CN109752470A - 一种红花的多组分染色剂的检测方法 - Google Patents

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陈林明
林晓坤
刘佳会
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Abstract

本发明公开了一种红花的多组分染色剂的检测方法，包括：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；取待测样品，加入乙醇，超声提取，取上清液，过滤，得供试品溶液；取复合标准溶液注入液相色谱仪于420‑510nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于420‑510nm的检测波长测定，记录色谱图；将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。本发明不仅可以做到同时检测多组分染色剂，提高红花临床用药安全，保证红花药材质量，提高了检出效率。

Description

一种红花的多组分染色剂的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种红花的多组分染色剂的检测方法。
背景技术
近年来，红花作为一种常用的中药材，临床用量大，市场上供不应求，价格上扬，致使市场上对一些卖相不好的红花，采取染色伪装，把质量较差的红花染色以改善外观，提高售价，牟取暴利，给中药材的质量和人民用药安全带来了严重的影响。为此，2007年、2013年及2014年国家药监总局发布了红花的染色的检测方法《国家食品药品监督管理总局药品检验补充检验方法和检验项目批准件》2007009号、2013006号、2014016号，检测方法检测的染色剂成分如下表1所示。
表1
但随着市场上染色伪装技术的变化，发现红花染色可能存在多种其他染色剂，增补法的检验方法暂无法检测其他组分染色剂。因此，为提高红花临床用药安全，保证红花药材质量，需要对红花多组分染色剂同时间检测的方法进行摸索，建立一种能够进行红花多组分染色剂同时间检测的检测方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红花的多组分染色剂的检测方法，该检测方法不仅可以做到同时检测多组分染色剂，提高红花临床用药安全，保证红花药材质量，提高了检出效率。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；
供试品溶液的制备步骤：取待测样品，加入乙醇，超声提取，取上清液，过滤，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
进一步地，复合标准溶液的制备步骤中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
进一步地，复合标准溶液的制备步骤中，第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
进一步地，复合标准溶液的制备步骤中，复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
进一步地，复合标准溶液的制备步骤中，乙醇浓度为70％。
进一步地，供试品溶液的制备步骤中，取待测样品0.2-2g，加乙醇5-25ml，超声提取8-12分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液。
进一步地，供试品溶液的制备步骤中，超声提取时间为10分钟。
进一步地，供试品溶液的制备步骤中，微孔滤膜的孔径为0.45μm。
进一步地，测定步骤中，所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A的比例增加60vt％；t40-41min，流动相A的比例增加10vt％；t41- 50min，流动相A的比例增至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
进一步地，分析步骤中，供试品溶液的色谱图中，不得出现与复合标准溶液的色谱图的主峰保留时间相同的色谱峰；若出现保留时间相同的色谱峰，则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在260-700nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，吸收光谱应不相同。
本发明的有益效果在于：
本发明的方法通过将柠檬黄、苋菜红、日落黄、亮黄、赤藓红、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙制成复合标准溶液，取复合标准溶液注入液相色谱仪测定得到色谱图；取供试品溶液注入液相色谱测定得到色谱图；将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果；本发明通过优化制备步骤及工艺参数，不仅可以做到同时检测多组分染色剂，提高红花临床用药安全，保证红花药材质量，提高了检出效率，符合市场需求，而且检出限、耐用性等符合方法学验证的要求。
附图说明
图1-1为复合标准溶液按照实施例1的方法测定得到的HPLC图；
图1-2为复合标准溶液按照实施例2的方法测定得到的HPLC图；
图1-3为复合标准溶液按照实施例3的方法测定得到的HPLC图；
图2-1为批号为20180621的红花按照实施例1的方法测定得到的HPLC图；
图2-2为批号为20180621的红花按照实施例2的方法测定得到的HPLC图；
图2-3为批号为20180621的红花按照实施例3的方法测定得到的HPLC图；
图3-1为批号为20180727的红花按照实施例1的方法测定得到的HPLC图；
图3-2为批号为20180727的红花按照实施例2的方法测定得到的HPLC图；
图3-3为批号为20180727的红花按照实施例3的方法测定得到的HPLC图；
图4-1为批号为20180815的红花按照实施例1的方法测定得到的HPLC图；
图4-2为批号为20180815的红花按照实施例2的方法测定得到的HPLC图；
图4-3为批号为20180815的红花按照实施例3的方法测定得到的HPLC图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种红花的多组分染色剂的检测方法，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；
供试品溶液的制备步骤：供试品溶液的制备步骤：取待测样品，加入乙醇，超声提取，取上清液，过滤，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
作为进一步地实施方式，复合标准溶液的制备步骤中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
作为进一步地实施方式，复合标准溶液的制备步骤中，第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
作为进一步地实施方式，复合标准溶液的制备步骤中，复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
作为进一步地实施方式，复合标准溶液的制备步骤中，乙醇浓度为70％。
作为进一步地实施方式，供试品溶液的制备步骤中，取待测样品0.2-2g，加乙醇5-25ml，超声提取8-12分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液。
作为进一步地实施方式，供试品溶液的制备步骤中，超声提取时间为10分钟。
作为进一步地实施方式，供试品溶液的制备步骤中，微孔滤膜的孔径为0.45μm。
作为进一步地实施方式，测定步骤中，所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A的比例增加60vt％；t40-41min，流动相A的比例增加10vt％；t41-50min，流动相A的比例增至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
作为进一步地实施方式，分析步骤中，供试品溶液的色谱图中，不得出现与复合标准溶液的色谱图的主峰保留时间相同的色谱峰；若出现保留时间相同的色谱峰，则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在260-700nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，吸收光谱应不相同。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1：
一种红花的多组分染色剂的检测方法，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加浓度为70％的乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；其中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
