CN104749307B - 水产品中43种人工合成色素的筛查方法 - Google Patents

Abstract

一种水产品中43种人工合成色素的筛查方法，包括以下步骤，采用液相色谱的四极杆串联飞行时间质谱筛查，调用已建立的质谱筛查数据库以分子式匹配模式自动扫描检索，通过C18分析柱，以5毫mol/L乙酸铵水溶液含0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.3ml/min；采用电喷雾离子化源，在负离子模式下进行检测，提取可疑样品，用基质分散法净化，液相色谱分离，外标法定量测定，确证。其优点在于：本发明的检测方法操作简便快速，灵敏度高，采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰，利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力。

Description

水产品中43种人工合成色素的筛查方法

技术领域

本发明涉及一种食品添加剂的检测方法，尤其指一种水产品中43种人工合成色素的筛查方法。

背景技术

近年来，色素在水产品中非法添加和滥用现象层出不穷。因此相关的检测方法也随之被关注和研究。人工合成色素由于色泽鲜艳、容易上色，主要应用于工业生产中如将羊毛、皮革、蚕丝等方面的染色等，都是具有一定毒性的化学品。然而，有些不法分子为节省成本，在水产品中非法添加人工合成色素，如偶氮玉红、酸性红、苏丹红等，对人民健康和社会稳定产生了极大的危害。因此很有必要建立水产品中人工合成色素的筛查方法，为有效遏制水产品非法添加行为和食品安全风险预警提供技术手段。

现有一种申请号为CN201110384147.1名称为《食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法》公开了一种36种人工合成色素高通量快速筛查方法，其方法为：食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，其特征在于：采用基于液相色谱/飞行时间质谱建立的食品中亮黑、柠檬黄、喹啉黄、胭脂红、酸性紫7、苋菜红、酸性红2G、酸性黄17、日落黄、诱惑红、坚牢黄、结晶丽春红6R、偶氮玉红、丽春红SX、萘酚蓝黑、间苯二酚黄、靛蓝、酸性红26、酸性红4、丽春红3R、酸性红52、萘酚黄色-S、荧光素钠、毛料绿色S、专利蓝五、坚牢绿FCF、亮蓝FCF、亮绿SF、酸性绿3、赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红、新红、曙红Y、橙色I和橙色II的食品中人工合成色素高通量快速筛查方法，并对可疑样品进行确证和定量。但其缺点是样品前处理复杂，只能通过一级信息来测定和确正，仅采用液相色谱/飞行时间，所以检测效率不高，速度不快，准确度也不高，并且，上述方法，只能适用于酸色素的筛查，而不能用于碱性色素的筛查，所以该检测方法还有待于进一步改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种操作简便快速、能有效地减少了基体成分的干扰、高灵敏度、高分辨率，利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，对已知和未知的酸性或碱性的可疑化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件的水产品中43种人工合成色素的筛查方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：水产品中43种人工合成色素的筛查方法，包括以下步骤，采用液相色谱的四极杆串联飞行时间质谱筛查，调用已建立的质谱筛查数据库以分子式匹配模式自动扫描检索，质量允许误差控制在5ppm；其特征在于：使用3.0×100mm，1.8μm的Agilent Eclipse Plus-C18作为分析柱，以5毫mol/L乙酸铵水溶液含0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.3ml/min；采用电喷雾离子源在负离子模式下进行检测，提取可疑样品，用基质分散法净化，液相色谱分离，外标法定量测定，确证，上述为体积百分比；所述43种人工合成色素为28种为酸性色素和15种碱性色素，所述28种人工合成的酸性色素染料为：苋菜红，日落黄，顁蓝，诱惑红，亮黑PN，萘酚黄S，酸性红18，酸性黄17，喹林黄、酸性红2G，亮绿SF、偶氮玉红，酸性红26，羊毛绿，橙色I，橙色II，监牢绿FCF、萘酚蓝黑，酸性蓝，酸性红52，赤藓红，荧光桃红，酸性黄36，酸性绿3，荧光素钠、孟加拉玫瑰红，酸性红87，丽春红SX；所述15种人工合成的碱性色素染料为：金胺、隐性孔雀石绿、孔雀石绿、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹黄、苏丹黑B、碱性橙II、罗丹明B、苏丹橙、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹红I、苏丹红II、橘红2号。

