CN108445117B - 一种偶氮染料降解产物的液相分离方法 - Google Patents

一种偶氮染料降解产物的液相分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种偶氮染料降解产物的液相分离方法，首先对酸性红18催化降解液进行冻干除杂，然后进行HPLC分离。本发明利用MnP对AR18脱色降解，通过探索不同类型的液相色谱柱、设置不同流动相及比例、流速、检测波长等因素，得到最佳HPLC分离条件，能够对AR18的六种降解产物达到较好的分离。

Description

一种偶氮染料降解产物的液相分离方法
技术领域
本发明涉及一种分离方法，具体地说是一种偶氮染料降解产物的液相分离方法。
背景技术
偶氮染料废水具有COD值高、色度高、成分复杂、毒性大等特点，因而进入环境水体中很难降解，直接影响气体的溶解度和水体的透光性，进而进导致水生动物的正常生命活动受限，从而破坏整个水体生态平衡。一些传统的物理化学、生物法已经用于染料废水的降解，但由于降解能力不同，可能产生更多有毒的中间产物。由于偶氮染料是带有羟基、磺酸基等助色基团的共轭发色体系，因而产物含有亲水性较强的磺酸根离子及羟基，不利于降解产物的分离提取。目前，偶氮染料的降解产物的分离方法不尽相同，而有关酸性红18降解的产物的液相分离并没有详细报道。
发明内容
本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种偶氮染料降解产物的液相分离方法，以使偶氮染料降解产物能够获得较好的分离，有利于对染料脱色降解的中间产物及终产物的鉴定分析，为今后研究染料降解途径和降解机理奠定基础。
本发明以酸性红18(AR18)为模式染料，利用锰过氧化物酶(Manganeseperoxidase，MnP，EC1.11.1.13)对其催化降解，反应1h脱色率高达90％以上。
本发明偶氮染料降解产物的液相分离方法，包括如下步骤：
步骤1：冻干除杂
取20mL酸性红18催化降解液，用冷冻干燥剂机-50℃冻干后用1mL的双蒸水溶解，有机相乙腈除去蛋白，离心后过滤，旋蒸，双蒸水再溶解，过0.22μm滤膜待用；
步骤2：HPLC分离
将步骤1所得处理液送样进行HPLC分离，操作参数如下：
色谱柱C8(ZORBAX 300SB-C8150mm×4.6mm)
流动相：乙腈-水溶液
洗脱方式：梯度洗脱
洗脱速度：0.5mL/min
洗脱时间：30min
柱温：25℃
进样体积：20μL
梯度洗脱时，洗脱参数为：0-5min：2-5％乙腈，水(0.1％甲酸)；5-30min：5-40％乙腈，水(0.1％甲酸)。
紫外检测波长280nm。
本发明利用MnP对AR18脱色降解，通过探索不同类型的液相色谱柱、设置不同流动相及比例、流速、检测波长等因素，得到最佳HPLC分离条件，能够对AR18的六种降解产物达到较好的分离。在保留时间4.33min、7.53min、15.81min、16.51min、17.42min、19.92min处有明显的产物生成。
附图说明
图1是MnP催化AR18脱色降解的UV-vis光谱图。
图2是MnP催化AR18降解不同时间所获得降解产物的HPLC图。
图3是MnP催化AR18降解不同时间所获得降解产物冻干浓缩后萃取液相分离谱图。
图4是MnP催化AR18降解不同时间所获得降解产物的HPLC图(a)对照组(b)实验组。
图5是AR18降解产物的HPLC图，其中萃取剂依次为(1)甲醇、(2)乙腈、(3)异丙醇、(4)二氯甲烷、(5)甲苯、(6)石油醚。
图6是将脱色液酸化或碱化处理后冻干浓缩，甲醇萃取液相检测谱图。
图7是乙酸乙酯萃取MnP催化AR18降解产物HPLC谱图。
图8是选取色谱柱C8冻干后液相分析谱图。
图9是选取色谱柱C8冻干除杂后液相分析谱图。其中图a为506nm检测波长，图b为280nm检测波长。
图10是MnP催化AR18降解后生成的降解产物，已通过液相达到了较好的分离，产物分别命名为M1-M6。
具体实施方式
下面通过对MnP催化降解AR18的降解产物进行不同方法分离，并对分离结果进行比较分析。
(一)MnP催化降解AR18
MnP催化降解酸性红18的条件为：110mmol/L乳酸钠缓冲液(pH 3.5)，初始浓度为100mg/L，MnP酶活为40U/L，MnSO4的浓度为3.5mmol/L，H2O2的浓度为0.2mmol/L，35℃水浴反应，反应1h脱色率达96％。
(二)酸性红18脱色降解产物的液相分析
1、紫外-可见(UV-Vis)光谱分析
本节考察MnP催化酸性红18脱色降解的紫外-可见光谱分析，以判断脱色降解过程中是否出现新的物质特征峰。在酸性红18最佳脱色条件下，进行脱色实验，取反应0min、10min、30min、1h、1.5h、2.5h、6h、12h及24h的脱色液，在紫外可见分光光度计中进行全波长(200nm-800nm)扫描分析，结果见图1。从图1可以看出，随着反应不断进行，酸性红18在506nm和330nm的特征峰的紫外吸收明显下降，说明MnP可催化酸性红18降解反应的降解，致使大的共轭体系萘环-N＝N-萘环中偶氮基团发生结构破坏；随着反应进行，在280nm处吸收峰有所上升，说明在MnP催化酸性红18脱色降解过程中，染料结构发生变化，有新物质生成。
2、高效液相色谱(HPLC)分析
2.1、选取色谱柱C18(TC-C18(2)250mm×4.6mm)
2.1.1、直接液相分析
在最佳脱色体系下，MnP催化酸性红18脱色降解不同时间的脱色液进行液相分析。
