CN115015437B - 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法 - Google Patents

一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115015437B
CN115015437B CN202210780415.XA CN202210780415A CN115015437B CN 115015437 B CN115015437 B CN 115015437B CN 202210780415 A CN202210780415 A CN 202210780415A CN 115015437 B CN115015437 B CN 115015437B
Authority
CN
China
Prior art keywords
derivatization
sample
white spirit
mass spectrometry
carboxyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210780415.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN115015437A (zh
Inventor
杨帆
王莉
杨玉波
许国旺
倪德让
谢小玉
曹念
刘心昱
陆欣
于迪
陈田田
张秀琼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kweichow Moutai Co Ltd
Original Assignee
Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kweichow Moutai Co Ltd filed Critical Kweichow Moutai Co Ltd
Priority to CN202210780415.XA priority Critical patent/CN115015437B/zh
Publication of CN115015437A publication Critical patent/CN115015437A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115015437B publication Critical patent/CN115015437B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8624—Detection of slopes or peaks; baseline correction
    • G01N30/8631—Peaks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample

Abstract

本发明属于白酒分析检测技术领域，涉及一种白酒中羧基化合物的高覆盖检测方法，特别是涉及一种利用2‑溴‑1‑(4‑二甲基氨基苯基)乙酮(DmPA)衍生，采用超高效液相色谱‑质谱联用技术，对衍生后的白酒样品进行高覆盖检测，结合保留时间、一级精确质量和二级质谱信息，实现白酒中羧基化合物准确鉴定的方法。本发明无需使用昂贵的重同位素衍生化试剂，且对白酒中高沸点、痕量羧基化合物的检测有显著优势，具有高覆盖度、高灵敏度和简单快速的特点。

Description

一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法
技术领域
本发明属于白酒检测分析技术领域，具体涉及一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法。
背景技术
现阶段对白酒风味物质的研究大多集中在低沸点成分，然而高沸点成分对白酒的风味也有较大贡献。羧基化合物广泛存在于白酒中，对白酒的呈香、呈味起着重要的作用。因此，对白酒中高沸点羧基化合物进行高覆盖的检测与注释，有助于揭示白酒的风味成分。目前，基于UHPLC-MS平台的白酒中羧基化合物检测通常采用直接进样的方法，难以满足白酒中痕量羧基化合物的检测灵敏度需求。
衍生化技术在提高化合物质谱响应上有显著的优势，已有多种衍生化试剂用于羧基化合物的衍生，比如N,N-二甲基乙二胺(DMED)，N-甲基-4-溴苄胺(4-BNMA)和2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮(DmPA)等。鉴于DmPA的高反应活性，本发明利用DmPA对白酒中的羧基化合物进行衍生化，以实现高覆盖检测。
为了筛选出被衍生化的成分，已有研究通常采用配对轻重同位素试剂分别对样品进行衍生化后，再一比一混合。被轻重同位素衍生化试剂同时衍生化的物质具有相同的保留时间，相似的峰强度以及固定的质荷比差值，依据该特点可筛选出被衍生化的化合物。但该方法所采用的重同位素衍生化试剂昂贵且不易获得。因此，开发基于特征碎片的白酒中羧基化合物的筛选方法是十分必要的。
目前对于衍生化的羧基化合物的鉴定大多依赖一级精确质量或者一级精确质量结合保留时间。为了更准确的对白酒中的羧基化合物进行定性，本发明提出基于保留时间、一级精确质量和二级质谱信息(MS/MS)的定性流程。本发明提出了一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法，将白酒高温和高真空旋蒸浓缩后，与DmPA反应，以衍生白酒中的羧基化合物，利用超高效液相色谱质谱联用技术对衍生后的白酒样本进行高覆盖检测，并结合保留时间，一级精确质量和二级质谱信息(MS/MS)实现白酒中高沸点羧基化合物的准确鉴定。本发明所用的方法无需使用昂贵的重同位素衍生化试剂，具有覆盖度高、灵敏度高和简单快速的特点，对白酒中痕量羧基化合物的检测有显著优势。目前尚无将本发明方法应用于白酒中羧基化合物的相关报道。
发明内容
本发明为了实现白酒中高沸点羧基化合物的高覆盖检测，对高温、高真空旋蒸后的白酒样品进行衍生化后，利用UHPLC-MS平台获取衍生化后白酒样品的液相色谱和高分辨质谱数据，并结合二级特征碎片筛选出被衍生化的化合物，基于保留时间、一级精确质量和二级质谱信息，实现对白酒中羧基化合物的鉴定。
本发明提供了一种白酒中羧基化合物的高覆盖检测方法，其包括以下步骤：
(1)构建羧基化合物的数据库，所述数据库包括羧基化合物的名称、CAS号、简化分子线性输入规范SMILES和质量数的信息；
