために、バクテリオファージKに関するビオチンの存在下および非存在下での結果を示した。
外因性に添加したビオチンがビオチン化に及ぼす影響を計測するために、細胞をビオチンの存在下および非存在下で増殖させることにより、以上の実験におけるビオチン化の程度を計測した。比較のために、バクテリオファージKに関するビオチンの存在下および非存在下での結果を示した。
これらの結果は、培地への外因性ビオチンの添加により、ビオチン化バクテリオファージKの量が約43%増加したことを示している。この外因性ビオチンが宿主細胞内に拡散し、提示ペプチドをインビボでビオチン化し、その結果、バクテリオファージの外被に取り込まれたビオチン化提示ペプチドの割合が増加した可能性が最も高い。
Stv-38を用いたバクテリオファージKおよびGの精製
以上に考察したように、ストレプトアビジン被覆ビーズからのビオチン化バクテリオファージKの溶出は、外被タンパク質融合物を第Xa因子で切断して、ビオチン化された提示ペプチドをバクテリオファージ粒子の残りの部分から分離することによって行いうる。ビオチンに対する親和性が約108M−1である改変ストレプトアビジンStv-38を利用する、1つの代替的な手順も開発した。バクテリオファージKおよびGを含む上清中に存在するビオチンの量を減らすために、1mlのバクテリオファージKおよびGを200μlの20%PEG 8000(2.5M NaCl中)によって沈殿させた。このバクテリオファージを1mlの20mM Tris pH 7.4および150mM NaCl中に再懸濁した。約10μgのStv-38、容積にして200μlをマイクロタイターウェルに添加して48時間インキュベートした。続いて、プレートを20mM Tris pH 7.5および150mM NaClで4回洗い、その後に3%BSA(低脂肪酸含量、0.002%)(20mM Tris pH 7.5および150mM NaCl中)で3時間ブロックした。続いて、プレートを20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P-40で4回洗った。KまたはGの1/100または1/1000希釈物の20μlのアリコートを各ウェルに添加し、総反応容積を200μlとしたが、このうち180μlは20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P40である。この反応物を1時間インキュベートした後に、マイクロタイターウェルを20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P40で4回洗うことにより、結合していないバクテリオファージを除去した。結合したバクテリオファージは、20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.1%Nonident P40、3mMビオチンおよび2mM CaCl2の250μl中での1時間のインキュベーションによって溶出させた。溶出したバクテリオファージを1.5μlの第Xa因子とともに17時間インキュベートした。続いて、種々の量のファージをTG1細胞とともに混合してプレーティングした。これらの結果を表IIIに示している。
以上に考察したように、ストレプトアビジン被覆ビーズからのビオチン化バクテリオファージKの溶出は、外被タンパク質融合物を第Xa因子で切断して、ビオチン化された提示ペプチドをバクテリオファージ粒子の残りの部分から分離することによって行いうる。ビオチンに対する親和性が約108M−1である改変ストレプトアビジンStv-38を利用する、1つの代替的な手順も開発した。バクテリオファージKおよびGを含む上清中に存在するビオチンの量を減らすために、1mlのバクテリオファージKおよびGを200μlの20%PEG 8000(2.5M NaCl中)によって沈殿させた。このバクテリオファージを1mlの20mM Tris pH 7.4および150mM NaCl中に再懸濁した。約10μgのStv-38、容積にして200μlをマイクロタイターウェルに添加して48時間インキュベートした。続いて、プレートを20mM Tris pH 7.5および150mM NaClで4回洗い、その後に3%BSA(低脂肪酸含量、0.002%)(20mM Tris pH 7.5および150mM NaCl中)で3時間ブロックした。続いて、プレートを20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P-40で4回洗った。KまたはGの1/100または1/1000希釈物の20μlのアリコートを各ウェルに添加し、総反応容積を200μlとしたが、このうち180μlは20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P40である。この反応物を1時間インキュベートした後に、マイクロタイターウェルを20mM Tris pH 7.5、150mM NaClおよび0.1%Nonident P40で4回洗うことにより、結合していないバクテリオファージを除去した。結合したバクテリオファージは、20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.1%Nonident P40、3mMビオチンおよび2mM CaCl2の250μl中での1時間のインキュベーションによって溶出させた。溶出したバクテリオファージを1.5μlの第Xa因子とともに17時間インキュベートした。続いて、種々の量のファージをTG1細胞とともに混合してプレーティングした。これらの結果を表IIIに示している。
これらの結果は、固定化したStv-38を、ビオチンを表面に提示するバクテリオファージの精製に首尾良く用いうることを示している。
総括
これらの以上の結果から、「K」と命名したペプチドがM13の表面に提示されて、低分子ビオチンによって修飾されうることが示された。対照としての、ビオチン化されるリジンがグリシンに置換されている点を除いてペプチド「K」と同一な、「G」と命名した別のペプチドも、M13の表面に提示された。この対照ペプチド「G」はビオチン化されなかった。これに対して、「K」ペプチドの約1%はビオチン化された。
これらの以上の結果から、「K」と命名したペプチドがM13の表面に提示されて、低分子ビオチンによって修飾されうることが示された。対照としての、ビオチン化されるリジンがグリシンに置換されている点を除いてペプチド「K」と同一な、「G」と命名した別のペプチドも、M13の表面に提示された。この対照ペプチド「G」はビオチン化されなかった。これに対して、「K」ペプチドの約1%はビオチン化された。
ある種の場合には、M13の代謝回転が約5分と早いため、この割合は比較的低いと思われる。必要に応じて、成熟M13バクテリオファージの生成のためにヘルパーファージをファージミドを用いて、この代謝回転を緩徐にすることができる。このファージミドは、pIIIと、BirAにより認識されるペプチドとの融合物も含む。この構築物を用いると、pIII-BirAにより認識されるペプチドを、完全なビオチン化を実現するために必要なだけ長くインキュベートすることが可能である。これが実現されたところで、完全にビオチン化されたM13の構築および細胞からの放出を開始させるためにヘルパーファージを添加する。この目的に有用なこのようなベクターの一例は、pCANTAB5 E(RPAS発現モジュール、Amersham)である。このベクターを利用する場合には、BirA遺伝子を含むベクターの抗生物質耐性を変化させる必要がある。特定の例においては、pBADBirA'2'中に存在するアンピシリン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性またはテトラサイクリン耐性遺伝子を用いてもよい。
以上の結果はさらに、M13と結合したビオチン化ペプチドを、天然ストレプトアビジンを被覆したビーズによって捕捉しうることも示している。ビオチンの天然ストレプトアビジンとの結合は本質的に不可逆であるため、結合したM13は第Xa因子を用いて回収した。この酵素は、ペプチド「K」および「G」のC末端に存在するペプチド配列IEGR(配列番号:X)の後方を切断し、これによってストレプトアビジン被覆ビーズに結合したビオチン化提示ペプチドをバクテリオファージ粒子の残りの部分から分離して、バクテリオファージをビーズから精製することを可能にする。第Xa因子の非存在下でも、M13は依然として複製可能であった。第Xa因子を用いる代わりに、ビオチン化バクテリオファージの結合および放出を穏和な条件下で行うために、天然ストレプトアビジンのバリアント(Stv-38)を用いた。本明細書に記載した結果は、ペプチド「K」または「G」を含むpIIIのアミノ末端を第Xa因子を用いて除去するとM13のTG1細胞への感染能が高まることも示している。
類似の方法を、他の分子をバクテリオファージの表面に提示させるために用いることができる。
実施例3
枯草菌胞子上でのビオチンの提示
ビオチンは枯草菌胞子の表面にも提示された。枯草菌胞子タンパク質を標的としてビオチンを結合させるために、胞子外被タンパク質であるCotBと、BirAによってビオチン化される提示ペプチドとのタンパク質融合物を作製した。CotB遺伝子と、BirAにより認識される提示ペプチドをコードするDNAとの核酸融合物を、CotBプロモーターの制御下においた。この核酸融合物を、枯草菌染色体のAmyE座位で二重交差イベントによって組換えを行うベクター中にクローニングした。大腸菌BirA遺伝子産物の入手可能性を確保するために、BirA遺伝子をハイブリッド型IPTG誘導性spacプロモーターの調節下で発現させた。この構築物は、同じ枯草菌染色体のLacA座位での二重交差組換えイベントによっても挿入された。このため、2つの染色体挿入物がこれらの構築物を用いて産生された。AmyE座位およびLacA座位での組換えイベントは、それぞれクロラムフェニコールおよびエリスロマイシンに対する耐性を付与した。
枯草菌胞子上でのビオチンの提示
ビオチンは枯草菌胞子の表面にも提示された。枯草菌胞子タンパク質を標的としてビオチンを結合させるために、胞子外被タンパク質であるCotBと、BirAによってビオチン化される提示ペプチドとのタンパク質融合物を作製した。CotB遺伝子と、BirAにより認識される提示ペプチドをコードするDNAとの核酸融合物を、CotBプロモーターの制御下においた。この核酸融合物を、枯草菌染色体のAmyE座位で二重交差イベントによって組換えを行うベクター中にクローニングした。大腸菌BirA遺伝子産物の入手可能性を確保するために、BirA遺伝子をハイブリッド型IPTG誘導性spacプロモーターの調節下で発現させた。この構築物は、同じ枯草菌染色体のLacA座位での二重交差組換えイベントによっても挿入された。このため、2つの染色体挿入物がこれらの構築物を用いて産生された。AmyE座位およびLacA座位での組換えイベントは、それぞれクロラムフェニコールおよびエリスロマイシンに対する耐性を付与した。
BirAのクローニング
プラスミドpA-spacを、大腸菌BirAを発現させるために用いた。このプラスミドはBirAの産生のためのリボソーム結合部位(RBS)を有しないため、YansuraおよびHenner(Proc Natl Acad Sci U S A 81(2): 439-443, 1984)によって記載されたRBSをこのベクターに追加した。この構築物は、pA-spacをテンプレートとして用いるPCRによって2つの断片を増幅することによって作製した。第1の断片は、プライマーFrag1-BK
およびFrag-FW
を用いて増幅した。第2の断片はプライマーFrag2-FW
およびFrag2-BK
を用いて増幅した。
プラスミドpA-spacを、大腸菌BirAを発現させるために用いた。このプラスミドはBirAの産生のためのリボソーム結合部位(RBS)を有しないため、YansuraおよびHenner(Proc Natl Acad Sci U S A 81(2): 439-443, 1984)によって記載されたRBSをこのベクターに追加した。この構築物は、pA-spacをテンプレートとして用いるPCRによって2つの断片を増幅することによって作製した。第1の断片は、プライマーFrag1-BK
およびFrag-FW
を用いて増幅した。第2の断片はプライマーFrag2-FW
およびFrag2-BK
を用いて増幅した。
断片1および2を制限酵素EcoRIで消化した後に、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。その後に、この断片およびpA-spacを制限酵素SacIを用いて消化した。pA-spacのより大きい断片を回収し、断片1および2の連結によって得られた断片と連結した。所望の配置を備えたクローンを、制限酵素PacIおよびEcoRIを用いて選択した。この結果得られたベクターをpA-spac-RBSと命名した。BirAをコードする遺伝子は、プライマーBirA-EcoRI-FW
およびBirA-SphI-BK-MOD
を用いて大腸菌から増幅した。増幅断片を、pA-spac-RBSのEcoRI部位とSphI部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターを「pA-spac-RBS-BirA」と表記した。PCR反応はすべて、Stratagene社のPfuポリメラーゼを用いて行い、制限酵素およびT4 DNAリガーゼはすべてNew England Biolabs社のものである。
およびBirA-SphI-BK-MOD
を用いて大腸菌から増幅した。増幅断片を、pA-spac-RBSのEcoRI部位とSphI部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターを「pA-spac-RBS-BirA」と表記した。PCR反応はすべて、Stratagene社のPfuポリメラーゼを用いて行い、制限酵素およびT4 DNAリガーゼはすべてNew England Biolabs社のものである。
CotB融合物
枯草菌のCotB遺伝子とBirAにより認識される23アミノ酸配列をコードする核酸
との融合物を含む3種類の構築物を設計した。エンドプロテアーゼ第Xa因子により認識される4つの残基(IEGR、配列番号:8)を、コードされるタンパク質融合物のアミノ末端に付加した。同じく、この配列のC末端にエンドプロテアーゼエンテロキナーゼ軽鎖によって認識される5残基(DDDDK、配列番号:26)を付加した。このペプチドを「ペプチド-K」と命名した。対照として、BirAによってビオチン化されるリジンの代わりにグリシンを有する類似のペプチドを設計した。このペプチドを「ペプチド-G」と命名した。
枯草菌のCotB遺伝子とBirAにより認識される23アミノ酸配列をコードする核酸
との融合物を含む3種類の構築物を設計した。エンドプロテアーゼ第Xa因子により認識される4つの残基(IEGR、配列番号:8)を、コードされるタンパク質融合物のアミノ末端に付加した。同じく、この配列のC末端にエンドプロテアーゼエンテロキナーゼ軽鎖によって認識される5残基(DDDDK、配列番号:26)を付加した。このペプチドを「ペプチド-K」と命名した。対照として、BirAによってビオチン化されるリジンの代わりにグリシンを有する類似のペプチドを設計した。このペプチドを「ペプチド-G」と命名した。
3つがペプチド-Kを含み、3つがペプチド-Gを含む、6種類の融合物を作製した。融合物のあるセット(融合物1)に関しては、ペプチド-Kおよびペプチド-Gを、CotBのC末端の、CotBの残基275の後方に付加した。融合物のもう1つのセット(融合物3)については、CotBの最後の4アミノ酸を融合物1のC末端に付加した。融合物の最後のセット(融合物2)については、ペプチド-Kおよびペプチド-GをCotBの最初の275アミノ酸と融合した。
融合物1に関して、CotB DNAの断片は、プライマーB1-SphI-FW
およびB3-BglII-BK
を用いて枯草菌染色体からPCR増幅した。同様に、ペプチド-Kを生成するためのテンプレートは、プライマーPEP-FW