HPLC条件：流动相为20％乙腈：80％10mmol/L乙酸铵(pH4.0)，洗脱速度0.8mL/min，柱温箱温度30℃，进样体积20μL，紫外检测波长280nm。
检测结果见图2。由图2可知，保留时间9.78min出现新的吸收峰，在保留时间3-5min，峰面积增加，说明有产物生成，但是不能达到较好的分离。
2.1.2、冻干浓缩后(甲醇乙腈萃取)液相分离
将不同时间脱色液各20mL经-50℃冷冻干燥2～3天后，用5mL的甲醇：乙腈(V:V＝1:1)震荡溶解后离心取上清液，过0.22μm的有机相滤膜，液相分析。
HPLC条件：流动相为15％乙腈：85％10mmol/L乙酸铵(自然pH)，等度洗脱，洗脱速度为0.25mL/min，其他条件同上。
检测结果见图3。由图3可知，未加dye的对照组与反应时间20min、16h、22h实验组的液相色谱图较相似，说明并没有产物生成。
2.2、选取色谱柱苯基柱(Hypersil C6H5250mm×4.6mm)
2.2.1、直接液相分析
在最佳脱色体系下，MnP催化酸性红18脱色降解不同时间的脱色液进行液相分析。
HPLC条件：流动相为15％乙腈：85％10mmol/L乙酸铵，等度洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，其他条件同上。
检测结果见图4。由图4可知，280nm检测波长下，在脱色之前的不同脱色体系对照组都有出峰。经过对比可知，在未脱色体系中，保留时间5.52min、5.67min主要是染料出峰；脱色体系中，保留时间3.7-4.7min、8.34min是新物质出峰。
2.2.2、冻干浓缩(不同有机溶剂萃取)后液相分析
将6组20mL的反应液(0min、40min、6h)用1M H2SO4调pH为2后，-50℃冷冻干燥，分别用极性由大到小的不同有机试剂5mL(甲醇、乙腈、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、石油醚)萃取，离心取上清，用0.22μm的有机相针式滤器过滤后，用于高效液相色谱仪检测分析。
HPLC条件：流动相为15％乙腈：85％10mmol/L乙酸铵，等度洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，其他条件同上。
检测结果见图5。由图5可知，在280nm的检测波长下，甲醇萃取能力较大，保留时间8.2min有产物生成；异丙醇在保留时间6.4有产物生成；石油醚萃取能力较小，但在保留时间5.37min有产物生成；乙腈、二氯甲烷、甲苯萃取后均无产物生成。因此，可以用甲醇对MnP催化酸性红18的脱色的降解产物进行萃取。
2.2.3、将脱色液酸化或碱化处理后冻干浓缩，甲醇萃取液相检测
在酸性红18最佳脱色条件下，进行脱色实验，将3组20mL的不同反应时间脱色液分别用1M H2SO4调pH至2、1M NaOH调pH至8和未经处理，冷冻干燥，再用20mL甲醇溶解，超声加热萃取，离心取上清，旋蒸浓缩至4mL，用0.22μm的有机相针式滤器过滤后，用于高效液相色谱仪检测分析。其他条件同上。
检测结果见图6。由图6可知，将脱色液调酸后，有较多的产物峰出现，且分离效果较好。
2.2.4、冻干浓缩后乙酸乙酯萃取，液相检测
在酸性红18最佳脱色条件下，进行脱色实验，将20mL脱色液经冷冻干燥后，用20mL的乙酸乙酯超声加热溶解，取10mL旋蒸干后再用2mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜待用。
HPLC条件：流动相为15％乙腈：85％10mmol/L乙酸铵(自然pH)，洗脱速度0.5mL/min，其他条件同上。
检测结果见图7。由图7可知，由乙酸乙酯萃取酸性红18降解产物的实验组和对照组的出峰时间一致，说明产物没有被萃取到。
2.3、选取色谱柱C8(ZORBAX 300SB-C8150mm×4.6mm)
2.3.1、冻干后液相分析
在酸性红18最佳脱色条件下，进行脱色实验，将20mL脱色液经1M H2SO4调pH为2，冷冻干燥后，再用1mL的超纯水溶解，离心后，用0.22μm的水相针式滤器过滤后，用于高效液相色谱仪检测分析。
检测结果见图8。由图8可知，调酸后的脱色液冻干，水溶解后的的液相分析实验组与对照组有明显区别，在保留时间2-10min的产物峰较明显。
2.3.2、冻干除杂后液相分析
在酸性红18的最佳脱色条件下，进行脱色实验，将20mL脱色液冻干后，用1mL的双蒸水溶解，乙腈去蛋白，离心后过滤，旋蒸，再溶解，过0.22μm滤膜待用。
HPLC条件：流动相：0-5min：2％-5％乙腈，水(0.1％甲酸)；5-30min：5％-40％乙腈，水(0.1％甲酸)，梯度洗脱，速度0.5mL min-1，柱温箱25℃，进样体积20μL，紫外检测波长280nm。
检测结果见图9。由图a可知，底物峰在506nm处随着反应时间的进行逐渐降低直至消失；图b可知，产物峰在保留时间2.7、4.2、11、24min处随着反应时间的增加而生成，且达到较好的分离。图10为MnP催化AR18降解后生成的降解产物，已通过液相达到了较好的分离，产物分别命名为M1-M6。从图10中可以看出，在反应初始30min，生成大量的M1、M3及M4，M2浓度较低，且随着反应时间段增加，M3的峰强度降低，产物M1、M2与M4的峰强度增高。脱色反应1h时M5、M6有少量产生，M5随反应时间的增加消失，M6的浓度变化不大。

