CN104792984B - 一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒 - Google Patents

一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒。本发明所制备的试剂盒，在临床样品检测时操作流程简单，3.5小时之内可完成检测，结果判定只需要一台普通的倒置显微镜即可，不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用。相对于现有商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒制备所需要的高成本、高技术制备工艺和生产条件，本发明所制备的试剂盒，不仅材料成本低廉、制备工艺简单，而且稳定性强、灵敏度高、高通量的特性可与商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒媲美。

Description

一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒。
背景技术
犬细小病毒病是危害我国养犬业的主要流行型传染病之一，是犬的一种具有高度接触性的烈性传染病，具有发病急和死亡率高等特点，不同品种和年龄的犬都易感，幼犬在l6周龄左右感染率高达100％，死亡率达10％~50％。中国宠物市场的发展和进步，是社会经济发展、人们对宠物的态度以及人口老龄化和城市化进程综合促进的结果。犬作为一种与人类接触最为亲密的、与人类相处时间最长的宠物之一，与人类的日常生活已经密不可分，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，诸如犬是多少人畜共患的寄生虫、病毒和细菌性病原的宿主和可能的传染源，因此，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类健康具有重要的公共卫生意义。犬除了作为宠物饲养之外，其在生命科学、军用犬已经试验动物用途中越来越广泛。
我国广泛存在并已分离多种毒株，对于其特异性抗体的检测方法主要有血凝抑制试验（HI），酶联免疫吸附法（ELISA），胶体金法。其中血凝抑制试验（HI），需要新鲜的猪、猴的红细胞，材料来源不及时、批次制备原料不稳定、难以高通量检测，操作人为因素影响大，而仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，而不能推广到基层养殖场和宠物医院临床一线检测之用。胶体金便于临床定性分析犬细小病毒抗体阳性与阴性问题，而无法做到精确定量。ELISA是一项国内外通用的，目前在各个检测领域技术最为成熟的一种方法，商品化的试剂盒也非常好用。然而，目前国内的技术力量没有达到相应的国际水平，迟迟没有中国自己的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒上市。而进口犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒价格昂贵，临床应用成本高，在国内难以普遍推广使用。
鉴于上述情况，开发一种能够适合工业化批量生产、质量可控、性能稳定、高通量、特异性和敏感性好的犬细小病毒抗体检测试剂盒十分必要，更为重要的是，该试剂盒的成本不能太高，否则，难以推广应用。基于以上种种背景，建立了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，能够快速、准确的进行检测。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5mL每管的底物显色液B液2管。
所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；
（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置1min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用；
（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；
（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复数为5TCID50，混合并搅拌均匀后制得包被液，备用；
（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的包被液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37℃、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养48h，将96孔免疫检测反应板中的包被液倒掉，并用PBS洗涤溶液清洗3-4次，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈；
（6）、向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得；
（7）、将步骤（6）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板。
每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl80g、kcl2g、Na2HPO414.2g、KH2PO42.7g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入温度为4℃下密闭保存即可。
所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1moL/L的乙酸盐缓冲液按1：0.03：1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。