上述数据库的建立步骤选择为：

一、将化合物的名称、分子式、保留时间、母离子质荷比信息加入到化合物数据库MassHunter软件中；

二、进行化合物标样配置，准确称量标准品于100ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成浓度10ug/ml；

三、标样直接质谱进样，进行一级准确质量数的采集，优化离子源参数和质谱电压，扫描采集参数；

四、对于已采集并确认的化合物一级准确质量数，进行针对性的二级质谱扫描采集，并进行不同碰撞能量下的测试，最终将二级全质量碎片信息加入到化合物数据库软件中，为样品进行二级精确匹配。

上述色谱条件选择为：采用Agilent Eclipse Plus-C18分离，Agilent EclipsePlus-C18的规格为：3.0×100mm，1.8μm，流动相：A相为5毫mol/L乙酸铵，体积百分比0.1％的甲酸水溶液；B相为乙腈，分析柱温度控制为30℃，样品温度为25℃，进样体积为3μL，流速为0.2ml/min，梯度洗脱程序为：0～1分钟，5％～20％B相；1～10分钟，20％～100％B相；10～15分钟，100％B相，上述为体积百分比。

上述流动相的选择为：甲醇0.1％，甲酸水溶液，乙腈0.1％甲酸水溶液，含0.1％甲醇的甲酸5毫mol/L乙酸铵溶液和乙腈，含0.1％甲酸的5毫mol/L乙酸铵溶液作为流动相分析比较色素分离结果。

上述优化离子源参数和质谱电压选择为：选取负离子模式，在全扫描方式下优化离子化电压、毛细管电压、母离子质荷比范围、离子源温度、裂解温度、脱溶剂气流速参数，所述采集数据为：优化碰撞电压，通过不同的碰撞电压进行碎裂，把全息二级图谱进行数据库建立，最终确定质谱条件，同时将一级质量数，同位素丰度和二级碎片信息建立成一个完成的数据库。

可疑样品的提取方法为：酸性色素的可疑样品用氨化乙醇提取，而对碱性可疑样品用含有1％乙酸的乙腈提取，所述百分比为体积百分比。

上述确证方法为：分子特征提取：对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用四极杆串联飞行时间质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。

上述进一步确证的步骤选择为：采用MSC结构的解析软件对可疑化合物进行进一步结构确证，然后自动生成进一步确证结果。

上述四极杆串联飞行时间质谱采用一级信息匹配和二级信息的匹配，通过一级信息匹配与二级信息的匹配相结合获得化合物筛查的准确度。

上述的基质分散法以及梯度洗脱法均为本技术领域的公知技术，还有，所述软件如MassHunter软件以及MSC结构的解析软件均不公知技术，在此不再细述。

现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的检测方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求，采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰，而且，本方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率，高质量精确度及可行的线性范围，利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，对已知和未知化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力，经检测后的水产品更为卫生安全；特别是发明的检测方法对现有的“食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法”相比，具有三大优点：一、本发明能够二级精确匹配，二、不仅能够对酸性色素进行检测，而且还能用于碱性色素检测，从而使检测更方便、应用范围也更广，三、样品前处理方法简便快捷，所使用的基质分散管均自制，既可以降低购买成本，而自制的基质分散管质量保证，使使用效果更好。

