CN103235059B

CN103235059B - 一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法及应用

Info

Publication number: CN103235059B
Application number: CN201310159357.XA
Authority: CN
Inventors: 徐春祥; 林慧; 颜春荣; 张征; 朱晓军
Original assignee: Jiangsu Supervision and Inspection Institute for Product Quality
Current assignee: Jiangsu Supervision and Inspection Institute for Product Quality
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-05-03
Also published as: CN103235059A

Abstract

本发明目的在于提供一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法及应用，本发明所述方法包括如下步骤：1）着色剂一级质谱数据库和二级质谱数据的建立；2）所建立质谱数据库中性质相近着色剂的分离。本发明从而为执法提供技术鉴定依据。通过该质谱谱图数据库，达到快速筛查未知违禁添加着色剂的目的。本发明可以有利于加强对市场食品检测，为切实的保护人民生命安全做到防患于未然。

Description

一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法及应用

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法及应用。

背景技术

食品中的着色剂原指食用色素，即是使食品直接着色，以改善食品感官色泽的呈色物质。现在常用的允许添加的食品色素包括两类：食用天然色素与食用合成色素。食用天然色素来自天然物，大多是可食资源。主要是由植物组织中提取而来，但有些也自动物和微生物的一些色素。天然色素安全性高且色调柔和自然，很多还具有较高的营养价值和药理作用，有利于人类的健康。随着人们保健意识的提高，人们崇尚自然的风气日益增强，而天然色素作为一类天然食品添加剂在食品工业越来越受到重视。即使在有众多可食用色素和天然色素可使用选择的情况下，然而某些工业染料却因其价格低廉、着色力强、稳定性好等优点还会一次又一次流入食品生产线，危害着人民生命健康安全。食用合成色素主要指用人工化学合成方法所制得的有机色素。

国内外对合成色素均有严格的安全要求。经卫生部批准允许使用的合成色素必须按照质量和卫生标准规范生产，且产品经检验合格后方可使用。必要时，还要遵照GB 2760-2011规定的使用范围和最大使用量使用。我国批准允许使用的合成色素共有16种（合成色素及其铝色淀计为1种，其中β-胡萝卜素和番茄红素为我国合成色素中仅有的两种油溶性天然等同色素），包括：苋菜红、胭脂红、新红、诱惑红、酸性红、柠檬黄、日落黄、赤藓红、合成番茄红素、喹啉黄、合成β-胡萝卜素、靛蓝、亮蓝、叶绿素铜钠盐、二氧化钛以及氧化铁黑。大量的研究报告指出，几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，甚至某些合成色素还会危害人体健康。我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制。但事实上，在巨大的经济利益的驱使下，我国食品中色素的超标、超范围使用现象屡禁不止。更有甚者，把工业染料等作为食用色素添加到食品中去。同时，由于染料品种很多，不少染料很难以其化学结构成合成方法的共同性进行分类，因此化学结构分类只是便于对结构与性能的研究。

例如，2003年沸沸扬扬的“苏丹红”风暴引起了全世界对色素安全的关注。2005年质检总局又查出不法分子用工业颜料炒出“铅铬绿茶”。还有加上媒体不断曝光的豆腐中掺杂致癌性“王金黄”、黑墨汁染出毒木耳、酸性橙染色熟食制品、酸性罗丹明B染色美容虾米、上海染色馒头、火锅底料中添加罗丹明B等。这些均给食品企业和市场造成了较大恐慌。自2008年至今，中国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组已陆续发布了6批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》。其中可能违法添加的非食用物质名单中有7种常见工业染料，分别是碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、苏丹红、玫瑰红B、美术绿、孔雀石绿。工业染料如此盛行，主要原因是价格便宜、着色强、稳定性强，并且不易检出。而这些工业染料通常用于皮毛制品、纤维制品、陶瓷制品染色，具有高毒、高残留及“三致”致畸、致癌、致突变等副作用。

