CN110108811A - 一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法及其净化枪头 - Google Patents

一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法及其净化枪头 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法及其净化枪头，检测步骤包括：样品提取，样品净化，样品排液；将移液技术与样品净化技术相结合，可以实现在液体移取的同时，完成待测样品的净化过程，大大节省了操作步骤，保证了检测精度。

Description

一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法及其净化 枪头
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法及其净化枪头。
背景技术
黄曲霉毒素是一种香豆素类衍生物，由黄曲霉菌代谢产生，是剧毒的一类致癌物。黄曲霉菌多存在于湿热环境下发霉的粮食当中。而酱油醋等多种酿造调味料液体均通过粮食发酵酿造制得。因此这些调味料如若采用被黄曲霉菌污染的原料，调味料产品中也有很大可能含有黄曲霉毒素，从而影响消费者健康。
酿造调味料中的物质组成复杂多样，食品成分分析前需要对干扰的物质进行净化处理，以便顺利完成检测。常用的净化方法是固相萃取方法，①这种方法需要专门的处理设备，成本高，不利于快速检测及野外检测的环境。②在净化过程中，样品需要慢慢流经固相柱，耗时过长且操作不便。③样品在净化后需要额外步骤转移到检测设备当中进行检测。其难以避免与外界环境发生接触，容易引起二次污染，影响检测的精度。移液枪是分析检测过程必备的液体移取工具，移液精度高，广泛应用于食品、环境、生物检测领域。
发明内容
为了提高检测工作效率，提高检测精度，本发明提供一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法，将移液技术与样品净化技术相结合，可以实现在液体移取的同时，完成待测样品的净化过程，大大节省了操作步骤，保证了检测精度。
本发明提供一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品净化：采用移液枪定量吸取样品提取液，继续定量吸取空气，鼓动样品提取液内气泡，使移液枪头内净化材料吸附杂质；(3)样品排液：将净化后的样品排出，送至检测设备上机检测。
其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g液体调味料样品于50mL离心管中，用提取液(纯乙腈)定容到25mL，涡旋混匀；超声提取20min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。所述液体调味料优选为液态的酿造调味料，包括酱油、醋和料酒。
其中，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪吸液，吸入1ml待净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪吸液，吸入1ml空气，使液体与净化材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气；③移液枪显示5000ul ALL满载，将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液，收集净化液上机分析。
其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(HPLC)进行分析，检测条件为：
流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)；
等梯度洗脱条件：A，68％；B，32％；
色谱柱：C18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
进样量：50μL；
荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。
本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化枪头，其包括管体，管体内从上到下依次设置有卡扣、上筛板、净化材料和下筛板。
净化材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、C18改性硅胶、C8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。
有益的技术效果
本发明提供的黄曲霉毒素样品净化检测方法，将微量移液技术与样品吸附净化技术相结合，可以实现在微量液体定量移取的同时，通过气泡鼓动，促进净化材料充分混合吸附，完成待测样品的净化过程，大大节省了操作步骤，消除杂质干扰背景，保证了检测精度，并在保证样品回收率的前提下，提高了样品净化速度，检测重复性好。
附图说明
图1为本发明黄曲霉毒素净化检测方法所用净化枪头的结构示意图；
图2为本发明黄曲霉毒素净化检测方法所用净化枪头吸取样品示意图；
图3为本发明黄曲霉毒素净化检测方法所用净化枪头净化样品示意图。
图4为本发明黄曲霉毒素净化检测方法所用净化枪头释放样品示意图。
图5为本发明黄曲霉毒素净化检测方法实施例检测谱图：
实施例1图5a黄曲霉毒素混标液相色谱图；图5b酱油阴性样品与阴性加标样品对比图；
实施例2图5c黄曲霉毒素混标液相色谱图；图5d醋阴性样品与阴性加标样品对比图。
具体实施方式
本发明提供一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品净化：采用移液枪定量吸取样品提取液，继续定量吸取空气，鼓动样品提取液内气泡，使移液枪头内净化材料吸附杂质；(3)样品排液：将净化后的样品排出，送至检测设备上机检测。
其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g液体调味料样品于50mL离心管中，用提取液(纯乙腈)定容到25mL，涡旋混匀；超声提取20min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。所述液体调味料优选为液态的酿造调味料，包括酱油、醋和料酒。
其中，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪吸液，吸入1ml待净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪吸液，吸入1ml空气，使液体与净化材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气；③移液枪显示5000ul ALL满载，将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液，收集净化液上机分析。
其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(HPLC)进行分析，检测条件为：
流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)；
等梯度洗脱条件：A，68％；B，32％；
色谱柱：C18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