附图说明

图1是本发明28种酸性色素标准溶液的峰面积小于流动相标准溶液的峰面积图；

图2是本发明实施例中28种酸性色素的阳性样品的提取离子流图；

图3是本发明实施例中28种酸性色素另一阳性样品的提取离子流图；

图4是本发明实施例28种酸性色素标准品的提取离子流图；

图5是本发明实施例中28种酸性色素中的酸性红18二级碎片图谱；

图6是本发明实施例中种酸性色素中的偶氮玉红二级碎片图谱；

图7是本发明实施例15种碱性合成色素混合标准液的总离子流色谱图；

图8是本发明碱性色素中基质标准溶液的峰面积小于流动相标准溶液的峰面积图；

图9本发明15种碱性合成色素中是阳性样品的总离子流图。

图10是本发明实施例中28种酸性色素中丽春红SX同分异构体质谱图；

图11是本发明实施例中28种酸性色素中酸性红同分异构体质谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、对人工合成28种酸性色素的检测方法作具体说明，

如图1至图6所示：

1试剂

1.1标准物质：苋菜红(Acid Red 27，纯度89％)、日落黄(Sunset Yellow FCF，纯度90％)、顁蓝(Indigo carmine，纯度89％)、诱惑红(Allura Red AC，纯度91％)、亮黑PN(Brilliant Black BN，纯度91％)、萘酚黄S(Naphthol Yellow S，纯度89％)、酸性红18(New Coccine(Acid Red 18；Red 6)，纯度91％)、酸性黄17(Acid Yellow 17，纯度89％)、喹林黄(Quinoline yellow，纯度91％)、酸性红2G(Acid Red 1，纯度89％)、亮绿SF(LightGreen SF，纯度91％)、偶氮玉红(Azorubine(Carmoisine)，纯度91％)、酸性红26(PonceauXylidine，纯度91％)、羊毛绿(Wool Green S(酸性绿50)，纯度91％)、橙色I(Orange I(Acid Orange 20)，纯度91％)、橙色II(Orange II，纯度91％)、监牢绿FCF(Fsat GreenFCF(Green 3)，纯度91％)、萘酚蓝黑((Acid Blank 1)，纯度91％)、酸性蓝(Erioglaucinedisodium salt(Brilliant Blue)，纯度91％)、酸性红52(Sulforhodamine B，纯度91％)、赤藓红(Erythrosin B(Red 7)，纯度91％)、荧光桃红(Phloxine B，纯度91％)、酸性黄36(Metanil Yellow，纯度91％)、酸性绿3(Guinea Green B，纯度91％)、荧光素钠(Uranine，纯度91％)、孟加拉玫瑰红(Rose Bengal，纯度91％)、酸性红87(Eosin Y disodium salt，纯度91％)、丽春红SX(Ponceau SX)标准样品购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.11标准溶液的配制：分别准确称取28种酸性色素标准品各10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1g/L的单标准储备液，密封储存于4℃冰箱中。再分别准确吸取1g/L的28种单标准储备液各1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容得10mg/L的混合标准溶液。使用时用A流动相将混合标准溶液稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。

1.2仪器

Agilent UHPLC和Agilent 6540-QTOF(美国Agilent公司)。高速冷冻离心机、涡旋混合器、氮吹仪、样品萃取管，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，乙酸铵、丙酮、正己烷、乙醇和氨水(质量分数为25％～28％)为分析纯，试验用水为Milli-Q超纯水，C18复合硅胶混合基质萃取管(自制)。

1.3色谱条件

采用Agilent Eclipse Plus-C18(3.0×100mm，1.8μm)分离。流动相：A相为5mmol/L乙酸铵、0.1％(v/v)甲酸水溶液；B相为乙腈。柱温为30℃，样品温度为25℃，进样体积为3μL，流速为0.2ml/min。梯度洗脱程序：0～1min，5％B～20％B；1～10min，20％B～100％B；10～15min，100％B。

质谱条件表如下：

1.4样品前处理

称取2.0g样品于50m L带盖聚四氟乙烯离心管中；加入10mL2∶7∶1氨水∶乙醇∶水(v/v)，涡旋，水浴80℃蒸发液体至4mL，用(200g/L)柠檬酸调节pH＝4.0，氨基化吸附剂基质分散法净化，以10000r/min冷冻离心10min，弃去上清液后，再下层固体中加入5mL氨化甲醇洗脱，再重复洗脱一次，合并洗脱液，用氨化甲醇定容10mL，取1mL氮气吹干，用甲醇-水(50∶50，V/V)溶解，过0.22μm有机滤膜后供LC-Q-TOF-MS分析测定。