譬如刚果红，化学名为：3,3'-[[1,1'-联苯]-4,4'-基双(偶氮)]双(4-氨基萘-1-磺酸)二钠，分子式为C₃₂H₂₂N₆Na₂O₆S₂，C.I. 22120，结构式如下。该物又名直接红28、直接大红、棉红、直接朱红，属于联苯胺为母体的红色偶氮染料，水溶性染料，易溶于乙醇。同时刚果红与纤维素纤维间有极强吸附力，目前刚果红一般用于临床诊断淀粉样病变、生物染色剂及酸碱指示剂等。水溶液中的刚果红可被光催化降解。刚果红可与机体蛋白结合，为可疑致癌物与诱变剂。该物被人体吸收后，在人体的正常代谢所发生的生化反应条件下，可能发生还原反应使偶氮基断裂，重新生成致癌芳香胺，并经过活化作用改变人体DNA的结构与功能，引起人体病变和诱发癌症。基于刚果红的毒性作用，纺织业已禁刚果红已久，同时它被很多国家列为食品中禁用着色剂。目前，文献报道刚果红的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法串联单四极杆质谱法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱法。大部分文献检测方法是针对环境中刚果红的测定，而关于食品中的刚果红测定仅有凌睿等报道的运用高效液相色谱法串联三重四极杆质谱测定肉制品中的刚果红。但是其检出限较高，不适用于微量刚果红分析，并且三重四极杆质谱仪分辨率远低于飞行时间质谱，易发生假阳性事件。

目前我国允许添加的食用着色剂（包括天然色素和人工合成色素）有近100种，而现有标准方法能够检测的食用色素只有10多种，还有一定数量的色素至今无检测方法。同时，还存在可能会添加到食品中的工业染料（据初步统计，常见的工业染料有近2000种）的现象，技术机构难以提供一一应对众多着色剂品种的检测方法。随着查处力度的加强，造假者的手段也不断变化，而对同类违禁添加物质的检测方法却落后于造假者。因此，有关执法部门往往是接到举报或相关信息后方能查处，且查处的依据仅仅是现场的举证。对于没有被举报的而流入到市场的产品，相关部门则无能为力。甚至对有怀疑的产品，检测机构也难以从技术上将其鉴别出来，甚至根本无法检测。这导致食品监管中因缺乏依据而不能处理的现象时有发生。尽快解决我国食品中违禁添加或超量、超范围色素等添加物质的问题已成为现阶段食品安全问题的重中之重。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法及应用，从而为执法提供技术鉴定依据。本发明以食品中允许添加的着色剂和潜在违禁添加的工业染料为主要研究对象，辅助采用快速前处理技术对含不同类型着色剂的样品进行净化，采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等高性能检测设备，利用色谱的高分离能力以及现代质谱的高分辨率，建立一种食品中违禁着色剂质谱数据库，通过该质谱谱图数据库，达到快速筛查未知违禁添加着色剂的目的。本发明可以有利于加强对市场食品检测，为切实的保护人民生命安全做到防患于未然。

基于本课题目的，本发明采取的技术方案为：一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，包括如下步骤：

1）着色剂一级质谱数据库和二级质谱数据的建立；

2）所建立质谱数据库中性质相近着色剂的分离。

步骤1）中所述着色剂一级质谱数据库的建立具体如下：首先，将收集到的化合物名称、CAS号、中性分子式、结构式等信息录入到个人化合物数据库（Personal Compound Database and Libarary Mangager，PCDL）软件中的编辑化合物信息条目下；然后，将收集到的建库化合物标准品分别配制成标准储备溶液和工作溶液，调节色谱条件和质谱条件，对标准品的工作溶液在MS模式下采集一级谱图数据；最后，判别与收集中性分子量信息是否一致，若一致则一级质谱数据库建立完毕；若不一致，则需要重新检索，确认信息收集是否正确，标准溶液是否正确，直至信息一致。

所述二级质谱数据库的建立具体如下：首先，在以一级质谱数据确认的情况下，对标准品的工作溶液，调节色谱条件和质谱条件，在Targeted MS/MS模式下给予目标离子10-60V的碰撞能，采集二级谱图数据；其次，将二级质谱信息导入到PCDL软件中的谱图编辑条目下。

所述标准储备溶液和工作溶液的配制为：精确称取各标准品溶于10mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液；分别吸取不同体积各标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的标准工作溶液。