Claims (4)

1.一种偶氮染料降解产物的液相分离方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：冻干除杂
取20mL酸性红18催化降解液，用冷冻干燥剂机-50℃冻干后用1mL的双蒸水溶解，有机相乙腈除去蛋白，离心后过滤，旋蒸，双蒸水再溶解，过0.22μm滤膜待用；
所述酸性红18催化降解液是利用锰过氧化物酶MnP对其催化降解后获得，MnP催化降解酸性红18的条件为：110mmol/L pH值3.5的乳酸钠缓冲液，初始浓度为100mg/L，MnP酶活为40U/L，MnSO4的浓度为3.5mmol/L，H2O2的浓度为0.2mmol/L，35℃水浴反应，反应1h脱色率达96％；
步骤2：HPLC分离
将步骤1所得处理液送样进行HPLC分离，对酸性红18的降解产物进行分离；
步骤2中，检测参数设置如下：
色谱柱C8，ZORBAX 300SB-C8150 mm×4.6mm
流动相：乙腈-水溶液
洗脱方式：梯度洗脱
洗脱速度：0.5mL/min
洗脱时间：30min
柱温：25℃
进样体积：20μL；
梯度洗脱时，洗脱参数为：0-5min：2-5％乙腈，余量为水溶液；5-30min：5-40％乙腈，余量为水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
梯度洗脱时所用水溶液为0.1％甲酸溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
酸性红18的降解产物的保留时间分别为4.33min、7.53min、15.81min、16.51min、17.42min、19.92min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
紫外检测波长为280nm。
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