CN112666347B

CN112666347B - 同步检测植物油中黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112666347B
Application number: CN202110286752.9A
Authority: CN
Inventors: 汤永平; 刘卫; 林志欣; 羊晓珊; 梁展鹏; 高成; 李立
Original assignee: Guangzhou Minjie Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Minjie Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2041-03-17
Also published as: CN112666347A

Abstract

本发明公开了一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫免疫荧光层析试剂盒及方法，旨在提供一种灵敏度高，抗干扰强，可同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒；其技术方案是这样的：包括底板，所述的底板上从左至右依次衔接有吸收垫、反应膜、结合垫、样品垫，所述反应膜划有一条含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线T1，一条玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线T2，一条含有鸡IgY质控C线；所述的结合垫包被含有黄曲霉毒素B1检测微球、玉米赤霉烯酮检测微球和羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球的混合物，属于生物检测技术领域。

Description

同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒及方法

技术领域

本发明公开一种免疫荧光层析试剂盒，具体地说，是一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，本发明还涉及植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的检测方法。

背景技术

中国的食品安全问题一直威胁国人的生命健康，近期发生的“酸汤子”中毒事件不算久远，9人中毒，无一生还。食用油中真菌毒素超标时有发生，食用油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮常见于多种植物油中，检测方法多样，各方法也非常成熟，但也各有优缺点。现有的检测方法主要有色谱/质谱法、免疫法，前者属于理化检测方法，前处理过程复杂，仪器化程度高，操作繁琐，对操作人员和仪器均有较高的要求，同时检测周期较长。免疫法目前主要包ELISA和免疫层析法，ELISA方法反应过程长，操作频繁，易受环境因素和人员频发操作影响，时常需要新建标曲，越来越无法满足现场检测“快速、灵敏、准确”等方面的需要。免疫层析当前比较流行的主要是胶体金和免疫荧光层析，胶体金检测能快速定性检测，但灵敏度不足，且在定量检测方面的准确性尚存争议。植物油脂样本粘稠，吸取不便，若是吸取下清，很容易吸到上层植物油，除杂过程也不方便。针对上述问题，非常迫切开发一种可以现场即时检测、操作简单、灵敏、准确的产品。本检测试剂盒，前处理不需离心，取上清液后直接稀释上样，可同时测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮两种毒素，灵敏度高，优点十分突出。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高，抗干扰强，可同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒。

本发明提供的第二个技术方案是可同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的检测方法，该方法操作简单，前处理无需离心直接取上清液稀释，对检测人员无特殊要求。

为了达到上述目的，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，包括底板，所述的底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，所述反应膜划有一条含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线T1，一条玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线T2，一条含有鸡IgY质控C线；所述的结合垫包被有黄曲霉毒素B1检测微球、玉米赤霉烯酮检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

其中：

所述的黄曲霉毒素B1检测微球是长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成；

所述的玉米赤霉烯酮检测微球是长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成；

所述的长链生物素连结有双长链（-LC-LC）加长臂，加长臂另一端连结有用于偶联标记单克隆抗体的NHS，能够有效降低空间位阻效应，提高标记效率和灵敏度。羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球是直接将羊抗鸡IgY多克隆抗体标记到荧光微球上制成。

进一步的，上述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，所述的反应膜通过下述步骤制得的：

（1）用含2%海藻糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到0.1mg/ml，作为质控C线工作液；将黄曲霉毒素B1偶联抗原稀释到0.2mg/ml，作为黄曲霉毒素B1检测线工作液；将玉米赤霉烯酮偶联抗原稀释到0.2mg/ml，作为玉米赤霉烯酮检测线工作液；

（2）将硝酸纤维素膜粘贴到底板，用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线T1、玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线T2和含有鸡IgY质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。

进一步的，上述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，所述的样品垫的制备方法为：

（1）样品垫处理液配方：含1%酪蛋白、0.15M NaCl、1.5% PEG 5000和1.5%TritonX-100的pH7.4 的0.02M的磷酸盐缓冲液；

（2）将步骤（1）制备的处理液以50μl/cm²的浓度均匀涂布于玻璃纤维SB08上，45°C烘干16h。

进一步的，上述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，所述的结合垫的制备方法为：将羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球，黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球按比例充分混合，用仪器均匀喷涂到SB08结合垫上，45℃烘干备用。