进样量：50μL；
荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。
本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化枪头，其包括管体，管体内从上到下依次设置有卡扣、上筛板、净化材料和下筛板。
净化材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、C18改性硅胶、C8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。
下面根据具体实施例对本发明净化检测实施过程进行阐述：
实施例1
酱油中黄曲霉毒素应用案例
样品提取：
·称取5g酱油样品于50mL离心管中，用提取液(纯乙腈)定容到25mL，涡旋混匀。
·超声提取20min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。
·样品净化：
·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入待净化液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml待净化液，停留5s。
·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。
·步骤3：移液枪显示5000ul ALL，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。
·上机分析：将样品净化液送至HPLC检测设备上机检测。
HPLC检测条件：
·流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)
·等梯度洗脱条件：A，68％；B，32％
·色谱柱：C18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)
·流速：1.0mL/min
·柱温：40℃
·进样量：50μL
·荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生
实验结果：
检测结果：图5a黄曲霉毒素混标液相色谱图所示。其中，AFG1和B1浓度为2ng/mL；AFG2和B2浓度为0.6ng/mL。
图5b酱油阴性样品与阴性加标样品对比图，其中，AFG1和B1加标浓度为4ng/g；AFG2和B2加标浓度为1.2ng/g。
表1酱油样品最低检出限、加标回收率与重复性
(AFG1和B1加标浓度为4ng/g；AFG2和B2加标浓度为1.2ng/g)
*AF为黄曲霉毒素的简称，G1、G2、B1和B2为黄曲霉素的四种类型
实施例2
醋中黄曲霉毒素应用案例
样品提取：
·称取5g醋样品于50mL离心管中，用提取液(纯乙腈)定容到25mL，涡旋混匀
·超声提取20min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液
·样品净化：
·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入待净化液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml待净化液，停留5s。
·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。
·步骤3：移液枪显示5000ul ALL，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。上机分析
HPLC检测条件：
·流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)
·等梯度洗脱条件：A，68％；B，32％
·色谱柱：C18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)
·流速：1.0mL/min
·柱温：40℃
·进样量：50μL
·荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生
实验结果：
图5c黄曲霉毒素混标液相色谱图，其中，AFG1和B1浓度为2ng/mL；AFG2和B2浓度为0.6ng/mL。
图5d醋阴性样品与阴性加标样品对比图，其中，AFG1和B1加标浓度为4ng/g；AFG2和B2加标浓度为1.2ng/g。
表2醋样品最低检出限、加标回收率与重复性
(AFG1和B1加标浓度为4ng/g；AFG2和B2加标浓度为1.2ng/g)
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种酿造调味料中黄曲霉毒素样品净化检测方法，其特征在于，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品净化：采用移液枪定量吸取样品提取液，继续定量吸取空气，鼓动样品提取液内气泡，使移液枪头内净化材料吸附杂质；(3)样品排液：将净化后的样品排出，送至检测设备上机检测。
2.如权利要求1所述的净化检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g液体调味料样品于50mL离心管中，用纯乙腈提取液定容到25mL，涡旋混匀；超声提取20min，放入离心机，8000r/min离心20min，取上清液作为样品提取液，所述液体调味料优选为液态的酿造调味料，包括酱油、醋和料酒。
3.如权利要求1或2所述的净化检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪吸液，吸入1ml待净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪吸液，吸入1ml空气，使液体与净化材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气；③移液枪显示5000ul ALL满载，将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液，收集净化液上机分析。
4.如权利要求1至3中任一项所述的净化检测方法，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(HPLC)进行分析，检测条件为：
流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)；
等梯度洗脱条件：A，68％；B，32％；
色谱柱：C18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
进样量：50μL；
荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。
5.一种适用于如权利要求1-4中任一项所述检测方法的净化枪头，其特征在于，其包括管体，管体内从上到下依次设置有卡扣、上筛板、净化材料和下筛板。
6.如权利要求5所述的净化枪头，其特征在于，净化材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、C18改性硅胶、C8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。
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