およびPEP-BK
をアニーリングさせ、Pfuポリメラーゼの存在下で1サイクル伸長させることによって入手した。この結果得られた産物を「テンプレート-K」と命名した。ペプチド-Gを生成するためのテンプレートは、プライマーPEP-FW-CTRL
およびPEP-BK
をアニーリングさせ、Pfuポリメラーゼの存在下で1サイクル伸長させることによって入手した。この結果得られた産物を「テンプレート-G」と命名した。ペプチド-Kおよびペプチド-GをコードするDNAを、それぞれテンプレート-Kおよびテンプレート-Gを用いて、プライマーBio-BglII-FW
およびBio-SalI-BK
を用いるPCRによって入手した。ペプチド-K、ペプチド-Gおよび増幅されたCotB断片をコードする断片を制限酵素BglIIによって消化した。続いて、精製したCotB断片を、ペプチド-Kまたはペプチド-GをコードするDNAと別個に融合させた。これらの連結により、「融合物1K」および「融合物1G」と命名した2つの断片が生じた。融合物1Kおよび融合物1Gを別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位およびSphI制限部位にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion1KおよびpDG364-fusion1Gと命名した。
およびB3-BglII-BK
を用いて枯草菌染色体からPCR増幅した。同様に、ペプチド-Kを生成するためのテンプレートは、プライマーPEP-FW
およびPEP-BK
をアニーリングさせ、Pfuポリメラーゼの存在下で1サイクル伸長させることによって入手した。この結果得られた産物を「テンプレート-K」と命名した。ペプチド-Gを生成するためのテンプレートは、プライマーPEP-FW-CTRL
およびPEP-BK
をアニーリングさせ、Pfuポリメラーゼの存在下で1サイクル伸長させることによって入手した。この結果得られた産物を「テンプレート-G」と命名した。ペプチド-Kおよびペプチド-GをコードするDNAを、それぞれテンプレート-Kおよびテンプレート-Gを用いて、プライマーBio-BglII-FW
およびBio-SalI-BK
を用いるPCRによって入手した。ペプチド-K、ペプチド-Gおよび増幅されたCotB断片をコードする断片を制限酵素BglIIによって消化した。続いて、精製したCotB断片を、ペプチド-Kまたはペプチド-GをコードするDNAと別個に融合させた。これらの連結により、「融合物1K」および「融合物1G」と命名した2つの断片が生じた。融合物1Kおよび融合物1Gを別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位およびSphI制限部位にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion1KおよびpDG364-fusion1Gと命名した。
融合物2に関しては、別のペプチド-K/ペプチド-G-CotB融合物の構築を3つの段階で行った。第1に、プライマーB1-SphI-FW
およびB6-BglII-BK
を用いて、枯草菌染色体の領域のPCR増幅によってCotB DNAを増幅した。この断片を断片「1」と命名した。ペプチド-Kおよびペプチド-Gを、それぞれテンプレート-KおよびテンプレートGを用い、プライマーBio-BglII-FW-Fusion2
およびBio-XhoI-BK
を用いるPCR増幅によって入手した。これらの増幅によって生じた断片を「2K」および「2G」と命名した。最後に、プライマーB7-XhoI-FW-MOD
およびB3-SalI-BK
を用いて、「3」と命名した第3の断片を増幅した。断片1、2Kおよび2GをBglIIで消化した後に、断片1を断片2Kおよび2Gと別個に連結し、それぞれ12Kおよび12Gを作製した。引き続いて、断片12K、12Gおよび3をXhoIで消化した。続いて、断片3を12Kおよび12Gと別個に連結し、「融合物2K」および「融合物2G」と命名した断片を作製した。融合物2Kおよび融合物2Gを、別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位とSphI制限部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion2KおよびpDG364-fusion2Gと命名した。
およびB6-BglII-BK
を用いて、枯草菌染色体の領域のPCR増幅によってCotB DNAを増幅した。この断片を断片「1」と命名した。ペプチド-Kおよびペプチド-Gを、それぞれテンプレート-KおよびテンプレートGを用い、プライマーBio-BglII-FW-Fusion2
およびBio-XhoI-BK
を用いるPCR増幅によって入手した。これらの増幅によって生じた断片を「2K」および「2G」と命名した。最後に、プライマーB7-XhoI-FW-MOD
およびB3-SalI-BK
を用いて、「3」と命名した第3の断片を増幅した。断片1、2Kおよび2GをBglIIで消化した後に、断片1を断片2Kおよび2Gと別個に連結し、それぞれ12Kおよび12Gを作製した。引き続いて、断片12K、12Gおよび3をXhoIで消化した。続いて、断片3を12Kおよび12Gと別個に連結し、「融合物2K」および「融合物2G」と命名した断片を作製した。融合物2Kおよび融合物2Gを、別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位とSphI制限部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion2KおよびpDG364-fusion2Gと命名した。
融合物3の作製に関しては、融合物1Kおよび融合物1Gをテンプレートとして用い、プライマーB1-SphI-FW
およびBio-XhoI-BK
を用いた。この増幅によって生じた2つの断片を「3K」および「3G」と命名した。続いて、プライマーB5-XhoI-Fw
およびB4-SalI-BK
を用いるPCR増幅により、染色体枯草菌DNAからCotBの最後の41残基を入手した。この断片を「41」と命名した。引き続いて、断片3K、3Gおよび41をXhoIで消化した。続いて、断片41を別個に3Kまたは3Gと連結し、「融合物3K」および「融合物3G」と命名した断片を作製した。融合物3Kおよび融合物3Gを、別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位とSphI制限部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion3KおよびpDG364-fusion3Gと命名した。
およびBio-XhoI-BK
を用いた。この増幅によって生じた2つの断片を「3K」および「3G」と命名した。続いて、プライマーB5-XhoI-Fw
およびB4-SalI-BK
を用いるPCR増幅により、染色体枯草菌DNAからCotBの最後の41残基を入手した。この断片を「41」と命名した。引き続いて、断片3K、3Gおよび41をXhoIで消化した。続いて、断片41を別個に3Kまたは3Gと連結し、「融合物3K」および「融合物3G」と命名した断片を作製した。融合物3Kおよび融合物3Gを、別個に、ベクターpDG364のSalI制限部位とSphI制限部位との間にクローニングした。この結果得られたベクターをそれぞれpDG364-fusion3KおよびpDG364-fusion3Gと命名した。
染色体挿入物
枯草菌宿主菌株PY79をビオチンの提示のために用いた。コンピテント細胞は「グローニンゲン法」(「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、HarwoodおよびCutting編、Wiley-Interscience 1990における方法3.2)を用いて入手した。ベクターpA-spac-RBS-BirAをNgoM IVを用いて線状化し、二重交差組換えイベントによって枯草菌染色体に挿入した。形質転換体をエリスロマイシンプレート上で選択した。エリスロマイシンプレート上で増殖したコロニーを、プライマー0N4-complementMOD
および0N5-complement
を用いて選択した。陽性クローンを選択し、「PY79-BirA」と命名した。この菌株を、続いてコンピテント細胞の作製に用いた。ベクターpDG364-fusion1K、pDG364-fusion1G、pDG364-fusion2K、pDG364-fusion2G、pDG364-fusion3KおよびpDG364-fusion3GをPstIによって線状化した。PstI消化によって得られた比較的大きい断片を形質転換に用いた。陽性クローンをそれぞれPY79-BirA-1K、PY79-BirA-1G、PY79-BirA-2K、PY79-BirA-2G、PY79-BirA-3KおよびPY79-BirA-3Gと命名した。形質転換体をクロラムフェニコールプレート上で選択した。クロラムフェニコールプレート上で増殖したコロニーをプライマーAmyS
およびAmyA
を用いて選択した。構築物はすべてDNAシークエンシングによって確認した。
枯草菌宿主菌株PY79をビオチンの提示のために用いた。コンピテント細胞は「グローニンゲン法」(「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、HarwoodおよびCutting編、Wiley-Interscience 1990における方法3.2)を用いて入手した。ベクターpA-spac-RBS-BirAをNgoM IVを用いて線状化し、二重交差組換えイベントによって枯草菌染色体に挿入した。形質転換体をエリスロマイシンプレート上で選択した。エリスロマイシンプレート上で増殖したコロニーを、プライマー0N4-complementMOD
および0N5-complement
を用いて選択した。陽性クローンを選択し、「PY79-BirA」と命名した。この菌株を、続いてコンピテント細胞の作製に用いた。ベクターpDG364-fusion1K、pDG364-fusion1G、pDG364-fusion2K、pDG364-fusion2G、pDG364-fusion3KおよびpDG364-fusion3GをPstIによって線状化した。PstI消化によって得られた比較的大きい断片を形質転換に用いた。陽性クローンをそれぞれPY79-BirA-1K、PY79-BirA-1G、PY79-BirA-2K、PY79-BirA-2G、PY79-BirA-3KおよびPY79-BirA-3Gと命名した。形質転換体をクロラムフェニコールプレート上で選択した。クロラムフェニコールプレート上で増殖したコロニーをプライマーAmyS
およびAmyA
を用いて選択した。構築物はすべてDNAシークエンシングによって確認した。
インビボでの胞子形成-ビオチン化
胞子は「栄養素枯渇法」(「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、HarwoodおよびCutting編、Wiley-Interscience 1990における方法9.1)を用いて入手した。本方法は以前の記載の通りに行ったが、胞子形成の固体期および液体期の間には希釈物に1mM IPTGおよび100μMビオチンを添加した。「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」(前記)415-416ページの手順9.8.2に記載された通りに、胞子をT0(胞子形成の開始時)から24時間後に収集し、リゾチーム処理により、ならびに塩および界面活性剤による洗浄により、精製した。
胞子は「栄養素枯渇法」(「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、HarwoodおよびCutting編、Wiley-Interscience 1990における方法9.1)を用いて入手した。本方法は以前の記載の通りに行ったが、胞子形成の固体期および液体期の間には希釈物に1mM IPTGおよび100μMビオチンを添加した。「桿菌のための分子生物学の方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」(前記)415-416ページの手順9.8.2に記載された通りに、胞子をT0(胞子形成の開始時)から24時間後に収集し、リゾチーム処理により、ならびに塩および界面活性剤による洗浄により、精製した。
PY79-BirA-1K、PY79-BirA-1G、PY79-BirA-2K、PY79-BirA-2G、PY79-BirA-3KおよびPY79-BirA-3Gに由来する胞子がビオチンを提示しうるか否かを検証するために、胞子を約5μlのストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynal)とともに1時間インキュベートした。胞子を、500μlの150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4および0.1%Nonident-P-40により、10分間隔で4回洗った。最後にビーズを1mlの150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4および0.1%Nonident P-40中に再懸濁し、アリコート(10μl、100μlおよび800μl)をLBトップアガーと混合した上で、予熱したLBプレートに播いた。10μlおよび100μlを有するプレート上で増殖した枯草菌コロニーの数は互いに比例していた;しかし、最大のアリコートを播いたプレート上では枯草菌の増殖の強い抑制が常に認められた。これは検査した6種の構築物のすべてで起こった。この結果(100μlアリコートによる)を以下の表IVに示した。
この表で、「#」は投入した胞子およびストレプトアビジン磁性ビーズと結合した胞子の総数を表す。これらの結果は、CotBのアミノ末端にペプチド-Kを有するPY79-BirA-K2に由来する胞子が、CotBのC末端付近にペプチドKを有する他の2つの構築物よりも効率的にビオチン化されうることを示している。
インビトロでのビオチン化
PY79-BirA-K1およびPY79-BirA-K3のビオチン化をインビトロで強化しうるか否かを明らかにするために、提示ペプチドを発現する胞子を、提示ペプチドのインビトロでのビオチン化の程度を計測する目的で、ビオチンおよびBirAを含む培地中でインキュベートした。このアッセイ用のBirAを産生させるために、BirA発現ベクターTOP10F'pBADBirA'2'による発現を細胞内で誘導した。アラビノースプロモーターの誘導から4時間後に、細胞を1/10培養容積中に再懸濁し、50μg/mlリゾチームを加えた50mM Tris-HCl、pH 8.0中で1時間インキュベートしてBirAを培地中に放出させた。続いて、Polyakら(J Biol Chem. 276: 3037-45, 2001)の記載の通りに、胞子のアリコート(105〜106個)を20μlのBirA、10mM MgCl2、50mM KCl、20μMビオチン、3mM ATP、0.1%BSAおよび0.1mM DTTとともにインキュベートした。このアッセイの結果を以下の表Vに示した。
PY79-BirA-K1およびPY79-BirA-K3のビオチン化をインビトロで強化しうるか否かを明らかにするために、提示ペプチドを発現する胞子を、提示ペプチドのインビトロでのビオチン化の程度を計測する目的で、ビオチンおよびBirAを含む培地中でインキュベートした。このアッセイ用のBirAを産生させるために、BirA発現ベクターTOP10F'pBADBirA'2'による発現を細胞内で誘導した。アラビノースプロモーターの誘導から4時間後に、細胞を1/10培養容積中に再懸濁し、50μg/mlリゾチームを加えた50mM Tris-HCl、pH 8.0中で1時間インキュベートしてBirAを培地中に放出させた。続いて、Polyakら(J Biol Chem. 276: 3037-45, 2001)の記載の通りに、胞子のアリコート(105〜106個)を20μlのBirA、10mM MgCl2、50mM KCl、20μMビオチン、3mM ATP、0.1%BSAおよび0.1mM DTTとともにインキュベートした。このアッセイの結果を以下の表Vに示した。
