JP2004057536A - 変性物質吸着材、変性物質除去カラムおよびそれらを用いた変性物質の除去方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】血液等の液体中に存在する変性物質を除去可能な吸着材、カラムを提供すること。
【解決手段】α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着することを特徴とする変性物質吸着材および該吸着材を充填したカラム。
【選択図】なし
【解決手段】α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着することを特徴とする変性物質吸着材および該吸着材を充填したカラム。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質の吸着材、該吸着材を充填してなるカラム、および該吸着材あるいは該カラムを用いた、液体中に存在する変性物質の除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生活習慣病といわれる病気が顕著に増加し、問題視されている。生活習慣病の中には、糖尿病や高脂血症などが原因となって起こる動脈硬化など、血管病変を引き起こす疾患が含まれ、患者の予後を大きく左右する場合が少なくない。特に糖尿病に至っては、罹患期間に依存して腎糸球体に病理学的変化が出現し、さらに悪化すると腎不全を伴い、透析を施行しなければならなくなる。透析導入患者の原疾患を見ると、１９９８年末に、糖尿病性腎症がこれまで主原因であった慢性糸球体腎炎を追い抜き、今後も増加の一途を辿ると言われている。この傾向は、糖尿病患者の増加が透析患者数の増加を後押しすることを示唆している。しかしながら、糖尿病性腎症の詳細な発症機序については未だ明らかとなっていないため、それを解明することが急務となっている。
【０００３】
最近、糖尿病合併症因子の病因性は、主に細胞上のある特殊な受容体と結合することで引き起こされることがわかってきた。その多くは一般的にスカベンジャー受容体と呼ばれるものであるが、本来別の機能を有する受容体に、糖化変性物質（ＡＧＥ）などの非酵素的変性物質が相互作用することで、病因性を引き起こす場合も報告されている。例えば、ガレクチン−３やＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などである。特にＲＡＧＥは糖尿病の３大合併症である腎症、網膜症、神経障害の発症を引き起こすだけではなく、動脈硬化も助長することがわかってきた。最近になり、ＲＡＧＥと糖尿病状態で亢進するある特定の物質との相互作用によって、糖尿病性合併症などの血管障害が引き起こされることが、動物レベルで証明されつつある（第４２回日本糖尿病学会）。
【０００４】
ＲＡＧＥは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属し、肺胞上皮細胞をはじめ、血管内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞などの血管壁細胞や腎臓メサンギウム細胞、赤血球、マクロファージなどに発現が認められている。発見当初はＡＧＥの受容体として認識されていたが、その後の研究により、β−アミロイドやある種の炎症マーカーの一群であるＨＭＧ−１、血清アミロイドＡ、Ｓ１００／カルグラニュリンスーパーファミリーと呼ばれる物質などとも結合するとの報告がなされ、現在はマルチリガンド受容体とされている。ＲＡＧＥと結合できるリガンド、つまりＲＡＧＥ結合物質は、ＥＮ−ＲＡＧＥ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と総称されている（セル、９７巻、８８９頁、１９９９年）。また、今後も新たなＲＡＧＥ結合物質が発見されることが予想される。
【０００５】
ところで、ＲＡＧＥと相互作用する物質の１つであるＡＧＥに関して、その形成に関与する反応基質が、グルコース等の還元糖のみならずその関連代謝産物および分解産物である場合もあることが示されている。それらの反応基質として、メチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾンなどのジカルボニル化合物や、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのα−ヒドロキシアルデヒドが挙げられる。これまで、ジカルボニル化合物を反応基質として生成した変性物質については、それらを吸着除去する材料に関する知見が開示されているのに対し、糖尿病性腎症患者の血清中に存在し、生物活性が高いことが示唆されている（竹内ら（モレキュラー・メディシン、６巻、１１４−１２５頁、２０００年））α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質を吸着する材料については、知られていないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑み、変性物質、特にα−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した生物活性の高い変性物質を吸着できる材料に関して鋭意検討した結果、それらを吸着可能である材料を見い出し、さらに、該材料が体液処理可能であることを示し、本発明に到達した。すなわち本発明は、変性物質、特にα−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質を除去可能な吸着材、カラムを提供することを目的とする。また本発明は、血液等の液体中に存在する変性物質を除去可能な吸着材、カラムを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着することを特徴とする変性物質吸着材。
（２）前記非酵素的反応生成物がＲＡＧＥのリガンドであることを特徴とする（１）に記載の変性物質吸着材。
（３）前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリコールアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする（１）または（２）に記載の変性物質吸着材。
（４）前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリセルアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする（１）または（２）に記載の変性物質吸着材。
（５）水不溶性担体にＲＡＧＥ誘導体を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（６）水不溶性担体にカチオン化した原子を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（７）水不溶性担体に反応性アミンを含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（８）水不溶性担体に次式［Ｉ］で表される構造を含む吸着基が固定化されたものであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
【０００８】
（水不溶性担体）−（Ｙ）ａ −Ｚ ［Ｉ］
Ｙ：アミド、または、ケトンのうちで何れかの官能基
Ｚ：−（環式化合物１）ｌ−（鎖状化合物）ｍ−（環式化合物２）ｎ−ＮＨ２であり、
且つ、炭素原子を１つ以上持つ官能基
ａ、ｌ、ｍ、ｎ：０、または、１以上の整数。
（９）前記水不溶性担体に前記吸着基を固定する方法が、共有結合であることを特徴とする（５）〜（８）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１０）前記水不溶性担体が、多糖体あるいはビニル芳香族化合物であることを特徴とする（５）〜（９）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１１）前記変性物質吸着材の、液体中からのα−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物の除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１２）前記変性物質吸着材のジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１３）前記変性物質吸着材のＲＡＧＥ結合物質の液体中からの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１４）前記変性物質吸着材の、液体中からのβ２ミクログロブリンの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１５）（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材を充填してなることを特徴とする変性物質除去カラム。
（１６）（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材あるいは請求項１５に記載の変性物質除去カラムを用いて、液体中の変性物質を除去する方法。
（１７）体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１８）体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする（１５）に記載の変性物質除去カラム。」
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
本発明において、糖化変性物質とは、生体内の還元糖（例えばグルコース）とタンパク質等の生体分子とが、非酵素的に反応することにより生成する産物を指し、変性物質とは、還元糖とは異なる反応基質とタンパク質等の生体分子とが非酵素的に反応して生成する産物を指す。ここでいう還元糖とは異なる反応基質とは、例えばメチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾンなどのジカルボニル化合物や、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのα−ヒドロキシアルデヒド、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリコールアルデヒドアルキルイミンなどのα−ヒドロキシアルデヒド誘導体といった還元糖の代謝産物あるいは分解産物を指す。また、ここでいう生体分子とは、生体内に存在する物質全般のことを指すが、特にアミノ基を有する物質がそれに該当する。本発明における生体分子としては、例えばタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質に代表される脂質関連タンパク質、ペプチド成分、ホルモン、核酸などの多糖体由来成分、ビタミンなど各種低分子の代謝産物、アミノ酸、アミノ酸関連物質、糖関連物質、脂質関連物質等の代謝産物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明でいう非酵素的反応とは、酵素を必要とすることなく進行する反応のことであり、代表的なものとしてメイラード反応が挙げられる。１９１２年にフランスの化学者メイラードが、ブドウ糖などの還元糖とアミノ酸を混合して過熱すると、黄褐色の物質が形成したことを報告したが、この反応は酵素による糖鎖の付加反応であるグリコシレーションとは異なり、酵素を必要としないことから、非酵素的糖化反応と呼ばれている。グルコースなどの還元糖若しくは前述の還元糖とは異なる反応基質と、タンパク質のＮ末端アミノ基か、リジンのε−アミノ基が反応してまず可逆性のシッフ塩基をつくり、ついで分子内転移を起こして安定なアマドリ化合物を形成する。さらに酸化・脱水・縮合などの複雑な反応を経ることにより、変性物質、糖化変性物質が生成する。また、生成した変性物質あるいは糖化変性物質の反応産物がさらに反応する場合もある。これら変性物質、糖化変性物質の構造や形成のメカニズムはまだ解明されていないが、単一の物質ではなく多様なものと考えられている。生成した変性物質、糖化変性物質は、褐色化や蛍光、架橋形成などの物理化学的特徴を有する他、ＲＡＧＥによりリガンドとして認識される生物学的特徴を有するものもある。本発明においては、前述の変性物質および糖化変性物質を吸着除去することが好ましく、ＲＡＧＥのリガンドとして認識される変性物質、糖化変性物質を除去することがさらに好ましい。ここで、本発明におけるＲＡＧＥのリガンドとは、ＲＡＧＥと結合し得る分子のことであり、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを用いたアフィニティーカラムによって濃縮精製し得る分子のことを指す。
【００１１】
本発明でいう吸着材は、変性物質および糖化変性物質を特異的に結合できる物質（以下、吸着基）が、水不溶性である材料に固定されたものであればよく、特に限定されるものではない。吸着基が固定される材料としては、体外循環可能で、かつグラフト反応可能な水不溶性担体であることが好ましく、表面積を広く取れる多孔質体を形成可能な材料であることがより好ましい。また、溶血反応を起こさず、血液中の必須成分の吸着ができるだけ少なく、白血球への刺激が低く抑えられた生体適合性の高い素材であることが好ましい。ここで、親水性表面を有する担体を用いる、あるいは担体表面に生体適合性の高い物質をコーティング、グラフトすることにより、担体の生体適合性を高めることがいっそう好ましい。なお、担体は有機、無機を問わず、また有機−有機あるいは有機−無機の複合担体でもよい。無機担体としては、例えばガラスビーズ、シリカゲル、金属ビーズなどが、有機担体としては、例えば架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋ポリスルホン等のビニル芳香族化合物に代表される合成高分子や結晶性セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類がそれぞれ好適に用いられる。担体の形状は、粒状、繊維状またはそれらの高次加工品、中空糸状と任意に選ぶことができ、その大きさも特に限定されない。
【００１２】