(2)配制羧基化合物标样的混标溶液，与DmPA进行衍生化反应，利用超高效液相色谱质谱联用技术，对衍生后的羧基化合物标样进行非靶向分析，采集保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息；
(3)利用步骤(2)中获得的标样信息，构建定量结构色谱保留相关关系模型，获取羧基化合物的二级特征碎片；
(4)优化衍生化条件：
a.采用中心复合试验设计(CCD)法，对衍生化时间、衍生化温度和衍生化试剂DmPA用量这三个衍生条件进行优化；
b.以含有特征碎片的二级质谱图数为因变量，构建响应面模型，将二级质谱图含有最多特征碎片时对应的衍生化条件作为最佳衍生化条件；
(5)根据步骤(4)获得的最佳衍生化条件，将白酒样品与DmPA进行衍生化反应，利用超高效液相色谱质谱联用技术，对获得的原始数据进行预处理，筛选出含有步骤(3)所述的羧基化合物二级特征碎片的白酒样品；
(6)白酒中羧基化合物的结构注释：将步骤(5)筛选获得的白酒样品中羧基化合物保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息，与数据库进行比对搜索，根据相似程度划分等级。
在一些实施例中，所述步骤(1)中的数据库包括YMDB、CMAUP、LM-FA和自建库，所述自建库包括文献报导的白酒羧基化合物。
在一些实施例中，所述步骤(2)中混标的衍生化反应过程为：向2μL混标中加入28μL乙腈、2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和57μL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺，再加入30μL浓度为20mg/mL的DmPA，在80℃条件下反应60min后，将反应液在21500g，4℃条件下离心10min，取80μL上清液，待进样分析。
在一些实施例中，所述步骤(3)包括以下步骤：
a.选取标样衍生后的保留时间和简化分子线性输入规范SMILES，在QSRR-Automator软件中，将简化分子线性输入规范SMILES转化为分子描述符，采用线性回归算法，以保留时间为因变量，简化分子线性输入规范SMILES为自变量，构建定量结构色谱保留相关关系模型，用于预测羧基化合物的保留时间；
b.根据衍生后标样的二级质谱信息，获取二级特征碎片，所述获取二级特征碎片的过程为：在所有标样(A)中搜索含有出现次数最多的碎片(B1)的标样(A1)；若剩余标样的数量为0或1时，终止搜索二级特征碎片的过程；否则，继续在剩余的标样中搜索含有出现次数最多的碎片(B2)的标样(A2)；重复此过程直至剩余标样的数量为0或1，得到衍生化后标样A1至An的二级特征碎片B1至Bn(n为自然数)。
在一些实施例中，获取的二级特征碎片为m/z 134.0962、180.1020和[M+H-179.0946]。
在一些实施例中，所述步骤(4)优化衍生化条件包括：
a.白酒样品的预处理：将白酒样品旋蒸浓缩等体积混合后，得到混合样品；
b.设计实验方案：以衍生化时间、衍生化温度和衍生化试剂DmPA用量为自变量，运用Design Expert 12软件，采用中心复合试验设计(CCD)法设计响应面实验方案，其中，自变量的取值范围为：反应时间42-100min，反应温度40-85℃，衍生试剂DmPA用量10-33μL，衍生化试剂DmPA与样品的体积比为：0.34-1.1:1；
c.白酒样品的衍生化反应和数据采集：将30μL混合样品与2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和7.5μL浓度为6M的盐酸混匀后，加入15μL饱和氯化钠溶液震荡5min，再加入150μL乙酸乙酯震荡5min，离心后取有机相并加入30μL浓度为180mg/mL的乙腈稀释的三乙胺混合，对混合样进行冷冻干燥，将冻干样用57μL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺复溶后，根据Design Expert 12软件给出的实验方案，进行20次衍生化实验，反应完成后将反应液在21500g,4℃条件下离心10min，取80μL上清液，利用超高效液相色谱质谱联用技术分析，获得衍生后白酒样品中羧基化合物保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息；
d.以含有特征碎片的二级质谱图数为因变量，构建响应面模型，将二级质谱图含有最多特征碎片时对应的衍生化条件作为最佳衍生化条件。
在一些实施例中，最佳衍生化条件为：反应时间102min，反应温度65℃，衍生化试剂DmPA用量36μL，衍生化试剂DmPA与样品的体积比为1:1.2。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中所述的超高效液相色谱质谱联用技术分析仪器选自超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱仪，超高效液相色谱-飞行时间质谱仪，超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中的一种。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中所述超高效液相色谱质谱联用技术分析仪器为超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱仪。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱仪为UHPLC-Q-Orbitrap HRMS。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述超高效液相色谱质谱联用技术分析中，色谱条件为：柱温50℃；流速0.35mL/min；进样体积5μL。
在一些实施例中，色谱柱为ACQUITYBEH C8色谱柱，规格为100mm×2.1mm，1.7μm。在一些实施例中，色谱条件为：流动相：A相：0.1％v/v甲酸水溶液，B相：0.1％v/v甲酸乙腈溶液；样品进样室温度：4℃；洗脱梯度：以体积百分比计算，以5％B开始，保持1min，然后在23min内线性增加到100％B，并保持4min，接着在0.1min内线性回到5％B，并保持2.9min。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述超高效液相色谱质谱联用技术分析中，质谱扫描模式为正离子模式。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述正离子模式为全扫描模式和数据依赖型二级质谱采集模式。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述全扫描模式的质谱条件为：扫描范围：m/z 200-1500；分辨率：120000；最大注入时间：100ms；自动增益控制目标：3×106离子容量。