これらの結果は、提示ペプチドを発現する細菌を、インビトロでのビオチン化を可能にするビオチンおよびBirAを含む培地中で必要に応じてインキュベートすることにより、いくつかのディスプレイペプチドに関しては、ビオチン化を強化しうることを示している。
総括
BirA認識配列を有する提示ペプチドを含むいくつかの融合タンパク質がインビボでビオチン化され、枯草菌胞子の表面に発現された。類似の方法を、枯草菌胞子などの細菌の表面に他の分子を提示するために用いることができる。
BirA認識配列を有する提示ペプチドを含むいくつかの融合タンパク質がインビボでビオチン化され、枯草菌胞子の表面に発現された。類似の方法を、枯草菌胞子などの細菌の表面に他の分子を提示するために用いることができる。
実施例4
バクテリオファージ上での脂肪酸の提示
バクテリオファージ上での脂肪酸の提示のためには、脂肪酸生合成においてアシル基活性化の原因となるアシルキャリアータンパク質(ACP)と呼ばれる低分子酸性タンパク質を、バクテリオファージの表面に外被タンパク質融合物の一部として発現させる。ACPは翻訳後修飾を受け、その際、ホロ-ACP-シンテターゼによって4'-ホスホパンテテイン基がCoAからアポ-ACPの特定のセリンへと転移する。この4'-ホスホパンテテイン修飾物は、チオエステル結合を介して脂肪酸と結合する遊離スルフヒドリル基を含む。
バクテリオファージ上での脂肪酸の提示
バクテリオファージ上での脂肪酸の提示のためには、脂肪酸生合成においてアシル基活性化の原因となるアシルキャリアータンパク質(ACP)と呼ばれる低分子酸性タンパク質を、バクテリオファージの表面に外被タンパク質融合物の一部として発現させる。ACPは翻訳後修飾を受け、その際、ホロ-ACP-シンテターゼによって4'-ホスホパンテテイン基がCoAからアポ-ACPの特定のセリンへと転移する。この4'-ホスホパンテテイン修飾物は、チオエステル結合を介して脂肪酸と結合する遊離スルフヒドリル基を含む。
これらの脂肪酸は大腸菌によって内因性脂肪酸経路を用いて産生される。外被タンパク質融合物に含まれるACP上に合成された脂肪酸のみがバクテリオファージ外被タンパク質へと移行する。これに対して、内因性ACP分子は外被タンパク質融合物の一部ではないため、内因性大腸菌ACPの約60,000個のコピー上で合成された脂肪酸は大腸菌内部に留まり、バクテリオファージ外被タンパク質には取り込まれない。各細胞を感染させるのは約100〜200個のバクテリオファージに過ぎず、各バクテリオファージはACP-外被タンパク質融合物の約5つのコピーしか含まないため、内因性ACP分子の代わりに外被タンパク質融合物を改変する脂肪酸分子は細胞1個当たり約500〜1000個に過ぎない。このため、バクテリオファージ外被タンパク質への脂肪酸の取り込みが大腸菌の細胞周期に及ぼす有害作用は、仮にあるにしても非常にわずかであると予想される。
脂肪酸の発現および提示
ACP-外被タンパク質融合物をコードする核酸の作製のためには、ACPをコードする核酸を、大腸菌ゲノムDNA、酵母ゲノムDNA、植物ゲノムDNAまたは任意の他の適切な源からPCR増幅する(Rawlingsら、J. Biol. Chem. 267: 5751-5754, 1992)。ACPをコードするこの核酸を、以前の記載の通りにバクテリオファージ遺伝子IIIと融合させる(Fowlkesら、前記)。必要に応じて、第Xa因子に対する認識配列をコードするリンカー(Ile-Glu-Gly-Arg、Ile-Asp-Gly-ArgまたはAla-Glu-Gly-Arg;それぞれ配列番号:4〜6)を、ACP核酸と遺伝子IIIとの間に挿入することができる(Nagaiら、Nature 309: 810-812, 1984)。このリンカーにより、ACP-脂肪酸複合体をバクテリオファージ外被タンパク質から切断することが可能になる。
ACP-外被タンパク質融合物をコードする核酸の作製のためには、ACPをコードする核酸を、大腸菌ゲノムDNA、酵母ゲノムDNA、植物ゲノムDNAまたは任意の他の適切な源からPCR増幅する(Rawlingsら、J. Biol. Chem. 267: 5751-5754, 1992)。ACPをコードするこの核酸を、以前の記載の通りにバクテリオファージ遺伝子IIIと融合させる(Fowlkesら、前記)。必要に応じて、第Xa因子に対する認識配列をコードするリンカー(Ile-Glu-Gly-Arg、Ile-Asp-Gly-ArgまたはAla-Glu-Gly-Arg;それぞれ配列番号:4〜6)を、ACP核酸と遺伝子IIIとの間に挿入することができる(Nagaiら、Nature 309: 810-812, 1984)。このリンカーにより、ACP-脂肪酸複合体をバクテリオファージ外被タンパク質から切断することが可能になる。
大腸菌株を、ACP-外被タンパク質融合物をコードするバクテリオファージに感染させるが、この際、ACPは内因性タンパク質または異種タンパク質(例えば、大腸菌ACPまたはホウレンソウACPなどの異種ACP)である。バクテリオファージをコードするベクターを保有するものを選択するために、大腸菌細胞を抗生物質の存在下で増殖させる。ACP-外被タンパク質融合物と結合した4'-ホスホパンテテイン補因子の放出をできるだけ抑え、それによって脂肪酸で修飾されうるホスホパンテテイン化タンパク質融合物の量を増やすために、パントテン酸塩(例えば、1〜100mM)を培地に添加する(Keatingら、J. Biol. Chem. 270: 22229-22235, 1995)。詳細には、パントテン酸塩は、通常であればACPからの4'-ホスホパンテテイン補因子を加水分解するACPホスホジエステラーゼという酵素を阻害する。ACP-外被タンパク質融合物と結合した脂肪酸の放出をできるだけ抑えるために、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼを非競合的に阻害する目的で、細胞増殖阻害薬であるダイデムニンB(例えば、1〜100mM)も培地に添加する(Mengら、Biochemistry 37: 10488-10492, 1998)。
4'-ホスホパンテテインの付加によって修飾されるACP-外被タンパク質融合物の量をさらに増やすために、LambalotおよびWalsh(Lambalotら、J. Biol. Chem. 270: 24658-24661, 1995)に記載されているように、選択的には、大腸菌ACP合成酵素(dpj)(Lambalotら、前記)などのACP合成酵素をコードする遺伝子を入手して大腸菌内で過剰発現させてもよい。異種ACP(例えば、ホウレンソウ ACP)をACP-外被タンパク質融合物の一部として用いる場合には、内因性大腸菌ACP合成酵素(これは過剰発現させてもさせなくともよい)によってそれをホスホパンテテイン化してもよい。または、異種ACP合成酵素(例えば、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACP合成酵素)を、ホスホパンテテイン化されるACP-外被タンパク質融合物の量を増やすために細菌内で発現させることもできる(Guerraら、J. Biol. Chem. 263: 4386-4391, 1988)。大腸菌ACP-外被タンパク質融合物が細胞増殖を阻害することが認められた場合には、異種ACPを含むACP-外被タンパク質融合物を用いる方が、ACP-外被タンパク質融合物を用いるよりも好ましいと考えられる。
バクテリオファージ構築の前の修飾タンパク質融合物の発現
脂肪酸で修飾されるACP-外被タンパク質融合物の量を増やすための1つの代替的な方法は、バクテリオファージの構築のためにヘルパーファージを必要とするバクテリオファージをコードするベクターを用いることを含む。このアプローチでは、バクテリオファージの構築の前にタンパク質融合物中のACPが脂肪酸で十分に修飾されることが保証される。ACP外被タンパク質融合物をヘルパーファージの非存在下で細菌内で発現させることにより、ACP-外被タンパク質融合物が、脂肪酸合成における固定化支持体として、内因性の野生型ACP分子と競合するのに十分な量として産生される。ヘルパーファージへの感染後に、細菌は、バクテリオファージ外被タンパク質上に脂肪酸を有する修飾されたACP-外被タンパク質融合物を発現するバクテリオファージを産生する。
脂肪酸で修飾されるACP-外被タンパク質融合物の量を増やすための1つの代替的な方法は、バクテリオファージの構築のためにヘルパーファージを必要とするバクテリオファージをコードするベクターを用いることを含む。このアプローチでは、バクテリオファージの構築の前にタンパク質融合物中のACPが脂肪酸で十分に修飾されることが保証される。ACP外被タンパク質融合物をヘルパーファージの非存在下で細菌内で発現させることにより、ACP-外被タンパク質融合物が、脂肪酸合成における固定化支持体として、内因性の野生型ACP分子と競合するのに十分な量として産生される。ヘルパーファージへの感染後に、細菌は、バクテリオファージ外被タンパク質上に脂肪酸を有する修飾されたACP-外被タンパク質融合物を発現するバクテリオファージを産生する。
または、修飾されたACP-外被タンパク質融合物の量を、バクテリオファージ感染の前に外被タンパク質融合物を発現するプラスミドを用いることによって増やすこともできる。ACP-外被タンパク質融合物の所望の量が脂肪酸で修飾された後に、大腸菌細胞にバクテリオファージを感染させる。本方法は、いずれのアプローチもバクテリオファージの構築前に修飾ACP-外被タンパク質融合物の過剰産生をもたらす点で、ヘルパーファージを用いるものと類似している。
新規な脂肪酸の合成および提示
大腸菌細胞によって合成される不飽和および/または飽和脂肪酸の量および多様性を増大させるために、脂肪酸の合成に関与するタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸を変異させ、基質特異性または触媒効率が変化したタンパク質を作製することができる(実施例7)。または、異種脂肪酸合成酵素を大腸菌細胞で発現させてもよい。続いて細胞を、標準的な手順を用いて、上記の外被タンパク質融合物を含む改変バクテリオファージに感染させる。
大腸菌細胞によって合成される不飽和および/または飽和脂肪酸の量および多様性を増大させるために、脂肪酸の合成に関与するタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸を変異させ、基質特異性または触媒効率が変化したタンパク質を作製することができる(実施例7)。または、異種脂肪酸合成酵素を大腸菌細胞で発現させてもよい。続いて細胞を、標準的な手順を用いて、上記の外被タンパク質融合物を含む改変バクテリオファージに感染させる。
または、以上の方法を、ACPの代わりにタンパク質融合物中の提示ペプチドとして、多ドメイン酵素由来のアシルキャリアータンパク質ドメイン(ACP-ドメイン)を用いて行ってもよい。図2は多ドメイン脂肪酸合成酵素の一例を示している。
標的分子と結合する脂肪酸の選択および同定
脂肪酸を表面に発現する、以上のいずれかの方法によって作製されたバクテリオファージは、標準的な手順を用いて収集して精製することができる。例えば、目的の標識分子と結合する脂肪酸を提示しているバクテリオファージは、固定化された標的分子を、標準的なカラムクロマトグラフィー、磁性ビーズ精製またはパニング手順に用いて選択しうる(例えば、Ausubelら、前記を参照)。単離したバクテリオファージは、ACP-脂肪酸複合体をバクテリオファージ表面の外被タンパク質と連結しているリンカーを切断するために、第Xa因子で処理することができる。続いて、バクテリオファージをPEG沈殿によって除去する。脂肪酸をACP分子から分離するためには、脂肪酸とACP分子との間のチオエステル結合を、ヒドロキシルアミン(pH 6.5)(Rosenfeldら、Anal. Biochem. 64: 221-228 1975)、水素化ホウ素ナトリウム(Barronら、Anal. Biochem. 40: 1742-1744 1968)または非特異的チオエステラーゼもしくはエステラーゼで処理することによって切断する。回収した脂肪酸の同定は質量分析またはNMR分析によって行いうる。
脂肪酸を表面に発現する、以上のいずれかの方法によって作製されたバクテリオファージは、標準的な手順を用いて収集して精製することができる。例えば、目的の標識分子と結合する脂肪酸を提示しているバクテリオファージは、固定化された標的分子を、標準的なカラムクロマトグラフィー、磁性ビーズ精製またはパニング手順に用いて選択しうる(例えば、Ausubelら、前記を参照)。単離したバクテリオファージは、ACP-脂肪酸複合体をバクテリオファージ表面の外被タンパク質と連結しているリンカーを切断するために、第Xa因子で処理することができる。続いて、バクテリオファージをPEG沈殿によって除去する。脂肪酸をACP分子から分離するためには、脂肪酸とACP分子との間のチオエステル結合を、ヒドロキシルアミン(pH 6.5)(Rosenfeldら、Anal. Biochem. 64: 221-228 1975)、水素化ホウ素ナトリウム(Barronら、Anal. Biochem. 40: 1742-1744 1968)または非特異的チオエステラーゼもしくはエステラーゼで処理することによって切断する。回収した脂肪酸の同定は質量分析またはNMR分析によって行いうる。
実施例5
脂肪酸の合成に関与する低分子基のT7バクテリオファージ上での提示
その他の有機分子を、T7バクテリオファージなどのファージの表面にあるタンパク質との共有結合を介して提示することができる。出発材料としてアセチル-CoAおよびマロニル-CoAを別個に使用して、脂肪酸合成に関与する低分子基を用いた。反応は以下の通りにまとめられる:
脂肪酸の合成に関与する低分子基のT7バクテリオファージ上での提示
その他の有機分子を、T7バクテリオファージなどのファージの表面にあるタンパク質との共有結合を介して提示することができる。出発材料としてアセチル-CoAおよびマロニル-CoAを別個に使用して、脂肪酸合成に関与する低分子基を用いた。反応は以下の通りにまとめられる:
大腸菌アシルキャリアータンパク質(ACP)を、アセチル基およびマロニル基を係留するための支持体として選択し、大腸菌の内因性脂肪酸機構を、T7-ACPの表面に提示されるマロニル基およびアセチル基をACPに結合させるために用いた。ACP遺伝子をT7のタンパク質10BのC末端と融合させた(T7セレクトディスプレイシステム、Novagen)。精製を容易にするために、ヘキサヒスチジンタグをACPのC末端に付加し、エンドプロテイナーゼ第Xa因子によって認識される配列(IEGR)をACPのアミノ末端に付加した。BLT5615大腸菌細胞をT7の宿主として選択した。これらの細胞は、バクテリオファージの構築のために必要なキャプシドタンパク質を大量に供給するプラスミドを含む。この種のタンパク質の産生を調節するプロモーターはIPTGにより誘導しうる。
ACPのクローニング
ACPをコードする遺伝子は、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いることにより、大腸菌株ATCC番号11303の染色体DNAからPCRによって入手した。この遺伝子をネステッドPCR法を用いて増幅した。最初に、プライマー
および
を用いてPCR反応を行った。この反応によるPCR産物を、プライマーACP-EcoRI-FW
およびACP-HindIII-BK