所述色谱条件为：流动相：正离子模式：0.1%甲酸水溶液/乙腈为50/50(V/V)；负离子模式：0.1%乙酸水溶液/乙腈为50/50(V/V)；流速：0.3mL/min；进样量：5 μL；所述质谱条件为：Agilent 6530型四极杆-飞行时间质谱仪采用Jet stream ESI源，喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min。

所述采集条件为：质谱采集模式为MS模式时，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s；质谱采集模式为Target-MS/MS模式时，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s；MS 响应绝对阈值200；MS/MS响应绝对阈值10。

所述步骤2）中性质相近着色剂的分离，具体为：a）根据着色剂分子量进行分组；b) 调节质谱条件和色谱条件，在一级MS模式下采集图谱。

步骤b) 所述的质谱条件，所有化合物均为：Jet stream ESI源；喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为100-600m/z；采集速度为2spectra/s；所述色谱条件根据每组着色剂特性进行优化设定。

所述食品中违禁着色剂质谱数据库在食品违禁着色剂检测中的应用。

通过本发明所述的方法，收集整理了食品中的着色剂以及可能违禁添加的工业染料的标准品或化学品102种，运用液相色谱-飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF）的高分辨率和准确度建立了收集着色剂一级和二级质谱数据库，技术和数量上达到了国际领先水平。同时，本发明利用色谱的高分离能力以及现代质谱的高分辨率分离了8组相近性质着色剂，辅助采用快速前处理技术对含不同类型着色剂的样品进行净化，从而达到快速筛查未知违禁添加着色剂并分离的目的。随着食品中色素检验工作的开展，该发明可以有效地掌握各类食品中色素以及违禁工业染料的使用情况，为食品检测机构提供技术服务和指导，帮助生产企业提高产品质量，并切实为政府职能部门加强食品安全监管提供强有力的技术支撑。

附图说明

图1为甲苯胺蓝O、甲基红和分散黄G的色谱图。

图2为分散红B和阳离子橙G的色谱图。

图3为橙黄Ⅱ和橙黄Ⅰ的色谱图。

图4为苏丹Ⅲ和分散橙B的色谱图。

图5为日落黄和橙黄G的色谱图。

图6为罗丹明6G和罗丹明B的色谱图。

图7为酸性红和玫瑰桃红R的色谱图。

图8为胭脂红、苋菜红和铬天青S的色谱图。

图9为本发明所述数据库用以着色剂检索检测示意图。

图10A为刚果红的一级质谱图。

图10B为未知物的一级质谱图。

图11 A为刚果红的二级质谱图。

图11 B为未知物的二级质谱图。

图12为黑花生米一级质谱数据库检索结果。

图13A为黑花生米二级质谱数据库检索结果。

图13B为黑花生米二级质谱数据库检索图谱。

具体实施方式

实施例1

本实施例选取了表1所示的102种着色剂进行整理分析，按照本发明所述方法，建立了Q-TOF质谱数据库。其中可食用色素16种，食品中违禁工业染料86种，包括酸性染料、碱性染料、直接染料、分散染料、活性染料、媒介染料等。

将收集到的表1所示的着色剂的化合物名称、CAS号、中性分子式、结构式等信息录入到个人化合物数据库（Personal Compound Database and Libarary Mangager，PCDL）软件中的编辑化合物信息条目下；然后，将收集到的建库化合物标准品分别配制成标准储备溶液和工作溶液，调节色谱条件和质谱条件，对标准品的工作溶液在MS模式下采集一级谱图数据；所用仪器、设备和具体的方法如下所述：

仪器与设备：1200RRLC型高效液相色谱仪串联6530型四级杆-飞行时间质谱配有MassHunter色谱工作站及PCDL软件美国Agilent公司；XS-205DU型电子分析天平美国梅特勒-托利多公司。

1）标准储备溶液和工作溶液的配制：精确称取各标准品适量溶于10mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液。分别吸取不同体积各标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的标准工作溶液。

2）色谱条件和质谱条件

流动相：正离子模式：0.1%甲酸水溶液/乙腈(50/50)(V/V)；负离子模式：0.1%乙酸水溶液/乙腈(50/50)(V/V)；流速：0.3mL/min；进样量：5 μL 。

Agilent 6530型四极杆-飞行时间质谱仪采用Jet stream ESI源，喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min。