1.5测定：采用电喷雾离子源在负离子模式下进行检测，提取可疑样品，用基质分散法净化，液相色谱分离，外标法定量测定。这些具体步骤为公知技术，在此不再细述。

1.6确证：分子特征提取：对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用四极杆串联飞行时间质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。进一步确证的步骤为：采用MSC结构的解析软件对可疑化合物进行进一步结构确证，然后自动生成进一步确证结果，所述四极杆串联飞行时间质谱采用一级信息匹配和二级信息的匹配，通过一级信息匹配与二级信息的匹配相结合获得化合物筛查的准确度。

1.7结果，本发明的UPLC-Q-TOF(四极杆飞行时间质谱)检测水产品中28种酸性色素的方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰。而且，该方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围，可利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，对已知和未知化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力。采用电喷雾离子源，在负离子模式下进行检测。样品用氨化乙醇提取，基质分散法净化，超高效液相色谱分离，外标法定量。结果表明，28种酸性色素在20～10000μg/L范围内线性关系良好，r均大于0.991，相对标准偏差(n＝6)均小于5.61％。在100，200，500μg/kg 3个添加水平下平均回收率为65.11％～106.47％。该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于水产品中未知酸性色素的筛查测定。

二、对人工合成15种碱性色素的检测方法作具体说明，如图7至图9所示，

1、试剂，

1.1标准物质：金胺(Auramine O，纯度89％)、隐性孔雀石绿(LeucomalachiteGreen，纯度90％)、孔雀石绿(Malachite Green，纯度89％)、苏丹红III(Sudan III，纯度91％)、苏丹红IV(Sudan IV，纯度91％)、苏丹黄(Butter Yellow，纯度89％)、苏丹黑B(Sudan Black B，纯度91％)、碱性橙II(Chrysoidine G，纯度89％)、罗丹明B(RhodamineB，纯度91％)、苏丹橙(Sudan Orange G，纯度89％)、苏丹红7B(Sudan Red 7B，纯度91％)、苏丹红G(Sudan Red G，纯度91％)、苏丹红I(Sudan I，纯度91％)、苏丹红II(Sudan II，纯度91％)、橘红2号(Citrus Red 2，纯度91％)。

1.11标准溶液配制，

分别准确称取15种碱性合成色素标准品各10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1g/L的单标准储备液(-20℃保存)，再分别吸取1g/L的15种单标准储备液各1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容得10mg/L的混合标准溶液。实验中使用流动相初始相溶液将其稀释成相应的标准工作溶液，于4℃保存。

1.2仪器

Agilent UHPLC和Agilent 6540-QTOF(美国Agilent公司)；高速冷冻离心机、涡旋混合器、氮吹仪、样品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸为色谱纯；乙酸铵为分析纯；氨基化吸附剂混合基质萃取管(自制)。

1.3色谱条件

Agilent Eclipse Plus-C18(3.0×100mm，1.8μm)作为分析柱，柱温为30℃；流动相：A相为5mmol/L乙酸铵-0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱程序：0～1min，5％B～20％B；1～10min，20％B～100％B；10～15min，100％B。进样体积为3μL，流速为0.2mL/min。

质谱条件表如下：

1.4样品前处理

称取2.0g样品于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中，加入10mL乙腈(含有1％乙酸)溶液，并进行涡旋1min后超声5min，提取液经10000r/min冷冻离心10min，取5mL上清液进一步采用氨基化吸附剂基质分散法净化处理，收集洗脱液后经氮气吹干，最后用甲醇-水(V/V＝50/50)溶解，并过0.22μm有机滤膜后供UPLC-Q-TOF分析测定。