を用いる第2のPCR反応のためのテンプレートとして用いた。この最終的なPCR産物を精製し、EcoRIおよびHindIIIで消化した。この断片を、これらの2つの酵素による消化処理がすでに行われたT7 EcoRI/HindIIIアーム(Novagen)と連結した。続いて、この連結混合物をインビトロパッケージングのためにT7パッケージング抽出物と混合した。最終的に構築されたT7バクテリオファージをLB中に希釈し、BLT5615細胞とともにインキュベートした上で、IPTGを含むTop LBを用いてLBプレートに播いた。所望の配列を有するT7バクテリオファージが見いだされ、これをT7-ACPと命名した。
ACPをコードする遺伝子は、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いることにより、大腸菌株ATCC番号11303の染色体DNAからPCRによって入手した。この遺伝子をネステッドPCR法を用いて増幅した。最初に、プライマー
および
を用いてPCR反応を行った。この反応によるPCR産物を、プライマーACP-EcoRI-FW
およびACP-HindIII-BK
を用いる第2のPCR反応のためのテンプレートとして用いた。この最終的なPCR産物を精製し、EcoRIおよびHindIIIで消化した。この断片を、これらの2つの酵素による消化処理がすでに行われたT7 EcoRI/HindIIIアーム(Novagen)と連結した。続いて、この連結混合物をインビトロパッケージングのためにT7パッケージング抽出物と混合した。最終的に構築されたT7バクテリオファージをLB中に希釈し、BLT5615細胞とともにインキュベートした上で、IPTGを含むTop LBを用いてLBプレートに播いた。所望の配列を有するT7バクテリオファージが見いだされ、これをT7-ACPと命名した。
宿主細胞
BLT5615株(Novagen)を宿主細胞として用いた。この菌株を、0.4%グルコース、100μMビオチン、1mMチアミン、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、100μg/mlアンピシリンを加えたM9最小培地中で増殖させた。
BLT5615株(Novagen)を宿主細胞として用いた。この菌株を、0.4%グルコース、100μMビオチン、1mMチアミン、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、100μg/mlアンピシリンを加えたM9最小培地中で増殖させた。
ACPの産生
アセチル含有化合物およびマロニル含有化合物の提示
BLT5615細胞を、CoAの前駆体であるβ-アラニンの細胞内の量をできるだけ減らすために、上記の通りに最小培地中で増殖させた。これは、放射標識したアセチル基およびマロニル基とACPとの結合が確実に起こるように行った。実験はすべて、対数期の最初まで増殖させた上で4℃で保存したBLT5615細胞10μlを含む25mlの最小培地(上記参照)を用いて開始した。この25mlのOD600が約0.05に達した時点で、5mlのアリコートを50μlの[2-14C]マロニル-CoA(52Ci/mol、20μCi/ml;Amersham)とともにインキュベートし、これとは別個に、もう1つの5mlアリコートを100μlの[3H]アセチルCoA(230Ci/mol、50μCi/ml;Amersham)とともにインキュベートした。細胞がOD600=0.5に達した時点で、IPTGを最終濃度1mMとなるように添加した。続いて、30分後に約2〜3×103個のT7-ACP分子を各容器に添加した。増殖を約3時間続けた後に細胞を溶解させた。続いて、細胞溶解産物を遠心分離によって除去し、T7-ACP分子を含む上清を採取した。
アセチル含有化合物およびマロニル含有化合物の提示
BLT5615細胞を、CoAの前駆体であるβ-アラニンの細胞内の量をできるだけ減らすために、上記の通りに最小培地中で増殖させた。これは、放射標識したアセチル基およびマロニル基とACPとの結合が確実に起こるように行った。実験はすべて、対数期の最初まで増殖させた上で4℃で保存したBLT5615細胞10μlを含む25mlの最小培地(上記参照)を用いて開始した。この25mlのOD600が約0.05に達した時点で、5mlのアリコートを50μlの[2-14C]マロニル-CoA(52Ci/mol、20μCi/ml;Amersham)とともにインキュベートし、これとは別個に、もう1つの5mlアリコートを100μlの[3H]アセチルCoA(230Ci/mol、50μCi/ml;Amersham)とともにインキュベートした。細胞がOD600=0.5に達した時点で、IPTGを最終濃度1mMとなるように添加した。続いて、30分後に約2〜3×103個のT7-ACP分子を各容器に添加した。増殖を約3時間続けた後に細胞を溶解させた。続いて、細胞溶解産物を遠心分離によって除去し、T7-ACP分子を含む上清を採取した。
ニッケルカラムを用いた放射標識ACPの精製
放射標識T7-ACP分子を含む、採取した上清を、上清の1/6倍容積の20%PEG 8000(2.5M NaCl中)とともにインキュベートした。試料を混合し、氷上で30分間インキュベートした。続いて、混合物を12,000rpmで15分間遠心してT7-ACP分子を沈降させた。2mlのT7-ACPから得たペレットを、400μlの2mM CaCl2、100mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 8.0に2μgの第Xa因子を加えたものの中に再懸濁した。10B外被タンパク質からACPを切断するために、この混合物を室温(約22℃)で16時間インキュベートした。この混合物を、膨潤して200μlの結合マトリックスとなるニッケルアガロースのディスク(Pierce)を含むミニカラムにローディングした。カラムは150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4によって平衡化した上で試料をローディングした。カラムを400μlの150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4で5回洗い、ACPを400μlの50mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4による3回の洗浄によって溶出させた。
放射標識T7-ACP分子を含む、採取した上清を、上清の1/6倍容積の20%PEG 8000(2.5M NaCl中)とともにインキュベートした。試料を混合し、氷上で30分間インキュベートした。続いて、混合物を12,000rpmで15分間遠心してT7-ACP分子を沈降させた。2mlのT7-ACPから得たペレットを、400μlの2mM CaCl2、100mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 8.0に2μgの第Xa因子を加えたものの中に再懸濁した。10B外被タンパク質からACPを切断するために、この混合物を室温(約22℃)で16時間インキュベートした。この混合物を、膨潤して200μlの結合マトリックスとなるニッケルアガロースのディスク(Pierce)を含むミニカラムにローディングした。カラムは150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4によって平衡化した上で試料をローディングした。カラムを400μlの150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4で5回洗い、ACPを400μlの50mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4による3回の洗浄によって溶出させた。
結果
以下の表VIのデータは、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAのそれぞれ別個の存在下で増殖させたT7-ACP分子からのACPを精製するために用いたカラムの流出液中に検出されたカウントの量を示している。
以下の表VIのデータは、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAのそれぞれ別個の存在下で増殖させたT7-ACP分子からのACPを精製するために用いたカラムの流出液中に検出されたカウントの量を示している。
マロニル-CoAとともにインキュベートした試料の場合には、溶出した試料は4.16ピコモルまたは2.5×1012個のT7-ACP分子に相当する。T7-ACP力価は高めにみて1×1011/mlであるため、このことは平均で約12.5個のマロニル基がACPに結合していることを示す。アセチル-CoAとともにインキュベートした試料の場合には、溶出した試料は0.6ピコモルまたは3.6×1011個のT7-ACP分子に相当する。T7-ACP力価は高めにみて1×1011/mlであるため、このことは平均1.8個のアセチル基がACPに結合していることを示す。
放射標識ACFのサイズ排除分析
この実験では、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAのそれぞれ別個の存在下で増殖させたT7-ACP分子の表面に提示されたACPが放射標識されたか否かを明らかにするためにサイズ排除濾過を用いた。すなわち、カットオフ値100kDaの濾過膜を通過したT7-ACP分子を含む溶液中の放射能を測定した。次に、濾過の前に溶液をまず第Xa因子とともにインキュベートした点を除いて、同じ実験を繰り返した。ACPは第Xa因子によって認識されるペプチドを介してT7-ACPの10Bタンパク質と融合しており、しかもACPは8.8kDaに過ぎないため、第Xa因子で処理するとACPがバクテリオファージ表面から放出されて、ACPがカットオフ値100kDaの濾過膜から流出するはずである。ACPが放射標識されていれば、膜を通過する放射能の量は増加すると考えられる。実験の詳細および結果を以下に示す。
この実験では、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAのそれぞれ別個の存在下で増殖させたT7-ACP分子の表面に提示されたACPが放射標識されたか否かを明らかにするためにサイズ排除濾過を用いた。すなわち、カットオフ値100kDaの濾過膜を通過したT7-ACP分子を含む溶液中の放射能を測定した。次に、濾過の前に溶液をまず第Xa因子とともにインキュベートした点を除いて、同じ実験を繰り返した。ACPは第Xa因子によって認識されるペプチドを介してT7-ACPの10Bタンパク質と融合しており、しかもACPは8.8kDaに過ぎないため、第Xa因子で処理するとACPがバクテリオファージ表面から放出されて、ACPがカットオフ値100kDaの濾過膜から流出するはずである。ACPが放射標識されていれば、膜を通過する放射能の量は増加すると考えられる。実験の詳細および結果を以下に示す。
沈降した2mlのT7-ACP分子を1mlの150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4中に溶解し、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAのそれぞれ別個の存在下で標識した300μlのT7-ACPを第Xa因子によって消化した。続いて、以上の試料をカットオフ値100kDaの濾過膜を用いて濾過し、第Xa因子で処理していない300μlのT7-ACP試料を対照として用いた。これらの試料の200μlを収集し、流出液中の放射能の量をシンチレーション計数によって測定した。重要なことに、膜を通過したカウント数のかなりの割合は、沈降したT7-ACP分子を含む残りの液中の残留物である非結合性の[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAに由来した。
結果は2mlのT7-ACPに対して標準化されており、バックグラウンドシグナルはすでに差し引かれている。
これらの結果は、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAによってそれぞれ別個に、ACPが放射標識されたことを示している。このデータは、T7-ACPの力価が1×1011/mlと(以上の表VII)であると仮定して、それぞれ平均8.9個および0.9個の放射標識されたマロニル基およびアセチル基がACPと結合していることを示唆する。
ACPと結合した放射標識材料の非変性PAGE分析
脂肪酸合成に関与する放射標識された低分子基をACPが提示するか否かを検討するために、15%非変性ゲル(Tris-HCl pH 8.0)分析を行った。ACPをバクテリオファージ外被から放出させるために、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチルCoAのそれぞれ別個によってT7-ACP分子を2μgの第Xa因子とともに、50mM NaCl、2mM CaCl2、20mM Tris-HCl pH 8.0を含む200μlの緩衝液中で14時間インキュベートした。続いて試料を18μlに濃縮した。緩衝液の添加後に、試料を約1.25時間、10V/cmで泳動した。電気泳動の後に、ゲルをX線フィルムに対して42時間露出した。
脂肪酸合成に関与する放射標識された低分子基をACPが提示するか否かを検討するために、15%非変性ゲル(Tris-HCl pH 8.0)分析を行った。ACPをバクテリオファージ外被から放出させるために、[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチルCoAのそれぞれ別個によってT7-ACP分子を2μgの第Xa因子とともに、50mM NaCl、2mM CaCl2、20mM Tris-HCl pH 8.0を含む200μlの緩衝液中で14時間インキュベートした。続いて試料を18μlに濃縮した。緩衝液の添加後に、試料を約1.25時間、10V/cmで泳動した。電気泳動の後に、ゲルをX線フィルムに対して42時間露出した。
結果
以下の図10に見てとれるように、このオートラジオグラムは、[2-14C]マロニル-ACPの存在下で増殖させて第Xa因子で消化したT7-ACPをローディングしたレーンにおける単一のバンドを示している。[3H]マロニル-CoAの存在下で増殖させて第Xa因子で消化したT7-ACPをローディングしたレーンにはバンドは検出されなかった。すなわち、非変性ゲルにより、[2-14C]マロニルがACPと結合していたことが確認された。このことは、T7-ACPバクテリオファージ全体ではゲルを通過できないという事実によって裏づけられる。以上に考察したように、エンドプロテイナーゼ第Xa因子は10Bタンパク質とACPとの間の配列IEGRを認識するため、第Xa因子で消化するとバクテリオファージ表面からACPが放出される。タンパク質10Bはバクテリオファージの表面に結合したまま残り、ゲルには入り込まないため、第Xa因子は[2-14C]マロニル基が結合したACPを放出させ、これがゲルを通過しうる唯一のタンパク質である。
以下の図10に見てとれるように、このオートラジオグラムは、[2-14C]マロニル-ACPの存在下で増殖させて第Xa因子で消化したT7-ACPをローディングしたレーンにおける単一のバンドを示している。[3H]マロニル-CoAの存在下で増殖させて第Xa因子で消化したT7-ACPをローディングしたレーンにはバンドは検出されなかった。すなわち、非変性ゲルにより、[2-14C]マロニルがACPと結合していたことが確認された。このことは、T7-ACPバクテリオファージ全体ではゲルを通過できないという事実によって裏づけられる。以上に考察したように、エンドプロテイナーゼ第Xa因子は10Bタンパク質とACPとの間の配列IEGRを認識するため、第Xa因子で消化するとバクテリオファージ表面からACPが放出される。タンパク質10Bはバクテリオファージの表面に結合したまま残り、ゲルには入り込まないため、第Xa因子は[2-14C]マロニル基が結合したACPを放出させ、これがゲルを通過しうる唯一のタンパク質である。
総括
以上をまとめると、実験結果から、T7-ACPの表面に、脂肪酸合成に関与する低分子基がACPと共有結合したものを提示させうることが示された。また、ニッケルカラム精製およびカットオフ値100kDaの膜濾過のいずれによっても、T7-ACPの表面にあるACPが、それぞれ[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAに由来するマロニル基およびアセチル基のそれぞれによって修飾されることが示唆された。ACP上で検出されたカウント数およびT7-ACPの力価に基づくと、本発明者らのデータは、[3H]アセチル-CoA由来のアセチル基が平均で0.9〜1.8個ACPに結合しており、それとは別個に、[2-14C]マロニル-CoA由来のマロニル基が平均8.9〜12.5個ACPに結合していることを示唆する。さらに、電気泳動ゲル分析により、ACPが大腸菌の内因性脂肪酸合成機構によってインビボで修飾されていること、および、ACPが[2-14C]マロニル-CoAを前駆体として用いる脂肪酸合成に関与する低分子基を提示しうることもさらに示された。
以上をまとめると、実験結果から、T7-ACPの表面に、脂肪酸合成に関与する低分子基がACPと共有結合したものを提示させうることが示された。また、ニッケルカラム精製およびカットオフ値100kDaの膜濾過のいずれによっても、T7-ACPの表面にあるACPが、それぞれ[2-14C]マロニル-CoAおよび[3H]アセチル-CoAに由来するマロニル基およびアセチル基のそれぞれによって修飾されることが示唆された。ACP上で検出されたカウント数およびT7-ACPの力価に基づくと、本発明者らのデータは、[3H]アセチル-CoA由来のアセチル基が平均で0.9〜1.8個ACPに結合しており、それとは別個に、[2-14C]マロニル-CoA由来のマロニル基が平均8.9〜12.5個ACPに結合していることを示唆する。さらに、電気泳動ゲル分析により、ACPが大腸菌の内因性脂肪酸合成機構によってインビボで修飾されていること、および、ACPが[2-14C]マロニル-CoAを前駆体として用いる脂肪酸合成に関与する低分子基を提示しうることもさらに示された。
実施例6
酵母の表面での脂肪酸の提示
脂肪酸の発現および提示
酵母の表面での脂肪酸の提示のためには、ACP遺伝子(例えば、大腸菌ACPまたは酵母ACP)をコードする遺伝子を、細胞接着に関与する表面タンパク質であるα-アグルチニンの酵母Aga2pタンパク質サブユニットの全体または部分をコードする核酸と融合させる(Schreuderら、Trends Biotechnol. 14: 115-120, 1996)。pCT302と類似した発現系を用いて、ACP核酸を酵母Aga2p核酸とインフレームに挿入することができる(Boderら、Methods Enzymol. 328: 430-444, 2000)。これらの2つの核酸は、第Xa因子によって切断される認識配列をコードするリンカーによって連結されていることが好ましい。
酵母の表面での脂肪酸の提示
脂肪酸の発現および提示
酵母の表面での脂肪酸の提示のためには、ACP遺伝子(例えば、大腸菌ACPまたは酵母ACP)をコードする遺伝子を、細胞接着に関与する表面タンパク質であるα-アグルチニンの酵母Aga2pタンパク質サブユニットの全体または部分をコードする核酸と融合させる(Schreuderら、Trends Biotechnol. 14: 115-120, 1996)。pCT302と類似した発現系を用いて、ACP核酸を酵母Aga2p核酸とインフレームに挿入することができる(Boderら、Methods Enzymol. 328: 430-444, 2000)。これらの2つの核酸は、第Xa因子によって切断される認識配列をコードするリンカーによって連結されていることが好ましい。
酵母細胞(例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)株EBY100)に、標準的な方法を用いてベクターによる形質転換を行い、適切な抗生物質(例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン)の存在下で増殖させる(Boderら、前記;Cereghinoら、Curr. Opin. Biotechnol. 10: 422-427, 1999)。この方法に、YES、pTEF1またはspECTRAシステム(Invitrogen)などの任意の市販の酵母発現系を用いてもよい。これらの方法に用いうる酵母株の例には、メタノールを用いるもの(例えば、Candida boidinii、Hansenula polymorpha、Pichia methanolicaまたはPichia pastoris)、ラクトース(例えば、Kluyveromyces lactis)、デンプン(例えば、Schwanniomyces occidentalis)、キシロース(例えば、Pichia stipitis)ならびにアルカンおよび脂肪酸(例えば、Yarrowia lipolytica)を用いるものが含まれる。
ACPタンパク質融合物は酵母の内因性酵素によって修飾される。詳細には、4'-ホスホパンテテイン補因子が内因性ACP合成酵素によってACP中のセリンに付加され、脂肪酸が酵母の内因性脂肪酸合成酵素によって補因子の遊離スルフヒドリル基に付加される。脂肪酸によって修飾されたタンパク質融合物の量を増やす必要がある場合には、より強力なプロモーターを有するベクターを用いて、または細胞内により多数のコピーを保有するベクターを用いて、タンパク質融合物を過剰発現させるとよい。さらに、修飾されたACPタンパク質融合物の量を増やすために、pLacなどの誘導性プロモーターを用いて、大腸菌または酵母の脂肪酸合成酵素を過剰発現させてもよい(Lambalotら、前記)。脂肪酸合成酵素を過剰発現させるためには、脂肪酸合成酵素の核酸を含むベクターを酵母に導入して形質転換を行わせる。上記の通り、脂肪酸によって修飾された状態を保つACPタンパク質融合物の量を増やすために、パントテン酸塩(例えば、1〜100mM)およびダイデムニンB(例えば、1〜100mM)を添加してもよい。
外被タンパク質融合物、ACP合成酵素または脂肪酸合成酵素の発現が酵母にとって有害な場合には、タンパク質融合物をコードする配列の前にアンバーコドンを導入すること、およびアンバー抑制酵母株を用いることにより、発現レベルを適したレベルに低下させてもよい(Christmannら、Protein Eng. 12: 797-806, 1999)。または、細胞内に所望のコピー数を保有するプラスミドを用いて発現レベルを制御することもできる(Daughertyら、Protein Eng. 12: 613, 1999)。
新規な脂肪酸の合成および提示
酵母によって合成される脂肪酸の量および多様性を増大させるために、基質特異性または触媒効率が変化した合成酵素を作製するための、実施例7に記載したような標準的な方法を用いて、1つまたは複数の内因性脂肪酸合成酵素の核酸を変異させることができる。または、異種脂肪酸合成酵素を酵母において発現させてもよい。
酵母によって合成される脂肪酸の量および多様性を増大させるために、基質特異性または触媒効率が変化した合成酵素を作製するための、実施例7に記載したような標準的な方法を用いて、1つまたは複数の内因性脂肪酸合成酵素の核酸を変異させることができる。または、異種脂肪酸合成酵素を酵母において発現させてもよい。
標的分子と結合する脂肪酸の選択および同定
脂肪酸を発現する、以上のいずれかの方法によって作製された酵母細胞は、本明細書に記載したものなどの標準的な手順を用いて収集して精製することができる。ACPタンパク質融合物中のACPとAga2pとの間のリンカーを切断するために、酵母細胞を第Xa因子で処理する。続いて、遠心分離によって酵母細胞をACP-脂肪酸分子から分離する。続いて、上清から得た可溶性タンパク質を、上記の通りに、チオエステル結合を切断して可溶性脂肪酸を生成するためにヒドロキシルアミン、pH 6.5または水素化ホウ素ナトリウムによって処理する。回収した脂肪酸は標準的な質量分析またはNMR分析を用いて同定しうる。
脂肪酸を発現する、以上のいずれかの方法によって作製された酵母細胞は、本明細書に記載したものなどの標準的な手順を用いて収集して精製することができる。ACPタンパク質融合物中のACPとAga2pとの間のリンカーを切断するために、酵母細胞を第Xa因子で処理する。続いて、遠心分離によって酵母細胞をACP-脂肪酸分子から分離する。続いて、上清から得た可溶性タンパク質を、上記の通りに、チオエステル結合を切断して可溶性脂肪酸を生成するためにヒドロキシルアミン、pH 6.5または水素化ホウ素ナトリウムによって処理する。回収した脂肪酸は標準的な質量分析またはNMR分析を用いて同定しうる。
実施例7
非リボソーム的に合成されたポリペプチドおよびポリケチドの提示
医薬およびバイオテクノロジーの面で関心が持たれる多数のポリペプチドおよびポリケチドは、リボソームの代わりにモジュール式酵素複合体によって合成されている。各モジュールは、1つの特定のアミノ酸を成長中の鎖に組み入れる役割を担っており、鎖の長さは存在するモジュールの数によって決定される。非リボソーム性ポリペプチド合成酵素の各モジュールは、種々のドメインにさらに細分することができる(図3)。アデニル化ドメイン(A-ドメイン)はアデニル化を触媒し、コグネイトペプチドの活性化をもたらす。この活性化されたアミノ酸は次に、ペプチジル担体タンパク質のチオレーションドメイン(T-ドメイン)と結合した4'-ホスホパンテテイン補因子と共有結合する。縮合ドメイン(C-ドメイン)は、T-ドメインと結合したアミノ酸の、近傍のモジュールと結合したペプチジル部分との縮合を触媒する。これらの3つの主なドメインに加えて、モジュールが、係留されたアミノ酸の共有結合性修飾を触媒する他のドメインを含んでもよい。例えば、チロシジンA合成経路のモジュール4は、係留されたアミノ酸を別の異性体型に変換するエピマー化ドメイン(E-ドメイン)を含む(Mootzら、Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 97: 5848-5853, 2000)。さらに、L-アミノ酸および300種を上回る特異な非タンパク質性残基[例えば、D-アミノ酸、β-アミノ酸、ヒドロキシ酸およびN-メチル化酸(図4)(von Dohrenら、Chem. Biol. 10: R273: 279, 1999)]などの、種々のアミノ酸およびアミノ酸類似体をポリペプチドに組み入れることもできる。
非リボソーム的に合成されたポリペプチドおよびポリケチドの提示
医薬およびバイオテクノロジーの面で関心が持たれる多数のポリペプチドおよびポリケチドは、リボソームの代わりにモジュール式酵素複合体によって合成されている。各モジュールは、1つの特定のアミノ酸を成長中の鎖に組み入れる役割を担っており、鎖の長さは存在するモジュールの数によって決定される。非リボソーム性ポリペプチド合成酵素の各モジュールは、種々のドメインにさらに細分することができる(図3)。アデニル化ドメイン(A-ドメイン)はアデニル化を触媒し、コグネイトペプチドの活性化をもたらす。この活性化されたアミノ酸は次に、ペプチジル担体タンパク質のチオレーションドメイン(T-ドメイン)と結合した4'-ホスホパンテテイン補因子と共有結合する。縮合ドメイン(C-ドメイン)は、T-ドメインと結合したアミノ酸の、近傍のモジュールと結合したペプチジル部分との縮合を触媒する。これらの3つの主なドメインに加えて、モジュールが、係留されたアミノ酸の共有結合性修飾を触媒する他のドメインを含んでもよい。例えば、チロシジンA合成経路のモジュール4は、係留されたアミノ酸を別の異性体型に変換するエピマー化ドメイン(E-ドメイン)を含む(Mootzら、Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 97: 5848-5853, 2000)。さらに、L-アミノ酸および300種を上回る特異な非タンパク質性残基[例えば、D-アミノ酸、β-アミノ酸、ヒドロキシ酸およびN-メチル化酸(図4)(von Dohrenら、Chem. Biol. 10: R273: 279, 1999)]などの、種々のアミノ酸およびアミノ酸類似体をポリペプチドに組み入れることもできる。
チロシジンの合成のための機構
環状デカペプチド抗生物質チロシジンAなどの、多くのポリペプチドおよびポリケチドの生合成を担う独立したモジュールに関しては広範な情報が得られている。チロシジンAの形成には、成長中のポリペプチド鎖に逐次的な順序でそれぞれ1つ、3つおよび6つのアミノ酸残基を組み入れる合成酵素をコードする、tycA、tycBおよびtycCという3つの遺伝子が関わる(MootzおよびMarahiel、J. Bacteriol. 179: 6843-6850, 1997)(図5)。
環状デカペプチド抗生物質チロシジンAなどの、多くのポリペプチドおよびポリケチドの生合成を担う独立したモジュールに関しては広範な情報が得られている。チロシジンAの形成には、成長中のポリペプチド鎖に逐次的な順序でそれぞれ1つ、3つおよび6つのアミノ酸残基を組み入れる合成酵素をコードする、tycA、tycBおよびtycCという3つの遺伝子が関わる(MootzおよびMarahiel、J. Bacteriol. 179: 6843-6850, 1997)(図5)。
tycA遺伝子はチロシジンシンテターゼIをコードし、これはA-ドメイン、T-ドメインおよびE-ドメインを含む。この遺伝子は鎖合成開始を担っている。tycB遺伝子はチロシジンシンテターゼIIをコードし、これはC-ドメイン、A-ドメインおよびT-ドメインを有する3つのモジュールからなり、第3のモジュールの末端には末端エピマー化ドメインがある。tycC遺伝子はチロシジンシンテターゼIIIをコードし、これはC-ドメイン、A-ドメインおよびT-ドメインを有する6つのモジュールを含み、第6のモジュールの末端にはチオエステラーゼドメイン(Te)がある。Te-ドメインはペプチド鎖の環状化および遊離を触媒すると考えられている。
詳細には、tycA遺伝子は、チロシジンAへのD-Pheの組み入れの原因となるモジュールをコードする。tycBの第1のモジュールは成長中のポリペプチド鎖へのL-Proの付加を担当する。D-Phe-L-Proジペプチド中間生成物の合成のために、tycAモジュールはD-Pheによって共有結合性に修飾され、tycBの第1のモジュールはL-Proによって共有結合性に修飾される(図6A)。
続いて、tycAモジュールに結合したD-Phe残基は、tycBの第1のモジュールと結合した近傍のL-Pro残基と縮合し、D-Phe-L-ProジペプチドがtycBの第1のモジュールと結合したものが生じる。
酵母、バクテリオファージまたは細菌の表面でのポリペプチドまたはポリケチド中間生成物または完全長生成物の提示のための戦略
(i)酵母の表面でのD-Phe-L-Proジペプチドの提示のためには、D-PheモジュールをコードするtycA遺伝子、および、Proモジュールの最初の2つのドメイン(すなわち、C-ドメインおよびA-ドメイン、T-ドメインは含まない)をコードする核酸を含むプラスミドにより、酵母細胞の形質転換を行う。L-ProモジュールのT-ドメインをコードする遺伝子を、タンパク質融合物の生成のためにAga2p遺伝子のカルボキシル末端と融合させる(図6B)。Proモジュールの最初の2つのドメインは、タンパク質融合物中のT-ドメインとともにトランス的に作用して、天然のL-Proモジュールによって自然下で触媒されるものと同じ反応を触媒する。L-ProモジュールのA-ドメインとT-ドメインとの間の連絡性を高めるために特異的認識配列を付加してもよい。すなわち、この戦略は、タンパク質融合物中のT-ドメインに対するD-Phe-L-Proジペプチドの共有結合、および、この改変されたタンパク質融合物の酵母の表面での発現をもたらす。