质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s。质谱采集模式Target-MS/MS模式，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s；碰撞能10-60V。MS 响应绝对阈值200；MS/MS响应绝对阈值10。各化合物具体碰撞能参数详见表2。

表1 质谱数据库化合物品种

3）质谱数据库建立与优化:分为一级质谱数据库和二级质谱数据库。

一级质谱数据库的建立以收集欲收入数据库化合物信息为前提下。首先，将收集到的化合物名称、CAS号、中性分子式、结构式等信息录入到PCDL软件中的编辑化合物信息条目下。然后，将收集到的建库化合物标准品按照步骤1）所述溶液配制方法配制好，按照步骤2）所述的色谱条件和质谱条件，在MS模式下采集一级谱图数据。最后，判别与收集中性分子量信息是否一致，若一致则一级质谱数据库建立完毕；若不一致，则需要重新检索，确认信息收集是否正确，标准溶液是否正确，直至信息一致。最后，各化合物一级质谱详细信息参见表2母离子一列。

二级质谱数据库的建立如下：首先，在以一级质谱数据确认的情况下，对标准品工作溶液按照步骤2）所述的色谱条件和质谱条件，在Targeted MS/MS模式下给予目标离子10-60V的碰撞能，获取二级谱图数据，各化合物二级质谱详细信息参见表2子离子一列。其次，将二级质谱信息导入到PCDL软件中的谱图编辑条目下。最后，所有化合物二级质谱数据录入完毕，则整个着色剂化合物质谱数据库建立完毕。

在建库过程中，预先分析各化合物的结构信息，分析质谱离子源模式，有助于提高建库效率。当某化合物在正负离子模式下均有较强响应时，可同时录入正负模式下的质谱信息。由于部分化合物质谱响应较低，要注意适当提高流动相有机相比例，或提高分析物进样浓度。

表2数据库化合物母离子子离子信息

实施例2

实施例1所述的着色剂质谱数据库建立完毕后，研究发现有部分性质相近着色剂的精确分子量十分接近。为区分这类化合物，本实施例通过采用色谱柱、调整流动相比例和类型对这类化合物进行了色谱分离。首先，根据着色剂分子量进行分组，总结为八组化合物，见表3。

八组化合物分析质谱条件如下：

Jet stream ESI源；喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为100-600m/z；采集速度为2spectra/s。

色谱条件如下：

第一组：甲苯胺蓝O CAS:92-31-9 甲基红 CAS:493-52-7 分散黄G CAS:2832-40-8

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸/乙腈=40/60 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图1，其中甲苯胺蓝O 的 t_R=1.4min 甲基红t_R=4.2min 分散黄t_R=3.7min。

第二组：分散红B CAS:2872-52-8 阳离子橙G CAS:3056-93-7

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸10mM乙酸铵/乙腈=40/60 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图2，其中，分散红 t_R=6.7min 阳离子橙Gt_R=2.4min。

第三组：橙黄Ⅱ CAS:633-96-5 橙黄Ⅰ CAS:523-44-4

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：10mM乙酸铵/乙腈=70/30 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图3，其中，橙黄Ⅱ t_R=7.8min 橙黄Ⅰ t_R=3.2min。

表3 相似分子量化合物信息表

第四组：苏丹Ⅲ CAS:85-86-9 分散橙B CAS:6253-10-7

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸/乙腈=25/75 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见4，其中，苏丹Ⅲ t_R=5.4min 分散橙B t_R=9.3min。

第五组：日落黄 CAS:2783-94-0 橙黄G CAS:1936-15-8

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：10mM乙酸铵/乙腈=90/10 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图5，其中，日落黄t_R=7.9min 橙黄G t_R=10min。

第六组：罗丹明6G CAS:989-38-8 罗丹明B CAS:81-88-9

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸10mM乙酸铵/乙腈=40/60 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图6，其中，罗丹明6G t_R=4.5min 罗丹明B t_R=3.7min。

第七组：酸性红 CAS:3567-69-9 玫瑰桃红R CAS: 5858-33-3

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：10mM乙酸铵/乙腈=75/25 (V/V)；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图7，其中，酸性红t_R=2.6min 玫瑰桃红R t_R=3.6min。