进一步的，上述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，所述的羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球制备方法如下：

（1）取1ml 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μl NHS（25mg/ml）和4μl的EDC（25mg/ml），涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl 0.02MpH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

（3）加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。

所述的黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球的制备方法如下：

第一步，制备长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体，具体步骤如下：

（1）取出长链生物素NHS-LC-LC-Biotin，室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

（2）浓度均为2mg/ml黄曲霉毒素B1单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体各取1ml至2个2ml离心管中，每管加入27μl步骤（1）配制的生物素NHS-LC-LC-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（3）反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

（4）向超滤管中加入2ml PBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

（5）重复步骤（4）5次，200μl PBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测浓度。

第二步，制备链霉亲和素荧光微球，具体步骤如下：

（1）取1ml标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到标记专用的2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；加入4μl25mg/ml的NHS和4μl25mg/ml的 EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球16500rpm离心20min，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl0.02M pH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

（3）取100μg链霉亲和素加入到步骤3）活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）封闭：每管加入100μl10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

（5）加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

（6）重复步骤（5）3次，充分去除未反应的链霉亲和素；加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。

第三步，制备黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球，具体步骤如下：

（1）分别取步骤1）制备的长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体各5μg，加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（2）完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

（3）加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

（4）重复步骤（3）3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

（5）加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。

上述的微球保存液为PBS缓冲液，其中含有0.15M NaCl，0.05M PB，pH7.2-7.4。

本发明提供的第二个技术方案是这样的：

（一）将样品进行前处理得到待测液；

（二）将待测液加入到权利要求1所述的检测卡中，水平静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪中读取结果；

（三）将结果带入到标曲中，即可计算出样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮的含量；

其中，步骤（一）中所述的前处理的方法为：

（1）取待测植物油，加入饱和盐水、乙腈后手动震荡混匀进行萃取，

（2）静置分层后取上清液；按照体积比1﹕（10-20）用稀释液稀释，即为待测液。

进一步的，所述植物油待测样品的取样质量与饱和盐水体积、乙腈的体积比为:2g﹕1ml~2ml﹕1~4ml。

进一步的，上述的同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，所述手动震荡混匀的时间为10-15s，静置分层的时间为30-60s。

进一步的，上述的同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，所述稀释液为含0.5-1wt%表面活性剂S9的PBS缓冲液。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的技术方案是将长链生物素化单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球通过生物素与链霉亲和素亲和作用制备标记微球，所述的长链生物素连结有双长链加长臂（-LC-LC），加长臂另一端连接有用于偶联标记单克隆抗体的NHS，能够有效降低空间位阻效应，提高标记效率，生物素链霉亲和素系统具有信号放大作用，可以进一步提高检测的灵敏度；

2、本发明提供的技术通过液液萃取的方法提取后可直接上样用于检测，前处理操作简单，无需吹干和过柱等过程，可同步检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量，应用范围广。

附图说明

图1是本发明提供的免疫荧光层析检测卡检测原理示意图。

图2是本发明提供的长链生物素化单克隆抗体制备过程示意图。

图3是本发明提供的链霉亲和素荧光微球制备过程示意图。

图4是本发明提供的检测微球制备过程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的限制，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做出的的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

检测试剂卡的制备：

1、样品垫的制备为：

（2）将上一步制备的处理液以50μl/cm2的浓度均匀涂布于玻璃纤维RB65上，45℃干燥16h。

2、结合垫的制备：将羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球、黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球按比例充分混合，用仪器均匀喷涂到SB08结合垫上，45℃烘干备用。

羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球制备方法如下：

（1）取1ml 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μl的浓度25mg/ml NHS和4μl的浓度25mg/ml EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1ml微球保存液，充分混匀，备用；

黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球分为三个部分：

（1）长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备；

（2）链霉亲和素荧光微球的制备；

（3）以生物素链霉亲和素系统为桥梁分别制备黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球；

具体如下：

第一步：生物素标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备方法为：

（2）黄曲霉毒素B1单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度稀释至2mg/ml黄各取1ml至2个2ml离心管中，每管加入27μl步骤（1）配制的长链生物素NHS-LC-LC-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（4）向超滤管中加入2mlPBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