吸着基としては、変性物質と高い親和性を有し、また血液中の生体必須成分の吸着ができるだけ少なく、生体適合性の高いものであれば特に限定されない。例えば、ＲＡＧＥ若しくはそのリガンド結合部位を含む一部、抗変性物質抗体若しくはその抗原認識部位を含む一部といったタンパク質またはペプチドなどの物質が挙げられる。また、変性物質と親和性のある部位を含む天然化合物、合成化合物を用いることも可能である。
【００１３】
吸着基を固定化する場合、化学的結合を用いる方法と物理的結合を用いる方法の２通りある。化学的結合を用いる場合、担体表面上に必要な官能基としては、例えば水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。また、吸着基は、これら官能基修飾を受けた担体に直接結合してもよいし、何らかのスペーサー分子を介して結合することも可能である。リガンド間の立体障害を防ぎ、吸着基の自由度が増すことから、スペーサーを介して結合することがより好ましい。一方、物理的な結合を用いる場合、吸着基側の酸性もしくは塩基性側鎖と静電的相互作用により結合する方法と、遷移金属などを介した配位結合を利用する方法がある。いずれの固定化方法を利用するにせよ、吸着基の活性が維持される方法であれば、固定化方法は特に限定を受けない。もし、滅菌時や治療などの使用時に吸着基の脱落・遊離が問題となる場合には、共有結合法で固定化することが好ましい。
【００１４】
一般に、吸着除去対象である生体由来物質の受容体そのものもしくはその一部、あるいはその抗体を吸着基に用いた場合、除去対象物質を結合することが明らかであるため利用しやすいが、生産コストや安定供給を考慮すると、化学合成の吸着基を用いたほうが有利な場合が多い。しかしながら、受容体や抗体と結合可能な生体由来物質と親和性を有する化学合成の吸着基を見いだすには、多くの試行錯誤が必要である。そこで我々は鋭意検討を行った結果、ＲＡＧＥや抗変性物質抗体と結合可能な物質と親和性を有する化学合成の吸着基に必要な性質として、少なくとも下記に示す何れか１項目を満足すればよいことがわかった。
「性質（１）：カチオン化した原子を含むこと」
「性質（２）：反応性アミンを含むこと」
「性質（３）：次式［Ｉ］で表されること。
【００１５】
（水不溶性担体）−（Ｙ）ａ−Ｚ ［Ｉ］
但し、Ｙ：アミド、または、ケトンのうちで何れかの官能基
Ｚ：−（環式化合物１）ｌ−（鎖状化合物）ｍ−（環式化合物２）ｎ−ＮＨ２であり、且つ、炭素原子を１つ以上持つ官能基。
【００１６】
ａ、ｌ、ｍ、ｎ：０または１以上の整数。」
性質（１）においては、カチオン化原子が４級アミンである場合に、変性物質との親和性が最も高くなるが、我々は、生理的ｐＨ付近においては、必ずしもカチオン化されていなくても変性物質を吸着可能であることを見いだした。すなわち、生理的ｐＨ付近において、少なくとも１つ以上の正電荷性原子があればよい。ここで、正電荷性原子は必ずしもＮ原子とは限定されず、例えばＣ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子といった元素、あるいは無機化合物を含む有機金属など、正電荷性を有するものであれば特に限定を受けない。
【００１７】
一方、生理的ｐＨ付近において、非カチオン性構造を形成する場合には、性質（２）に示されるように、微小正電荷性官能基の近傍即ちα位もしくはβ位に水酸基やアミノ基のような電子吸引性官能基が存在すると、糖化変性物質に対する親和性を有することが多いだけでなく、α−ヒドロキシアルデヒド由来の変性物質との親和性も有する。正電荷性官能基の例としては、２級アミン、３級アミン、４級アミンといった脂肪族性の窒素原子含有官能基、ピロリジン、ピラロリジン、ピペリジン、ピペラジン等の窒素原子含有環化脂肪族性官能基、環化構造中に２重結合を有するピロール、ピロリン、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、インドール、ベンジイミダゾール、プリン、キノリン、カルバゾール、アクリジン、フェナントロリン等の芳香族系複素環化合物、オキサゾール、チアゾール、モルフォリン、フェノチアジン等の環化脂肪族系もしくは芳香族性官能基中に酸素原子、硫黄原子等電気陰性度の高い原子を含有するトルイジン環のような構造が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではない。また、正電荷性官能基の近傍に存在する電子吸引性官能基の例としては、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アセチル基、ニトロ基、エステル基、ハロゲン基、スルホン酸基、リン酸基、フェニル基に代表される芳香族官能基等が挙げられるが、特にこれらに限定を受けるわけではない。さらに、非イオン性でかつ正電荷性構造を有する場合、全血接触に対して生体適合性がよいとされるため、いっそう好ましい。
【００１８】
より良い血液適合性を求めるならば、一般的に性質（３）に記載した吸着基が好適に用いられる。これらの吸着基のうち、より好適な構造は、化学式［Ｉ］中のＺ基の中に４−アミノジフェニルメタン基のような芳香族アミンが含まれたものであるが、ここで用いられる芳香族は必ずしも６員環である必要はなく、また環構造は、５員環以上１０員環以下であれば特に問題はなく用いることが可能である。また、Ｚ基中の環式化合物１及び２と鎖状化合物については、特に限定を受けることはなく、また、炭化水素系化合物に限定されることもない。
【００１９】
Ｚ基中の環式化合物１及び２は、シクロヘキサン、シクロペンタンのような脂環式化合物や、さらにメチル基、エチル基、イソブチル基などが結合した脂環式化合物誘導体でもよい。好ましくは、フェニル基、ジフェニルメチル基、ナフチル基等の芳香族化合物が挙げられるが、ハロゲン基、アルキル基、水酸基、ニトロ基、スルホン酸基、カルボキシル基等の芳香族誘導体でも用いることができる。より好ましくは、芳香族アミン誘導体が用いられるが、特に限定を受けない。また、炭化水素系化合物に限定する必要はなく、ピロリジン、ピラロリジン、ピペリジン、ピペラジン等のＮ含有環化脂肪族性官能基であってもよく、さらに、環化構造中に２重結合を有するピロール、ピロリン、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、インドール、ベンジイミダゾール、プリン、キノリン、カルバゾール、アクリジン、フェナントロリン等の芳香族系複素環化合物や、また、オキサゾール、チアゾール、モルフォリン、フェノチアジン等の環化脂肪族系もしくは芳香族性官能基中にＯ、Ｓ等の電気陰性度の高い原子を含有するトルイジン環のような構造であってもよく、特にこれに記載された構造に限定されるわけではない。同様にＺ基中の鎖状化合物も限定を受けるものではなく、エチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基の直鎖状の構造やイソプロピル基、ジエチルメチレン基のような分岐状の構造でもよく、また、直鎖あるいは分岐ポリエチレンイミンのような含窒素鎖状構造でもよく、特に限定を受けない。好ましくはメチレン基が挙げられるが、特にこれに記載の構造に限定されることはない。
【００２０】
α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着可能な変性物質吸着材は、例えば以下に示す方法によって製造することができる。可溶性ＲＡＧＥや抗変性物質抗体のようなタンパク質、ペプチドを吸着基とする場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）を活性基としてセルロース担体に導入し、吸着基となる物質をカップリング反応させて固定化する方法や、末端にエポキシ基のような反応性の高い官能基を有するスペーサーを中空糸やビーズに結合させておき、吸着基と反応させて固定化する方法等がある。また、合成化合物を吸着基とする場合、例えばキトサンビーズあるいはセルロースビーズにイソシアネート基を有する芳香族化合物を導入した後、イソシアネート基をアミノ基に加水分解させることにより芳香族アミンを導入する方法や、親水性スペーサーを固定した担体にカチオン化原子を末端に有する化合物を固定化する方法、親水性ポリマーでコーティングした担体に活性基を導入し、反応性アミンを有する化合物を固定化する方法等により吸着材を製造することができる。これらの方法は、吸着基を共有結合で担体に固定する方法であるために吸着基が遊離しにくく好ましい。また以上に示したようにセルロースやキトサンのような多糖類に限らずポリスチレンなどのビニル芳香族化合物を担体として用いることにより生体適合性の高い吸着材を製造することができる。また、これらの方法により製造された吸着材は、非酵素的反応生成物がＲＡＧＥのリガンドである場合も良好な吸着性能を示し、αヒドロキシアルデヒドがグリコールアルデヒドやその誘導体である場合、αヒドロキシアルデヒドがグリセルアルデヒドやその誘導体である場合ま含めて良好な吸着性能を示すものである。α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、上述の製造方法において、例えば活性基を導入した担体に可溶性ＲＡＧＥを固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、ジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、ＲＡＧＥ結合物質の液体中からの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば臭化シアン等の活性基を導入した担体にＲＡＧＥを固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、β２ミクログロブリンの液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば中空糸を担体に用いて、スペーサーを固定化しておき、さらに吸着基を有する化合物を固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。以上のような方法で本発明に係る吸着材を製造できるが、ここに示した方法に限定されるものではない。
【００２１】
吸着材を充填してなるカラムは、入口と出口を１つずつ有する容器内に上述の吸着材を充填することにより、製造することができる。カラムに用いる容器の形状は特に限定されないが、血液を灌流させることを考慮すると、円筒状が好ましい。また、容器の材質は特に限定されないが、溶血反応を起こさず、血液中の必須成分の吸着ができるだけ少なく、白血球への刺激が低く抑えられた生体適合性の高い素材であることが好ましい。吸着材にビーズを利用する場合、カラムに液体を通過させるときに吸着材が流出しないようにするため、カラムの入口側、出口側にフィルターを装填することが好ましい。吸着材を充填してなるカラムは、γ線、オートクレーブ等により滅菌することが好ましい。また、吸着材、カラム容器をそれぞれ滅菌後、無菌的にカラムを組み立てる方法により製造してもよい。以上のような方法で本発明に係るカラムを製造できるが、ここに示した方法に限定されるものではない。
【００２２】
本発明の吸着材を治療に用いる場合には種々の方法がある。最も簡便な方法としては、患者の血液等の体液を体外に導出して血液バッグに貯留し、これに本発明の吸着材を混合して糖化変性物質を吸着させた後、フィルターを通して吸着材を除去し、体液を患者に戻す方法がある。また、吸着材をカラムに充填し、体外循環回路に組み込み、オンラインで吸着除去をする方法もある。この場合、全血を直接灌流する方法と、血液から血漿を分離し、血漿のみをカラムに通過させる方法があり、本発明の吸着材はいずれの方法にも用いることができる。このうち、オンライン処理による治療方法が好ましく、全血を直接灌流する方法がさらに好ましい。
【００２３】
ここでいう体外循環においては、本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他のアフェレーシス治療との併用も可能である。併用例としては、例えば人工透析が挙げられ、透析回路に本発明の吸着材を組み込み、透析療法と組み合わせて用いることも可能である。
【００２４】
以下、本発明における実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
（１）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのクローニング
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、細胞外ドメイン上流及び下流の２つの断片を増幅した。ＰＣＲプライマーはヒトＲＡＧＥのデータベース配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ９１２１１）を基に４種類設計し、各々２種類ずつを上流及び下流増幅プライマーとして用いた。
・上流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（１〜２９）及びＡＳ（７３０〜７４９）
・下流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置）
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２）
（上流には制限酵素ＥｃｏＲＩ、下流にはＢｇｌＩＩの切断部位を付加した。）また、プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。さらに、ＲＡＧＥを可溶型とするため、細胞外ドメインの下流末端に終止コドン（ＴＧＡ）を付加した。
【００２６】
２種類の反応産物をアガロースゲル電気泳動し、得られた各ＰＣＲ増幅断片を電気泳動のゲルから回収した後、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、ＰＣＲ産物の塩基配列確認を行った。
（２）バキュロウイルストランスファーベクターへの遺伝子挿入
バキュロウイルスベクターへのクローニングを以下のように行った。ベクターはｐＶＬ１３９３（ファーミンジェン）を用いた。まず、ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化した後精製した。（１）で得たＲＡＧＥ細胞外領域上流及び下流の２つの断片は以下に示す制限酵素で切断後、目的断片を精製した（目的断片の塩基数）。
・上流：ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ（６６６ｂｐ）