1.5测定：采用电喷雾离子源在负离子模式下进行检测，提取可疑样品，用基质分散法净化，液相色谱分离，外标法定量测定。这些具体步骤为公知技术，在此不再细述。

1.6确证：分子特征提取：对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用四极杆串联飞行时间质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。进一步确证的步骤为：采用MSC结构的解析软件对可疑化合物进行进一步结构确证，然后自动生成进一步确证结果，所述四极杆串联飞行时间质谱采用一级信息匹配和二级信息的匹配，通过一级信息匹配与二级信息的匹配相结合获得化合物筛查的准确度。

1.7结果，本发明的UPLC-Q-TOF(四极杆飞行时间质谱)检测水产品中15种碱性色素的方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰。而且，该方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围，可利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，对已知和未知化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力。

2、化合物的分子结构信息

43种化合物的分子结构信息见下表：

色谱-质谱分析

本发明以酸性红18、偶氮玉红、隐性孔雀石绿、苏丹红III等为代表的15种在水产品中禁用的碱性合成色素为研究目标物进行测，依据他们的相对质量和理化性质的差异，并结合应用UPLC技术进行色谱分离，Q-TOF进行质谱信息采集。图7显示15种碱性色素标准液的总离子流图(TIC)，并收集15种目标物的保留时间、一级精确质量、二级碎片全谱、同位素丰度等等信息，详见下表。

水产品中15种碱性合成色素的保留时间和质谱采集参数表：

实验获得的质谱信息并结合Agilent质谱Masshunter软件对目标物进行质谱库对比，以保留时间、母离子和碎片离子精确质量数、同位素丰度模型进行比对确证，以母离子用于定量分析。由于方法中的碎片匹配采用了二级全离子图谱匹配，所以匹配度比一般用特征子离子的方式有更高的可靠性和准确度，效果更好，使得筛查的准确度更高。同分异构体存在的情况下，也同样非常有效。图10和图11为同分异构体质谱图。

提取溶剂的选择

提取溶剂的优化需同时考察目标物化合物和样品基质的特性，合适的提取剂可有效分离目标物与基质杂质，从而增加对样品目标物检测灵敏度。本实验通过比较四种有机溶剂为提取剂——乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮，研究分析表明乙腈是最适合作为水产品中碱性合成色素的提取剂，回收率最高。乙腈适用范围广，它不仅减少对基质中油脂的溶解，且可有效沉淀蛋白质，减少杂质对色素的干扰。二氯甲烷因溶剂密度大，提取液分布于底层，增加操作难度；此外以丙酮和乙酸乙酯提取色素时，回收率偏低。在确定最优提取剂的基础上，本发明中进一步分析加入1％乙酸的乙腈溶液对色素提取效率，结果显示加入乙酸后提取剂不仅保持较好的回收率，且能使目标物离子化，为下一步提取液的分离净化处理奠定了良好基础。由此，本发明确定最优提取溶剂即是含1％乙酸的乙腈溶液。

净化方法优化

本实验选用三种常用的固相萃取柱——C18柱、弱阳离子交换柱与阳离子交换柱和C18复合硅胶基质萃取管对水产品中色素提取分离效率进行比较分析，其中以对样品中色素回收率为指标，结果见表2。从表可知，以C18复合硅胶基质萃取管对净化载体，样品中色素的回收率最高，分析原因可能有以下几个方面：①C18固相萃取小柱具有强疏水性，但吸附性较弱，导致15种碱性合成色素回收率较低(在60％～75％之间)；②弱阳离子离子交换柱和阳离子固相萃取小柱平均色素回收率在85％和74％，但是个别目标物如对碱性橙II、苏丹红II等吸附能力较弱，达不到检测方法要求高通量检测要求；③从表2可以看出，自制C18复合硅胶混合基质萃取管对15种碱性合成色素平均回收率高达96.58％，既能够通过不同吸附剂进行针对性的保留，有效除去杂质干扰，快速高效分离目标物，即保证了碱性合成色素净化效率，且缩短了检测周期。由此，本发明确定C18复合硅胶基质萃取管作为净化载体，使检测15种碱性合成色素物质有较好的回收率，为水产品色素检测方法提供了一个新的净化手段。