（5）重复步骤（4）5次，200μlPBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测浓度；

第二步，链霉亲和素荧光微球的制备方法为：

（1）取1ml标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到标记专用的2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；加入25mg/ml的的NHS4μl和的25mg/ml EDC4μl，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球16500rpm离心20min，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl硼酸盐缓冲液（0.02M pH8.0），充分混匀；

第三步，黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球的制备过程：

（1）分别取长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体和长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体各50μg加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（5）加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。

上述的微球保存液均为PBS缓冲液，其中含有0.15M NaCl，0.05M PB，pH7.2-7.4。

反应膜的制备方法为：

（2）将硝酸纤维素膜粘贴到底板的指定位置，用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划黄曲霉毒素B1检测线T1、玉米赤霉烯酮检测线T2和质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。

检测卡的组装

按上述方法制得样品垫、结合垫、反应膜干燥后，在硝酸纤维素膜的一边紧压硝酸纤维素膜边缘约1-2mm粘贴吸水纸垫，在硝酸纤维素膜的另一边紧压硝酸纤维素膜边缘约1-2mm粘贴结合垫，在结合垫的另一边紧压结合垫边缘约1-2mm粘贴样品垫。然后切成宽度为3.95mm的试纸条，装入检测卡下盖的试纸条槽内，盖上检测卡上盖就是一条完整的检测卡。

实施例2

含有标曲的ID芯片的制备

系列标准品配制：取32μl黄曲霉毒素B1标准品（2mg/kg）和64μl玉米赤霉烯酮标准品（100mg/kg）加入到904μl甲醇溶液中，混匀得混合标准品1（黄曲霉毒素B1为64 μg/kg、玉米赤霉烯酮为6.4 mg/kg），然后倍比稀释5次得混合标准品2、混合标准品3、混合标准品4、混合标准品5、混合标准品6；取7个15ml离心管，每管加入2g不含黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的空白植物油（玉米油）样本，取50μl混合标准品1-6加入其中6管，第7管加入50μl甲醇，混匀。

黄曲霉毒素B1的终浓度梯度为：1.6μg/kg、0.8μg/kg、0.4μg/kg、0.2μg/kg、0.1μg/kg、0.05μg/kg、0μg/kg；

玉米赤霉烯酮的终浓度梯度为：160μg/kg、80μg/kg、40μg/kg、20μg/kg、10μg/kg、5μg/kg、0μg/kg；

每管加入2ml饱和NaCl溶液和2ml乙腈，手动震荡10s，静置30s，取50μl上清液加入到1ml稀释液中，涡旋混匀。取100μl加入到检测卡中，静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪读数，得到检测线与质控C线的比值（T/C）。以浓度梯度为横坐标，以对应的T/C值为纵坐标，绘制工作曲线：

黄曲霉毒素B1检测的标准曲线为：Y=0.47474-1.96517*X R2=0.99523

线性范围：0.1-1.6μg/kg；

玉米赤霉烯酮检测的标准曲线为：Y=5.04993X-2.33266*X R2=0.99383

线性范围：10-160μg/kg；

将标准曲线拷贝到ID卡中，检测时将ID卡插入荧光免疫层析仪可作为标曲直接计算出待测样本中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量。

实施例3

（1）样本前处理与检测

取加标植物油（玉米油）和阴性未加标植物油（玉米油）各3管，2ml/管，每管加入1ml饱和食盐水，2ml乙腈，手动震荡10s，静置分层后，取上清液用稀释液稀释10倍，待测；

（2）检测

取100μl待测液加入到检测卡的加样孔中，10min后插入仪器读数。

实施例4

（1）样本前处理与检测

取实施例2中的加标植物油（玉米油）和阴性未加标植物油（玉米油）各3管，2ml/管，每管加入2ml饱和食盐水，2ml乙腈，手动震荡10s，静置分层后，取上清液用稀释液稀释10倍，待测；