在一些实施例中，所述步骤(4)或步骤(5)中，所述数据依赖型二级质谱采集模式的质谱条件为：扫描范围：m/z 50-1500；分辨率：30000；最大注入时间：50ms；自动增益控制目标：1×105离子容量。
在一些实施例中，所述步骤(5)的原始数据预处理包括：使用MS-DIAL软件对获得的原始数据进行峰对齐、峰提取、空白扣除及数据导出处理，所述筛选二级特征离子碎片的筛选是利用python代码进行筛选。
在一些实施例中，所述步骤(6)中的结构注释包括以下步骤：
a.将步骤(5)筛选获得的白酒样品的一级精确质量与数据库比对搜索，若在数据库中搜索不到候选的化合物，则计算其理论元素组成后，减去DmPA元素组成，得到羧基化合物的元素组成，并将定性等级定义为等级5；
b.若在数据库中搜到候选结构的化合物，则利用步骤(3)建立的定量结构色谱保留相关关系模型，预测候选结构化合物的保留时间，若候选结构的预测保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值大于50s，则将定性等级定义为等级4；
c.若候选结构的保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值小于等于50s，则将白酒样品中羧基化合物的二级质谱图与候选结构的二级特征碎片比对，若存在相同的二级特征碎片，则将定性等级定义为等级1；
d.若不存在相同的二级特征碎片，则利用CFM-ID软件预测候选结构的MS/MS图，并利用反点击算法计算预测的MS/MS与实际MS/MS的相似度得分，若相似度大于或等于0.5，则定性等级定义为等级2；
e.若相似度小于0.5，则定性等级定义为等级3。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)利用DmPA对白酒中的羧基化合物进行衍生，无需使用昂贵的重同位素衍生化试剂，节约成本；(2)结合保留时间、一级精确质量和二级质谱信息(MS/MS)，提高了对白酒中羧基化合物定性的准确性；(3)简单快速、灵敏度高、覆盖度高，对白酒中高沸点、痕量羧基化合物的检测有显著优势。
附图说明
图1为二级特征碎片搜索流程图。
图2为衍生化后的羧基化合物的二级特征谱图。(A)DmPA标记的2-氧代己二酸。(B)DmPA标记的2-羟基丁二酸。(C)DmPA标记的壬二酸。(D)DmPA标记的十三烷酸。(E)DmPA标记的3-羟基丁酸。(F)DmPA标记的2-呋喃甲酸。(G)DmPA标记的咖啡酸。
图3为响应面模型的3D曲面图。(A)时间和温度对因变量的影响。(B)温度和衍生化的量对因变量的影响。(C)时间和衍生化体积对因变量的影响。
图4为羧基化合物定性流程图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1整理数据库
首先，整理现有技术报导的白酒中232个羧基化合物的名称、CAS号、简化分子线性输入规范SMILES和精确质量数信息，添加到excel文件中，作为自建库。
其次，整理The Yeast Metabolome Database(YDMB)、Collective MolecularActivities of Useful Plants(CMAUP)和LIPID MAPS Structure Database-Fatty Acyls(LM-FA)数据库中的羧基化合物，得到的羧基化合物数量分别为752、2070、3691和9824个，并将羧基化合物的名称、CAS号、简化分子线性输入规范SMILES、精确质量数添加到excel文件中，用于后续候选结构的搜索。
实施例2探究衍生后羧基化合物的二级特征碎裂规律
步骤一：将100个羧基化合物标样配制成3个混标，每个混标中至少含有30个羧基化合物标样，混标中主要包括多元羧酸、羟基羧酸、酚羧、饱和脂肪酸以及不饱和脂肪酸等羧基化合物，每个种类的羧基化合物取3个以上。
所述的100个羧基化合物标样信息如表1所示：
表1-100个羧基化合物标样的信息
Figure BDA0003727543670000061
Figure BDA0003727543670000071
Figure BDA0003727543670000081
步骤二：混标的衍生化反应：
向2μL混标中加入28μL乙腈、2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和57μL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺，再加入30μL浓度为20mg/mL的DmPA，在80℃条件下反应60min后，将反应液在21500g，4℃条件下离心10min，取80μL上清液，待进样分析。
步骤三：利用超高效液相色谱质谱联用技术，对衍生后的羧基化合物标样进行非靶向分析，采集保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息。
其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY BEH C8色谱柱，规格：100mm×2.1mm，1.7μm；流动相：A相：0.1％v/v甲酸水溶液，B相：0.1％v/v甲酸乙腈溶液；流速：0.35mL/min；柱温：50℃；进样体积：5μL；样品进样室温度：4℃；洗脱梯度：以体积百分比计算，以5％B开始，保持1min，然后在23min内线性增加到100％B，并保持4min，接着在0.1min内线性回到5％B，并保持2.9min；
其中，质谱条件为：高分辨质谱仪(品牌Thermo Fisher型号Q Exactive HF)；扫描模式：正离子模式下的全扫描模式结合数据依赖型二级质谱采集模式(full scan/ddMS2)；全扫描模式中，扫描范围：m/z 200-1500，分辨率：120000，最大注入时间：100ms，自动增益控制目标：3×106离子容量；数据依赖型二级质谱采集模式中，扫描范围：m/z 50-1500，分辨率：30000，最大注入时间：50ms，自动增益控制目标：1×105离子容量；隔离窗口为m/z1.0；碰撞能采用15％、30％和45％的混合归一化能量；二级的采集由每个扫描循环中响应强度为前10的离子触发；Inclusion list设置为on；喷雾电压为3.5kV；离子传输管的温度为320℃；辅助气的加热器温度为350℃；鞘气和辅助气流速分别为45和10(in arbi tRaryunits)；S-lens设置为50.0(in arbi tRary units)。