所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
有益效果
1、本发明所制备的试剂盒，在临床样品检测时操作流程简单，3.5小时之内可完成检测，结果判定只需要一台普通的倒置显微镜即可，不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用。
2、相对于现有商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒制备所需要的高成本、高技术制备工艺和生产条件，本发明所制备的试剂盒，不仅材料成本低廉、制备工艺简单，而且稳定性强、灵敏度高、高通量的特性可与商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒媲美。
3、本发明所制备的试剂盒具有材料来源稳定、单一、可控的优点，本发明所采用的F81细胞为传代细胞系，国际通用材料，背景清楚，可进行工业化生产。
附图说明
图1为试验2中2只犬体内IgG抗体采用本试剂盒所测定的效价变化曲线。
具体实施方式
一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5mL每管的底物显色液B液2管。
所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；
（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置1min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用；
（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；
（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复数为5TCID50，混合并搅拌均匀后制得包被液，备用；
（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的包被液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37℃、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养48h，将96孔免疫检测反应板中的包被液倒掉，并用PBS洗涤溶液清洗3-4次，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈；
（6）、向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得；
（7）、将步骤（6）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板。
每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl80g、kcl2g、Na2HPO414.2g、KH2PO42.7g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入温度为4℃下密闭保存即可。
所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1moL/L的乙酸盐缓冲液按1：0.03：1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。
所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
实施例1
一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其组成为：
（1）包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板5块
（2）10×洗涤液1瓶（120mL）
（3）样品稀释液1瓶120mL
（4）阳性血清1管（50μL）
（5）阴性血清1管（50μL）
（6）辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管（20μL）
（7）底物显色液A液1瓶（60mL）
（8）底物显色液B液2管（每管1.5mL）
（9）试剂盒说明书1份。
本发明具体制备方法包括：
1.包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备工艺：
（1）把长满单层猫肾细胞的75cm2的细胞培养瓶中的培养液倒掉；猫肾细胞的的培养方法：细胞所有培养基为含5%胎牛血清的MEM培养基（北京清大天一科技有限公司产品），培养条件为37℃、5CO2%培养箱，培养4天，长满单层。
（2）用适量PBS洗涤液溶液（PBS洗涤液配制方法：称取8.0gNaCL、0.2gKCL、1.42gNa2HPO4、0.27gKH2PO4，溶入到900mL去离子水中，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存）（75cm2的瓶中加2mL）加入细胞瓶中轻轻晃动，使洗涤液覆盖细胞面，将残留的培养基（5%胎牛血清的MEM培养基培养）洗下，然后倒掉PBS；
（3）每个培养瓶加入适量0.25%胰酶-EDTA-Na2溶液（称取胰酶粉末2.5g和0.2gEDTA-Na2加入到500mL已灭菌的PBS中，磁力搅拌充分溶解然后补PBS到1000mL。0.22μm微孔细菌滤器过滤除菌，分装成40mL一瓶，-20℃保存备用。）（75cm2的瓶中加1mL），然后摇匀至消化液覆盖细胞；
（4）室温放置1min；
（5）倒掉瓶中的0.25%胰酶-EDTA-Na2溶液，室温放置2min；
（6）轻拍，如果细胞全部脱落，视为消化到位；
（7）往瓶中加入6mL含5%胎牛血清的MEM培养基培养，用枪吹散细胞，把培养瓶放在显微镜下观察细胞呈单个或存有少量的细胞团视为到位，制得细胞悬液；