（2）检测

实施例5

和实施例3的不同之处是加入1ml乙腈。

实施例6

和实施例3的不同之处是加入4ml乙腈。

对比例1

（1）取加标植物油（玉米油）和阴性未加标植物油（玉米油）各3管，2ml/管， 2ml30%甲醇溶液，手动震荡10s，静置分层后，取下清用稀释液稀释10倍，待测；

（2）取100μl待测液加入到检测卡的加样孔中，10min后插入仪器读数。

对比例2

（1）取加标植物油（玉米油）和阴性未加标植物油（玉米油）各3管，2ml/管， 2ml甲醇溶液，手动震荡10s，静置分层后，取上清液用稀释液稀释10倍，待测；

对比例3

（1）取加标植物油（玉米油）和阴性未加标植物油（玉米油）各3管，2ml/管， 2ml 乙腈，手动震荡10s，静置分层后，取下清用稀释液稀释10倍，待测；

实施例2-实施例5，以及对比例1至对比例2中所采用的的稀释液均为含0.8wt%表面活性剂S9的PBS缓冲液。

实施例2-实施例5，以及对比例1至对比例2中的前处理分层结果见表1，加标抑制率结果见表2。

表1 待测样品在不同萃取剂中的前处理分层结果

表2 加标抑制率结果

吸取上清液可以减少样本干扰，油脂中非极性物质和极性很弱的物质不溶于乙腈，同时油脂中的易溶于水的杂质被饱和盐水除去。

实施例7

试剂盒回收率和重复性

样本加标：取8μl黄曲霉毒素B1标准品（2mg/kg）和16μl玉米赤霉烯酮标准品（20mg/kg）加入到904μl甲醇溶液中，混匀得混合标准品1（黄曲霉毒素B1为16μg/kg、玉米赤霉烯酮为320μg/kg的标准品），然后倍比稀释2次得混合标准品2（黄曲霉毒素B1的浓度为8μg/kg、玉米赤霉烯酮的浓度为160μg/kg）、混合标准品3（黄曲霉毒素B1的浓度为4μg/kg、玉米赤霉烯酮的浓度为80μg/kg）。取15个15ml离心管，取不含黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的空白植物油样本，2g/管，分三组，5管/组。第一组每管加入混和标准品1，50μl/管，混匀则黄曲霉毒素B1的加标浓度为0.4μg/kg，玉米赤霉烯酮系统的加标浓度为8μg/kg；第二组每管加入混和标准品2，50μl/管，混匀则黄曲霉毒素B1的加标浓度为0.2μg/kg，玉米赤霉烯酮系统的加标浓度为4μg/kg；第三组每管加入混和标准品3，50μl/管，混匀则黄曲霉毒素B1的加标浓度为0.1μg/kg，玉米赤霉烯酮系统的加标浓度为2μg/kg。

每管加入2ml饱和NaCl溶液和2ml乙腈，手动震荡10s，静置30s，取50μl上清液加入到1ml稀释液中，涡旋混匀。取100μl加入到检测卡中，静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪直接读取结果，各个浓度黄曲霉毒素B1加标回收率见表3；各个浓度玉米赤霉烯酮加标回收率见表4。

表3 黄曲霉毒素B1加标回收率

表4 玉米赤霉烯酮加标回收率

为了证明验证本申请提供的技术方案，下面给出本申请提供的技术的应用例。

将待测液加入到检测卡的样品孔内，检测卡水平静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪的读卡槽内，由于仪器已经植入下述实施例6中ID卡芯片的标准曲线，所以可以直接读取结果。

应用例1

常见植物油中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的检测

取玉米油、花生油、大豆油、菜籽油、葵花籽油等常见植物油样本，每种样本中黄曲霉毒素B1的加标终浓度为0.2μg/kg，玉米赤霉烯酮的加标终浓度为4μg/kg。每种样本取10管，2g/管，每管加入2ml饱和NaCl溶液和2ml乙腈，手动震荡10s，静置30s，取50μl上清液加入到1ml稀释液中，涡旋混匀。取100μl加入到检测卡中，静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪读数，得到两个检测线与质控C线的比值（T/C），T/C值代入标曲得反馈浓度，进而计算出加标回收率和重复性。结果如表5：