步骤四：总结衍生后羧基化合物的二级质谱碎裂规律：
利用步骤三获得的二级质谱信息，获取二级特征碎片，搜索二级特征碎片的过程为(图1)：在所有标样(A)中搜索含有出现次数最多的碎片(B1)的标样(A1)；若剩余标样的数量为0或1时，终止搜索二级特征碎片的过程；否则，继续在剩余的标样中搜索含有出现次数最多的碎片(B2)的标样(A2)；重复此过程直至剩余标样的数量为0或1，得到衍生化后标样A1至An的二级特征碎片B1至Bn(n为自然数)。
结果表明，大部分羧基化合物的二级质谱图(MS/MS)中会出现m/z 180.1020和m/z134.0962两个特征碎片(图2A-E)。部分羧基化合物的MS/MS谱图不存在m/z180.1020的特征碎片，而产生丢失[M+H-179.0946]的中性丢失峰(图2F)，且这些羧基化合物的羧基α位具有碳碳双键，其在失去179.0946Da后，形成的碳正离子与α位的碳碳双键具有共轭作用，从而使碎片更加稳定。基于此，MS/MS谱图中存在m/z 180.1020、m/z 134.0962和[M+H-179.0946]中的任意两个特征碎片的化合物可被认定为潜在的羧基化合物。
此外，发明人还发现，若在二级谱图中存在H2O的中性丢失峰，则该化合物的结构可能为多元羧酸或者带有羟基的羧酸；若在二级谱图中存在CO2或HCOOH的中性丢失峰，则该化合物的结构可能为多元羧酸；若二级谱图中存在[M+H-179.0946]的中性丢失峰,且相对强度大于50％，则该化合物的羧基α位含有碳碳双键；若二级谱图中存在一系列相差14.0156的峰，则该化合物的结构为脂肪羧酸。
实施例3建立定量结构色谱保留相关关系(QSRR)模型
获取100个标样衍生后的真实保留时间，按从小到大排序，每4个为一组，每组选取后3个，共选出75个标样作为训练集。将这75个标样衍生化后的简化分子线性输入规范SMILES和保留时间导入QSRR-Automator软件，在默认参数下将简化分子线性输入规范SMILES转化成315个分子描述符后，分别用线性回归、支持向量机回归以及随机森林回归算法拟合分子描述符与真实保留时间的关系，并进行5次内部交叉验证，最终选择了16个分子描述符和线性回归算法建立了QSRR模型，该模型得分为0.97。为了验证该模型的性能，导入剩余的25个衍生化后标样的简化分子线性输入规范SMILES，用上述建立的模型预测对应的保留时间，计算25个衍生化后标样保留时间的预测值和真实值之间的平均绝对误差，得到的平均绝对误差为42秒，并选择50秒作为阈值进行过滤。
实施例4利用反应曲面法(RSM)模型优化衍生化条件
步骤一：白酒样品的预处理：白酒样品选自酱香型白酒，编号R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7，对R1-R7白酒样品在70±5rpm/min,45±2℃和-0.1±0.01MPa条件下浓缩20-25倍(即浓缩至原体积的1/20-1/25)，然后将旋蒸浓缩后的R1-R7白酒样品等体积混合，得到混合样品；
步骤二：设计实验方案：在Design Expert 12软件(Stat-Ease Inc.,Minneapolis,USA)的默认参数下选择中心复合实验设计(CCD)法，输入三个自变量的取值范围：反应时间为42-100min，反应温度为40-85℃，DmPA的体积为10-33μL(衍生化试剂与样品的体积比为：0.34-1.1:1)。Design Expert 12软件在默认参数下组合三个反应条件，形成20个实验方案。
步骤三：白酒样品的衍生化反应：将30μL混合样品与2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和7.5μL浓度为6M的盐酸混匀后，加入15μL饱和氯化钠溶液震荡5min，再加入150μL乙酸乙酯震荡5min，离心后取有机相并加入30μL浓度为180mg/mL的乙腈稀释的三乙胺混合，对混合样进行冷冻干燥，将冻干样用57μL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺复溶后，根据Design Expert 12软件给出的实验方案，进行20次衍生化实验，反应完成后将反应液在21500g,4℃条件下离心10min,取80μL上清液，待进样分析。
步骤四：利用超高效液相色谱质谱联用技术进行非靶向分析。
其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY BEH C8色谱柱，规格：100mm×2.1mm，1.7μm；流动相：A相：0.1％v/v甲酸水溶液，B相：0.1％v/v甲酸乙腈溶液；流速：0.35mL/min；柱温：50℃；进样体积：5μL；样品进样室温度：4℃；洗脱梯度：以体积百分比计算，以5％B开始，保持1min，然后在23min内线性增加到100％B，并保持4min，接着在0.1min内线性回到5％B，并保持2.9min；
其中，质谱条件为：高分辨质谱仪(品牌Thermo Fisher型号Q Exactive HF)；扫描模式：正离子模式下的全扫描模式结合数据依赖型二级质谱采集模式(full scan/ddMS2)；全扫描模式中，扫描范围：m/z 200-1500，分辨率：120000，最大注入时间：100ms，自动增益控制目标：3×106离子容量；数据依赖型二级质谱采集模式中，扫描范围：m/z 50-1500，分辨率：30000，最大注入时间：50ms，自动增益控制目标：1×105离子容量；隔离窗口为m/z1.0；碰撞能采用15％、30％和45％的混合归一化能量；二级的采集由每个扫描循环中响应强度为前10的离子触发；Inclusion list设置为on；喷雾电压为3.5kV；离子传输管的温度为320℃；辅助气的加热器温度为350℃；鞘气和辅助气流速分别为45和10(in arbi tRaryunits)；S-lens设置为50.0(in arbi tRary units)。
步骤五：利用Design Expert 12软件，以衍生化时间、衍生化温度和衍生试剂用量为自变量，以含有特征碎片的二级质谱图数为因变量，构建衍生化条件与二级特征碎片之间关系的响应面模型，生成3D曲面图(图3)。基于所建的模型，将二级质谱图含有最多特征碎片时对应的衍生化条件作为最佳衍生化条件。
