CN108008026A

CN108008026A - 一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法

Info

Publication number: CN108008026A
Application number: CN201711056673.9A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 罗轶; 朱雪妍; 黄博; 林燕翔; 白桂昌; 谢培德
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN108008026B

Abstract

本发明公开了一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，包括以下步骤：（1）空白基质溶液的制备；（2）混合对照品溶液的制备；（3）样品溶液的制备；（4）进行液相色谱‑串联质谱分析；（5）结果分析。所述13种着色剂为酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙和碱性橙2。该法具有操作简便、准确度高、精密度高、稳定性好的优点，可同时检测13种着色剂种的一种或者多种，适用于实验室对于山楂丸的质量控制，检测山楂丸是否经过上述13种着色剂的染色，可批量进行检测，检测效率高。

Description

一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法

技术领域

本发明涉及药品检测领域，具体是一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法。

背景技术

山楂丸是由山楂、白糖经过粉碎后混匀，并按一定比例加入炼蜜所制成的大蜜丸，具有消积化滞之功效。山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名山里果、山里红，蔷薇科山楂属，是传统的药食两用植物，含有黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类、黄烷醇类及其聚合物、三萜类和甾体类、有机酸类等150多种活性物质。山楂具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药，对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效。山楂内的黄酮类化合物牡荆素，是一种抗癌作用较强的药物，其提取物对抑制体内癌细胞生长、增殖和浸润转移均有一定的作用。山楂丸现行标准《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册中，仅收载了其性状和丸剂通则检查项，其他的项目还没有建立相关的检测标准。

目前，国内外用于食品中多种合成着色剂的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、高效液相串联质谱法等。分光光度法操作繁琐、定性定量准确度较差；液相色谱法是目前应用最广泛的检测方法，但是缺乏配套的确证技术，无法满足复杂的食品基质中目标物的定性确证要求。已报道的检测合成着色剂的LC-MS/MS方法中，一般都是涉及食品和化妆品等行业的，还没有普遍适用的检测方法。因此，建立一种同时提取、净化、同步快速定量检测山楂丸中合成着色剂的方法对于控制山楂丸的产品质量尤为重要，可有效防止山楂丸中药材掺假、掺入不合理添加剂等问题。

目前公开文献中也有关于着色剂的检测方法，还没有关于山楂丸中多种着色剂同步检测的相关技术。下面是检测到的相关文献：

1、中国专利：一种同时检测葡萄酒中六种着色剂含量的方法；申请号：201610535407.3；申请日： 2016.07.08；申请人：江苏今世缘酒业股份有限公司；摘要：本发明公开了一种同时检测葡萄酒中六种着色剂含量的方法，包括以下步骤：a、样品的制备，量取一定体积的待测酒样，煮沸至尽干除，用超纯水定容至初体积，过微孔滤膜；b、着色剂混合标准溶液的制备：分别称取一定量的着色剂标准物质，用超纯水稀释定容至一定体积，使用时混合后逐级稀释至所需浓度溶液，过水相微孔滤膜；c、使用高效液相色谱-四级杆-静电场轨道离子阱质量分析联用仪进行定性和定量分析。本发明对葡萄酒样中6种着色剂的检测准确性好、灵敏度高、精密性好，回收率符合分析检测要求，可适用于各种品种葡萄酒中着色剂的检测分析。

2、中国专利：化妆品中38种限用着色剂同时检测的方法；申请号：201410539619.X；申请日： 2014.10.14；申请人：大连市食品检验所；摘要：一种化妆品中38种限用着色剂同时检测的方法，所述着色剂为苋菜红、酸性蓝74、胭脂红、酸性黄1、酸性橙10、日落黄、酸性红1、诱惑红、坚牢绿、酸性蓝9、酸性红50、酸性黄11、酸性黑1、酸性蓝1、酸性橙7、酸性红52、酸性绿22、专利蓝v、酸性红92、酸性绿9、酸性红88、颜料红49、溴甲酚绿、酸性紫43、酸性紫9、酸性蓝62、酸性蓝7、碱性紫2、酸性紫50、溶剂黄33、溶剂黄21、颜料红64、溶剂红3、溶剂黄16、溶剂黄29、颜料红4、溶剂绿3、碱性蓝26，检测步骤如下：溶液的配制、各种标准储备溶液的配制、样品溶液的制备、液相色谱定性分析、定量测定。本发明可同时检测化妆品中38种限用着色剂，检测效率高，检测成本低。

3、中国专利：一种检测再造烟叶用辅料中九种合成着色剂浓度的方法；申请号201510707623.7；申请日： 2015.10.27；申请人：云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南同创检测技术股份有限公司；摘要：一种检测再造烟叶用辅料中九种合成着色剂浓度的方法，本发明方法是制备柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红九种合成着色剂混合母液及样品溶液，准备标准工作溶液，采用液相色谱-串联三重四级杆质谱分析仪，分析检测得到样品溶液中九种合成着色剂浓度。本发明方法准确可靠、灵敏度高，非常适合复杂基质再造烟叶用辅料中九种合成着色剂的分析。

4、中国专利：同步快速检测配制酒中8种人工合成着色剂的LC-MS/MS方法；申请号201610309435.3；申请日： 201,6.05.11；申请人：济南出入境检验检疫局检验检疫技术中心；摘要：本发明公开了一种同步快速检测配制酒中8种人工合成着色剂的LC-MS/MS方法。所述的8种人工合成着色剂为新红、靛蓝、酸性紫6B、罗丹明B、酸性红、喹啉黄、萘酚黄和亮黑。本发明首先加热除去乙醇、调酸后，采用自组装的固相萃取净化小柱(阳离子交换填料+阴离子交换填料)对不同性质的人工合成着色剂实现同步净化、富集，采用LC-MS/MS一次色谱过程进行配制酒中8种人工合成着色剂的同时定量测定。该方法操作简单，净化效果好，灵敏度高，重现性好，可广泛应用于配制酒中上述8种人工合成着色剂的检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，以考察山楂丸是否添加此类着色剂。该法操作简便，检测效率高，一次过柱，一次色谱过程，可同步检测13种着色剂，检测成本较低；且该法具有准确率高、重现性好、灵敏度高等优点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，其中所述的着色剂为酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙和碱性橙2；其检测方法包括以下步骤：

（1）空白基质溶液的制备：取空白基质样品5～6g，精密称定，加入甲醇25～30 ml，超声处理30～40分钟，冷却，摇匀，过滤；精密吸取滤液1ml，置于10 ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.2μm滤膜，即可得到空白基质溶液，于4～6℃条件下避光保存；

（2）混合对照品溶液的制备：分别精密称取酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙、碱性橙2对照品适量，加空白基质溶液稀释，制成单种着色剂含量均为1μg/ml的混合溶液，得到混合对照品储备液；精密量取上述混合对照品储备液，加入空白基质溶液稀释，制成单种着色剂含量均为100ng/ml的混合对照品溶液，于4～6℃条件下避光保存；

（3）样品溶液的制备：取山楂丸样品5～6g，打碎，精密称定后加入甲醇25～30 ml，超声处理30～40分钟，冷却，摇匀，过滤；精密吸取滤液1ml，置于10 ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.2μm滤膜，即可得到待测样品溶液，于4～6℃条件下避光保存；样品溶液的制备与空白基质溶液的制备保持一致；

（4）进行液相色谱-串联质谱分析：分别精密吸取同样体积的混合对照品溶液与样品溶液，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，按照一定的色谱条件和质谱条件进行测定，得到LC-MS／MS 谱图；

（5）结果分析：将样品溶液的谱图与混合对照品溶液的谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某对照品的保留时间一致的色谱峰，并且扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的吸收图谱一致，则认定样品中存在该着色剂。

所述超声处理条件为：功率320W，频率40kHz。

所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：Eclipse Plus C₁₈柱（1.8µm，2.1 mm×100mm）；柱温35℃；流速0.3ml/min；以10mmol/L乙酸铵为流动相A，以甲醇为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱：

进样量：2μl 。

所述质谱条件为：采用电喷雾电离源（ESI），正离子方式扫描， MRM方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；离子漏斗参数：高压150V，低压60V；毛细管电压：3.5KV；喷嘴电压：0V。

本发明采用的检测条件和方法是在查阅大量文献的基础上，经过多次实验探索研究之后筛选出来的，能够达到准确度高、稳定性好的目的。以下为本发明的检测方法的选择研究试验：

（1）色谱条件的选择

酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙、碱性橙2均属于红色系或者黄色系着色剂，具有相似的化学性质，在本发明所述色谱条件下，以10mmol/L乙酸铵为流动相A，以甲醇为流动相B，所测13种着色剂成分峰形良好。

（2）质谱条件的选择

本发明所测13种染色剂成分中均含有偶氮基团,经过试验，水相采用10mmol/L乙酸铵，有机相采用甲醇，电离模式为正离子模式，得出的峰形较好，响应较高。以此为基础进行质谱条件优化，优化得出的参数详见表1。

表1 13种着色剂的质谱参数

经过试验，最终选择如下质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI），正离子方式扫描， MRM方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；离子漏斗参数：高压150V，低压60V；毛细管电压：3.5KV；喷嘴电压：0V。

（3）提取溶剂的选择

经预试，酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙、碱性橙2等对照试剂在甲醇中的溶解性较好，可采用甲醇直接提取。

（4）提取方法的考察选择

经过试验比较了超声提取和加热回流等2种提取方法，最终选择超声处理（功率320W，频率40kHz）30分钟进行提取，提取效果更好。

（5）检出限

分别精密量取混合对照品溶液（100ng/ml）5μl、50μl、500μl，分别加试剂空白溶液至1000μl，摇匀，即得检出限溶液1、2、3。将上述对照品溶液按上述色谱条件分别进样2μl，测定，各成分检出限计算结果如下：

表2 13种着色剂的检出限表

本发明的有益效果：

本发明所述一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，该法操作简便，检测效率高，一次过柱，一次色谱过程，可同步检测13种着色剂，检测成本较低；该法具有操作简便、准确度高、精密度高、稳定性好的优点，可同时检测13种着色剂种的一种或者多种，适用于实验室对于山楂丸的质量控制，检测山楂丸是否经过上述13种着色剂的染色，可批量进行检测，检测效率高。此外，本发明所述方法可以为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。

附图说明

图1是13种着色剂对照品LC-MS／MS TIC图。

图2是13种着色剂对照品LC-MS／MS MRM图，从上往下依次为酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙、碱性橙2。

图3是吉林市鹿王制药股份有限公司样品的13种着色剂LC-MS/MS TIC图。

图4是吉林市鹿王制药股份有限公司样品的13种着色剂LC-MS/MS MRM图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明所述检测方法，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）仪器和试剂

Agilent 1290快速高分离液相色谱系统；Agilent 6490Triple Quad LC/MS/MS液相色谱/质谱联用仪；配电喷雾电离源（ESI）；色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈（100×2.1mm,1.8μm）；甲醇为色谱纯，乙酸铵为色谱纯，水为高纯水。

（2）方法与结果

一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，所述的着色剂为酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙和碱性橙2；其检测方法包括以下步骤：

（1）空白基质溶液的制备：取空白基质样品5g，精密称定，加入甲醇25 ml，超声处理30分钟，冷却，摇匀，过滤；精密吸取滤液1ml，置于10 ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.2μm滤膜，即可得到空白基质溶液，于4℃条件下避光保存；

（2）混合对照品溶液的制备：分别精密称取酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙、碱性橙2对照品适量，加空白基质溶液稀释，制成单种着色剂含量均为1μg/ml的混合溶液，得到混合对照品储备液；精密量取上述混合对照品储备液，加入空白基质溶液稀释，制成单种着色剂含量均为100ng/ml的混合对照品溶液，于4℃条件下避光保存；

（3）样品溶液的制备：取山楂丸样品5g，打碎，精密称定后加入甲醇25ml，超声处理30分钟，冷却，摇匀，过滤；精密吸取滤液1ml，置于10 ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.2μm滤膜，即可得到待测样品溶液，于4℃条件下避光保存；样品溶液的制备与空白基质溶液的制备保持一致；

所述超声处理条件为：功率320W，频率40kHz。

进样量：2μl 。

结合下列案例和附图，对本发明做进一步说明。

按照上述实施例1所述检测方法，对吉林市鹿王制药股份有限公司的52批样品进行检测，检测结果如图3、图4所示；实验结果表明抽取的样品原料未添加有该13种着色剂。

Claims

1.一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，其特征在于：其中所述的着色剂为酸性红6B、诱惑红、罗丹明B、橙黄G、碱性橙22、金橙IV、酸性黄36、新品红、金莲橙、金橙II、碱性橙21、甲基橙和碱性橙2；其检测方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，其特征在于：所述超声处理条件为：功率320W，频率40kHz。

3.根据权利要求1所述山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，其特征在于：所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：Eclipse Plus C₁₈柱（1.8µm，2.1 mm×100mm）；柱温35℃；流速0.3ml/min；以10mmol/L乙酸铵为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；进样量：2μl 。

4.根据权利要求1所述一种山楂丸中13种着色剂同步检测的方法，其特征在于：所述质谱条件为：采用电喷雾电离源（ESI），正离子方式扫描， MRM方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；离子漏斗参数：高压150V，低压60V；毛细管电压：3.5KV；喷嘴电压：0V。