CN113358785A - 基于hplc-dad结合uplc-ms/ms法检测18种中药非法染色色素的方法 - Google Patents

基于hplc-dad结合uplc-ms/ms法检测18种中药非法染色色素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于HPLC‑DAD结合UPLC‑MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法，包括如下步骤：S1.HPLC‑DAD筛查；S2.UPLC‑MS/MS确证。本发明利用HPLC‑DAD结合UPLC‑MS/MS法实现18种常见中药非法染色色素的检测，可全面替代现行红花、蒲黄、黄柏、黄芩、人工牛黄、五味子和血竭7种中药材(饮片)的补充检验方法，将七合一，且具有更好的专属性、灵敏度及准确度。此外，18种色素基本包含了现行非法染色补充检验标准中涉及的黄、红色系色素，能更好的应对中药非法染色的动态变化，具有较好的适应性和适用范围。

Description

基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素 的方法
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，具体涉及基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法。
背景技术
现行非法染色补充检验方法多以70％乙醇(乙醇/甲醇)等作为提取溶剂，采用TLC初筛、HPLC-DAD确证的筛查模式，针对的多为中药材(饮片)中1种或少数几种色素，检测种类远低于市面上可能的非法染色剂种类，在日常监督检验中易造成漏检。此外，虽然TLC筛查及HPLC-DAD确证模式在中药非法染色检测中应用较为普遍，但其分辨力及检测灵敏度有一定局限性，也不适用于高通量筛查。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法，有效解决现有非法染色补充检验方法存在的检测种类较少，分辨力和检测灵敏度较差，以及不适用于高通量筛查等问题中的至少一个。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法，包括如下步骤：
S1.HPLC-DAD筛查：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到对照品HPLC色谱图与供试品HPLC色谱图；
3)将供试品HPLC色谱图与对照品HPLC色谱图进行比对，得到供试品中所含色素；
S2.UPLC-MS/MS确证：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行超高效液相色谱-串联质谱检测；
3)对检测结果进行分析，确定各色素结构及各色素相对保留时间，得到对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
4)将供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图进行比对，确证供试品中所含色素。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，S1中，供试品溶液的配制过程为：向研细后的药材或中成药中加入10％乙醇(检查水溶性色素S组)或70％乙醇溶液(检查偏脂溶性色素Z组)，超声处理30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得；其中，供试品与乙醇的质量体积比(g/ml)为1:10。
进一步，S1中，S组混合对照品溶液的配制过程为：取10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各20μg的混合溶液；
Z组混合对照品溶液的配制过程为：取8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅲ各10μg,含苏丹红Ⅳ20μg，含808猩红25μg的混合溶液。
进一步，S1中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：S组采用甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，Z组采用乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；流速：0.9-1.1ml/min；柱温：25℃-35℃；进样体积：5μl(S组)、10μl(Z组)；检测波长：430nm(柠檬黄、酸性黄36、金胺O、碱性橙2)、510nm(新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、酸性红73、金橙Ⅱ、赤藓红、罗丹明B、苏丹红Ⅰ、808猩红、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ)。
进一步，S1中，色谱检测条件：流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
进一步，S1中，S组的梯度洗脱程序为：0-8min，8％→12％A；8-20min，12％→55％A；20-28min，55％→70％A；28-30min，70％→8％A；30-35min，8％A；Z组的梯度洗脱程序为：0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-43min，90％→92％A；43-45min，92→20％A；45-47min，20％A。
进一步，S2中，供试品溶液的配制过程为：取S1中的供试品溶液稀释5倍即得。
进一步，S2中，S组混合对照品溶液的配制过程为：取10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各2μg的混合溶液；
Z组混合对照品溶液的配制过程为：取8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和808猩红各0.5μg的混合溶液。
进一步，S2中，色谱检测条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：S组采用甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，Z组采用乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；流速：0.2ml/min；柱温：35℃；进样体积：2μl；
质谱检测条件为：离子源：ESI；扫描类型：多反应监测(MRM)；极性：负离子(S组)或正离子(Z组)；毛细管电压：3.0kV(S组)或5.0kV(Z组)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度(TEM)：500℃。
进一步，S2中，S组的梯度洗脱程序为：0-8min，8％→12％A；8-20min，12％→55％A；20-28min，55％→70％A；28-30min，70％→8％A；30-35min，8％A；Z组的梯度洗脱程序为：0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-30min，90％→92％A；30-32min，92→20％A；32-35min，20％A。
本发明的有益效果是：本发明利用HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法实现18种常见中药非法染色色素的检测，可全面替代现行红花、蒲黄、黄柏、黄芩、人工牛黄、五味子和血竭7种中药材(饮片)的补充检验方法，将七合一，且具有更好的专属性、灵敏度及准确度。此外，18种色素基本包含了现行非法染色补充检验标准中涉及的黄、红色系色素，能更好的应对中药非法染色的动态变化，具有较好的适应性和适用范围。
附图说明
图1为本发明实施例1中专属性试验HPLC色谱图；
其中，图1A为水溶性色素S组专属性试验HPLC色谱图，图中：S.混合对照品，A.阴性红花，B.阴性蒲黄，C.阴性西红花，D.阴性人工牛黄，E.阴性五味子，F.阴性乌梅；1.柠檬黄，2.新红，3.苋菜红，4.胭脂红，5.日落红，6.诱惑红，7.偶氮玉红，8.酸性红73,9.金橙Ⅱ，10.赤藓红；
图1B为偏脂溶性色素Z组专属性试验HPLC色谱图，图中：S.混合对照品，B.阴性蒲黄，D.阴性人工牛黄，G.阴性血竭，H.阴性大活络胶囊，I.阴性关黄柏，J.阴性黄柏，K.阴性黄芩；1.酸性黄36，2.金胺O，3.罗丹明B，4.碱性橙2,5.苏丹红Ⅰ，6.808猩红，7.苏丹红Ⅲ，8.苏丹红Ⅳ。
图2为本发明实施例1中染色筛查阳性检出样品HPLC色谱图；
其中，图2A为水溶性色素S组阳性检出样品HPLC色谱图，图中：S.混合对照品，HH1.红花(批号180101)，HH2.红花(批号20190321)，HH3.红花(批号190701)，PH.蒲黄(批号190301)；1.柠檬黄，2.新红，3.苋菜红，4.胭脂红，5.日落红，6.诱惑红，7.偶氮玉红，8.酸性红73,9.金橙Ⅱ，10.赤藓红；
图2B为偏脂溶性色素Z组阳性检出样品HPLC色谱图，图中：S.混合对照品，GHB1.关黄柏(批号180501)，GHB2.关黄柏(批号B706281-01)，PH1.蒲黄(批号190617)，PH2.蒲黄炭(批号181101)；1.酸性黄36，2.金胺O，3.罗丹明B，4.碱性橙2,5.苏丹红Ⅰ，6.808猩红，7.苏丹红Ⅲ，8.苏丹红Ⅳ。
图3为本发明实施例1中S组10种水溶性色素UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
其中，图3A为混合对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
图3B为阳性检出样品典型UPLC-MS/MS提取离子流色谱图。
图4为本发明实施例1中Z组8种偏脂溶性色素UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
其中，图4A为混合对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
图4B为阳性检出样品典型UPLC-MS/MS提取离子流色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
由于18种色素在极性上存在较大差异，在同一个流动相下分离效果无法达到兼顾，因此根据色素极性差异，将其分为水溶性色素S组和偏脂溶性色素Z组。
即S组(10种水溶性色素)：柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红；
Z组(8种偏脂溶性色素)：酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ、808猩红、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ。
实施例1
本实施例所设计的基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法，包括如下步骤：
S1.HPLC-DAD筛查：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到对照品HPLC色谱图与供试品HPLC色谱图；
3)将供试品HPLC色谱图与对照品HPLC色谱图进行比对，得到供试品中所含色素；
S2.UPLC-MS/MS确证：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行超高效液相色谱-串联质谱检测；
3)对检测结果进行分析，确定各色素结构及各色素相对保留时间，得到对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
4)将供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图进行比对，确证供试品中所含色素。
1.HPLC-DAD筛查中：
1.1色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相：
S组：甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0-8min，8％→12％A；8-20min，12％→55％A；20-28min，55％→70％A；28-30min，70％→8％A；30-35min，8％A)
Z组：乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-43min，90％→92％A；43-45min，92→20％A；45-47min，20％A)
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样体积：5μl(S组)、10μl(Z组)
检测波长：430nm(柠檬黄、酸性黄36、金胺O、碱性橙2)、510nm(新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、酸性红73、金橙Ⅱ、赤藓红、罗丹明B、苏丹红Ⅰ、808猩红、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ)
1.2溶液的制备
1)供试品溶液
分别取10种非法染色高风险药材(饮片)及43批中成药(片剂除去包衣、胶囊剂取内容物)研细，称取2g(大蜜丸加入等量硅藻土，拌匀)，置具塞锥形瓶中，加入10％乙醇(检查水溶性色素S组)或70％乙醇溶液(检查偏脂溶性色素Z组)20ml，超声处理(功率250W，频率40KHz)30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2)对照品溶液
水溶性色素S组：取上述10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各20μg的混合溶液；
偏脂溶性色素Z组：取上述8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅲ各10μg,含苏丹红Ⅳ20μg，含808猩红25μg的混合溶液。
3)阴性供试品溶液
以未检出样品作为阴性供试品溶液。其中，水溶性色素S组：A.阴性红花，B.阴性蒲黄，C.阴性西红花，D.阴性人工牛黄，E.阴性五味子，F.阴性乌梅。偏脂溶性色素Z组：B.阴性蒲黄，D.阴性人工牛黄，G.阴性血竭，H.阴性大活络胶囊，I.阴性关黄柏，J.阴性黄柏，K.阴性黄芩。
4)阴性加标供试品溶液
精密吸取混合对照品溶液1.0ml置2ml量瓶中，加阴性供试品溶液，稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3方法学验证
1)专属性试验：除Z组中黄芩HPLC色谱图在酸性黄36处有干扰外，阴性供试品在与对照品色谱峰保留时间相同处无色谱峰，结果见附图1。
2)检出限：18种色素的方法检出限见下表1。
表1 18种色素的检出限
Figure BDA0003101209930000081
Figure BDA0003101209930000091
3)耐用性：考察不同品牌的色谱柱、流速(1.0±0.1ml/min)、柱温(30℃±5℃)的影响，结果表明，各对照品色谱峰分离度良好，能满足试验要求。
2.UPLC-MS/MS确证中：
2.1液质条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径为2.1mm)
流动相：
S组：甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相，梯度洗脱程序与高效液相色谱法相同
Z组：乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-30min，90％→92％A；30-32min，92→20％A；32-35min，20％A)
流速：0.2ml/min
柱温：35℃
进样体积：2μl
离子源：ESI
扫描类型：多反应监测(MRM)
极性：负离子(S组)或正离子(Z组)
毛细管电压：3.0kV(S组)或5.0kV(Z组)
离子源温度：150℃
脱溶剂温度(TEM)：500℃
监测离子对及质谱参数见下表2
表2 18种色素监测离子对及质谱参数
Figure BDA0003101209930000101
2.2溶液的制备
1)供试品溶液
取高效液相色谱法中的供试品溶液稀释5倍即得。
2)对照品溶液
水溶性色素S组：取上述10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各2μg的混合溶液；
偏脂溶性色素Z组：取上述8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和808猩红各0.5μg的混合溶液，即得。
3.10种非法染色高风险药材(饮片)及43批中成药检测结果为：3批红花不同程度的检出柠檬黄、日落黄、胭脂红及酸性红73,3批蒲黄不同程度的检出柠檬黄、金胺O、罗丹明B，2批关黄柏检出金胺O，43批中成药均未检出上述18种色素。阳性检出样品HPLC色谱图见附图2，UPLC-MS/MS提取离子流色谱图见附图3和4。
本实施例中，水溶性色素S组选用10％乙醇溶液作为提取溶剂，提取效率、色谱峰形更好。
本发明中未对具体技术做出描述的均为现有技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于HPLC-DAD结合UPLC-MS/MS法检测18种中药非法染色色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.HPLC-DAD筛查：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到对照品HPLC色谱图与供试品HPLC色谱图；
3)将供试品HPLC色谱图与对照品HPLC色谱图进行比对，得到供试品中所含色素；
S2.UPLC-MS/MS确证：
1)分别配制10种水溶性色素(S组)的混合对照品溶液、8种偏脂溶性色素(Z组)的混合对照品溶液以及供试品溶液；
2)分别对S组混合对照品溶液、Z组混合对照品溶液及供试品溶液进行超高效液相色谱-串联质谱检测；
3)对检测结果进行分析，确定各色素结构及各色素相对保留时间，得到对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图；
4)将供试品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图与对照品UPLC-MS/MS提取离子流色谱图进行比对，确证供试品中所含色素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，供试品溶液的配制过程为：向研细后的药材或中成药中加入10％乙醇(检查水溶性色素S组)或70％乙醇溶液(检查偏脂溶性色素Z组)，超声处理30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得；其中，供试品与乙醇的质量体积比(g/ml)为1:10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，S组混合对照品溶液的配制过程为：取10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各20μg的混合溶液；
Z组混合对照品溶液的配制过程为：取8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅲ各10μg,含苏丹红Ⅳ20μg，含808猩红25μg的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：S组采用甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，Z组采用乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；流速：0.9-1.1ml/min；柱温：25℃-35℃；进样体积：5μl(S组)、10μl(Z组)；检测波长：430nm(柠檬黄、酸性黄36、金胺O、碱性橙2)、510nm(新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、酸性红73、金橙Ⅱ、赤藓红、罗丹明B、苏丹红Ⅰ、808猩红、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中，色谱检测条件：流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中，S组的梯度洗脱程序为：0-8min，8％→12％A；8-20min，12％→55％A；20-28min，55％→70％A；28-30min，70％→8％A；30-35min，8％A；Z组的梯度洗脱程序为：0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-43min，90％→92％A；43-45min，92→20％A；45-47min，20％A。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中，供试品溶液的配制过程为：取S1中的供试品溶液稀释5倍即得。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中，S组混合对照品溶液的配制过程为：取10种水溶性色素对照品适量，加10％乙醇溶液，制成每1ml含柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红(酸性红)、酸性红73、金橙Ⅱ和赤藓红色素各2μg的混合溶液；
Z组混合对照品溶液的配制过程为：取8种偏脂溶性色素对照品适量，加70％乙醇溶液，制成每1ml含酸性黄36、金胺O、罗丹明B、碱性橙2、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和808猩红各0.5μg的混合溶液。
9.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，S2中，色谱检测条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：S组采用甲醇(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，Z组采用乙腈(A)-0.02mol/L乙酸铵溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；流速：0.2ml/min；柱温：35℃；进样体积：2μl；
质谱检测条件为：离子源：ESI；扫描类型：多反应监测(MRM)；极性：负离子(S组)或正离子(Z组)；毛细管电压：3.0kV(S组)或5.0kV(Z组)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度(TEM)：500℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，S2中，S组的梯度洗脱程序为：0-8min，8％→12％A；8-20min，12％→55％A；20-28min，55％→70％A；28-30min，70％→8％A；30-35min，8％A；Z组的梯度洗脱程序为：0-8min，20％→60％A；8-15min，60％A；15-17min，60％→90％A；17-30min，90％→92％A；30-32min，92→20％A；32-35min，20％A。
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CN114062546A (zh) * 2021-11-15 2022-02-18 巩长芹 一种同时筛查舒筋活血片中8种非法染色剂的方法

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