利用Design Expert 12生成的实验方案以及实验结果如表2所示。
表2-建立RSM模型的参数
Figure BDA0003727543670000111
Figure BDA0003727543670000121
最终得到的最佳衍生化条件为：衍生化时间为102min，衍生化温度为65℃，衍生化试剂DmPA用量为36μL，衍生化试剂DmPA与样品的体积比为1:1.2。
实施例5白酒样品衍生化和数据采集
步骤一：白酒样品衍生化：
分别取50mL编号为R1-R7的酱香型白酒样品，以及50mL空白样品(53％vol乙醇水溶液)，在70rpm/min，45℃，-0.1MPa条件下蒸发至2mL。在30μL酒样或空白样品中加入2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和7.5μL浓度为6M的盐酸，混匀后，加入15μL饱和氯化钠溶液震荡5min,再加入150μL乙酸乙酯震荡5min，离心后取有机相与30μL浓度为180mg/mL的乙腈稀释的三乙胺混合，对混合样进行冷冻干燥，将冻干样用57μL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺复溶后，加入36μL乙腈制备的10mg/mL的DmPA，在65℃条件下反应102min，反应后将反应液在21500g，4℃条件下离心10min,取80μL上清液待进样分析。
步骤二：超高效液相色谱质谱联用技术分析：
首先采用无inclusion list的DDA模式进行预实验，得到一级精确质量信息，根据一级精确质量以10±0.1ppm的偏差搜索谱库，获得对应候选羧基化合物的精确质量，添加到inclusion list中进行DDA模式采集，获得液相色谱和高分辨质谱信息。
其中，超高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY BEH C8色谱柱，规格为100mm×2.1mm，1.7μm；流动相：A相：0.1％v/v甲酸水溶液，B相：0.1％v/v甲酸乙腈溶液；流速：0.35mL/min；柱温：50℃；进样体积：5μL；样品进样室温度：4℃；洗脱梯度：以体积百分比计算，以5％B开始，保持1min，然后在23min内线性增加到100％B，并保持4min，接着在0.1min内线性回到5％B，并保持2.9min；
其中，质谱条件为：高分辨质谱仪(品牌Thermo Fisher型号Q Exactive HF)；扫描模式：正离子模式下的全扫描模式结合数据依赖型二级质谱采集模式(full scan/ddMS2)；全扫描模式中，扫描范围：m/z 200-1500，分辨率：120000，最大注入时间：100ms，自动增益控制目标：3×106离子容量；数据依赖型二级质谱采集模式中，扫描范围：m/z 50-1500，分辨率：30000，最大注入时间：50ms，自动增益控制目标：1×105离子容量；隔离窗口为m/z1.0；碰撞能采用15％、30％和45％的混合归一化能量；二级的采集由每个扫描循环中响应强度为前10的离子触发；Inclusion list设置为on；喷雾电压为3.5kV；离子传输管的温度为320℃；辅助气的加热器温度为350℃；鞘气和辅助气流速分别为45和10(in arbi tRaryunits)；S-lens设置为50.0(in arbi tRary units)。
步骤三：使用MS-DIAL软件对获得的原始数据进行峰对齐、峰提取、空白扣除(在待测白酒样品中去除空白样中峰面积比待测白酒样品峰面积大5倍的化合物)处理，导出扣除空白的化合物列表的Excel文件，包含化合物分子量、保留时间、二级碎片和不同样本中的响应面积等信息，然后利用python代码从上述excel文件中筛选出含有m/z180.1020、134.0962以及[M+H-179.0946]三种碎片中任意两种的化合物，整理被衍生化合物一级精确质量、二级特征碎片和保留时间的信息，得到扣除空白后被衍生的化合物列表，用于进行结构注释。
实施例6白酒样品中羧基化合物的结构注释
白酒样品中羧基化合物的结构注释流程(图4)具体步骤如下：
a.将步骤(5)筛选获得的白酒样品的一级精确质量与数据库比对搜索，若在数据库中搜索不到候选的化合物，则计算其理论元素(C,H,O,N,S)组成后，减去DmPA元素组成(C10H12NO)，得到羧基化合物的元素组成，并将定性等级定义为等级5；
b.若在数据库中搜到候选结构的化合物，则利用步骤(3)建立的定量结构色谱保留相关关系模型，预测候选结构化合物的保留时间，若候选结构的预测保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值大于50s，则将定性等级定义为等级4；
c.若候选结构的保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值小于等于50s，则将白酒样品中羧基化合物的二级质谱图与候选结构的二级特征碎片比对，若存在相同的二级特征碎片，则将定性等级定义为等级1；
d.若不存在相同的二级特征碎片，则利用CFM-ID软件预测候选结构的MS/MS图，并利用反点击算法计算预测的MS/MS与实际MS/MS的相似度得分，若相似度大于或等于0.5，则定性等级定义为等级2；
e.若相似度小于0.5，则定性等级定义为等级3。
应用上述定性方法，在酱香型白酒R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7酒样中分别检测到463，520，579，583，582，581和597个羧基化合物，共检出614个羧基化合物，检测到的羧基化合物定性等级如表3所示。
表3-白酒样品R1-R7中检测到的羧基化合物对应的等级
Figure BDA0003727543670000141
在614个羧基化合物中，152个为等级1，比如己二酸，2,2-二甲基琥珀酸，3-氧代己二酸等。24个为等级2，如2-羟基乙酸，2-氧代丙酸，戊酸等。85个为等级3，如甲酸，丙酸，丁酸等。130个为等级4，如4-羟基戊酸，3-乙氧基-3-氧代丙酸，2-乙基己酸等。233个为等级5，如元素组成为C6H10O3，C3H6O2，C10H12O2等的羧基化合物。
上述实施方式仅为本申请的优选实施方式，不能以此来限定本申请保护的范围，本领域的技术人员在本申请的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本申请所要求保护的范围。

Claims (15)