不同萃取柱对水产品中15种碱性合成色素的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)的影响见下表，

方法学确证

基质效应

色素化合物和样品本身均存在基质效应，由此本实验分别用流动相初始相和空白样品溶液稀释了一系列的标准溶液进行UPLC-Q-TOF分析。结果表明(见图8)：基质标准溶液的峰面积小于流动相标准溶液的峰面积。

标准曲线、检出限与精密度

配制0.1～500μg/L的标准溶液，以分子离子峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)分别绘制15种碱性合成色素的标准曲线，并将10μg/L混合标准溶液平行测定6次，计算峰面积的相对标准偏差，结果见表3。从表可知，15种碱性合成色素在0.1～500μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.993，表明该方法重现性较好，可以满足日常水产品色素检测分析要求。

表下是：15种碱性色素的线性范围、线性方程、相关系数和精密度

回收率、检出限与定量限

根据3倍信噪比定为检出限(LOD，S/N＝3)和10倍信噪比定为定量限(LOQ，S/N＝10)的要求，本发明采用流动相初始相稀释标准曲线的最低浓度，直到信噪比分别达到3和10时的浓度，确定各目标物的检出限和定量限。从表4所示，15种目标物的检出限在0.05～2.0μg/kg之间(除苏丹红III和苏丹红IV的检测限为10.0μg/kg和5.0μg/kg)，同时15种色素的定量限小于5.0μg/kg(除苏丹红III和苏丹红IV标品定量限为20.0μg/kg和10.0μg/kg)。

此外，在阴性的鲳鱼样品基质中添加10、50和200μg/kg 3种不同浓度水平的15种混合标准溶液，按4.3节方法进行预处理，采用UPLC-Q-TOF测定提取液中的目标化合物，且每个水平重复测定6次，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD％)，结果见表4。从表4可知，在不同加标浓度范围内，15种碱性合成色素的回收率均在80.60％～107.37％之间，RSD为3.33％～6.69％。由此，依据15中碱性合成色素的检出限、定量限和回收率的实验结果，本方法不仅满足快速筛查的需要，同时也符合国内外对水产品中色素检测的要求。

下表是15种碱性合成色素的回收率、RSDs、检出限和定量限：

5.3.4方法应用

以加标水平50μg/kg的鲳鱼样品为研究样品，根据1.3中提取和UPLC-Q-TOF技术检测分析，得到的阳性样品的总离子流图(TIC)(图9所示)。将所得目标物进行分子质量及标准物质谱图数据库的检索，结果可知15种碱性合成色素化合物匹配度均较高，其匹配度在85％以上。由此，综合方法学验证和方法应用分析表明，经过乙腈和乙酸混合液提取和C18复合硅胶基质萃取柱净化，15种碱性合成色素化合物能够被UPLC-Q-TOF有效筛查出来。

5.3.5实际样品的筛查

选取市售22份水产品——白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤作为方法验证样品基质，结果未有发现阳性样品。下一步将以水产制品为采集对象，扩大筛查范围和样品种类。

质谱条件的优化

选取负离子模式，在全扫描方式下优化离子化电压、毛细管电压、m/z范围、离子源温度、裂解温度、脱溶剂气流速等参数。离子化电压是质谱离子源的一项关键参数，该参数直接影响目标化合物的检测灵敏度。随着离子化电压的逐渐增大，离子的响应强度会逐渐增强，响应值达到一定值后，离子的响应又逐渐减弱。本实验考察了100V～150V离子化电压的影响，结果表明，在130V的离子化电压下，所有的目标化合物均能够得到比较满意的准分子离子峰，本发明以130V作为最佳采样离子化电压，根据优化结果，采集数据。其次优化碰撞电压，由于高分辨质谱的筛查需要准确质量的二级图谱碎片进行匹配，所以通过不同的碰撞电压进行碎裂，并把全息二级图谱进行数据库建立最终确定了质谱条件用于酸性色素的分析，同时将一级质量数，同位素丰度和二级碎片信息等建立成一个完成的数据库，以用于质谱筛选。