・下流：ＦｓｐＩ／ＢｇｌＩＩ（３８４ｂｐ）
精製した２断片をｐＶＬ１３９３ベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入した。得られたクローンについて電気泳動による挿入断片のサイズ確認と塩基配列決定により、目的ＤＮＡを持つクローンが構築できたことを確認した。
（３）Ｈｉｓ−Ｔａｇ導入
（２）で得られたＲＡＧＥプラスミドＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、細胞外ドメイン下流末端にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは（１）で用いた下流増幅用プライマーの終止コドンの前にＨｉｓをコードするコドン（ＣＡＴ）の６回繰り返し配列を挿入したものを作製した。
・増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置または塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２＋（ＣＡＴ）６＋（ＴＧＡ２）＋ＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅ）
プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。確認の結果、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン（ＲＡＧＥアミノ酸配列のＮ末端側から３４４アミノ酸残基までの配列；但し最初のアミノ酸をＧからＭに変更した。）のＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを融合した遺伝子配列を得た。
（４）昆虫細胞への感染とヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの発現
バキュロウイルスを感染させる昆虫細胞はＳｆ−９を用いた。昆虫細胞の培養、ウイルス感染、組み替えタンパク質の発現等については、次の文献を参考に操作を行った（バイオ・インダストリー：ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ、１０巻、１号、４０頁、１９９３年）。ＴＭＮ−ＦＨ培地に１０％非働化ウシ血清を添加した培養液中で、Ｓｆ−９を２７℃の条件で単層培養した。ＲＡＧＥ細胞外ドメイン遺伝子を導入するために、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、Ｓｆ−９への発現ベクターとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。６日培養後、培養上清および細胞を回収した。ＲＡＧＥ細胞外ドメインの発現効率を上げるために、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ添付のマニュアルに従って感染増幅を２回行い、ＲＡＧＥ細胞外ドメインとバキュロウイルスを含む培養上清と昆虫細胞を別に回収した。
（５）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの精製
（４）で得られたヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液から、目的タンパク質を精製した。精製には、ＨｉｓＴｒａｐ（アマシャムファルマシア）を用いた。精製したヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの一部を、再度ＨｉｓＴｒａｐに結合させた後、溶出バッファーで溶出を行わず、そのままカラムを解体して実施例１の変性物質吸着材（ヒトＲＡＧＥ結合担体）とした。溶出液中の残存ＲＡＧＥ量をＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース）で測定することにより、ヒトＲＡＧＥ結合量を算定した結果、約２．２６ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
（６）ＡＧＥの作製
本発明に係る変成物質吸着材の吸着能評価に用いるためのαヒドロキシアルデヒドと生体物質の非酵素的反応生成物として以下の方法により各種のＡＧＥを作製した。
【００２７】
α−Ｄ−グルコース（和光純薬工業）とウシ血清アルブミン（シグマ）とを３７℃で２ヶ月反応させることにより、ＡＧＥを得た（ＡＧＥ−１）。また、α−ヒドロキシアルデヒドとしてＤＬ−グリセルアルデヒド（シグマ）、グリコールアルデヒド２量体（シグマ）、およびジカルボニル化合物としてメチルグリオキサール（シグマ）、グリオキサール（和光純薬工業）とウシ血清アルブミン（シグマ）とをそれぞれ混合し、３７℃で１週間反応させることにより、各種ＡＧＥを得た（グリセルアルデヒド由来：ＡＧＥ−２、グリコールアルデヒド由来：ＡＧＥ−３、メチルグリオキサール由来：ＡＧＥ−４、グリオキサール由来：ＡＧＥ−５）。それぞれ反応終了後、ＰＢＳに対して透析し、標品を得た。
（７）ＡＧＥとＲＡＧＥの結合性確認
（６）で作製したＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３およびＢＳＡを２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化した。ＡＧＥ溶液を除去し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを１ウェル当たり４００μｌ入れ、室温で１時間静置してブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、緩衝液を１ウェル当たり５０μｌ入れ、さらに０．２μｇ／ｍｌに調製したヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液を５０μｌ加えて、２５℃で１時間振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍｌに調製した抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体を１ウェル当たり１００μｌ入れ、２５℃で１時間振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメット）を１ウェル当たり１００μｌ入れ、２５℃で３０分振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−ツイーン２０で４回洗浄した後、発色液を１ウェル当たり１００μｌ入れ、５分振盪後１Ｎ硫酸を１００μｌ加えて反応を停止させ、５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図１に示すとおり、ＡＧＥとＲＡＧＥを反応させたサンプルは、ＢＳＡとＲＡＧＥを反応させたサンプルより有意に吸光度が高く、ＡＧＥとＲＡＧＥが強い親和性を有することが示された。
（８）抗ＡＧＥ抗体の作製
ニュージーランド・ホワイト・ラビット（ＮＺＷ）に対して、（６）で作製した各ＡＧＥで免疫した。免疫手法は、細胞工学 別冊 抗ペプチド抗体実験プロトコール、４８頁を参考にして行った。ＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３、ＡＧＥ−４、ＡＧＥ−５とフロイントの完全アジュバント（和光純薬）を混合し、ＮＺＷの背部３ヶ所に週１回、６回皮下投与した。免疫終了後は、頸部動脈から脱血して、抗血清を得た。得られた抗血清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（アマシャムファルマシア）で精製した。得られた抗体は、ＢＳＡとはほとんど反応しないが、ＡＧＥ化ＢＳＡとは反応したことから、これらの抗体は抗原性のあるＡＧＥを認識することが示された。
（９）セルロース担体への抗体及びヒトＲＡＧＥの固定化
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したセルロースゲル（ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア））１ｍｌに、（８）で得られたポリクローナル抗体１．４２ｍｇを０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）１ｍｌに溶解した溶液を加え、４℃で一晩ゆっくりと撹拌した。遠心してゲルを沈降させ、反応液を除去した後、１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍｌを加えて、室温で２時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した。次に、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０）、０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）の順で３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液により平衡化したものを実施例２の変性物質吸着材とした。固定化溶液に残存している抗体量から算定して、抗体の固定化量は約１．３１ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
また、抗体固定化法と同様の手法を使って、ヒトＲＡＧＥをＮＨＳ活性化セファロース４Ｂに固定化した。ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂを１ｍｌ当たり、（５）で得られた精製ヒトＲＡＧＥを１．０５ｍｇ反応させ、得られたものを実施例３の変性物質吸着材とした。固定化溶液に残存しているＲＡＧＥ量から逆算して、ヒトＲＡＧＥの固定化量は約０．９５ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
（１０）アミドメチル化繊維の合成
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる米国特許４６６１２６０記載の海島型複合繊維（太さ：２．６デニール、島の数：１６）を、５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８％硫酸、０．８５ｇのパラホルムアルデヒドの混合溶液と２０℃で１時間反応させた。その後、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、その後、水により反応を停止させた後、メタノールで再び洗浄することによりα−クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す。）を得た。
（１１）アミドメチル化繊維への抗体及びヒトＲＡＧＥの固定化
（１０）で得られたＡＭＰＳｔ繊維をさらに水でよく洗浄し、ＡＭＰＳｔ繊維０．５ｇ（乾燥重量相当）を得た。（５）で得られたヒトＲＡＧＥあるいは（７）で得られた抗ＡＧＥ抗体の溶媒を脱塩カラムで０．１Ｍ重曹水溶液に置換した。抗体溶液１．２８ｍｇ／５ｍｌあるいはヒトＲＡＧＥ溶液１．０８ｍｇ／８ｍｌに各々ＡＭＰＳｔ繊維０．５ｇを浸漬し、試験管内で３７℃で２時間ゆっくり振盪しながら反応させた。反応前後における反応液中の吸光度を測定することにより、抗体あるいはヒトＲＡＧＥの固定化量を算定した結果、それぞれ抗体固定化繊維は０．８２ｍｇ／ｇ繊維（実施例４）、ヒトＲＡＧＥ固定化繊維は１．１８ｍｇ／ｇ繊維（実施例５）であった。各々の固定化繊維を０．１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）５ｍｌに浸漬し、室温で１．５時間反応させ、未反応のα−クロロアセトアミドメチル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍｌ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍｌで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行い、吸着実験に使用した。
（１２）非生体分子固定化ビーズの作製
前記式［Ｉ］で表される構造を含む吸着基が固定化された吸着材として、４種類（実施例６〜９）の非生体分子固定化ビーズを作製した。各実施例の構造を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
粒径０．１ｍｍのキトサンビーズ（富士紡（株）、“キトパール”ＡＬ−０１）１２ｍｌ（沈降時体積、乾燥時重量は１．０ｇ）をジメチルホルムアミド中で攪拌した。この操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。このビーズを１０ｇのヘキサメチレンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。この洗浄操作を３回繰り返し、未反応のヘキサメチレンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解した。さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＩ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例６）。
（キトサンビーズ）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２ ［ＩＩ］
また、キトサンビーズ（ＡＬ−０１）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させたビーズを１５ｇの４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。この洗浄を３回繰り返し、未反応４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＩＩ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例７）。
（キトサンビーズ）−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［ＩＩＩ］