1.一种白酒中羧基化合物的高覆盖检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）构建羧基化合物的数据库，所述数据库包括羧基化合物的名称、CAS号、简化分子线性输入规范SMILES和质量数的信息；
（2）配制羧基化合物标样的混标溶液，与DmPA进行衍生化反应，利用超高效液相色谱质谱联用技术，对衍生后的羧基化合物标样进行非靶向分析，采集保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息；
（3）利用步骤（2）中获得的标样信息，构建定量结构色谱保留相关关系模型，获取羧基化合物的二级特征碎片；
（4）优化衍生化条件：
a.采用中心复合试验设计法，对衍生化时间、衍生化温度和衍生化试剂DmPA用量这三个衍生条件进行优化；
b.以含有特征碎片的二级质谱图数为因变量，构建响应面模型，将二级质谱图含有最多特征碎片时对应的衍生化条件作为最佳衍生化条件；
（5）根据步骤（4）获得的最佳衍生化条件，将白酒样品与DmPA进行衍生化反应，利用超高效液相色谱质谱联用技术分析，并对获得的原始数据进行处理，筛选出含有步骤（3）所述的羧基化合物二级特征碎片的白酒样品；
（6）白酒中羧基化合物的结构注释：将步骤（5）筛选获得的白酒样品中羧基化合物保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息，与数据库进行比对搜索，根据相似程度划分等级；
所述步骤（3）包括以下步骤：
a.选取标样衍生后的保留时间和简化分子线性输入规范SMILES，在QSRR-Automator软件中，将简化分子线性输入规范SMILES转化为分子描述符，采用线性回归算法，以保留时间为因变量，简化分子线性输入规范SMILES为自变量，构建定量结构色谱保留相关关系模型，用于预测羧基化合物的保留时间；
b. 根据衍生后标样的二级质谱图，获取二级特征碎片，所述获取二级特征碎片的过程为：在所有标样A中搜索含有出现次数最多的碎片B1的标样A1；若剩余标样的数量为0或1时，终止搜索二级特征碎片的过程；否则，继续在剩余的标样中搜索含有出现次数最多的碎片B2的标样A2；重复此过程直至剩余标样的数量为0或1，得到衍生化后标样A1至An的二级特征碎片B1至Bn，n为自然数；获取的二级特征碎片为m/z 134.0962、180.1020和[M+H-179.0946]；
所述步骤（6）的结构注释包括以下步骤：
a.将步骤（5）筛选获得的白酒样品的一级精确质量与数据库比对搜索，若在数据库中搜索不到候选的化合物，则计算其理论元素组成后，减去DmPA元素组成，得到羧基化合物的元素组成，并将定性等级定义为等级5；
b. 若在数据库中搜到候选结构的化合物，则利用步骤（3）建立的定量结构色谱保留相关关系模型，预测候选结构化合物的保留时间，若候选结构的预测保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值大于50s，则将定性等级定义为等级4；
c.若候选结构的保留时间与白酒样品中羧基化合物测得的保留时间差值小于等于50s，则将白酒样品中羧基化合物的二级质谱图与候选结构的二级特征碎片比对，若存在相同的二级特征碎片，则将定性等级定义为等级1；
d. 若不存在相同的二级特征碎片，则利用CFM-ID软件预测候选结构的MS/MS图，并利用反点击算法计算预测的MS/MS与实际MS/MS的相似度得分，若相似度大于或等于0.5，则定性等级定义为等级2；
若相似度小于0.5，则定性等级定义为等级3。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的数据库包括YMDB、CMAUP、LM-FA和自建库，所述自建库包括文献报导的白酒羧基化合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的衍生化反应过程为：
向2μL混标中加入28μL乙腈、2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和57µL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺，再加入30µL浓度为20mg/mL的衍生试剂DmPA，在80ºC条件下反应60min后，将反应液在21500g，4℃条件下离心10min，取上清液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）优化衍生化条件包括：
a.白酒样品的预处理：将白酒样品旋蒸浓缩等体积混合后，得到混合样品；
b. 设计实验方案：以衍生化时间、衍生化温度和衍生化试剂DmPA用量为自变量，运用Design Expert 12软件，采用中心复合试验设计法设计响应面实验方案，其中，自变量的取值范围为：反应时间42-100min，反应温度40-85℃，衍生试剂用量10-33μL，衍生化试剂DmPA与样品的体积比为：0.34-1.1:1；
c.白酒样品的衍生化反应和数据采集：将30μL混合样品与2μL浓度为5μM的内标富马酸-D2和7.5μL浓度为6M的盐酸混匀后，加入15μL饱和氯化钠溶液震荡5min，再加入150μL乙酸乙酯震荡5min，离心后取有机相并加入30μL浓度为180mg/mL的乙腈稀释的三乙胺混合，对混合样进行冷冻干燥，将冻干样用57µL浓度为20mg/mL的乙腈稀释的三乙胺复溶后，根据Design Expert 12软件给出的实验方案，进行20次衍生化实验，反应完成后将反应液在21500g，4℃条件下离心10min，取上清液，利用超高效液相色谱质谱联用技术分析，获得衍生后白酒样品中羧基化合物保留时间、一级质谱信息和二级质谱信息；