2.2流动相的选择

本实验选择甲醇-0.1％(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1％(v/v)甲酸水溶液、甲醇-含0.1％(v/v)甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-含0.1％(v/v)甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液作为流动相分析比较多种酸性色素分离效果。结果表明在负离子模式下，乙腈的效果明显优于甲醇，因为乙腈作为质子受体可以提高负离子灵敏度，乙酸铵能够使酸性色素得到较好的峰型，相比之下纯水的效果较差；且在乙酸铵溶液中加入0.1％(v/v)甲酸，虽然在负离子条件下会损失一定灵敏度，但实验发现其影响是在可接受的范围内，同时峰形和分离有明显改善，因此比较了在乙酸铵溶液中添加不同体积分数(0、0.1％、0.2％、0.5％)的甲酸对色谱峰的影响，结果表明，含0.1％(v/v)甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液和乙腈为较佳的流动相。

2.3方法学验证

2.3.1标准曲线、检出限与精密度

用甲醇配制20～10000μg/L的标准溶液，以峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)分别绘制28种酸性色素的标准曲线。根据3倍及10倍信噪比分别确定检出限(LOD)及定量下限(LOQ)，具体结果见表1。将200μg/L混合标准溶液连续检测6次，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表1。各酸性色素的线性范围、线性回归方程、相关系数(r)、LOQ、LOD和RSD见表1。

下表是：28种酸性色素的线性范围、线性方程、相关系数和精密度

结果表明：28种酸性色素在20～10000μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.991，而且仪器的重现性也较好，可以满足分析要求。

基质效应

染料和样品本身的性质都是影响基质效应的因素，因此，本实验分别用流动相和空白样品溶液稀释了一系列的标准溶液进行LC-Q-TOF-MS测试。结果表明：基质标准溶液的峰面积小于流动相标准溶液的峰面积。

回收率、检出限与定量限

分别在阴性的鲳鱼样品基质中添加100、200和500μg/kg3种不同水平的28种混合标准溶液，按1.3节方法进行预处理，每个水平重复测定6次。根据3倍信噪比确定检出限(LOD，S/N＝3)，10倍信噪比确定定量限(LOQ，S/N＝10)。回收率、检出限及定量限见表2。从表2可以看出，在3种加标水平下28种酸性色素的回收率分别为65.11％～106.47％，可以满足日常样品分析要求。

表2为28种酸性色素的回收率、RSD、检出限和定量限表

实际样品分析

选取市售22份水产品(蟹、虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子文蛤等)进行检测，结果未发现阳性样品。

阳性制备样品多极质谱的确证，为有效地使用本方法确证阳性样品，本实验室用43种色素溶液注入鲳鱼样品的方法制备阳性样品，应用四极杆串联飞行时间质谱进行分析，对阳性制备样品进行确证。图2、3为加标水平500μg/kg的28种酸性色素的阳性样品提取离子流图。图4为28种酸性色素标准品提取离子流图。阳性样品与标准品提取离子流图相似，且保留时间几乎相同，所以可以准确地对该样品进行定性分析。图5和图6为部分酸性色素的高分辨二级谱图，之所以四极杆串联飞行时间质谱能更有效的进行筛查确证，很重要的原因是除了一级匹配外，本发明通过二级信息的匹配来进一步提高化合物筛查的准确度。对于基质复杂的水产品分析过程中，四极杆串联飞行时间质谱可以在快速高通量的前提下，保证数据结果的准确性，因此该方法非常行之有效。

本发明由于液相色谱与质谱联用技术在一定程度上能够排除基质干扰，对于基质复杂、需要高灵敏度、宽适用范围的检测工作而言，它已成为最佳的手段之一。四极杆/飞行时间质谱(Q-TOF MS)作为高分辨质谱，能测定到精确质量数，并且通过数据库进行一级，二级质量匹配，同位素匹配的进行化合物鉴定，特别是非特定的目标化合物同时可以对检测到阳性目标物进行定量。