供试品溶液的制备步骤：供试品溶液的制备步骤中，取待测样品1g，加乙醇15ml，超声提取10分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，微孔滤膜的孔径为0.45μm，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于420nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于420nm的检测波长测定，记录色谱图；
所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A由15vt％逐渐升至75vt％；t40-41min，流动相A由75vt％逐渐升至85vt％；t41-50min，流动相A由85vt％逐渐升至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
实施例2：
一种红花的多组分染色剂的检测方法，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加浓度为70％的乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；其中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
供试品溶液的制备步骤：供试品溶液的制备步骤中，取待测样品1g，加乙醇15ml，超声提取10分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，微孔滤膜的孔径为0.45μm，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于485nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于485nm的检测波长测定，记录色谱图；
所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A由15vt％逐渐升至75vt％；t40-41min，流动相A由75vt％逐渐升至85vt％；t41-50min，流动相A由85vt％逐渐升至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
实施例3：
一种红花的多组分染色剂的检测方法，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加浓度为70％的乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；其中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
供试品溶液的制备步骤：供试品溶液的制备步骤中，取待测样品1g，加乙醇15ml，超声提取10分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，微孔滤膜的孔径为0.45μm，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于510nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于510nm的检测波长测定，记录色谱图；
所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A由15vt％逐渐升至75vt％；t40-41min，流动相A由75vt％逐渐升至85vt％；t41-50min，流动相A由85vt％逐渐升至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
结果分析如下：
供试品溶液的色谱图中,不得出现与复合标准溶液的色谱图的主峰保留时间相同的色谱峰。若出现保留时间相同的色谱峰,则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在260-700nm波长范围的紫外-可见吸收光谱,吸收光谱应不相同。
该检测方法是通过梯度洗脱从而可在75min内对药材中的染色剂进行定性检测，如图1-1所示，标准试剂在HPLC上的出峰时间依次为柠檬黄、苋菜红、日落黄、亮黄、赤藓红、酸性红73、金橙II，金胺O(1)、金胺O(2)、碱性橙。
参照图1-1、图1-2、图1-3，信号峰1为柠檬黄，信号峰2为苋菜红，信号峰3为日落黄，信号峰4为亮黄，信号峰5为赤藓红，信号峰6为酸性红73，信号峰7为金橙II，信号峰8为金胺O(1)，信号峰9为金胺O(2)，信号峰10为碱性橙。
参照图2-1、图2-2、图2-3，图2-1中的1、2均为杂质峰，图2-3中的3为杂质峰。批号为20180621的红花药材中，在保留时间与标准试剂的保留时间内未发现信号峰，所以，批号为20180621的红花药材中不含有上述染色剂。
参照图3-1、图3-2、图3-3，图3-1中的1、2均为杂质峰，图3-2中的3为杂质峰，图,3-3中的3为杂质峰。批号为20180727的红花药材中，在保留时间与标准试剂的保留时间内未发现信号峰，所以，批号为20180727的红花药材中不含有上述染色剂。
参照图4-1、图4-2、图4-3，图4-1中的1、2、5均为杂质峰，信号峰2为杂质峰，图4-2中的1、3均为杂质峰，图4-3中的1、3、4均为杂质峰。批号为20180815的红花药材中，在保留时间与标准试剂的保留时间内未发现信号峰，所以，批号为20180815的红花药材中不含有上述染色剂。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，包括：
复合标准溶液的制备步骤：取柠檬黄、苋菜红、赤藓红标准试剂，加乙醇制成第一标准溶液；取日落黄、亮黄、酸性红73、金橙II，金胺O、碱性橙标准试剂，加同浓度乙醇制成第二标准溶液；取第一标准溶液和第二标准溶液各1mL，稀释，得到复合标准溶液；
供试品溶液的制备步骤：取待测样品，加入乙醇，超声提取，取上清液，过滤，得供试品溶液；
测定步骤：取复合标准溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；取供试品溶液注入液相色谱仪于420-510nm的检测波长测定，记录色谱图；
分析步骤：将供试品溶液的色谱图与复合标准溶液的色谱图进行比较，分析得出结果。
2.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，复合标准溶液的制备步骤中，第一标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
3.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，复合标准溶液的制备步骤中，第二标准溶液中各标准试剂的浓度为0.1mg/mL。
4.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，复合标准溶液的制备步骤中，复合标准溶液中各标准试剂的浓度为0.02mg/mL。
5.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，复合标准溶液的制备步骤中，乙醇浓度为70％。
6.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备步骤中，取待测样品0.2-2g，加乙醇5-25ml，超声提取8-12分钟，通过离心取上清液，然后采用微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液。
7.如权利要求6所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备步骤中，超声提取时间为10分钟。
8.如权利要求6所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备步骤中，微孔滤膜的孔径为0.45μm。
9.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，测定步骤中，所述液相色谱仪的参数为：色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：乙腈；流动相B：0.02mol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：t0-15min，流动相A由5vt％逐渐升至15vt％；t15-40min，流动相A的比例增加60vt％；t40-41min，流动相A的比例增加10vt％；t41-50min，流动相A的比例增至95vt％；T50-60min，流动相A恒定为95vt％。
10.如权利要求1所述的红花的多组分染色剂的检测方法，其特征在于，分析步骤中，供试品溶液的色谱图中，不得出现与复合标准溶液的色谱图的主峰保留时间相同的色谱峰；若出现保留时间相同的色谱峰，则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在260-700nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，吸收光谱应不相同。
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CN112285092A (zh) * 2020-10-29 2021-01-29 浙江大学 一种基于表面增强拉曼光谱技术的红花染色快速检测方法

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