（8）取步骤（7）细胞悬液4mL于一无菌皿中，加入20mL5%胎牛血清的MEM培养基培养（共24mL），用枪将其混匀，取基因型为2a型犬细小病毒液（该病毒为本单位分离培养的犬细小病毒NY毒株，其培养方法为：将病毒按感染复数（m.o.i）为5TCID50接种长满单层的F81细胞，于37℃、5CO2%培养箱中培养4天，出现80%左右细胞病变时收获病毒，将病毒液反复冻融，3000r/min，离心5min，取上清于-20℃保存备用）加入上述培养液中，使每孔病毒感染复数（m.o.i）为5TCID50，轻轻混匀；
（9）用排枪以每孔120μL加入96孔板；
（10）转圈轻拍细胞板，使细胞在孔内均匀分布。
（11）放入37℃，5%CO2培养箱进行培养。
（12）病毒培养48h后，将96孔板里的细胞培养液倒掉，用PBS洗涤溶液（每孔加200μL）洗3次，真空干燥仪内，30℃真空干燥1h，直到孔边缘出现白色圈为宜；
（13）每孔加入100μL33%丙酮-PBS室温放置30min，33%丙酮-PBS溶液配方：取33mL丙酮，加入到67mLPBS洗液中混匀，室温保存；
（14）弃固定液，真空干燥仪内，30℃真空干燥1h，直到孔边缘出现白色圈为宜；
（15）将每块板用真空包装机抽真空、封口、贴好标签后，于-20℃保存备用，保质期为1年。
2.10×洗涤液的制备：每升10×洗涤液中含NaCL80g、KCL2g、Na2HPO414.2g、KH2PO42.7g，溶入到900mL去离子水中，定容至1000mL，分装成每瓶120mL，经过120℃高压灭菌30分钟后，密闭，4℃保存，保存期1年。
3.样品稀释液的制备：每升1×洗涤液中含NaCL8.0g、KCL0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g，pH值为7.4，分装成每瓶120mL，经过120℃高压灭菌30分钟后，密闭，4℃保存，保存期1年。
4.辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体制备：采用本试剂盒中的样品稀释液按照1:3000比例稀释使用。
5.底物显色液A液的制备：首先配制1L0.1moL/L乙酸盐缓冲液（4℃避光保存），然后取0.1moL/L乙酸盐缓冲液（pH5.0）5mL、去离子无菌H2O5mL、体积百分数为30%的双氧水（H2O2）30μL，混合均匀即为显色液A液，灌装至棕色试剂瓶中，每瓶含量为60mL，每个试剂盒配备1瓶；1L0.1moL/L乙酸盐缓冲液的配制的配制方法：乙酸钠8.2g、H2O1000mL，用冰醋酸调pH值至5.0。
6.底物显色液B液的制备：称取3-氨基-9-乙基咔唑200mg溶于50mL二甲基甲酰胺中，混合均匀即为显色液B液，灌装至棕色试剂管中，每管含量为1.5mL，每个试剂盒配备2管。
7.底物显色液的制备与使用方法：将上述制备的底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1比例混合，现配现用。
一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其具体使用方法包括以下步骤：
一、试剂准备：
1．血清样品准备：新鲜、冷藏（4℃）和冷冻的犬血清样品均可用于检测。冷冻的血清在4℃下解冻，然后3000r/min离心10min，取上清用于检测。
2．洗涤液：10倍浓缩的洗涤液应恢复至室温，并充分的混合，确保结晶的盐溶解；在使用前用蒸馏水或去离子水作1：10稀释。无菌条件下配制的洗涤液可在4℃保存1周。例如，200mL洗涤液需用20mL浓缩洗涤液加入180mL蒸馏水充分混合即可。
3．酶标抗体工作液：在使用前，用样品稀释液将酶标抗体作1：3000稀释，混匀，注意现用现配。例如，10mL的酶标抗体工作液，取3μL的酶标抗体加入到9mL的样品稀释液中混匀，注意现用现配。
4．底物显色液：显色前，将底物A液和底物B液按照20：1的比例混匀即可，注意现用现配。
二、操作步骤
1．预温：在使用前，根据检测血清样本数量，取免疫检测反应板（根据样品数量，将未用孔用塑料膜封闭）、洗涤液及稀释液恢复至室温，轻轻均匀。
2．浸板：每孔注入200μL的洗涤液，置室温浸洗一次，轻轻甩出洗液，吸水纸上轻叩。
3．样品稀释：用样品稀释液将待检样品、阴性血清对照品和阳性血清对照品作1：100倍稀释。例如：分别将待检和对照血清样品3μL加入300μL样品稀释液，混匀。如果要测定样品中IgG的滴度可以按照10倍的梯度稀释法稀释。
4．与血清样品反应：取上述稀释的血清样品分别加入到对应孔，每孔100μL，依次注入反应板孔中，记录每个样品位置，将反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1h。
5．洗板：每孔注入200μL洗涤液，立即排除洗液，吸水纸上轻叩，重复3次。
6．与酶标抗体反应：每孔注入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体，将反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1h。
7．洗板：按步骤5进行。
8．底物显色：每孔注入100μL底物显色液（现用现配），避光，于37℃温箱中反应15min。
9．终止反应：甩出反应液，每孔注入200μL蒸馏水洗一次，每孔加入100μLddH2O观察结果。
10．在显微镜下观察各孔显色情况，进行样品结果判定。
三、结果判定
免疫检测反应板内细胞质内或细胞核周围呈棕红色，细胞核无着色，判为阳性；细胞质内或细胞核周围无着色反应判定为阴性。以检测血清阳性终点时最高稀释度的倒数表示抗体效价。
本发明试剂盒质量标准及检定：
特异性：30份阴性血清、30份阳性血清，分别采用血凝抑制试验和本试剂盒进行检测，符合率不低于95%。
灵敏性：犬细小病毒阳性血清12800倍稀释能检出（即1μL血清加到12800μL样品稀释液中，取其中100μL加入样品检测孔）能检出。
稳定性：将试剂盒置于37℃不少于2天与4℃存放的试剂盒同步检测10份样品，其符合率为100%。
试验1
犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬抗细小病毒IgG抗体：从广州某养狗场采集30份未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬（60日龄）血清样本，按照犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测程序进行检测。
试验结果
未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬抗细小病毒IgG抗体检测结果:从广州某养狗场采集30份未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬血清样本进行犬细小病毒IgG抗体检测，结果表明（表1）：12份为阳性，18份为阴性。其中阳性血清中最高的效价为400倍（400×），最低效价为10倍（10×）。所有阴性血清样品均已原倍检测为阴性结果。这些结果表明，幼犬中存在犬细小病毒母源抗体。
表1犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测30份健康犬血清
试验2
用本发明试剂盒检测犬细小病毒灭活疫苗免疫犬体内IgG动态变化：对本研究中2只犬细小病毒灭活疫苗接种制备抗血清的试验犬在首次免疫前3天和第2次免疫（两次免疫间隔2周）后第7、14、21采集血清样本，采用本试剂盒程序进行IgG抗体检测。
试验结果
用本发明试剂盒检测犬细小病毒灭活疫苗免疫犬体内IgG动态变化：对本研究中2只犬细小病毒灭活疫苗接种制备抗血清的试验犬在首次免疫前3天和第2次免疫（两次免疫间隔2周）后第7、14、21采集血清样本，采用本试剂盒程序进行IgG抗体检测。结果表明，免疫前血清中犬细小病毒抗体均为阴性（血清原倍检测），2次免疫后第7、14、21天所采集的血清中IgG抗体呈明显的上升趋势。1#犬2次免疫后第7、14、21天IgG滴度分别达到800倍、3200倍、12800倍。2#犬2次免疫后第7、14、21天IgG滴度分别达到400倍、3200倍、6400倍。
图1为具体现场实施例2中2只犬体内IgG抗体采用本试剂盒所测定的效价变化曲线。由图中曲线可以看出，免疫前血清中犬细小病毒抗体均为阴性，2次免疫后第7、14、21天所采集的血清中IgG抗体呈明显的上升趋势。1#犬2次免疫后第7、14、21天IgG滴度分别达到800倍、3200倍、12800倍。2#犬2次免疫后第7、14、21、30、37天IgG滴度分别达到400倍、3200倍、6400倍。两只犬免疫后均有效的产生犬细小病毒特异性抗体，在2次免疫后，二者的抗体效价有所不同，但总体趋势是都是上升到一定时间后维持相对一段时间的水平保持不变。
试验1和试验2试剂的质量检定：
特异性：犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒和血凝抑制试验分别对20份阴性血清、10阳性质控血清进行检测，符合率为100%；
灵敏度：两种试剂的灵敏度检定所用质控血清是用犬细小病毒灭活疫苗免疫试验犬制备的犬抗犬细小病毒阳性血清。检定结果表明：犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒灵敏度可达到1：12800。

Claims (5)

1.一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5mL每管的底物显色液B液2管；
所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；
（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置1min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用；
（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；
（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复数为5TCID50，混合并搅拌均匀后制得包被液，备用；
（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的包被液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37℃、CO2体积浓度为5%的培养箱中培养48h，倒掉免疫检测反应板中的包被液，并用PBS洗涤溶液清洗3-4次，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈；
（6）、向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得；
（7）、将步骤（6）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板。
2.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl80g、kcl2g、Na2HPO414.2g、KH2PO42.7g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入温度为4℃下密闭保存即可。
3.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1moL/L的乙酸盐缓冲液按1：0.03：1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
4.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。
5.根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
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