さらに、セルロースビーズ（セルロファインＧＣＬ−２００ｃｃ；乾燥重量１．０ｇ）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【００３０】
このビーズを１５ｇの４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。これを３回繰り返し、未反応の４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換した。さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解した。さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＶ］の構造を有するセルロースビーズを得た（実施例８）。
（セルロースビーズ）−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［ＩＶ］
他にも、キトサンビーズ（ＡＬ−０１、乾燥重量１．０ｇ）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させたビーズを１５ｇの４、４’−ビフェニルジカルボニルクロライドを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行い、この洗浄を３回繰り返し、未反応４、４’−ビフェニルジカルボニルクロライドを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させイソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［Ｖ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例９）。
（キトサンビーズ）−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［Ｖ］
（１３） 吸着材のＡＧＥ吸着実験１
（５）、（８）、（１０）、（１１）で得られた吸着材、及び、市販の吸着材を使って、ＡＧＥ吸着実験を行った。市販の吸着材は、カチオン性担体には、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＱＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ（東ソー：実施例１０）を、また反応性アミン固定化担体には、アミノセルロファイン（チッソ：実施例１１）をそれぞれ用いた。形状がゲルの場合は沈降体積で吸着材１００μｌあたり、サンプル（（６）で得られたＡＧＥ−１，ＡＧＥ−２およびＡＧＥ−３を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。形状が繊維の場合は、ＡＭＰＳｔ繊維の乾燥重量で５０μｇあたり、サンプルを１ｍｌ加えた。３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した。この反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を以下に示す免疫学的測定法（競合法ＥＬＩＳＡ）で測定した。（６）で作製したＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３を２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、緩衝液２５μｌ、測定サンプル２５μｌ、（８）で作製したＡＧＥ抗体の希釈溶液を５０μｌを入れて、２５℃で１時間振盪した。固相化抗原を認識した抗体に対して、抗ウサギペルオキシダーゼ標識抗体（カッペル）を反応させた後、発色させて５９５ｎｍの吸光度を測定した。なお、検量線は（６）で作製した各ＡＧＥを用いた。各吸着材のＡＧＥ吸着率を表２に示す。すべての吸着材について、ＡＧＥに対して良好な選択性を示した。特に、カチオン性ビーズと反応性アミン固定化ビーズがＡＧＥに対する強い親和性を示した。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（１４）吸着材のＡＧＥ吸着実験２
（９）で使用したＮＨＳ活性化セファロース４Ｂを１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに加えて、室温で１．５時間反応させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した担体（比較例１）と（１０）で作成したＡＭＰＳｔ繊維（比較例２）を用いて（１３）と同様の操作でＡＧＥに対する吸着実験を行った。また、（１３）に記載した吸着実験の方法が、ＡＧＥのキャリアタンパクであるＢＳＡに対する親和性により吸着率が左右されないことを確認するために、ＢＳＡ親和性担体であるトヨパール ＡＦ−Ｂｌｕｅ ６５０ＭＬ（東ソー：比較例３）を用いた場合のＡＧＥ吸着性能も調べた。結果を表３に示す。その結果、ＡＧＥに対して顕著な親和性を示さないことが明らかとなった。したがって、糖尿病合併症因子に対して特異的な親和性を持つリガンドを固定化することにより、ＡＧＥに対して特異的な親和性が生じることが示された。
【００３３】
【表３】
【００３４】
（１５）吸着材のＡＧＥ吸着実験３
（１３）に記載の実施例１〜１１について、（６）で得られたＡＧＥをさらにＲＡＧＥ結合アフィニティーカラムにより精製したＡＧＥの吸着実験を行った。ＲＡＧＥ結合アフィニティーゲルは、（８）で得られた実施例３を使用した。オープンカラムにＲＡＧＥ結合ゲルを３ｍｌ充填し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。（６）で得られたＡＧＥ化ＢＳＡ（濃度：３０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加して、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを吸着させた。次いで、ＰＢＳを５０ｍｌ通過させて、ＲＡＧＥ非結合性ＡＧＥ化ＢＳＡを除去した。さらに、０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）を通過させて、結合したＡＧＥ化ＢＳＡを回収した。回収したＡＧＥ化ＢＳＡに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて中和後、ＰＢＳに対して十分透析し、目的とするＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを得た。得られたＡＧＥ溶液について、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース）でタンパク濃度を測定した結果、約４．７１ｍｇ／ｍｌであった。吸着実験は、（１３）と同様の方法で行った。形状がゲルの場合は沈降体積で吸着材１００μｌあたり、サンプル（ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。形状が繊維の場合は、ＡＭＰＳｔ繊維の乾燥重量で５０μｇあたり、サンプルを１ｍｌ加えた。それぞれ３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を（１３）に記載したＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を表４に示す。その結果、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対しても、検討した吸着材すべてにおいて良好な親和性を示した。また、吸着率はＲＡＧＥアフィニティーカラムで精製していないＡＧＥより、高い吸着率を示した。したがって、実施例１〜１１の吸着材はＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対して、より良好な親和性を有することが示された。
【００３５】
【表４】
【００３６】
（１６）吸着材のＡＧＥ吸着実験４
（１４）で得られた比較例１〜３の吸着材を用いて、（１５）と同様の操作でＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対する吸着実験を行った。結果を表５に示す。（１４）と同様、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対する顕著な親和性を有さないことが示された。したがって、実施例１〜１１のように、糖尿病合併症因子に対して特異的な親和性を持つリガンドを固定化することにより、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対して特異的な親和性が生じることが示された。
【００３７】
【表５】
【００３８】
（１７）吸着材のＡＧＥ吸着実験５
（１２）に記載の実施例７、（１３）に記載の実施例１０、および（１４）に記載の比較例１について、ジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物に対する吸着実験を行った。ジカルボニル化合物由来非酵素的反応生成物として、（６）に記載のメチルグリオキサール由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−４）、およびグリオキサール由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−５）を用いた。吸着材１００μｌあたり、サンプル（ＡＧＥ−４あるいはＡＧＥ−５を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を（１３）に記載したＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を表６に示す。実施例７、実施例１０は親和性を有していたのに対し、比較例１は親和性を有さなかったことから、実施例７、実施例１０はジカルボニル化合物由来ＡＧＥに対して良好な親和性を有することが示された。
【００３９】
【表６】
【００４０】
（１８）吸着材のＨＭＧ−１吸着実験
（１２）に記載の実施例７及び（１３）に記載の実施例１０の吸着材について、ＲＡＧＥ結合物質として知られているＨＭＧ−１の吸着実験を行った。吸着材１００μｌあたり、ヒトＨＭＧ−１が１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１ｍｌ加えた。３７℃で２時間振盪し、反応前後の上清のＨＭＧ−１をＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を表７に示す。実施例７および実施例１０は、ＡＧＥの他に、ＨＭＧ−１と親和性を有することが示された。
【００４１】
【表７】
【００４２】
（１９）吸着材のβ２ミクログロブリン吸着実験
（１２）に記載の実施例７について、β２ミクログロブリン吸着試験を行った。ヒト新鮮血清１０ｍｌに吸着材７を１ｇ添加し、３７℃で２時間振盪した。振盪前後の上清中のβ２ミクログロブリンをＥＬＩＳＡ法で測定した結果、吸着率は８１．３％であった。したがって、実施例７は、ＡＧＥの他にβ２ミクログロブリンと親和性を有することが示された。
（２０）吸着材充填容器によるＡＧＥ吸着実験
（１２）に記載の実施例７を、円筒状のカラム（容量：１ｍｌ）に充填した。吸着材の流失を防ぐ目的で、カラムの入口と出口にそれぞれフィルターを装填した。カラムの入口および出口にチューブを接続し、ペリスタポンプを用いて、ＡＧＥ濃度を１０μｇ／ｍｌに調製した０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで循環させた。３０、６０、１２０、２４０、４８０分後にそれぞれ溶液をサンプリングし、各時間におけるＡＧＥ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表８に示す。その結果、実施例７を充填したカラムはＡＧＥを除去する性能を有していることが示された。また、カラムに充填された吸着材の圧損による変形はみられなかった。
【００４３】
【表８】
【００４４】
【発明の効果】
本発明の吸着材は、α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質と特異的に結合できる物質を、水不溶性担体に固定してなるものであり、該吸着材と変性物質を含む被処理液とを接触させることにより、変性物質を吸着除去することが可能となり、糖尿病合併症など非酵素的反応が原因で起こり得る血管障害の治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】作製した各ＡＧＥとヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインとの結合性をＥＩＡで評価した結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質の吸着材、該吸着材を充填してなるカラム、および該吸着材あるいは該カラムを用いた、液体中に存在する変性物質の除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生活習慣病といわれる病気が顕著に増加し、問題視されている。生活習慣病の中には、糖尿病や高脂血症などが原因となって起こる動脈硬化など、血管病変を引き起こす疾患が含まれ、患者の予後を大きく左右する場合が少なくない。特に糖尿病に至っては、罹患期間に依存して腎糸球体に病理学的変化が出現し、さらに悪化すると腎不全を伴い、透析を施行しなければならなくなる。透析導入患者の原疾患を見ると、１９９８年末に、糖尿病性腎症がこれまで主原因であった慢性糸球体腎炎を追い抜き、今後も増加の一途を辿ると言われている。この傾向は、糖尿病患者の増加が透析患者数の増加を後押しすることを示唆している。しかしながら、糖尿病性腎症の詳細な発症機序については未だ明らかとなっていないため、それを解明することが急務となっている。
【０００３】