d. 以含有特征碎片的二级质谱图数为因变量，构建响应面模型，将二级质谱图含有最多特征碎片时对应的衍生化条件作为最佳衍生化条件。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述最佳衍生化条件为：反应时间102min，反应温度65℃，衍生化试剂用量36μL，衍生化试剂DmPA与样品的体积比为1:1.2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述的超高效液相色谱质谱联用技术分析仪器选自超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱仪，超高效液相色谱-飞行时间质谱仪，超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中的一种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱仪为UHPLC-Q-Orbitrap HRMS。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所述超高效液相色谱质谱联用技术分析中，色谱条件为：柱温50℃；流速0.35mL/min；进样体积5μL。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，色谱柱为ACQUITY BEH C8色谱柱，规格为100mm×2.1mm，1.7μm。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，色谱条件为：流动相：A相：0.1%v/v甲酸水溶液，B相：0.1%v/v甲酸乙腈溶液；样品进样室温度：4℃；洗脱梯度：以体积百分比计算，以5%B开始，保持1min，然后在23min内线性增加到100% B，并保持4min，接着在0.1min内线性回到5% B，并保持2.9min。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所述超高效液相色谱质谱联用技术分析中，质谱扫描模式为正离子模式。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述正离子模式为全扫描模式和数据依赖型二级质谱采集模式。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述全扫描模式的质谱条件为：扫描范围：m/z 200-1500；分辨率：120000；最大注入时间：100ms；自动增益控制目标：3×106离子容量。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述数据依赖型二级质谱采集模式的质谱条件为：扫描范围：m/z 50-1500；分辨率：30000；最大注入时间：50ms；自动增益控制目标：1×105离子容量。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）的原始数据预处理包括：使用MS-DIAL软件对原始数据进行峰对齐、峰提取、空白扣除及数据导出处理，筛选二级特征碎片的是利用python代码进行筛选。
CN202210780415.XA 2022-07-04 2022-07-04 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法 Active CN115015437B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210780415.XA CN115015437B (zh) 2022-07-04 2022-07-04 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210780415.XA CN115015437B (zh) 2022-07-04 2022-07-04 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115015437A CN115015437A (zh) 2022-09-06
CN115015437B true CN115015437B (zh) 2023-04-21

Family

ID=83079791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210780415.XA Active CN115015437B (zh) 2022-07-04 2022-07-04 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115015437B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1197251A (en) * 1967-03-09 1970-07-01 Merck & Co Inc N-Phenyl p-Chlorobenzamide Derivatives and their Conversion to Indolyl Acetic Acid Derivatives
CN103293243A (zh) * 2013-06-03 2013-09-11 福建省产品质量检验研究院 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用
CN106770864A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 光明乳业股份有限公司 柱前衍生化法和发酵乳制品中组胺的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1197251A (en) * 1967-03-09 1970-07-01 Merck & Co Inc N-Phenyl p-Chlorobenzamide Derivatives and their Conversion to Indolyl Acetic Acid Derivatives
CN103293243A (zh) * 2013-06-03 2013-09-11 福建省产品质量检验研究院 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用
CN106770864A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 光明乳业股份有限公司 柱前衍生化法和发酵乳制品中组胺的检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Xian Luo et al.High-Performance Chemical Isotope Labeling Liquid Chromatography– Mass Spectrometry for Profiling the Metabolomic Reprogramming Elicited by Ammonium Limitation in Yeast.J. Proteome Res.2016,第15卷1602-1612. *