(i)酵母の表面でのD-Phe-L-Proジペプチドの提示のためには、D-PheモジュールをコードするtycA遺伝子、および、Proモジュールの最初の2つのドメイン(すなわち、C-ドメインおよびA-ドメイン、T-ドメインは含まない)をコードする核酸を含むプラスミドにより、酵母細胞の形質転換を行う。L-ProモジュールのT-ドメインをコードする遺伝子を、タンパク質融合物の生成のためにAga2p遺伝子のカルボキシル末端と融合させる(図6B)。Proモジュールの最初の2つのドメインは、タンパク質融合物中のT-ドメインとともにトランス的に作用して、天然のL-Proモジュールによって自然下で触媒されるものと同じ反応を触媒する。L-ProモジュールのA-ドメインとT-ドメインとの間の連絡性を高めるために特異的認識配列を付加してもよい。すなわち、この戦略は、タンパク質融合物中のT-ドメインに対するD-Phe-L-Proジペプチドの共有結合、および、この改変されたタンパク質融合物の酵母の表面での発現をもたらす。
同様の戦略を用いて、D-Phe-L-Proジペプチドを、バクテリオファージの外被タンパク質と融合したT-ドメイン上に提示させることもできる。この方法では、ProモジュールのT-ドメインを、Aga2p酵母タンパク質の代わりにpIII外被タンパク質と融合させる。これまでの実施例における説明のように、この外被タンパク質融合物は細菌によって発現され、バクテリオファージ外被タンパク質として構築される。
(ii)このジペプチドによって修飾されたタンパク質融合物におけるL-Pro T-ドメインの量を増やすために、L-ProモジュールのA-ドメインとT-ドメインとの間の連絡性が高まるように以上の方法を改変することもできる(Tsujiら、Biochemistry, 40: 2317-2325, 2001)。この目的のためには、A-ドメインおよびT-ドメインを1つのプラスミドによって発現させ、プロテアーゼ第Xa因子の認識配列を含む可動性リンカーを介して連結する(図6C)(例えば、Ausubelら、前記を参照)。第Xa因子をコードする核酸は誘導性プロモーターの制御下に置く。D-Phe-L-Proジペプチドが合成されると、プロテアーゼの発現が誘導され、組換えタンパク質モジュールが切断されて、Aga2p-T-ドメインを含む所望のセグメントならびにC-ドメインおよびA-ドメインを含むセグメントが生じる。その後に、共有結合したD-Phe-L-Proジペプチドを含むAga2p-T-ドメインは酵母細胞の表面へと輸送される。
(iii)ポリペプチドをバクテリオファージの表面に提示させることを可能にする組換えモジュールを作製するための類似の戦略を図6Dに示している。この代替的な戦略では、L-ProモジュールのA-ドメインとT-ドメインとの間の挿入物のサイズが最小限となり、このため組換えタンパク質がD-Phe-L-Proジペプチドを合成する能力が高くなる。詳細には、ファージ遺伝子IIIのリーダー配列および第Xa因子切断部位を含む2.5kDaの挿入物を、L-ProモジュールのA-ドメインおよびT-ドメインのコード配列の間に挿入する。遺伝子IIIのコード配列もT-ドメインのコード配列の3'末端に付加する。この方法に用いる2.5kDaの挿入物は、上記の酵母ディスプレイ法に用いた挿入物(第Xa因子切断部位およびAga2pをコードする)の4分の1の小ささである。第Xa因子をコードする核酸は誘導性プロモーターの制御下に置かれる。
(iv)ジペプチドの提示のためのもう1つの方法では、L-ProモジュールのA-ドメインとT-ドメインとの間にさらに小さい挿入物を用いる。この方法では、C-ドメインおよびA-ドメイン、4アミノ酸の第Xa因子切断部位、T-ドメイン、ならびに「パートナー」タンパク質に対して高い親和性を有する低分子「結合」タンパク質を含む組換えタンパク質をコードするベクターを用いる。このパートナータンパク質をバクテリオファージpIII外被タンパク質と融合させる。例えば、プロテインキナーゼA(PKA)アイソフォームα阻害因子を組換えタンパク質における結合タンパク質として用い、PKAを外被タンパク質融合物のパートナータンパク質成分として用いることができる。これらのタンパク質は高い親和性(Ki=98pM)で相互作用する(Wenら、J. Biol. Chem. 270: 2041-2046, 1995)。または、ペプチドおよびそのペプチドと反応する抗体を用いて、高い親和性を有する複合体を形成してもよい。
これらのタンパク質の発現のためには、組換えタンパク質モジュール、第Xa因子およびtycAをともにコードする1つまたは複数のベクター、ならびに外被タンパク質融合物を有するバクテリオファージをコードするベクターを大腸菌または酵母細胞に導入して形質転換を行う。組換えタンパク質モジュール中のT-ドメインと結合した状態を保ってD-Phe-L-Proジペプチドが合成された後に(例えば、30、60または90分後)、第Xa因子をコードする遺伝子を誘導し、タンパク質産物に組換えタンパク質モジュールを切断させる。切断産物の1つは修飾されたT-ドメインが結合タンパク質と結合したものを含む。結合タンパク質と外被タンパク質融合物のパートナータンパク質とは互いに、高親和性の非共有結合性相互作用によって会合する。この複合体は培地中に分泌され、バクテリオファージの表面に提示される。
(v)ポリペプチド中間生成物および生成物を、細菌鞭毛ディスプレイ法を用いて提示することもできる。これらの方法は、提示ペプチドを大腸菌FliCなどの細菌鞭毛表面タンパク質と融合させる点を除いて、酵母ディスプレイのために用いたものと類似している。鞭毛ディスプレイシステムの利点は、鞭毛タンパク質融合物の数千ものコピーが提示されることにある。これらのタンパク質は標的分子に対するタンパク質融合物の親和性を高め、標的分子と結合する提示されたポリペプチドの検出を容易にする。
ProモジュールのT-ドメイン(または任意の他のポリペプチドモジュールのT-ドメイン)のコード配列を、H7フラジェリンの可変ドメインをコードするFliCH7遺伝子に挿入する(図6E)。この核酸構築物、tycAコード配列およびProモジュールの最初の2つのドメインをコードする核酸(すなわち、C-ドメインおよびAドメイン、T-ドメインは含まない)をともに含む1つまたは複数のベクターを、機能的な内因性FliCの発現を妨げるFliCノックアウト変異を有する大腸菌JT1株において発現させる(Westerlund-Wikstromら、Prot. Eng. 10: 1319-1326, 1997;Tanskanenら、Appl. Environ. Microbiol. 66: 4152-4156, 2000)。FliCの中央部の可変領域は、鞭毛における抗原多様性の原因となる上に(Nambaら、Nature 342: 648-654, 1989)大きな欠失および挿入に対しても鞭毛の重合性を失わない耐性を備えた表面露出ドメインを形成するため(Kuwajima、J. Bacteriol. 170: 3305-3309, 1988)、T-ドメインのコード配列をFliCH7遺伝子のこの領域に挿入すると、修飾されたT-ドメインの細菌表面での提示がもたらされる。
1つの代替的な鞭毛ディスプレイ法では、C-ドメインおよびA-ドメインをT-ドメインに近接して含み、このため野生型L-Proモジュールの活性の大部分またはすべてを維持しているタンパク質融合物を作製する。詳細には、C-ドメインおよびA-ドメインならびにプロテアーゼ切断部位をコードする核酸をFliCH7の5'末端と融合させ、TドメインをFliCH7遺伝子の可変ドメインに挿入する(図6F)。このタンパク質融合物およびtycAを大腸菌JT1株において発現させると、D-Phe-L-Proジペプチドとタンパク質融合物のTドメインとの共有結合が起こる。続いて、タンパク質融合物を切断するためにプロテアーゼの発現を誘導する。その後に、修飾されたTドメインがFliC鞭毛の可変領域に挿入されたものを含む切断産物は大腸菌細胞の表面へと輸送される。
これらの鞭毛ディスプレイ法を、任意の他の細菌由来の鞭毛タンパク質を用いて行うこともできる。これらのタンパク質は、大腸菌(例えば、大腸菌JT1株)、対応する鞭毛遺伝子を天然に含む他の細菌、または任意の他の細菌において発現させうる。鞭毛タンパク質融合物を発現する細菌は野生型の内因性鞭毛タンパク質を発現してもよく、または内因性鞭毛タンパク質の発現を低下もしくは消失させる変異を含んでいてもよい。本発明において有用な鞭毛タンパク質の例を以下の表VIIIに挙げている。
(表VIII)細菌の表面に化合物を提示するためのタンパク質融合物中に用いるための鞭毛タンパク質
1.輸出タンパク質と考えられるfliO(ネズミチフス菌;アクセッション番号L49021およびS78697)
2.鞭毛生合成タンパク質と考えられるmopB(Erwinia carotovora subsp. Atroseptica;アクセッション番号S35275)
3.タンパク質mopB(Pectobacterium carotovorum;アクセッション番号CAA51475.1)
4.Burkholderia pseudomallei(アクセッション番号U73848)
5.Ralstonia solanacearum(アクセッション番号AF283285)
6.ディフィシル菌(Clostridium difficile)(アクセッション番号AF095238)
7.Salmonella enterica subsp. Enterica(アクセッション番号AF332601)
8.Rhodobacter sphaeroides(アクセッション番号AF274346)
9.鳴疽菌(Clostridium chauvoei)(株:Okinawa;アクセッション番号D89073)
10.Pseudomonas chlororaphis(アクセッション番号AJ297537)
11.Pseudomonas citronellolis(アクセッション番号AJ297535)
12.Pseudomonas fragi(アクセッション番号AJ297534)
13.チフス菌(アクセッション番号M33541)
14.緑膿菌(アクセッション番号L81176)
15.Riftia pachyptila endosymbiont(アクセッション番号AF105060)
16.Xenorhabdus nematophila(アクセッション番号AJ131736)
17.Burkholderia mallei(アクセッション番号AF084815)
18.Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum(アクセッション番号AF139681)
19.Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pullorum(アクセッション番号AF139674)
20.Pseudomonas putida(アクセッション番号AB018737)
21.蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)(アクセッション番号AB018715)
22.セパシア菌(Burkholderia cepacia)(アクセッション番号AF011372)
23.Burkholderia thailandensis(アクセッション番号AF081500)
24.Brucella melitensis biovar Abortus(アクセッション番号AF019251)
25.Salmonella naestved(アクセッション番号D78639)
26.ボイド菌(Shigella boydii)(アクセッション番号D26165)
27.フレキシナー菌(Shigella flexneri)(アクセッション番号D16819)
28.ゾンネ菌(Shigella sonnei)(アクセッション番号D16820)
29.バシラス属(アクセッション番号D10063)
30.腸炎菌(Salmonella enteritidis)(アクセッション番号M84980)
1.輸出タンパク質と考えられるfliO(ネズミチフス菌;アクセッション番号L49021およびS78697)
2.鞭毛生合成タンパク質と考えられるmopB(Erwinia carotovora subsp. Atroseptica;アクセッション番号S35275)
3.タンパク質mopB(Pectobacterium carotovorum;アクセッション番号CAA51475.1)
4.Burkholderia pseudomallei(アクセッション番号U73848)
5.Ralstonia solanacearum(アクセッション番号AF283285)
6.ディフィシル菌(Clostridium difficile)(アクセッション番号AF095238)
7.Salmonella enterica subsp. Enterica(アクセッション番号AF332601)
8.Rhodobacter sphaeroides(アクセッション番号AF274346)
9.鳴疽菌(Clostridium chauvoei)(株:Okinawa;アクセッション番号D89073)
10.Pseudomonas chlororaphis(アクセッション番号AJ297537)
11.Pseudomonas citronellolis(アクセッション番号AJ297535)
12.Pseudomonas fragi(アクセッション番号AJ297534)
13.チフス菌(アクセッション番号M33541)
14.緑膿菌(アクセッション番号L81176)
15.Riftia pachyptila endosymbiont(アクセッション番号AF105060)
16.Xenorhabdus nematophila(アクセッション番号AJ131736)
17.Burkholderia mallei(アクセッション番号AF084815)
18.Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum(アクセッション番号AF139681)
19.Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pullorum(アクセッション番号AF139674)
20.Pseudomonas putida(アクセッション番号AB018737)
21.蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)(アクセッション番号AB018715)
22.セパシア菌(Burkholderia cepacia)(アクセッション番号AF011372)
23.Burkholderia thailandensis(アクセッション番号AF081500)
24.Brucella melitensis biovar Abortus(アクセッション番号AF019251)
25.Salmonella naestved(アクセッション番号D78639)
26.ボイド菌(Shigella boydii)(アクセッション番号D26165)
27.フレキシナー菌(Shigella flexneri)(アクセッション番号D16819)
28.ゾンネ菌(Shigella sonnei)(アクセッション番号D16820)
29.バシラス属(アクセッション番号D10063)
30.腸炎菌(Salmonella enteritidis)(アクセッション番号M84980)
(vi)上記のいずれかの方法を、3つ以上のアミノ酸を含むポリペプチド中間生成物もしくはポリケチド中間生成物を提示するため、または完全長のポリペプチドもしくはポリケチド生成物を提示するために用いることもできる。これらの方法のためには、最終アミノ酸または低分子の係留を担当するモジュールのT-ドメイン、チオエステラーゼドメイン(Te-ドメイン)またはACP-ドメインをAga2p遺伝子、バクテリオファージ遺伝子IIIまたはFliC遺伝子と融合させる。