最近、糖尿病合併症因子の病因性は、主に細胞上のある特殊な受容体と結合することで引き起こされることがわかってきた。その多くは一般的にスカベンジャー受容体と呼ばれるものであるが、本来別の機能を有する受容体に、糖化変性物質（ＡＧＥ）などの非酵素的変性物質が相互作用することで、病因性を引き起こす場合も報告されている。例えば、ガレクチン−３やＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などである。特にＲＡＧＥは糖尿病の３大合併症である腎症、網膜症、神経障害の発症を引き起こすだけではなく、動脈硬化も助長することがわかってきた。最近になり、ＲＡＧＥと糖尿病状態で亢進するある特定の物質との相互作用によって、糖尿病性合併症などの血管障害が引き起こされることが、動物レベルで証明されつつある（第４２回日本糖尿病学会）。
【０００４】
ＲＡＧＥは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属し、肺胞上皮細胞をはじめ、血管内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞などの血管壁細胞や腎臓メサンギウム細胞、赤血球、マクロファージなどに発現が認められている。発見当初はＡＧＥの受容体として認識されていたが、その後の研究により、β−アミロイドやある種の炎症マーカーの一群であるＨＭＧ−１、血清アミロイドＡ、Ｓ１００／カルグラニュリンスーパーファミリーと呼ばれる物質などとも結合するとの報告がなされ、現在はマルチリガンド受容体とされている。ＲＡＧＥと結合できるリガンド、つまりＲＡＧＥ結合物質は、ＥＮ−ＲＡＧＥ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と総称されている（セル、９７巻、８８９頁、１９９９年）。また、今後も新たなＲＡＧＥ結合物質が発見されることが予想される。
【０００５】
ところで、ＲＡＧＥと相互作用する物質の１つであるＡＧＥに関して、その形成に関与する反応基質が、グルコース等の還元糖のみならずその関連代謝産物および分解産物である場合もあることが示されている。それらの反応基質として、メチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾンなどのジカルボニル化合物や、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのα−ヒドロキシアルデヒドが挙げられる。これまで、ジカルボニル化合物を反応基質として生成した変性物質については、それらを吸着除去する材料に関する知見が開示されているのに対し、糖尿病性腎症患者の血清中に存在し、生物活性が高いことが示唆されている（竹内ら（モレキュラー・メディシン、６巻、１１４−１２５頁、２０００年））α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質を吸着する材料については、知られていないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑み、変性物質、特にα−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した生物活性の高い変性物質を吸着できる材料に関して鋭意検討した結果、それらを吸着可能である材料を見い出し、さらに、該材料が体液処理可能であることを示し、本発明に到達した。すなわち本発明は、変性物質、特にα−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質を除去可能な吸着材、カラムを提供することを目的とする。また本発明は、血液等の液体中に存在する変性物質を除去可能な吸着材、カラムを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着することを特徴とする変性物質吸着材。
（２）前記非酵素的反応生成物がＲＡＧＥのリガンドであることを特徴とする（１）に記載の変性物質吸着材。
（３）前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリコールアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする（１）または（２）に記載の変性物質吸着材。
（４）前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリセルアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする（１）または（２）に記載の変性物質吸着材。
（５）水不溶性担体にＲＡＧＥ誘導体を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（６）水不溶性担体にカチオン化した原子を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（７）水不溶性担体に反応性アミンを含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（８）水不溶性担体に次式［Ｉ］で表される構造を含む吸着基が固定化されたものであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
【０００８】
（水不溶性担体）−（Ｙ）ａ −Ｚ ［Ｉ］
Ｙ：アミド、または、ケトンのうちで何れかの官能基
Ｚ：−（環式化合物１）ｌ−（鎖状化合物）ｍ−（環式化合物２）ｎ−ＮＨ２であり、
且つ、炭素原子を１つ以上持つ官能基
ａ、ｌ、ｍ、ｎ：０、または、１以上の整数。
（９）前記水不溶性担体に前記吸着基を固定する方法が、共有結合であることを特徴とする（５）〜（８）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１０）前記水不溶性担体が、多糖体あるいはビニル芳香族化合物であることを特徴とする（５）〜（９）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１１）前記変性物質吸着材の、液体中からのα−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物の除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１２）前記変性物質吸着材のジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１３）前記変性物質吸着材のＲＡＧＥ結合物質の液体中からの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１４）前記変性物質吸着材の、液体中からのβ２ミクログロブリンの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１５）（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材を充填してなることを特徴とする変性物質除去カラム。
（１６）（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材あるいは請求項１５に記載の変性物質除去カラムを用いて、液体中の変性物質を除去する方法。
（１７）体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする（１）〜（１４）のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（１８）体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする（１５）に記載の変性物質除去カラム。」
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１０】
本発明において、糖化変性物質とは、生体内の還元糖（例えばグルコース）とタンパク質等の生体分子とが、非酵素的に反応することにより生成する産物を指し、変性物質とは、還元糖とは異なる反応基質とタンパク質等の生体分子とが非酵素的に反応して生成する産物を指す。ここでいう還元糖とは異なる反応基質とは、例えばメチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾンなどのジカルボニル化合物や、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのα−ヒドロキシアルデヒド、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリコールアルデヒドアルキルイミンなどのα−ヒドロキシアルデヒド誘導体といった還元糖の代謝産物あるいは分解産物を指す。また、ここでいう生体分子とは、生体内に存在する物質全般のことを指すが、特にアミノ基を有する物質がそれに該当する。本発明における生体分子としては、例えばタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質に代表される脂質関連タンパク質、ペプチド成分、ホルモン、核酸などの多糖体由来成分、ビタミンなど各種低分子の代謝産物、アミノ酸、アミノ酸関連物質、糖関連物質、脂質関連物質等の代謝産物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明でいう非酵素的反応とは、酵素を必要とすることなく進行する反応のことであり、代表的なものとしてメイラード反応が挙げられる。１９１２年にフランスの化学者メイラードが、ブドウ糖などの還元糖とアミノ酸を混合して過熱すると、黄褐色の物質が形成したことを報告したが、この反応は酵素による糖鎖の付加反応であるグリコシレーションとは異なり、酵素を必要としないことから、非酵素的糖化反応と呼ばれている。グルコースなどの還元糖若しくは前述の還元糖とは異なる反応基質と、タンパク質のＮ末端アミノ基か、リジンのε−アミノ基が反応してまず可逆性のシッフ塩基をつくり、ついで分子内転移を起こして安定なアマドリ化合物を形成する。さらに酸化・脱水・縮合などの複雑な反応を経ることにより、変性物質、糖化変性物質が生成する。また、生成した変性物質あるいは糖化変性物質の反応産物がさらに反応する場合もある。これら変性物質、糖化変性物質の構造や形成のメカニズムはまだ解明されていないが、単一の物質ではなく多様なものと考えられている。生成した変性物質、糖化変性物質は、褐色化や蛍光、架橋形成などの物理化学的特徴を有する他、ＲＡＧＥによりリガンドとして認識される生物学的特徴を有するものもある。本発明においては、前述の変性物質および糖化変性物質を吸着除去することが好ましく、ＲＡＧＥのリガンドとして認識される変性物質、糖化変性物質を除去することがさらに好ましい。ここで、本発明におけるＲＡＧＥのリガンドとは、ＲＡＧＥと結合し得る分子のことであり、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを用いたアフィニティーカラムによって濃縮精製し得る分子のことを指す。
【００１１】
本発明でいう吸着材は、変性物質および糖化変性物質を特異的に結合できる物質（以下、吸着基）が、水不溶性である材料に固定されたものであればよく、特に限定されるものではない。吸着基が固定される材料としては、体外循環可能で、かつグラフト反応可能な水不溶性担体であることが好ましく、表面積を広く取れる多孔質体を形成可能な材料であることがより好ましい。また、溶血反応を起こさず、血液中の必須成分の吸着ができるだけ少なく、白血球への刺激が低く抑えられた生体適合性の高い素材であることが好ましい。ここで、親水性表面を有する担体を用いる、あるいは担体表面に生体適合性の高い物質をコーティング、グラフトすることにより、担体の生体適合性を高めることがいっそう好ましい。なお、担体は有機、無機を問わず、また有機−有機あるいは有機−無機の複合担体でもよい。無機担体としては、例えばガラスビーズ、シリカゲル、金属ビーズなどが、有機担体としては、例えば架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋ポリスルホン等のビニル芳香族化合物に代表される合成高分子や結晶性セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類がそれぞれ好適に用いられる。担体の形状は、粒状、繊維状またはそれらの高次加工品、中空糸状と任意に選ぶことができ、その大きさも特に限定されない。
【００１２】
吸着基としては、変性物質と高い親和性を有し、また血液中の生体必須成分の吸着ができるだけ少なく、生体適合性の高いものであれば特に限定されない。例えば、ＲＡＧＥ若しくはそのリガンド結合部位を含む一部、抗変性物質抗体若しくはその抗原認識部位を含む一部といったタンパク質またはペプチドなどの物質が挙げられる。また、変性物質と親和性のある部位を含む天然化合物、合成化合物を用いることも可能である。
【００１３】
吸着基を固定化する場合、化学的結合を用いる方法と物理的結合を用いる方法の２通りある。化学的結合を用いる場合、担体表面上に必要な官能基としては、例えば水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。また、吸着基は、これら官能基修飾を受けた担体に直接結合してもよいし、何らかのスペーサー分子を介して結合することも可能である。リガンド間の立体障害を防ぎ、吸着基の自由度が増すことから、スペーサーを介して結合することがより好ましい。一方、物理的な結合を用いる場合、吸着基側の酸性もしくは塩基性側鎖と静電的相互作用により結合する方法と、遷移金属などを介した配位結合を利用する方法がある。いずれの固定化方法を利用するにせよ、吸着基の活性が維持される方法であれば、固定化方法は特に限定を受けない。もし、滅菌時や治療などの使用時に吸着基の脱落・遊離が問題となる場合には、共有結合法で固定化することが好ましい。
【００１４】
一般に、吸着除去対象である生体由来物質の受容体そのものもしくはその一部、あるいはその抗体を吸着基に用いた場合、除去対象物質を結合することが明らかであるため利用しやすいが、生産コストや安定供給を考慮すると、化学合成の吸着基を用いたほうが有利な場合が多い。しかしながら、受容体や抗体と結合可能な生体由来物質と親和性を有する化学合成の吸着基を見いだすには、多くの試行錯誤が必要である。そこで我々は鋭意検討を行った結果、ＲＡＧＥや抗変性物質抗体と結合可能な物質と親和性を有する化学合成の吸着基に必要な性質として、少なくとも下記に示す何れか１項目を満足すればよいことがわかった。
「性質（１）：カチオン化した原子を含むこと」
「性質（２）：反応性アミンを含むこと」