Claims (7)

1.一种水产品中43种人工合成色素的筛查方法，包括以下步骤，采用液相色谱的四极杆串联飞行时间质谱筛查，调用已建立的质谱筛查数据库以分子式匹配模式自动扫描检索，质量允许误差控制在5ppm；其特征在于：使用3.0×100mm，1.8μm的Agilent EclipsePlus-C18作为分析柱，以乙腈-含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.3ml/min；采用电喷雾离子源在负离子模式下进行检测，提取可疑样品，用基质分散法净化，液相色谱分离，外标法定量测定，确证，上述为体积百分比；所述43种人工合成色素为28种酸性色素和15种碱性色素，所述28种人工合成的酸性色素染料为：苋菜红，日落黄，顁蓝，诱惑红，亮黑PN，萘酚黄S，酸性红18，酸性黄17，喹林黄、酸性红2G，亮绿SF、偶氮玉红，酸性红26，羊毛绿，橙色I，橙色II，监牢绿FCF、萘酚蓝黑，酸性蓝，酸性红52，赤藓红，荧光桃红，酸性黄36，酸性绿3，荧光素钠、孟加拉玫瑰红，酸性红87，丽春红SX；所述15种人工合成的碱性色素染料为：金胺、隐性孔雀石绿、孔雀石绿、苏丹红III、苏丹红IV、苏丹黄、苏丹黑B、碱性橙II、罗丹明B、苏丹橙、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹红I、苏丹红II、橘红2号；所述色谱条件为：采用Agilent Eclipse Plus-C18分离，Agilent Eclipse Plus-C18的规格为：3.0×100mm，1.8μm，流动相：A相为5mmol/L乙酸铵，体积百分比0.1％的甲酸水溶液；B相为乙腈，分析柱温度控制为30℃，样品温度为25℃，进样体积为3μL，流速为0.2ml/min，梯度洗脱程序为：0～1分钟，5％～20％B相；1～10分钟，20％～100％B相；10～15分钟，100％B相，可疑样品的提取方法为：酸性色素的可疑样品用氨化乙醇提取，而对碱性色素的可疑样品用含有1％乙酸的乙腈提取，所述百分比为体积百分比。

2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于：所述数据库的建立步骤为：

一、将化合物的名称、分子式、保留时间、母离子质荷比信息加入到化合物数据库MassHunter软件中；

二、进行化合物标样配置，准确称量标准品于100ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成浓度10μg/ml；

三、标样直接质谱进样，进行一级准确质量数的采集，优化离子源参数和质谱电压，扫描采集参数；

四、对于已采集并确认的化合物一级准确质量数，进行针对性的二级质谱扫描采集，并进行不同碰撞能量下的测试，最终将二级全质量碎片信息加入到化合物数据库软件中， 为样品进行二级精确匹配。

3.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于：选择甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液，甲醇-含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，和乙腈-含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，以上百分比为体积百分比，分析比较色素分离结果。

4.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于：所述优化离子源参数和质谱电压为：选取负离子模式，在全扫描方式下优化离子化电压、毛细管电压、母离子质荷比范围、离子源温度、裂解温度、脱溶剂气流速参数，所述采集数据为：优化碰撞电压，通过不同的碰撞电压进行碎裂，把全息二级图谱进行数据库建立，最终确定质谱条件，同时将一级质量数，同位素丰度和二级碎片信息建立成一个完成的数据库。

5.根据权利要求1至4中任一所述的筛查方法，其特征在于：所述确证方法为：分子特征提取：对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用四极杆串联飞行时间质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。

6.根据权利要求5所述的筛查方法，其特征在于：所述进一步确证的步骤为：采用MSC结构的解析软件对可疑化合物进行进一步结构确证，然后自动生成进一步确证结果。

7.根据权利要求5所述的筛查方法，其特征在于：所述四极杆串联飞行时间质谱采用一级信息匹配和二级信息的匹配，通过一级信息匹配与二级信息的匹配相结合获得化合物筛查的准确度。