第八组：胭脂红 CAS:2611-82-7 苋菜红 CAS:915-67-3 铬天青S CAS:1667-99-8

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 Narrow-Bore (2.1mm×150mm，5μm)；流动相：10mM乙酸铵：乙腈梯度洗脱，0-5min乙腈10%，5-10min乙腈10%-100%，10-15min乙腈100%；柱温：30℃；流速：0.2mL/min；进样量：5 μL。分离图谱见图8，其中，胭脂红t_R=3.2min 苋菜红t_R=2.2min 铬天青S t_R=12.6min。

实施例1和实施例2采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF）建立102种着色剂化合物的质谱数据库，同时，利用色谱的高分离能力以及现代质谱的高分辨率分离了8组相近分子量化合物，从而建立了完善的质谱数据库，为快速筛查未知违禁添加着色剂并分离提供了有效的依据，如图9所示，为保障食品安全提供有效地技术支持。

实施例3 牛肉中刚果红的定性和定量检测

本实施例探讨的食品中非法添加刚果红的鉴别方法，以期为非法添加物的鉴别定量提供良好的解决方案，为食品质量控制和安全评价提供保证。

仪器与材料：

1200RRLC型高效液相色谱仪串联6530型四级杆-飞行时间质谱，MassHunter色谱工作站及PCDL软件自建有着色剂质谱谱图数据库（美国Agilent公司）；XW-80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；Avanti J-E型离心机（美国贝克曼库尔特公司）；5418R型离心机（艾本德中国有限公司）；XS-205DU型电子分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

牛肉样品为市售样品。

实验步骤：

1）样品制备

称取5g试样，精确至0.01g，于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中；加入10mL甲醇和10mL正己烷，涡旋5min，放入离心机中，以5000r/min 的转速离心5min；取上清液2mL移入2.5mL离心管中，放入高速离心机中，以12000r/min的转速离心2min。移取上清液于进样小瓶中，必要时适当用甲醇稀释。

）色谱条件和质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈ Rapid Resolution HD（2.1mm×50mm，1.8μm），或性能相当者，定性分析时捷两通；流动相：甲醇：水=95：5；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：LC-QTOF：5μL。

定性条件：Agilent 6530型四极杆-飞行时间质谱仪采用Jet stream ESI源，离子模式为负离子模式；喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min。质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为m/z100-700；采集速度为2spectra/s。质谱采集模式Target-MS/MS模式，质谱采集范围为m/z100-700；采集速度为2spectra/s；碰撞能40V、50V、60V。

）定性分析：未知物的定性鉴别是通过与实施例1和实施例2所述的质谱谱图库进行检索匹配实现的。首先取步骤1）中样品前处理溶液，按照步骤2）实验定性条件上机，在MS模式下采集一级质谱谱图数据后，见图10，通过分子特征提取，将提取出的精确质量数导入到PCDL软件中与质谱谱图库中的化合物进行检索匹配，发现未知物与谱图库中的刚果红匹配度较高。然后，在Targeted MS/MS模式下给目标母离子40V、50V、60V的碰撞能，获取二级质谱谱图数据，见图11，导入到PCDL软件中进行二级质谱谱图数据检索匹配，发现未知物依然与质谱谱图库中的刚果红二级质谱谱图数据匹配度较高，分值达到97%以上。因此确认该未知物为刚果红。

同时试验中发现，当配制刚果红标准溶液用水、甲醇、乙腈时，在水和甲醇中的溶解度较好，乙腈中的溶解度较差。因此为了得到较好的离子化效果，选择采用甲醇配制刚果红标准溶液。同时由于刚果红结构的特殊性，其吸附能力较强且在超声波中易降解，所以在样品前处理时采用涡旋提取离心方式净化，而避免采用超声提取膜过滤方式净化。

进行定性试验分析时，在空白溶剂中发现了与刚果红母离子精确质量数m/z325.0537相近的一个质量数m/z325.1877，虽然这两个精确质量数在四极杆飞行时间质谱仪中可以分辨，但是在相对低灵敏度的三重四极杆质谱仪中难以分辨，因此试验中对此未知干扰物进行了二级质谱确证，在40V、50V、60V的碰撞能下刚果红和未知干扰物的二级质谱碎片信息。发现刚果红母离子m/z325.0537的子离子有m/z234.0103、m/z169.0404、m/z152.0378、m/z80.9553；未知干扰物母离子m/z325.1830的子离子有m/z281.2457、m/z197.0267、m/z183.0110、m/z119.0496、m/z79.9577。二级质谱数据库对比的不同，进一步有效区分了未知干扰物和刚果红，可有效避免假阳性结果的发生，使检验结果更加精准。