「性質（３）：次式［Ｉ］で表されること。
【００１５】
（水不溶性担体）−（Ｙ）ａ−Ｚ ［Ｉ］
但し、Ｙ：アミド、または、ケトンのうちで何れかの官能基
Ｚ：−（環式化合物１）ｌ−（鎖状化合物）ｍ−（環式化合物２）ｎ−ＮＨ２であり、且つ、炭素原子を１つ以上持つ官能基。
【００１６】
ａ、ｌ、ｍ、ｎ：０または１以上の整数。」
性質（１）においては、カチオン化原子が４級アミンである場合に、変性物質との親和性が最も高くなるが、我々は、生理的ｐＨ付近においては、必ずしもカチオン化されていなくても変性物質を吸着可能であることを見いだした。すなわち、生理的ｐＨ付近において、少なくとも１つ以上の正電荷性原子があればよい。ここで、正電荷性原子は必ずしもＮ原子とは限定されず、例えばＣ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子といった元素、あるいは無機化合物を含む有機金属など、正電荷性を有するものであれば特に限定を受けない。
【００１７】
一方、生理的ｐＨ付近において、非カチオン性構造を形成する場合には、性質（２）に示されるように、微小正電荷性官能基の近傍即ちα位もしくはβ位に水酸基やアミノ基のような電子吸引性官能基が存在すると、糖化変性物質に対する親和性を有することが多いだけでなく、α−ヒドロキシアルデヒド由来の変性物質との親和性も有する。正電荷性官能基の例としては、２級アミン、３級アミン、４級アミンといった脂肪族性の窒素原子含有官能基、ピロリジン、ピラロリジン、ピペリジン、ピペラジン等の窒素原子含有環化脂肪族性官能基、環化構造中に２重結合を有するピロール、ピロリン、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、インドール、ベンジイミダゾール、プリン、キノリン、カルバゾール、アクリジン、フェナントロリン等の芳香族系複素環化合物、オキサゾール、チアゾール、モルフォリン、フェノチアジン等の環化脂肪族系もしくは芳香族性官能基中に酸素原子、硫黄原子等電気陰性度の高い原子を含有するトルイジン環のような構造が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではない。また、正電荷性官能基の近傍に存在する電子吸引性官能基の例としては、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アセチル基、ニトロ基、エステル基、ハロゲン基、スルホン酸基、リン酸基、フェニル基に代表される芳香族官能基等が挙げられるが、特にこれらに限定を受けるわけではない。さらに、非イオン性でかつ正電荷性構造を有する場合、全血接触に対して生体適合性がよいとされるため、いっそう好ましい。
【００１８】
より良い血液適合性を求めるならば、一般的に性質（３）に記載した吸着基が好適に用いられる。これらの吸着基のうち、より好適な構造は、化学式［Ｉ］中のＺ基の中に４−アミノジフェニルメタン基のような芳香族アミンが含まれたものであるが、ここで用いられる芳香族は必ずしも６員環である必要はなく、また環構造は、５員環以上１０員環以下であれば特に問題はなく用いることが可能である。また、Ｚ基中の環式化合物１及び２と鎖状化合物については、特に限定を受けることはなく、また、炭化水素系化合物に限定されることもない。
【００１９】
Ｚ基中の環式化合物１及び２は、シクロヘキサン、シクロペンタンのような脂環式化合物や、さらにメチル基、エチル基、イソブチル基などが結合した脂環式化合物誘導体でもよい。好ましくは、フェニル基、ジフェニルメチル基、ナフチル基等の芳香族化合物が挙げられるが、ハロゲン基、アルキル基、水酸基、ニトロ基、スルホン酸基、カルボキシル基等の芳香族誘導体でも用いることができる。より好ましくは、芳香族アミン誘導体が用いられるが、特に限定を受けない。また、炭化水素系化合物に限定する必要はなく、ピロリジン、ピラロリジン、ピペリジン、ピペラジン等のＮ含有環化脂肪族性官能基であってもよく、さらに、環化構造中に２重結合を有するピロール、ピロリン、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、インドール、ベンジイミダゾール、プリン、キノリン、カルバゾール、アクリジン、フェナントロリン等の芳香族系複素環化合物や、また、オキサゾール、チアゾール、モルフォリン、フェノチアジン等の環化脂肪族系もしくは芳香族性官能基中にＯ、Ｓ等の電気陰性度の高い原子を含有するトルイジン環のような構造であってもよく、特にこれに記載された構造に限定されるわけではない。同様にＺ基中の鎖状化合物も限定を受けるものではなく、エチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基の直鎖状の構造やイソプロピル基、ジエチルメチレン基のような分岐状の構造でもよく、また、直鎖あるいは分岐ポリエチレンイミンのような含窒素鎖状構造でもよく、特に限定を受けない。好ましくはメチレン基が挙げられるが、特にこれに記載の構造に限定されることはない。
【００２０】
α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着可能な変性物質吸着材は、例えば以下に示す方法によって製造することができる。可溶性ＲＡＧＥや抗変性物質抗体のようなタンパク質、ペプチドを吸着基とする場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）を活性基としてセルロース担体に導入し、吸着基となる物質をカップリング反応させて固定化する方法や、末端にエポキシ基のような反応性の高い官能基を有するスペーサーを中空糸やビーズに結合させておき、吸着基と反応させて固定化する方法等がある。また、合成化合物を吸着基とする場合、例えばキトサンビーズあるいはセルロースビーズにイソシアネート基を有する芳香族化合物を導入した後、イソシアネート基をアミノ基に加水分解させることにより芳香族アミンを導入する方法や、親水性スペーサーを固定した担体にカチオン化原子を末端に有する化合物を固定化する方法、親水性ポリマーでコーティングした担体に活性基を導入し、反応性アミンを有する化合物を固定化する方法等により吸着材を製造することができる。これらの方法は、吸着基を共有結合で担体に固定する方法であるために吸着基が遊離しにくく好ましい。また以上に示したようにセルロースやキトサンのような多糖類に限らずポリスチレンなどのビニル芳香族化合物を担体として用いることにより生体適合性の高い吸着材を製造することができる。また、これらの方法により製造された吸着材は、非酵素的反応生成物がＲＡＧＥのリガンドである場合も良好な吸着性能を示し、αヒドロキシアルデヒドがグリコールアルデヒドやその誘導体である場合、αヒドロキシアルデヒドがグリセルアルデヒドやその誘導体である場合ま含めて良好な吸着性能を示すものである。α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、上述の製造方法において、例えば活性基を導入した担体に可溶性ＲＡＧＥを固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、ジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、ＲＡＧＥ結合物質の液体中からの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば臭化シアン等の活性基を導入した担体にＲＡＧＥを固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。また、β２ミクログロブリンの液体中からの除去率が４０％以上であることを特徴とする変性物質吸着材は、例えば中空糸を担体に用いて、スペーサーを固定化しておき、さらに吸着基を有する化合物を固定化する方法や、担体に芳香族アミンを導入する方法等により製造することができる。以上のような方法で本発明に係る吸着材を製造できるが、ここに示した方法に限定されるものではない。
【００２１】
吸着材を充填してなるカラムは、入口と出口を１つずつ有する容器内に上述の吸着材を充填することにより、製造することができる。カラムに用いる容器の形状は特に限定されないが、血液を灌流させることを考慮すると、円筒状が好ましい。また、容器の材質は特に限定されないが、溶血反応を起こさず、血液中の必須成分の吸着ができるだけ少なく、白血球への刺激が低く抑えられた生体適合性の高い素材であることが好ましい。吸着材にビーズを利用する場合、カラムに液体を通過させるときに吸着材が流出しないようにするため、カラムの入口側、出口側にフィルターを装填することが好ましい。吸着材を充填してなるカラムは、γ線、オートクレーブ等により滅菌することが好ましい。また、吸着材、カラム容器をそれぞれ滅菌後、無菌的にカラムを組み立てる方法により製造してもよい。以上のような方法で本発明に係るカラムを製造できるが、ここに示した方法に限定されるものではない。
【００２２】
本発明の吸着材を治療に用いる場合には種々の方法がある。最も簡便な方法としては、患者の血液等の体液を体外に導出して血液バッグに貯留し、これに本発明の吸着材を混合して糖化変性物質を吸着させた後、フィルターを通して吸着材を除去し、体液を患者に戻す方法がある。また、吸着材をカラムに充填し、体外循環回路に組み込み、オンラインで吸着除去をする方法もある。この場合、全血を直接灌流する方法と、血液から血漿を分離し、血漿のみをカラムに通過させる方法があり、本発明の吸着材はいずれの方法にも用いることができる。このうち、オンライン処理による治療方法が好ましく、全血を直接灌流する方法がさらに好ましい。
【００２３】
ここでいう体外循環においては、本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他のアフェレーシス治療との併用も可能である。併用例としては、例えば人工透析が挙げられ、透析回路に本発明の吸着材を組み込み、透析療法と組み合わせて用いることも可能である。
【００２４】
以下、本発明における実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
（１）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのクローニング
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、細胞外ドメイン上流及び下流の２つの断片を増幅した。ＰＣＲプライマーはヒトＲＡＧＥのデータベース配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ９１２１１）を基に４種類設計し、各々２種類ずつを上流及び下流増幅プライマーとして用いた。
・上流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（１〜２９）及びＡＳ（７３０〜７４９）
・下流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置）
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２）
（上流には制限酵素ＥｃｏＲＩ、下流にはＢｇｌＩＩの切断部位を付加した。）また、プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。さらに、ＲＡＧＥを可溶型とするため、細胞外ドメインの下流末端に終止コドン（ＴＧＡ）を付加した。
【００２６】
２種類の反応産物をアガロースゲル電気泳動し、得られた各ＰＣＲ増幅断片を電気泳動のゲルから回収した後、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、ＰＣＲ産物の塩基配列確認を行った。
（２）バキュロウイルストランスファーベクターへの遺伝子挿入
バキュロウイルスベクターへのクローニングを以下のように行った。ベクターはｐＶＬ１３９３（ファーミンジェン）を用いた。まず、ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化した後精製した。（１）で得たＲＡＧＥ細胞外領域上流及び下流の２つの断片は以下に示す制限酵素で切断後、目的断片を精製した（目的断片の塩基数）。
・上流：ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ（６６６ｂｐ）
・下流：ＦｓｐＩ／ＢｇｌＩＩ（３８４ｂｐ）
精製した２断片をｐＶＬ１３９３ベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入した。得られたクローンについて電気泳動による挿入断片のサイズ確認と塩基配列決定により、目的ＤＮＡを持つクローンが構築できたことを確認した。
（３）Ｈｉｓ−Ｔａｇ導入
（２）で得られたＲＡＧＥプラスミドＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、細胞外ドメイン下流末端にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは（１）で用いた下流増幅用プライマーの終止コドンの前にＨｉｓをコードするコドン（ＣＡＴ）の６回繰り返し配列を挿入したものを作製した。
・増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置または塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２＋（ＣＡＴ）６＋（ＴＧＡ２）＋ＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅ）
プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。確認の結果、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン（ＲＡＧＥアミノ酸配列のＮ末端側から３４４アミノ酸残基までの配列；但し最初のアミノ酸をＧからＭに変更した。）のＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを融合した遺伝子配列を得た。
（４）昆虫細胞への感染とヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの発現
バキュロウイルスを感染させる昆虫細胞はＳｆ−９を用いた。昆虫細胞の培養、ウイルス感染、組み替えタンパク質の発現等については、次の文献を参考に操作を行った（バイオ・インダストリー：ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ、１０巻、１号、４０頁、１９９３年）。ＴＭＮ−ＦＨ培地に１０％非働化ウシ血清を添加した培養液中で、Ｓｆ−９を２７℃の条件で単層培養した。ＲＡＧＥ細胞外ドメイン遺伝子を導入するために、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、Ｓｆ−９への発現ベクターとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡのｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。６日培養後、培養上清および細胞を回収した。ＲＡＧＥ細胞外ドメインの発現効率を上げるために、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ添付のマニュアルに従って感染増幅を２回行い、ＲＡＧＥ細胞外ドメインとバキュロウイルスを含む培養上清と昆虫細胞を別に回収した。
（５）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの精製
（４）で得られたヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液から、目的タンパク質を精製した。精製には、ＨｉｓＴｒａｐ（アマシャムファルマシア）を用いた。精製したヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの一部を、再度ＨｉｓＴｒａｐに結合させた後、溶出バッファーで溶出を行わず、そのままカラムを解体して実施例１の変性物質吸着材（ヒトＲＡＧＥ結合担体）とした。溶出液中の残存ＲＡＧＥ量をＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース）で測定することにより、ヒトＲＡＧＥ結合量を算定した結果、約２．２６ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
（６）ＡＧＥの作製
本発明に係る変成物質吸着材の吸着能評価に用いるためのαヒドロキシアルデヒドと生体物質の非酵素的反応生成物として以下の方法により各種のＡＧＥを作製した。
【００２７】
α−Ｄ−グルコース（和光純薬工業）とウシ血清アルブミン（シグマ）とを３７℃で２ヶ月反応させることにより、ＡＧＥを得た（ＡＧＥ−１）。また、α−ヒドロキシアルデヒドとしてＤＬ−グリセルアルデヒド（シグマ）、グリコールアルデヒド２量体（シグマ）、およびジカルボニル化合物としてメチルグリオキサール（シグマ）、グリオキサール（和光純薬工業）とウシ血清アルブミン（シグマ）とをそれぞれ混合し、３７℃で１週間反応させることにより、各種ＡＧＥを得た（グリセルアルデヒド由来：ＡＧＥ−２、グリコールアルデヒド由来：ＡＧＥ−３、メチルグリオキサール由来：ＡＧＥ−４、グリオキサール由来：ＡＧＥ−５）。それぞれ反応終了後、ＰＢＳに対して透析し、標品を得た。
（７）ＡＧＥとＲＡＧＥの結合性確認
（６）で作製したＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３およびＢＳＡを２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化した。ＡＧＥ溶液を除去し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを１ウェル当たり４００μｌ入れ、室温で１時間静置してブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、緩衝液を１ウェル当たり５０μｌ入れ、さらに０．２μｇ／ｍｌに調製したヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液を５０μｌ加えて、２５℃で１時間振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍｌに調製した抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体を１ウェル当たり１００μｌ入れ、２５℃で１時間振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメット）を１ウェル当たり１００μｌ入れ、２５℃で３０分振盪した。反応液を除去し、ＰＢＳ−ツイーン２０で４回洗浄した後、発色液を１ウェル当たり１００μｌ入れ、５分振盪後１Ｎ硫酸を１００μｌ加えて反応を停止させ、５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図１に示すとおり、ＡＧＥとＲＡＧＥを反応させたサンプルは、ＢＳＡとＲＡＧＥを反応させたサンプルより有意に吸光度が高く、ＡＧＥとＲＡＧＥが強い親和性を有することが示された。
（８）抗ＡＧＥ抗体の作製
ニュージーランド・ホワイト・ラビット（ＮＺＷ）に対して、（６）で作製した各ＡＧＥで免疫した。免疫手法は、細胞工学 別冊 抗ペプチド抗体実験プロトコール、４８頁を参考にして行った。ＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３、ＡＧＥ−４、ＡＧＥ−５とフロイントの完全アジュバント（和光純薬）を混合し、ＮＺＷの背部３ヶ所に週１回、６回皮下投与した。免疫終了後は、頸部動脈から脱血して、抗血清を得た。得られた抗血清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（アマシャムファルマシア）で精製した。得られた抗体は、ＢＳＡとはほとんど反応しないが、ＡＧＥ化ＢＳＡとは反応したことから、これらの抗体は抗原性のあるＡＧＥを認識することが示された。
（９）セルロース担体への抗体及びヒトＲＡＧＥの固定化
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したセルロースゲル（ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア））１ｍｌに、（８）で得られたポリクローナル抗体１．４２ｍｇを０．５ＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）１ｍｌに溶解した溶液を加え、４℃で一晩ゆっくりと撹拌した。遠心してゲルを沈降させ、反応液を除去した後、１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍｌを加えて、室温で２時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した。次に、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４．０）、０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）の順で３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液により平衡化したものを実施例２の変性物質吸着材とした。固定化溶液に残存している抗体量から算定して、抗体の固定化量は約１．３１ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
また、抗体固定化法と同様の手法を使って、ヒトＲＡＧＥをＮＨＳ活性化セファロース４Ｂに固定化した。ＮＨＳ活性化セファロース４Ｂを１ｍｌ当たり、（５）で得られた精製ヒトＲＡＧＥを１．０５ｍｇ反応させ、得られたものを実施例３の変性物質吸着材とした。固定化溶液に残存しているＲＡＧＥ量から逆算して、ヒトＲＡＧＥの固定化量は約０．９５ｍｇ／ｇ−ゲルであった。
（１０）アミドメチル化繊維の合成
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる米国特許４６６１２６０記載の海島型複合繊維（太さ：２．６デニール、島の数：１６）を、５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８％硫酸、０．８５ｇのパラホルムアルデヒドの混合溶液と２０℃で１時間反応させた。その後、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、その後、水により反応を停止させた後、メタノールで再び洗浄することによりα−クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す。）を得た。
（１１）アミドメチル化繊維への抗体及びヒトＲＡＧＥの固定化
（１０）で得られたＡＭＰＳｔ繊維をさらに水でよく洗浄し、ＡＭＰＳｔ繊維０．５ｇ（乾燥重量相当）を得た。（５）で得られたヒトＲＡＧＥあるいは（７）で得られた抗ＡＧＥ抗体の溶媒を脱塩カラムで０．１Ｍ重曹水溶液に置換した。抗体溶液１．２８ｍｇ／５ｍｌあるいはヒトＲＡＧＥ溶液１．０８ｍｇ／８ｍｌに各々ＡＭＰＳｔ繊維０．５ｇを浸漬し、試験管内で３７℃で２時間ゆっくり振盪しながら反応させた。反応前後における反応液中の吸光度を測定することにより、抗体あるいはヒトＲＡＧＥの固定化量を算定した結果、それぞれ抗体固定化繊維は０．８２ｍｇ／ｇ繊維（実施例４）、ヒトＲＡＧＥ固定化繊維は１．１８ｍｇ／ｇ繊維（実施例５）であった。各々の固定化繊維を０．１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）５ｍｌに浸漬し、室温で１．５時間反応させ、未反応のα−クロロアセトアミドメチル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍｌ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍｌで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行い、吸着実験に使用した。
（１２）非生体分子固定化ビーズの作製
前記式［Ｉ］で表される構造を含む吸着基が固定化された吸着材として、４種類（実施例６〜９）の非生体分子固定化ビーズを作製した。各実施例の構造を表１に示す。
【００２８】
【表１】
粒径０．１ｍｍのキトサンビーズ（富士紡（株）、“キトパール”ＡＬ−０１）１２ｍｌ（沈降時体積、乾燥時重量は１．０ｇ）をジメチルホルムアミド中で攪拌した。この操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。このビーズを１０ｇのヘキサメチレンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。この洗浄操作を３回繰り返し、未反応のヘキサメチレンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解した。さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＩ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例６）。
（キトサンビーズ）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２ ［ＩＩ］
また、キトサンビーズ（ＡＬ−０１）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させたビーズを１５ｇの４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。この洗浄を３回繰り返し、未反応４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＩＩ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例７）。
（キトサンビーズ）−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［ＩＩＩ］
さらに、セルロースビーズ（セルロファインＧＣＬ−２００ｃｃ；乾燥重量１．０ｇ）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【００３０】
このビーズを１５ｇの４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行った。これを３回繰り返し、未反応の４、４’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換した。さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させ、イソシアネート基を１級アミノ基に加水分解した。さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［ＩＶ］の構造を有するセルロースビーズを得た（実施例８）。
（セルロースビーズ）−ＣＯＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［ＩＶ］
他にも、キトサンビーズ（ＡＬ−０１、乾燥重量１．０ｇ）に対して、同じく、ジメチルホルムアミド中での攪拌操作を１回２０分間、４回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させたビーズを１５ｇの４、４’−ビフェニルジカルボニルクロライドを溶解させた１リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた１リットルのジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操作を行い、この洗浄を３回繰り返し、未反応４、４’−ビフェニルジカルボニルクロライドを完全に除去した。次いで水洗を４回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液と攪拌しながら室温で２０分間反応させイソシアネート基を１級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を４回行い、最後に８０℃の水中で２０分間浸漬し、［Ｖ］の構造を有するキトサンビーズを得た（実施例９）。