環状化されていない中間生成物または生成物は、ウイルスまたは細胞の表面に発現されるタンパク質融合物中の最後の非リボソーム性ポリペプチドまたはポリケチド合成酵素結合ドメイン(例えば、チオレーションまたはアシルキャリアードメイン)と非共有的に結合した状態に保つことによって提示される。環状化生成物の提示のためには、改変型のディスプレイシステムを用いる。環状化非リボソーム性ペプチドおよび/またはポリケチドの合成の間に、成長中の鎖は成長中の鎖が完全長へと伸長するまで種々のドメインによって移送される。続いて、完全に成長した鎖は、鎖伸長時に最後の支持体の役割を果たしたタンパク質からチオエステラーゼドメインへと移送され、そこでポリペプチドまたはポリケチドの両端が共有結合して環状化生成物を形成する。線状鎖の一端は固定化されているため、環状化過程によって環状化低分子がチオエステラーゼドメインから遊離する。チオエステラーゼドメインからの環状化生成物の不要な切断を避けるためには、線状生成物を合成させるために、チオエステラーゼドメインを除く合成酵素ドメインのすべてを含む組換えタンパク質を細菌内で発現させる。環状化は触媒させるが生成物の遊離は触媒させないためには、表面タンパク質(例えば、ウイルス外被タンパク質または鞭毛タンパク質)と融合させた変異型チオエステラーゼドメインも細菌内で発現させる。所望の変異型チオエステラーゼドメインを発現する細菌は環状化を触媒するが、ポリペプチドまたはポリケチド生成物の遊離は触媒しない。チオエステラーゼドメインと共有結合した環状化された低分子を提示する細菌またはバクテリオファージは、環状化された低分子に対する抗体などの作用物質を用いて同定される。このようにして、低分子を環状化するが、それを直ちには遊離させないチオエステラーゼ変異体を容易に同定することができる。
例えば、完全長の環状化チロシジンA生成物は、デカペプチドの環状化を担当する最終モジュールのTe-ドメインをAga2p遺伝子、バクテリオファージ遺伝子IIIまたはFliC遺伝子と融合させることによって提示しうる。このTe-ドメインはモジュールからのチロシジンAの遊離にも関係しているため、環状化の段階は触媒するがモジュールからのチロシジンAの遊離は触媒しないようにTe-ドメインを改変する必要があると思われる。例えば、ランダムな変異をTe-ドメインに導入し、改変されたTe-ドメインを、環状化チロシジン生成物がどのドメインと共有結合した状態を保つかを明らかにするためにアッセイするとよい。
チロシジンポリペプチドの類似体または他のポリペプチドを、上記のいずれかの方法によって提示することもできる。例えば、他のポリペプチド合成酵素由来の縮合ドメイン、アデニル化ドメイン、チオレーションドメインおよびチオエステラーゼドメインを、他の合成酵素からの対応ドメインとの相同性に基づいて容易に同定し、本明細書に記載の方法に用いることができる。これらの方法を用いて提示しうる他の非リボソーム性ペプチドの例には、エルシニアバクチン(yersiniabactin)(Pelludatら、J. Bacteriol. 180: 538-546, 1988)、ミコサブチリン(mycosubtilin)(Duitmanら、J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 13294-13299, 1999)、フェンジシン(fengycin)(Stellerら、J. Chem. Bio. 6: 31-41, 1999)、エルゴペプチン(ergopeptine)(Riedererら、U. J. Biol. Chem. 271: 27524-27530, 1996)、バシリバクチン(bacillibactin)(Mayら、J. Biol. Chem. 276: 7209-7217, 2001)、エタマイシン(Schlumbohmら、J. Biol. Chem. 265: 2156-2161, 1990)およびアクチノマイシン(Pfennigら、J. Biol. Chem. 274: 12508-12516, 1999)が含まれる。
以上の任意の方法を、新規または天然のポリケチド中間生成物または生成物の提示のために適合させることも容易である。例えば、これらの方法を用いて提示しうる、詳細に特徴が述べられているポリケチドには、6-デオキシエリスロノリドBがある。6-デオキシエリスロノリドBポリケチド合成酵素には6つのモジュールがあり、各モジュールは内部に異なるドメインを有する(図7A〜7C)。例えば、モジュール1はケトシンテターゼ(KS)ドメイン、アシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン、ケトレダクターゼ(KR)ドメインおよびアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメインを含む。モジュール2、5および6はモジュール1と類似しているが、異なるリンカー配列を有する。ポリケチドのその他の例には、脂質代謝における不飽和化および伸長の段階を触媒するポリケチドが含まれる(Metzら、Science 293: 290-293, 2001)。さらに、他のポリケチド合成酵素および非リボソーム性合成酵素に由来する縮合ドメイン、アデニル化ドメイン、チオレーションドメインおよびチオエステラーゼドメインを、他の合成酵素からの対応ドメインとの相同性に基づいて容易に同定し、本明細書に記載の方法に用いることができる。
新規なポリペプチドおよびポリケチドを合成し、酵母、バクテリオファージまたは細胞の表面に提示することもできる。例えば、1つまたは複数の内因性非リボソーム性ポリペプチド合成酵素、ポリケチド合成酵素またはハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素の核酸を変異させて、基質特異性または触媒効率が変化した合成酵素を作製することができる。または、本明細書に記載したものなどの、1つまたは複数の異種非リボソーム性ポリペプチド合成酵素、ポリケチド合成酵素、および/またはハイブリッド型ポリケチド/非リボソーム性ペプチド合成酵素を酵母または細菌において発現させることもできる。
標的分子と結合する提示されたポリペプチドまたはポリケチドの選択および同定
標的分子と結合するポリペプチドまたはポリケチドを提示する細菌、酵母細胞またはバクテリオファージを標準的な方法を用いて選択し、続いて、選択したバクテリオファージまたは細胞からポリペプチドまたはポリケチドを回収することができる。ポリペプチドまたはポリケチドを切断するために、ポリペプチドまたはポリケチドと提示ペプチドとの間のチオエステル結合を切断するヒドロキシルアミン、pH 6.5または水素化ホウ素ナトリウムを用いうる(Rosenfeldら、前記;Barronら、前記)。目的のポリペプチドまたはポリケチドは質量分析またはNMRを用いて同定しうる。ポリペプチドおよびポリケチドは、ヒトまたは獣医学的な関心が持たれる動物における感染と関連するものといった、特定の細菌の増殖を抑制する能力、またはそれらを死滅させる能力に関して試験することができる。
標的分子と結合するポリペプチドまたはポリケチドを提示する細菌、酵母細胞またはバクテリオファージを標準的な方法を用いて選択し、続いて、選択したバクテリオファージまたは細胞からポリペプチドまたはポリケチドを回収することができる。ポリペプチドまたはポリケチドを切断するために、ポリペプチドまたはポリケチドと提示ペプチドとの間のチオエステル結合を切断するヒドロキシルアミン、pH 6.5または水素化ホウ素ナトリウムを用いうる(Rosenfeldら、前記;Barronら、前記)。目的のポリペプチドまたはポリケチドは質量分析またはNMRを用いて同定しうる。ポリペプチドおよびポリケチドは、ヒトまたは獣医学的な関心が持たれる動物における感染と関連するものといった、特定の細菌の増殖を抑制する能力、またはそれらを死滅させる能力に関して試験することができる。
実施例8
新規な化合物の作製および提示
ウイルスまたは細胞の表面に発現される種々の低分子を作製するために、目的の分子の合成に関与するタンパク質をコードする内因性遺伝子または異種遺伝子を、タンパク質の基質特異性または触媒効率が変化するように変異させることもできる。詳細には、ランダムな変異を、異なる生物の二次代謝経路にかかわる重要な酵素に導入することができる。変異させうる核酸の例には、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするものが含まれる。これらの変異した核酸を有する細胞を、標的分子と結合する新規な分子を作製して単離するための本発明の方法に用いることができる。
新規な化合物の作製および提示
ウイルスまたは細胞の表面に発現される種々の低分子を作製するために、目的の分子の合成に関与するタンパク質をコードする内因性遺伝子または異種遺伝子を、タンパク質の基質特異性または触媒効率が変化するように変異させることもできる。詳細には、ランダムな変異を、異なる生物の二次代謝経路にかかわる重要な酵素に導入することができる。変異させうる核酸の例には、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするものが含まれる。これらの変異した核酸を有する細胞を、標的分子と結合する新規な分子を作製して単離するための本発明の方法に用いることができる。
このような変異誘発法の1つでは、多数の変異が導入される条件下でポリメラーゼ連鎖反応を用いて、1つまたは複数の変異を核酸に導入する(Fromantら、Anal. Biochem. 224: 347-353, 1995)。その他の変異誘発法には、複数の生物に由来するポリケチド、非リボソーム性ペプチドおよび/または脂肪酸合成酵素の核酸のインビトロ相同組換え(例えば、DNAシャッフリング)が含まれる(図8)(Stemmerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 10747-10751, 1994;Cocoら、Nat. Biotech. 19: 354-359, 2001)。
これらの方法を、非常にさまざまな新規脂肪酸を生成する脂肪酸合成酵素の作製に用いることもできる。変異させうる脂肪酸合成酵素の例には、スルホリピド合成のために必要な多数のメチル分枝型脂肪酸を生成する、結核菌における合成酵素などが含まれる(Sirakovaら、J. Biol. Chem. 276: 16833-16839, 2001)。その他の脂肪酸合成酵素、例えばストレプトミセス・グラウセセンス(Streptomyces glaucescens)β-ケトアシル-アシルキャリアータンパク質合成酵素III(KASIII)は、マロニル-ACPと種々のアシル-補酵素A(CoA)基との脱カルボキシル縮合を触媒することにより、直鎖脂肪酸および分枝鎖脂肪酸の生合成を開始する(Smirnovaら、J. Bacteriol. 183: 2335-2342, 2001)。さらに、カイメン(Amphimedon complanata)のリン脂質脂肪酸組成物には、以下の特異なリン脂質が含まれる:2-メトキシ-13-メチルテトラデカン酸、2-メトキシ-14-メチルペンタデカン酸および2-メトキシ-13-メチルペンタデカン酸)。このカイメン由来の脂肪酸合成酵素を変異させ、さらなる関心対象の脂質を作製することもできる(Carballeiraら、Lipids 36: 83-87, 2001)。
新規な特性を備えた抗生物質を生産するために、ランダムな変異をシンテターゼ核酸に導入することもできる。例えば、対応する野生型合成酵素とは異なるアミノ酸を利用する合成酵素、または異なる修飾(例えば、係留アミノ酸のアシル化)を触媒する合成酵素を作製することができる。さらに、DNAシャッフリングを用いて、複数の生物由来の合成酵素を組み合わせることもできる。この変異誘発法に関しては、異なるドメイン、異なるモジュール、および/または異なる天然型ポリケチド合成酵素コード配列を組み合わせることができる。
脂肪酸、ポリケチドおよび非リボソーム性ペプチド合成酵素は相同であるため、それらの対応する核酸のシャッフリングを行って新規な化合物を作製することもできる(Metzら、Science 2001、293, 290-293, 2001)。
その他の態様
以上の説明から、本発明を種々の用法および条件に適合させるために、本発明に種々の変更および修正を加えうることは明らかであると考えられる。このような態様も以下の特許請求の範囲に含まれる。
以上の説明から、本発明を種々の用法および条件に適合させるために、本発明に種々の変更および修正を加えうることは明らかであると考えられる。このような態様も以下の特許請求の範囲に含まれる。
本明細書で言及したすべての刊行物は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように明確かつ個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
Claims (78)
- 標的分子と結合する低分子を選択するための方法であって、
(a)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団において発現させる段階、この際、該発現は、該提示ペプチドが該細胞内でビオチン以外の低分子によって修飾され、該タンパク質融合物がウイルスに感染した該細胞から放出される該ウイルスの表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;この際、該低分子は、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
(b)該ウイルスを該標的分子と接触させる段階;および
(c)該標的分子と結合する該ウイルスを選択し、それによって該標的分子と結合する該低分子を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する低分子を選択するための方法であって、
(a)細胞の集団において核酸を変異させる段階;
(b)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を該細胞内で発現させる段階、この際、該発現は、該提示ペプチドが該細胞内で低分子によって修飾され、該タンパク質融合物がウイルスに感染した該細胞から放出される該ウイルスの表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;この際、該低分子は、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
(c)該ウイルスを該標的分子と接触させる段階;および
(d)該標的分子と結合する該ウイルスを選択し、それによって該標的分子と結合する該低分子を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する翻訳後修飾物を選択するための方法であって、
(a)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団において発現させる段階、この際、該発現は、該細胞における該提示ペプチドの翻訳後修飾、および該タンパク質融合物がウイルスに感染した該細胞から放出される該ウイルスの表面に提示されることを可能にする条件下で行われ、該翻訳後修飾物はビオチンではない;
(b)該ウイルスを該標的分子と接触させる段階;および
(c)該標的分子と結合する該ウイルスを選択し、それによって該標的分子と結合する該翻訳後修飾物を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する翻訳後修飾物を選択するための方法であって、
(a)細胞の集団において核酸を変異させる段階;
(b)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を該細胞内で発現させる段階、この際、該発現は、該細胞における該提示ペプチドの翻訳後修飾、および該タンパク質融合物がウイルスに感染した該細胞から放出される該ウイルスの表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;
(c)該ウイルスを該標的分子と接触させる段階;および
(d)該標的分子と結合する該ウイルスを選択し、それによって該標的分子と結合する該翻訳後修飾物を選択する段階、
を含む方法。 - (d)細胞を選択したウイルスに感染させ、それによって低分子または翻訳後修飾物を提示するさらなるウイルスを作製する段階をさらに含む、請求項1または3記載の方法。
- (e)細胞を選択したウイルスに感染させ、それによって低分子または翻訳後修飾物を提示するさらなるウイルスを作製する段階をさらに含む、請求項2または4記載の方法。
- ウイルスがバクテリオファージである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 表面タンパク質が外被タンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が細菌である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 細菌が大腸菌である、請求項9記載の方法。
- ウイルスが、低分子または転位後修飾物の合成のために必要なタンパク質の少なくとも1つをコードする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子と結合する低分子を選択するための方法であって、
(a)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団において発現させる段階、この際、該発現は、該提示ペプチドが該細胞内でビオチン以外の低分子によって修飾され、該タンパク質融合物が該細胞の表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;この際、該低分子は、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
(b)該細胞を該標的分子と接触させる段階;および
(c)該標的分子と結合する該細胞を選択し、それによって該標的分子と結合する該低分子を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する低分子を選択するための方法であって、
(a)細胞の集団において核酸を変異させる段階;
(b)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を該細胞内で発現させる段階、この際、該発現は、該提示ペプチドが該細胞内で低分子によって修飾され、該タンパク質融合物が該細胞の表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;この際、該低分子は、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
(c)該細胞を該標的分子と接触させる段階;および
(d)該標的分子と結合する該細胞を選択し、それによって該標的分子と結合する該低分子を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する翻訳後修飾物を選択するための方法であって、
(a)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を細胞の集団において発現させる段階、この際、該発現は、該細胞における該提示ペプチドの翻訳後修飾、および該タンパク質融合物が該細胞の表面に提示されることを可能にする条件下で行われ、該翻訳後修飾物はビオチンではない;
(b)該細胞を該標的分子と接触させる段階;および
(c)該標的分子と結合する該細胞を選択し、それによって該標的分子と結合する該翻訳後修飾物を選択する段階、
を含む方法。 - 標的分子と結合する翻訳後修飾物を選択するための方法であって、
(a)細胞の集団において核酸を変異させる段階;
(b)表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を該細胞内で発現させる段階、この際、該発現は、該細胞における該提示ペプチドの翻訳後修飾、および該タンパク質融合物が該細胞の表面に提示されることを可能にする条件下で行われる;
(c)該細胞を該標的分子と接触させる段階;および
(d)該標的分子と結合する該細胞を選択し、それによって該標的分子と結合する該翻訳後修飾物を選択する段階、
を含む方法。 - 選択した細胞を細胞増殖を許容する条件下で培養し、それによって低分子または翻訳後修飾物を発現するさらなる細胞を生じさせる段階をさらに含む、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が細菌である、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 細菌が大腸菌である、請求項17記載の方法。
- 表面タンパク質が鞭毛タンパク質である、請求項17記載の方法。
- 細胞が酵母である、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 酵母が出芽酵母である、請求項20記載の方法。
- 表面タンパク質が受容体である、請求項20記載の方法。
- 細胞が、低分子または転位後修飾物の合成のために必要なタンパク質の少なくとも1つをコードする、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 段階(b)において標的分子が固定化されている、請求項1、3、12または14記載の方法。
- 段階(c)において標的分子が固定化されている、請求項2、4、13または15記載の方法。
- 低分子由来の部分を含む、または翻訳後修飾物由来の部分を含む、化合物を回収する段階をさらに含む、請求項1〜4および12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 段階(a)(b)および(c)を反復する段階をさらに含む、請求項1、3、12または14記載の方法。
- 段階(b)(c)および(d)を反復する段階をさらに含む、請求項2、4、13または15記載の方法。
- 段階(a)の前に、核酸を細胞において変異させる段階をさらに含む、請求項1、3、12または14記載の方法。
- 核酸が、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする、請求項29記載の方法。
- 核酸が、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする、請求項2、4、13または15記載の方法。
- 核酸が内因性核酸である、請求項2、4、13、15または29記載の方法。
- 核酸が内因性核酸の重複コピーである、請求項2、4、13、15または29記載の方法。
- 核酸が異種核酸である、請求項2、4、13、15または29記載の方法。
- 1つまたは複数の提示ペプチドが新規化合物によって修飾される、請求項2、4、13、15または29記載の方法。
- 細胞を変異誘発物質と接触させる、請求項2、4、13、15または29記載の方法。
- 低分子または翻訳後修飾物が、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン基、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、アルカロイド、テルペン、ポリケチドまたはポリペプチドである、請求項1〜4および12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 脂質が提示ペプチド中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している、請求項37記載の方法。
- 提示ペプチドが、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオエステラーゼドメインまたはチオレーションドメインである、請求項38記載の方法。
- 脂質が、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸またはステロイドである、請求項37記載の方法。
- 糖質が、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸またはケラタン硫酸である、請求項37記載の方法。
- 補欠分子族がヘムである、請求項37記載の方法。
- 低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスであって、該低分子が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、ウイルス。
- 低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスであって、該低分子が、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;および
該ウイルスの核酸が該低分子の合成のために必要なタンパク質をコードする、ウイルス。 - 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスであって、該翻訳後修飾物が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、ウイルス。
- 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスであって、該ウイルスの核酸が該翻訳後修飾物の合成のために必要なタンパク質をコードする、ウイルス。
- 表面タンパク質が提示ペプチドと共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現するウイルスであって、脂質、ポリケチドまたはポリペプチドが該提示ペプチド中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している、ウイルス。
- 提示ペプチドが、アシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーションドメインまたはチオエステラーゼドメインである、請求項47記載のウイルス。
- バクテリオファージである、請求項43〜47のいずれか一項記載のウイルス。
- 表面タンパク質がpIII外被タンパク質である、請求項49記載のウイルス。
- 核酸が、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする、請求項44または46記載のウイルス。
- 核酸が変異を有する、請求項44または46記載のウイルス。
- 提示ペプチドが、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、テルペン、アルカロイド、ポリケチドまたはポリペプチドの付加によって修飾されている、請求項44または46記載のウイルス。
- 補欠分子族がヘムである、請求項43または45記載のウイルス。
- 補欠分子族がヘムである、請求項53記載のウイルス。
- 低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質を表面に発現する細胞であって、該低分子が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、細胞。
- 低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質を表面に発現する細胞であって、該低分子が、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
該低分子の合成のために必要なタンパク質をコードする変異した核酸または異種核酸を含む細胞。 - ビオチン以外の低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質を表面に発現する細胞であって、該低分子が、
(i)該提示ペプチド中のアミノ酸の側鎖と共有結合している;
(ii)非天然アミノ酸を含む;または
(iii)分子量が4,000ダルトン未満であり、かつ非天然アミノ酸またはアミノ酸以外の部分を含む;
該低分子の合成のために必要なタンパク質をコードする核酸を含む細胞。 - 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞であって、該翻訳後修飾物が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、細胞。
- 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞であって、該翻訳後修飾物の合成のために必要なタンパク質をコードする変異した核酸または異種核酸を含む細胞。
- 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞であって、該翻訳後修飾物の合成のために必要なタンパク質をコードする核酸を含み、該翻訳後修飾物がビオチンではない、細胞。
- 提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物を表面に発現する細胞であって、脂質、ポリケチドまたはポリペプチドが該提示ペプチド中のホスホパンテテイン化アミノ酸と共有結合している、細胞。
- 提示ペプチドがアシルキャリアータンパク質、アシルキャリアータンパク質ドメイン、チオレーションドメインまたはチオエステラーゼドメインである、請求項62記載の細胞。
- 細菌である、請求項56〜62のいずれか一項記載の細胞。
- 細菌が大腸菌である、請求項64記載の細胞。
- 表面タンパク質が鞭毛タンパク質である、請求項64記載の細胞。
- 酵母である、請求項56〜62のいずれか一項記載の細胞。
- 酵母が出芽酵母である、請求項67記載の細胞。
- 表面タンパク質が受容体である、請求項67記載の細胞。
- 核酸が、ビオチンリガーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、脂肪酸合成酵素、ポリケチド合成酵素、非リボソーム性ペプチド合成酵素、リポ酸リガーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼまたはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする、請求項57、58、60または61記載の細胞。
- 提示ペプチドが、ビオチン類似体、脂質、ホスホパンテテイン、糖質、補欠分子族、ビタミン、ケトン、カルボン酸、テルペン、アルカロイド、ポリケチドまたはポリペプチドの付加によって修飾されている、請求項57、58、60または61記載の細胞。
- 補欠分子族がヘムである、請求項56または59記載の細胞。
- 補欠分子族がヘムである、請求項71記載の方法。
- 低分子の付加によって修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物であって、該低分子が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、タンパク質融合物。
- 翻訳後修飾された提示ペプチドと表面タンパク質が共有結合したものを含むタンパク質融合物であって、該翻訳後修飾物が、ビオチン類似体、ホスホパンテテイン、ビオチン以外の補欠分子族、ケトン、テルペン、アルカロイド、ポリケチド、パルミトイル基、ミリストイル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、リポイル基、アラキドン酸、ステロイド、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、または非天然アミノ酸を含む分子である、タンパク質融合物。
- 表面タンパク質が鞭毛タンパク質、細胞受容体またはバクテリオファージ外被タンパク質である、請求項74または75記載のタンパク質融合物。
- 請求項74または75記載のタンパク質融合物をコードする核酸。
- 請求項77記載の核酸を含むベクター。
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