实施例4 黑花生的真伪鉴别

按照类似实施例3所述的方法对该黑花生米采用了LC-Q-TOF技术进行着色剂数据筛查。运用实施例1-2所述的一级质谱数据库和二级质谱数据库。经过一级质谱库检索后发现，软件给出了四个匹配度较高的着色剂，如图12所示，分别为天青1，苏丹Ⅱ，苏丹蓝2，甲酚红。一般情况下蓝色和橙红色在一定配比下，能调出紫色。

为了确保实验的可靠性，对一级质谱中筛选出来的四个化合物，进行了二级质谱采集，并检索。结果这四个化合物的二级质谱信息并未检索出相关的化合物，如图13所示。因此，花生中并未加入天青1，苏丹Ⅱ，苏丹蓝2，甲酚红这四种着色剂。通过一级质谱数据库与二级质谱数据库的检索，有效的避免了假阳性的情况的出现，为检测的精准度有了更好的保障。

Claims

1.一种食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）着色剂一级质谱数据库和二级质谱数据的建立；

2）所建立质谱数据库中性质相近着色剂的分离；

其中：

步骤1）所述二级质谱数据库的建立具体如下：首先，在以一级质谱数据确认的情况下，对标准品的工作溶液，调节色谱条件和质谱条件，在Targeted MS/MS模式下给予目标离子10-60V的碰撞能，采集二级谱图数据；其次，将二级质谱信息导入到PCDL软件中的谱图编辑条目下；

步骤1）所述二级质谱数据库建立的色谱条件、质谱条件以及采集条件为：所述色谱条件为：流动相：正离子模式：体积比为50：50的0.1%甲酸水溶液：乙腈；负离子模式：体积比为50：50的0.1%乙酸水溶液：乙腈；流速：0.3mL/min；进样量：5 μL；所述质谱条件为：Agilent 6530型四极杆-飞行时间质谱仪采用Jet stream ESI源，喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；所述采集条件为：质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s；质谱采集模式Target-MS/MS模式，质谱采集范围为100-1100m/z；采集速度为2spectra/s；碰撞能10-60V；MS 响应绝对阈值200；MS/MS响应绝对阈值10；

步骤2）中所述性质相近着色剂的分离，具体为：a）根据着色剂分子量进行分组；b)调节质谱条件和色谱条件，在一级MS模式下采集图谱；

步骤2）中性质相近着色剂分离的质谱条件和色谱条件为：Jet stream ESI源；喷嘴电压为1000V，毛细管电压为3500V，碰撞电压为130V，锥孔电压为65V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为5L/min；雾化器压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；质谱采集模式MS模式，质谱采集范围为100-600m/z；采集速度为2spectra/s；所述色谱条件根据每组着色剂特性进行优化设定。

2.根据权利要求1所述的食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，其特征在于：步骤1）中所述着色剂一级质谱数据库的建立具体如下：首先，将收集到的化合物名称、CAS号、中性分子式、结构式信息录入到个人化合物数据库软件中的编辑化合物信息条目下；然后，将收集到的建库化合物标准品分别配制成标准储备溶液和工作溶液，调节色谱条件和质谱条件，对标准品的工作溶液在MS模式下采集一级谱图数据；最后，判别与收集中性分子量信息是否一致，若一致则一级质谱数据库建立完毕；若不一致，则需要重新检索，确认信息收集是否正确，标准溶液是否正确，直至信息一致。

3.根据权利要求2所述的食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，其特征在于：所述标准储备溶液和工作溶液的配制为：精确称取各标准品溶于10mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液；分别吸取不同体积各标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的标准工作溶液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，其特征在于：所述方法建立的违禁着色剂的质谱数据库。

5.根据权利要求4所述的食品中违禁着色剂质谱数据库的建立方法，其特征在于：所述违禁着色剂的质谱数据库在食品违禁着色剂检测中的应用。