（キトサンビーズ）−ＣＯ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２ ［Ｖ］
（１３） 吸着材のＡＧＥ吸着実験１
（５）、（８）、（１０）、（１１）で得られた吸着材、及び、市販の吸着材を使って、ＡＧＥ吸着実験を行った。市販の吸着材は、カチオン性担体には、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＱＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ（東ソー：実施例１０）を、また反応性アミン固定化担体には、アミノセルロファイン（チッソ：実施例１１）をそれぞれ用いた。形状がゲルの場合は沈降体積で吸着材１００μｌあたり、サンプル（（６）で得られたＡＧＥ−１，ＡＧＥ−２およびＡＧＥ−３を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。形状が繊維の場合は、ＡＭＰＳｔ繊維の乾燥重量で５０μｇあたり、サンプルを１ｍｌ加えた。３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した。この反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を以下に示す免疫学的測定法（競合法ＥＬＩＳＡ）で測定した。（６）で作製したＡＧＥ−１、ＡＧＥ−２、ＡＧＥ−３を２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、緩衝液２５μｌ、測定サンプル２５μｌ、（８）で作製したＡＧＥ抗体の希釈溶液を５０μｌを入れて、２５℃で１時間振盪した。固相化抗原を認識した抗体に対して、抗ウサギペルオキシダーゼ標識抗体（カッペル）を反応させた後、発色させて５９５ｎｍの吸光度を測定した。なお、検量線は（６）で作製した各ＡＧＥを用いた。各吸着材のＡＧＥ吸着率を表２に示す。すべての吸着材について、ＡＧＥに対して良好な選択性を示した。特に、カチオン性ビーズと反応性アミン固定化ビーズがＡＧＥに対する強い親和性を示した。
【００３１】
【表２】
（１４）吸着材のＡＧＥ吸着実験２
（９）で使用したＮＨＳ活性化セファロース４Ｂを１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに加えて、室温で１．５時間反応させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した担体（比較例１）と（１０）で作成したＡＭＰＳｔ繊維（比較例２）を用いて（１３）と同様の操作でＡＧＥに対する吸着実験を行った。また、（１３）に記載した吸着実験の方法が、ＡＧＥのキャリアタンパクであるＢＳＡに対する親和性により吸着率が左右されないことを確認するために、ＢＳＡ親和性担体であるトヨパール ＡＦ−Ｂｌｕｅ ６５０ＭＬ（東ソー：比較例３）を用いた場合のＡＧＥ吸着性能も調べた。結果を表３に示す。その結果、ＡＧＥに対して顕著な親和性を示さないことが明らかとなった。したがって、糖尿病合併症因子に対して特異的な親和性を持つリガンドを固定化することにより、ＡＧＥに対して特異的な親和性が生じることが示された。
【００３３】
【表３】
（１５）吸着材のＡＧＥ吸着実験３
（１３）に記載の実施例１〜１１について、（６）で得られたＡＧＥをさらにＲＡＧＥ結合アフィニティーカラムにより精製したＡＧＥの吸着実験を行った。ＲＡＧＥ結合アフィニティーゲルは、（８）で得られた実施例３を使用した。オープンカラムにＲＡＧＥ結合ゲルを３ｍｌ充填し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。（６）で得られたＡＧＥ化ＢＳＡ（濃度：３０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加して、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを吸着させた。次いで、ＰＢＳを５０ｍｌ通過させて、ＲＡＧＥ非結合性ＡＧＥ化ＢＳＡを除去した。さらに、０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）を通過させて、結合したＡＧＥ化ＢＳＡを回収した。回収したＡＧＥ化ＢＳＡに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて中和後、ＰＢＳに対して十分透析し、目的とするＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを得た。得られたＡＧＥ溶液について、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース）でタンパク濃度を測定した結果、約４．７１ｍｇ／ｍｌであった。吸着実験は、（１３）と同様の方法で行った。形状がゲルの場合は沈降体積で吸着材１００μｌあたり、サンプル（ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥを１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。形状が繊維の場合は、ＡＭＰＳｔ繊維の乾燥重量で５０μｇあたり、サンプルを１ｍｌ加えた。それぞれ３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を（１３）に記載したＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を表４に示す。その結果、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対しても、検討した吸着材すべてにおいて良好な親和性を示した。また、吸着率はＲＡＧＥアフィニティーカラムで精製していないＡＧＥより、高い吸着率を示した。したがって、実施例１〜１１の吸着材はＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対して、より良好な親和性を有することが示された。
【００３５】
【表４】
（１６）吸着材のＡＧＥ吸着実験４
（１４）で得られた比較例１〜３の吸着材を用いて、（１５）と同様の操作でＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対する吸着実験を行った。結果を表５に示す。（１４）と同様、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対する顕著な親和性を有さないことが示された。したがって、実施例１〜１１のように、糖尿病合併症因子に対して特異的な親和性を持つリガンドを固定化することにより、ＲＡＧＥ結合性ＡＧＥに対して特異的な親和性が生じることが示された。
【００３７】
【表５】
（１７）吸着材のＡＧＥ吸着実験５
（１２）に記載の実施例７、（１３）に記載の実施例１０、および（１４）に記載の比較例１について、ジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物に対する吸着実験を行った。ジカルボニル化合物由来非酵素的反応生成物として、（６）に記載のメチルグリオキサール由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−４）、およびグリオキサール由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−５）を用いた。吸着材１００μｌあたり、サンプル（ＡＧＥ−４あるいはＡＧＥ−５を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着材を沈降させ、上清中のＡＧＥ量を（１３）に記載したＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を表６に示す。実施例７、実施例１０は親和性を有していたのに対し、比較例１は親和性を有さなかったことから、実施例７、実施例１０はジカルボニル化合物由来ＡＧＥに対して良好な親和性を有することが示された。
【００３９】
【表６】
（１８）吸着材のＨＭＧ−１吸着実験
（１２）に記載の実施例７及び（１３）に記載の実施例１０の吸着材について、ＲＡＧＥ結合物質として知られているＨＭＧ−１の吸着実験を行った。吸着材１００μｌあたり、ヒトＨＭＧ−１が１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１ｍｌ加えた。３７℃で２時間振盪し、反応前後の上清のＨＭＧ−１をＥＬＩＳＡ法にて測定した。結果を表７に示す。実施例７および実施例１０は、ＡＧＥの他に、ＨＭＧ−１と親和性を有することが示された。
【００４１】
【表７】
（１９）吸着材のβ２ミクログロブリン吸着実験
（１２）に記載の実施例７について、β２ミクログロブリン吸着試験を行った。ヒト新鮮血清１０ｍｌに吸着材７を１ｇ添加し、３７℃で２時間振盪した。振盪前後の上清中のβ２ミクログロブリンをＥＬＩＳＡ法で測定した結果、吸着率は８１．３％であった。したがって、実施例７は、ＡＧＥの他にβ２ミクログロブリンと親和性を有することが示された。
（２０）吸着材充填容器によるＡＧＥ吸着実験
（１２）に記載の実施例７を、円筒状のカラム（容量：１ｍｌ）に充填した。吸着材の流失を防ぐ目的で、カラムの入口と出口にそれぞれフィルターを装填した。カラムの入口および出口にチューブを接続し、ペリスタポンプを用いて、ＡＧＥ濃度を１０μｇ／ｍｌに調製した０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで循環させた。３０、６０、１２０、２４０、４８０分後にそれぞれ溶液をサンプリングし、各時間におけるＡＧＥ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表８に示す。その結果、実施例７を充填したカラムはＡＧＥを除去する性能を有していることが示された。また、カラムに充填された吸着材の圧損による変形はみられなかった。
【００４３】
【表８】
【発明の効果】
本発明の吸着材は、α−ヒドロキシアルデヒドを反応基質として生成した変性物質と特異的に結合できる物質を、水不溶性担体に固定してなるものであり、該吸着材と変性物質を含む被処理液とを接触させることにより、変性物質を吸着除去することが可能となり、糖尿病合併症など非酵素的反応が原因で起こり得る血管障害の治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】作製した各ＡＧＥとヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインとの結合性をＥＩＡで評価した結果を示すグラフである。
Claims (18)
- α−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物を吸着することを特徴とする変性物質吸着材。
- 前記非酵素的反応生成物がＲＡＧＥのリガンドであることを特徴とする請求項１に記載の変性物質吸着材。
- 前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリコールアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする請求項１または２に記載の変性物質吸着材。
- 前記α−ヒドロキシアルデヒドがグリセルアルデヒドおよびその誘導体から選ばれることを特徴とする請求項１または２に記載の変性物質吸着材。
- 水不溶性担体にＲＡＧＥ誘導体を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 水不溶性担体にカチオン化した原子を含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 水不溶性担体に反応性アミンを含む吸着基を固定化したものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 水不溶性担体に次式［Ｉ］で表される構造を含む吸着基が固定化されたものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の変性物質吸着材。
（水不溶性担体）−（Ｙ）ａ −Ｚ ［Ｉ］
Ｙ：アミド、または、ケトンのうちで何れかの官能基
Ｚ：−（環式化合物１）ｌ−（鎖状化合物）ｍ−（環式化合物２）ｎ−ＮＨ２であり、
且つ、炭素原子を１つ以上持つ官能基
ａ、ｌ、ｍ、ｎ：０、または、１以上の整数。 - 前記水不溶性担体に前記吸着基を固定する方法が、共有結合であることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 前記水不溶性担体が、多糖体あるいはビニル芳香族化合物であることを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 前記変性物質吸着材の、液体中からのα−ヒドロキシアルデヒドと生体分子との非酵素的反応生成物の除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 前記変性物質吸着材のジカルボニル化合物と生体分子との非酵素的反応生成物の液体中からの除去率が、少なくとも４０％以上であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 前記変性物質吸着材のＲＡＧＥ結合物質の液体中からの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 前記変性物質吸着材の、液体中からのβ２ミクログロブリンの除去率が、少なくとも３０％以上であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 請求項１〜１４のいずれかに記載の変性物質吸着材を充填してなることを特徴とする変性物質除去カラム。
- 請求項１〜１４のいずれかに記載の変性物質吸着材あるいは請求項１５に記載の変性物質除去カラムを用いて、液体中の変性物質を除去する方法。
- 体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の変性物質吸着材。
- 体液中の変性物質の除去に用いられることを特徴とする請求項１５に記載の変性物質除去カラム。
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