Xiqing Bian et al.In-depth mapping carboxylic acid metabolome reveals the potential biomarkers in colorectal cancer through characteristic fragment ions and metabolic flux.Anal Chim Acta.2020,第1128卷62-71. *
刘纲勇等.液相质谱测定非极性或弱极性物质的研究进展.广州化学.2020,第45卷(第01期),60-65. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115015437A (zh) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hockaday et al. Electrospray and photoionization mass spectrometry for the characterization of organic matter in natural waters: a qualitative assessment
Arnhard et al. Applying ‘Sequential Windowed Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra’(SWATH) for systematic toxicological analysis with liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry
Rubert et al. Metabolic fingerprinting based on high-resolution tandem mass spectrometry: a reliable tool for wine authentication?
Causon et al. Fingerprinting of traditionally produced red wines using liquid chromatography combined with drift tube ion mobility-mass spectrometry
Lam et al. Development and validation of a spectral library searching method for peptide identification from MS/MS
US6917037B2 (en) Mass spectrum analyzing system
Troise et al. Quantitation of acrylamide in foods by high-resolution mass spectrometry
CN109828068B (zh) 质谱数据采集及分析方法
US20060255263A1 (en) Method of identifying substances using mass spectrometry
US7197402B2 (en) Determination of molecular structures using tandem mass spectrometry
JP2005091344A (ja) 質量分析システム
US8148677B2 (en) Peptide identification and quantitation by merging MS/MS spectra
Szabó et al. Collision energies on QTof and Orbitrap instruments: How to make proteomics measurements comparable?
Rubert et al. Application of hybrid linear ion trap-high resolution mass spectrometry to the analysis of mycotoxins in beer
Almstetter et al. Comparison of two algorithmic data processing strategies for metabolic fingerprinting by comprehensive two-dimensional gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry
CN115038961A (zh) 一种同时检测微量血液中维生素k1和维生素k2的方法
Meier et al. Silver dopants for targeted and untargeted direct analysis of unsaturated lipids via infrared matrix‐assisted laser desorption electrospray ionization (IR‐MALDESI)
Menicatti et al. Determination of coeluted isomers in wine samples by application of MS/MS deconvolution analysis
CN115015437B (zh) 一种基于衍生化的白酒中羧基化合物的高覆盖分析方法
JP2009156722A (ja) 質量分析スペクトル分析方法
EP4078600B1 (en) Method and system for the identification of compounds in complex biological or environmental samples
US20220301839A1 (en) Method for analyzing mass spectrometry data, computer program medium, and device for analyzing mass spectrometry data
CN117789848B (zh) 一种应用特征碎片及特征碎片组辅助非靶向筛查的方法
Zhang et al. Quantitative analysis of targeted proteins in complex sample using novel data independent acquisition
CN112881577B (zh) 基于液质联用的石油馏分中含氮化合物分子表征方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant