CN110672771A - 一种再造烟叶中的11种色素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟用再造烟叶中11种色素的检测方法，包括如下步骤：1)采用双三元高效液相色谱和高分辨质谱建立11种色素的高分辨质谱库信息，高分辨质谱数据库信息包括色素名称、保留时间、[M+H]⁺及[M‑2H]^2‑离子精确质量数、特征碎片离子精确质量数；2)待测烟用再造烟叶前处理：待测烟用再造烟叶经溶剂提取获得待测液。本发明具有操作简便、检测快速、灵敏度高的优点，可应用于卷烟中再造烟叶的日常检测。

Description

一种再造烟叶中的11种色素的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种再造烟叶中的11种色素的检测方法。

背景技术

色素又称着色剂，按其来源可分为天然色素和人工合成色素两大类。天然色素从动植物中提取而来，稳定性较差，且价格昂贵。人工色素是指用人工化学合成方法所制得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成的。按结构区分，人工色素可分类偶氮类、氧蒽类和二苯甲烷类等；按溶解性区分，可分为脂溶性和水溶性色素。大量研究报告表明，几乎所有的人工合成色素不仅不能为人体提供营养，而且某些人工色素会危害人体健康，导致生育力下降、畸胎等，甚至某些人工色素具有致癌的潜在风险。列入国家卫生使用标准(GB 2760-2014)的人工色素仅包括以下9种：胭脂红、苋菜红、诱惑红、酸性红、赤藓红、日落黄、柠檬黄、靛蓝及亮蓝，且均为限量使用。

再造烟叶主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。可作为烟草制品原料代替天然烟叶，现已广泛用于国内卷烟产品中，其安全性受到烟草行业的高度重视。柠檬黄、日落黄、胭脂红、亮蓝、诱惑红、酸性红、苋菜红、赤藓红、姜黄素、去甲氧基姜黄素、去二甲氧基姜黄素等11种色素未列入烟草企业标准YQ44-2014《再造烟叶许可使用物质名单》。因技术上无法避免着色剂作为污染物带入再造烟叶中，烟草行业对这11种着色剂最大残留限量作了要求。所以，准确测定再造烟叶中的色素含量对于卷烟产品的质量安全控制具有重要的意义。

色素的检测方法包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、分光光度法、薄层色谱法、示波极谱法等。液相作为传统的分析方法，是目前检测色素的最常用的方法，广泛应用于饮品、食品、化妆品等样品中的着色剂检测。对于烟草行业，烟草企业标准YQ/T70-2015中采用液相色谱法配合紫外检测器对再造烟叶中的8种合成着色剂进行测定。然而，液相色谱法存在一定的局限性，样品的复杂基质会对多种混合色素的分析产生干扰，紫外检测器仅仅依靠保留时间进行定性，容易出现假阳性或定量不准确的结果。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种再造烟叶中的11种色素的检测方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。

本发明提供一种烟用再造烟叶中11种色素的检测方法，包括如下步骤：

1)采用双三元高效液相色谱和高分辨质谱建立11种色素的高分辨质谱库信息，高分辨质谱数据库信息包括色素名称、保留时间、[M+H]⁺及[M-2H]^2-离子精确质量数、特征碎片离子精确质量数；

2)待测烟用再造烟叶前处理：待测烟用再造烟叶经溶剂提取获得待测液；

3)色素的定性筛查：待测液经双三元高效液相色谱和高分辨质谱分析检测获得样品数据，依据11种色素的高分辨质谱库信息，从样品数据中提出色素母离子和子离子信息，以色谱峰保留时间及母离子精确质量数为依据，同时辅以特征子离子精确质量数进行定性筛查确证；

4)色素的定量分析：对确证的色素，配制适当浓度的基质配标标准工作溶液，以母离子峰面积与内标峰面积的比及基质溶液中色素含量建立标准工作曲线，对待测烟用再造烟叶中色素进行定量分析。

根据本发明上述技术方案，11种色素包括8种水溶性色素和3种姜黄素；所述8种水溶性色素包括柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红、亮蓝和赤藓红；所述3种姜黄素包括去二甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素。

根据本发明上述技术方案，待测烟用再造烟叶的大小可以根据实际需要进行制备，如采用剪裁等方式使得其成为适当大小，待测烟用再造烟叶的面积不大于0.5cm²。

根据本发明上述技术方案，步骤2)中，包括如下特征中的一种或多种：

所述溶剂为甲醇水溶液；

提取时，加入内标液；

提取时，溶剂的使用量与待测烟用再造烟叶的加入量的比为(10～20)mL/g；

提取在室温下进行；

提取时，采用超声萃取。

本申请中，所述内标液的浓度可以根据具体情况确定，本发明中为了进一步确保定性定量分析的快速和准确性，内标液的浓度为10μg/mL。

超声萃取的时间可以根据具体需要进行设定。根据本发明中具体的情况，超声萃取的时间为5～15min。

根据本发明上述技术方案，为了进一步使得测量能够顺利进行，可以对所述待测液进行过滤处理。优选地，本发明中采用不超过0.25μm的滤膜对上清液进行过滤处理。

根据本发明上述技术方案，包括如下特征中的一种或多种：

所述内标液为氘代水杨酸的甲醇溶液；

内标液的加入量与待测烟用再造烟叶质量的比为(100～200)μL/g；

所述甲醇水溶液中甲醇与水的质量比为1:(0.5～1.5)。

根据本发明上述技术方案，双三元高效液相色谱的其中一个三元泵为分析泵，用于常规色谱分析；另一个三元泵为补偿泵，用于调节经色谱柱后馏分的pH值。本申请中采用双三元高效液相色谱进行快速分离，并采用双三元泵，从而提高质谱检测的灵敏度。

根据本发明上述技术方案，基质配标标准工作溶液是指混合标准储备液A和/或混合标准储备液B加入内标液后采用基质溶液定容形成的混合液；混合标准储备液A为含有8种水溶性色素的水溶液；混合标准储备液B为含有3种姜黄素的甲醇溶液；基质溶液为不含有11种色素的烟用再造烟叶样品前处理后获得的不添加内标的溶液。

本申请中，混合标准储备液A为含有8种水溶性色素的水溶液，8种水溶性色素总浓度为10μg/mL。

本申请中，混合标准储备液B为含有3种姜黄素的甲醇溶液，3种姜黄素的总浓度为10μg/mL。

根据本发明上述技术方案，基质配标标准工作溶液中11种色素的浓度均包含50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL六种。

根据本发明上述技术方案，所述不含有11种色素的烟用再造烟叶样品的前处理方法与待测烟用再造烟叶的前处理方法相同。

根据本发明上述技术方案，从样品数据中提出色素的母离子和离子碎片信息时，色谱峰保留时间的偏差不超过±0.1分钟，母离子精确质量数的误差不超过±5ppm，特征子离子精确质量数的误差不超过±20ppm。

根据本发明上述技术方案，双三元高效液相色谱中的参数条件包括如下中的一种或多种：

色谱柱柱长150mm；

内径为2.1mm；

粒径3μm；

柱温为20℃；

当测试8种水溶性色素时，流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液；

当测试3种姜黄素时，流动相A为0.1％甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

流动相梯度为0％B,0-0.5min；0-95％B,0.5-9.5min；95％B,9.5-13min；95-0％B,13-13.01min；

进样量为5μL；

流速为0.3mL/min；

当测试8种水溶性色素时，启动补偿泵，补偿泵流动相为1wt％氨水；

质谱负离子模式时开启补偿泵，流速为0.1mL/min。

根据本发明上述技术方案，高分辨质谱工作条件包括如下特征中的一种或多种：

采用电喷雾离子源；

测试8种水溶性色素为负离子模式；

测试3种姜黄素为正离子模式；

鞘气压力35psi；

辅助加热器流速15arb；

喷雾电压3.5kV；

毛细管温度300℃；

辅助加热气温度350℃；

S-Lens射频水平55；

质谱检测采用交替的全扫描/源内碎裂全扫描的方式。

根据本发明上述技术方案，包括如下特征中的一种或多种：

全扫描范围为60-900Da，针对核质比为200的离子，分辨率70000，自动增益控制值为5e⁵；

源内碎裂全扫描范围60-900Da，针对核质比为200的离子，分辨率70000，源内碎裂能量为80eV，自动增益控制值为2e⁵。

本申请中上述技术方案，采用液相色谱和高分辨质谱联用技术能够有效消除基质干扰，定性能力强，灵敏度高，能够对样品中的多种色素进行快速准确的测定。

本申请上述技术方案中，色素的定性以母离子精确质量数及保留时间为依据，辅以子离子的精确质量数为确证，具有极强的抗干扰能力，避免检测结果的假阳性。色素的定量采用基质配标内标法，操作简便，定量准确。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：

本方法采用交替的全扫描/源内碎裂全扫描的质谱采集模式，能获得全部色素的母离子及其碎片离子信息，以母离子的精确质量数、色谱保留时间对化合物进行定性，以碎片子离子精确质量数为化合物鉴定进行确证，定性能力更强，避免结果假阳性。

采用双三元高效液相色谱进行分离，具有分析速度快、分离效率高、适用范围广等优点可节省有机溶剂，降低分析成本。由于人工色素化学性质差异，质谱检测时需同时采用正/负离子的采集模式，但色谱流动相pH值对质谱相应影响大，因此常规方法使用流动相不同的两种方法分别检测正/负离子分别检测。本发明采用双三元高效液相色谱，一个三元泵为分析泵，一个三元泵为补偿泵调剂溶剂pH，从而满足所有人工色素使用同一体系检测的要求。

本发明与现有技术相比，色素筛查种类可更多，定性能力更强，其定量分析能力完全满足烟用再造烟叶中人工色素的限量检测要求，适用于卷烟中再造烟叶日常检测。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

以下实施例使用的试剂及仪器如下：

1.试剂：8种水溶性色素购自美国AccuStandard公司，3种姜黄素购自成都曼思特生物科技有限公司，内标(氘代水杨酸)，购自加拿大C/D/N ISOTopes公司；甲醇、乙腈、乙酸胺、甲酸均为色谱级试剂。

2.仪器：双三元高效液相色谱为美国Thermo Fisher公司的U3000；色谱柱为美国Waters公司的Atlantes T3色谱柱(柱长150mm×内径2.1mm，粒径3μm)；质谱为美国ThermoFisher公司产品(Q-Exactive)；电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司产品；超声波仪，瑞士SONO公司产品；离心机，Eppfendof公司。

具体包括以下步骤：

1)建立11种色素的高分辨质谱数据库

为建立11种色素的高分辨质谱库，以100ng/mL单一色素标样进行检测，重复检测5次。各色素保留时间、母离子及子离子精确质量数取5次检测结果平均值。高分辨质谱数据库信息包括色素名称、保留时间、[M+H]⁺及[M-2H]^2-离子精确质量数、特征碎片离子精确质量数等信息，详见下表。

表1 11种色素的高分辨质谱库

2)待测烟用再造烟叶的前处理

准确称取0.2g再造烟叶样品，精确到0.1mg，于50mL离心管中，加入250μL内标溶液，加入25mL甲醇水(1:1)，室温下超声萃取10min，取出后静置5min，取适量上清液过0.22μm PTFE滤膜后，待检测分析。

内标液(1000μg/mL)：称取0.01g氘代水杨酸，精确至0.0001g，于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。内标工作液(10μg/mL)移取1mL前述溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

3)待测烟用再造烟叶中色素的筛查

步骤2)中的待测液经高效液相色谱和高分辨质谱分析检测，依据色素高分辨质谱库信息，从样品数据中提出色素母离子和子离子信息，以色谱峰保留时间(偏差不超过±0.1min)及母离子精确质量数(误差不超过±5ppm)为依据，同时辅以特征子离子精确质量数(误差不超过±20ppm)进行筛查。

4.)待测烟用再造烟叶中色素的定量

对确证的色素，配制适当浓度的基质配标标准工作溶液，以母离子峰面积与内标峰面积的比及基质溶液中色素含量建立标准工作曲线，对待测烟用再造烟叶中色素准确定量。

基质配标标准工作溶液的配制方法如下：

8种水溶性色素的单一标准储备液(1000μg/mL)：分别称取0.01g每种色素标准物质，精确至0.0001g，至不同的10mL容量瓶中，用水稀释定容。混合标准储备液A(10μg/mL)：移取各农药单一标准储备液各1mL于100mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度。

3种姜黄素的单一标准储备液(1000μg/mL)：分别称取0.01g每种色素标准物质，精确至0.0001g，至不同的10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容。混合标准储备液B(10μg/mL)：移取各农药单一标准储备液各1mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。

基质溶液：以不含有11种色素的烟用再造烟叶样品为基质，采用与待测烟用再造烟叶相同的方法处理并不添加内标后，得到基质溶液。

基质配标工作溶液：分别移取混合标准储备液A和B各50μL、各100μL、各200μL、各300μL、各500μL、各1000μL到不同10mL容量瓶中，每个容量瓶移入100μL内标工作液，用基质溶液定容，得到基质配标工作溶液，其中11种色素的浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

应用双三元高效液相色谱-高分辨质谱联用技术，对两个再造烟叶样品中的色素进行筛查及定量检测。

色素筛查依照高分辨质谱数据库信息，在实验数据提取母离子的精确质量数，比对色谱峰保留时间及碎片子离子信息，对未知化合物进行定性，共计筛查出色素3种。

对上述3种筛查出的色素建立基质配标的标准工作曲线，详细结果见表2。标准曲线线性相关系数均大于0.99。

表2筛查出的3种色素的线性范围及线性相关系数(mg/kg)

通过标准曲线的自动计算，对3种筛查出色素进行定量，结果如表3所示。

表3HPLC-HRMS方法筛查后的色素定量检测结果(mg/kg)

表4负离子模式下补偿泵的影响

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种烟用再造烟叶中11种色素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用双三元高效液相色谱和高分辨质谱建立11种色素的高分辨质谱库信息，高分辨质谱数据库信息包括色素名称、保留时间、[M+H]⁺及[M-2H]^2-离子精确质量数、特征碎片离子精确质量数；

2)待测烟用再造烟叶前处理：待测烟用再造烟叶经溶剂提取获得待测液；

3)色素的定性筛查：待测液经双三元高效液相色谱和高分辨质谱分析检测获得样品数据，依据11种色素的高分辨质谱库信息，从样品数据中提出色素母离子和子离子信息，以色谱峰保留时间及母离子精确质量数为依据，同时辅以特征子离子精确质量数进行定性筛查确证；

4)色素的定量分析：对确证的色素，配制适当浓度的基质配标标准工作溶液，以母离子峰面积与内标峰面积的比及基质溶液中色素含量建立标准工作曲线，对待测烟用再造烟叶中色素进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，11种色素包括8种水溶性色素和3种姜黄素；所述8种水溶性色素包括柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红、亮蓝和赤藓红；所述3种姜黄素包括去二甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，包括如下特征中的一种或多种：

所述溶剂为甲醇水溶液；

提取时，加入内标液；

提取时，溶剂的使用量与待测烟用再造烟叶的加入量的比为(10～20)mL/g；

提取在室温下进行；

提取时，采用超声萃取。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，包括如下特征中的一种或多种：

所述内标液为氘代水杨酸的甲醇溶液；

内标液的加入量与待测烟用再造烟叶质量的比为(100～200)μL/g；

所述甲醇水溶液中甲醇与水的质量比为1:(0.5～1.5)。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，双三元高效液相色谱的其中一个三元泵为分析泵，用于常规色谱分析；另一个三元泵为补偿泵，用于调节经色谱柱后馏分的pH值。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，基质配标标准工作溶液是指混合标准储备液A和/或混合标准储备液B加入内标液后采用基质溶液定容形成的混合液；混合标准储备液A为含有8种水溶性色素的水溶液；混合标准储备液B为含有3种姜黄素的甲醇溶液；基质溶液为不含有11种色素的烟用再造烟叶样品前处理后获得的不添加内标的溶液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，包括如下特征中的一种或多种：

基质配标标准工作溶液中11种色素的浓度均包含50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL六种；

所述不含有11种色素的烟用再造烟叶样品的前处理方法与待测烟用再造烟叶的前处理方法相同；

混合标准储备液A为含有8种水溶性色素的水溶液，8种水溶性色素总浓度为10μg/mL；

混合标准储备液B为含有3种姜黄素的甲醇溶液，3种姜黄素的总浓度为10μg/mL。

8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，双三元高效液相色谱中的参数条件包括如下中的一种或多种：

色谱柱柱长150mm；

内径为2.1mm；

粒径3μm；

柱温为20℃；

当测试8种水溶性色素时，流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液；

当测试3种姜黄素时，流动相A为0.1wt％甲酸水溶液；

流动相B为乙腈；

流动相梯度为0％B,0-0.5min；0-95％B,0.5-9.5min；95％B,9.5-13min；95-0％B,13-13.01min；

进样量为5μL；

流速为0.3mL/min；

当测试8种水溶性色素时，启动补偿泵，补偿泵流动相为1wt％氨水；

质谱负离子模式时开启补偿泵，流速为0.1mL/min。

9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，高分辨质谱工作条件包括如下特征中的一种或多种：

采用电喷雾离子源；

测试8种水溶性色素为负离子模式；

测试3种姜黄素为正离子模式；

鞘气压力35psi；

辅助加热器流速15arb；

喷雾电压3.5kV；

毛细管温度300℃；

辅助加热气温度350℃；

S-Lens射频水平55；

质谱检测采用交替的全扫描/源内碎裂全扫描的方式。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括如下特征中的一种或多种：

全扫描范围为60-900Da，针对核质比为200的离子分辨率70000，自动增益控制值为5e⁵；

源内碎裂全扫描范围60-900Da，针对核质比为200的离子分辨率70000，源内碎裂能量为80eV，自动增益控制值为2e⁵。