表5 植物油中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的检测结果

Claims

1.一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，包括检测卡、ID标曲芯片、提取试剂，所述检测卡包括底板，底板上从左至右依次衔接有吸收垫、反应膜、结合垫、样品垫，其特征在于，所述反应膜划有一条含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线T1，一条玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线T2，一条含有鸡IgY质控C线；所述的结合垫包被有黄曲霉毒素B1检测微球、玉米赤霉烯酮检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

其中：

所述的黄曲霉毒素B1检测微球是连结有双长链-LC-LC加长臂的长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成的；

所述的玉米赤霉烯酮检测微球是连结有双长链-LC-LC加长臂的长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成的；

所述的结合垫的制备方法为：将羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球，黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球按比例充分混合，用仪器均匀喷涂到玻璃纤维SB08上，45℃烘干备用；

所述的羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球制备方法如下：

(1)取1ml 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μl的浓度25mg/ml NHS和4μl的浓度25mg/ml EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

(2)将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl 0.02M pH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

(3)加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

(4)每管加入100μl 10％酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1ml微球保存液，充分混匀，备用；

所述的黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球制备过程分为三个部分：

第一步：制备长链生物素化黄曲霉毒素B单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体

(1)取出长链生物素NHS-LC-LC-Biotin，室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

(2)浓度均为2mg/ml黄曲霉毒素B1单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体各取1ml至2个2ml离心管中，每管加入27μl步骤(1)配制的生物素NHS-LC-LC-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

(3)反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

(4)向超滤管中加入2ml PBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

(5)重复步骤(4)5次，200μl PBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测蛋白浓度；

第二步：制备链霉亲和素荧光微球

(1)取1ml标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到标记专用的2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；加入4μl25mg/ml的NHS和4μl25mg/ml的EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

(2)将活化后的荧光微球16500rpm离心20min，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl0.02MpH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

(3)取100μμg链霉亲和素加入到步骤2)活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

(4)封闭：每管加入100μl10％酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

(5)加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

(6)重复步骤(5)3次，充分去除未反应的链霉亲和素；加入1ml微球保存液，充分混匀，备用；

第三步：制备黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球

(1)分别取长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体各50μμg，加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

(2)完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

(3)加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

(4)重复步骤(3)3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

(5)加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的反应膜通过下述步骤制得的：

(1)用含2％海藻糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到0.1mg/ml，作为质控C线工作液；将黄曲霉毒素B1偶联抗原稀释到0.2mg/ml，作为黄曲霉毒素B1检测线工作液；将玉米赤霉烯酮偶联抗原稀释到0.2mg/ml，作为玉米赤霉烯酮检测线工作液；

(2)将硝酸纤维素膜粘贴到底板，用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线、玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线和含有鸡IgY质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的样品垫的制备方法为：

(1)样品垫处理液配方：含1％酪蛋白、0.15M NaCl、1.5％PEG 5000和1.5％Triton X-100的pH7.4的0.02M的磷酸盐缓冲液；

(2)将步骤(1)制备的处理液以50μl/cm²的浓度均匀涂布于玻璃纤维RB65上，45℃烘干16h。

4.一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)将样品进行前处理得到待测液；

(二)将待测液加入到权利要求1所述的检测卡中，水平静置10min，然后插入到荧光免疫层析仪中读取结果；

(三)将结果带入到标曲中，即可计算出样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮的含量；

其中，步骤(一)中所述的前处理的方法为：

(1)取待测植物油，加入饱和盐水、乙腈后手动震荡混匀进行萃取，

(2)静置分层后取上清液；按照体积比1﹕(10-20)用稀释液稀释，即为待测液。

5.根据权利要求4所述的同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，其特征在于，所述待测植物油、饱和盐水、乙腈的添加比例为：2g:1ml～2ml:1～4ml。

6.根据权利要求4所述的同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，其特征在于，所述手动震荡混匀的时间为10-15s，静置分层的时间为30-60s。

7.根据权利要求4所述的同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的方法，其特征在于，所述稀释液为含0.5-1wt％表面活性剂S9的PBS缓冲液。