CN105403699B

CN105403699B - 一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN105403699B
Application number: CN201510724056.6A
Authority: CN
Inventors: 唐青海; 阚云超; 姚伦广; 唐存多; 刘宗才; 焦铸锦; 李丹丹
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Hunan Perfect Animal Health Co.,Ltd.
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105403699A

Abstract

本发明公开了一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 µL阳性血清1管、50 µL阴性血清1管、20 µL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物显色液B液2管。本发明不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用，且检测灵敏、快速、准确。

Description

一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒。

背景技术

犬腺状病毒是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒。有2个血清型——血清Ⅰ型腺病毒既可引起犬传染性肝炎又可引起狐狸脑炎,故又称狐狸脑炎与犬传染性肝炎病；血清Ⅱ型可引起犬传染性喉气管炎和肠炎，经血清Ⅱ型腺病毒所制备的疫苗免疫过的动物能够抵抗血清Ⅰ型和血清Ⅱ型腺病毒的攻击，因此现在临床应用的主要是基于血清Ⅱ型腺病毒所制备的商品化疫苗。本病呈全球流行,而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。本病一年四季均可发生,各种性别、年龄和品种的犬、狐均易感染,但其中以离乳至一岁的动物,发病率和死亡率最高。犬作为一种与人类接触最为亲密的、与人类相处时间最长的宠物之一，与人类的日常生活已经密不可分，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，因此，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类健康具有重要的公共卫生意义。

目前我国对于其特异性抗体的检测方法主要有间接免疫荧光检测法、ELISA检测法、胶体金法和病毒中和试验。其中病毒中和试验，是现在疫苗企业评价犬腺病毒疫苗的主要方法，该方法需要临时培养细胞、调节要求高、难以高通量检测，而且操作人为因素影响大，而仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，而不能推广到基层养殖场和宠物医院临床一线检测之用。间接免疫荧光检测法是一种特异性和敏感性很高的检测方法，但是受温度、PH值、蛋白质浓度影响较大，目前临床应用方面尚有待进一步研究。胶体金便于临床定性分析犬腺病毒抗体阳性与阴性问题，而无法做到精确定量。ELISA是一项国内外通用的，目前在各个检测领域技术最为成熟的一种方法，商品化的试剂盒也非常好用。然而，目前国内的技术力量没有达到相应的国际水平，迟迟没有中国自己的犬腺病毒ELISA抗体检测试剂盒上市。

鉴于上述情况，开发一种能够适合工业化批量生产、质量可控、性能稳定、高通量、成本低廉、特异性和敏感性好的犬腺病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒十分必要，特别重要的是，该试剂盒的成本不能太高，否则，难以推广应用。基于以上种种背景，建立了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬腺病毒Ⅱ型所制备的疫苗IgG抗体检测试剂盒，能够快速、准确的进行检测。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 µL阳性血清1管、50 µL阴性血清1管、20 µL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物显色液B液2管。

所述包被犬腺病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤：

（1）、将培养单层犬肾细胞的培养瓶中的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm²单层犬肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶使洗涤液覆盖单层犬肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；

（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na₂溶液，每cm²单层犬肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na₂溶液为0.015mL，摇动培养瓶直至胰酶-EDTA-Na₂溶液覆盖单层犬肾细胞，室温下静置3min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na₂溶液，然后在温度为37℃条件静置5min，振动培养瓶直至单层犬肾细胞全部脱落，备用；

（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，每cm²单层犬肾细胞对应的MEM培养基溶液为0.4mL，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散犬肾细胞，直至犬肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；

（4）、用排枪吸取步骤（3）制备的细胞悬液，并以每孔100μL的量加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使细胞悬液在孔内均匀分布，之后将载有细胞悬液的免疫检测反应板放入温度为37℃、CO₂体积浓度为5%的培养箱中培养24h，倒掉96孔免疫检测反应板中的细胞悬液，并用PBS洗涤溶液清洗，备用；

（5）向步骤（4）处理过的96孔免疫检测反应板中加入无血清MEM培养基稀释过的稀释倍数为100倍的犬腺病毒Ⅱ型，使每孔病毒感染复数为5TCID₅₀，之后将96孔免疫检测反应板放入温度为37℃、CO₂体积浓度为5%的培养箱中培养15h，再把96孔免疫检测反应板的液体倒掉，并用PBS洗涤溶液清洗，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥1h，直至孔边缘处出现白色圈；

（6）、向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按35:65的体积比混合并搅拌均匀后制得；

（7）、将步骤（6）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被犬腺病毒Ⅱ型抗原的96孔免疫检测反应板。

进一步优化，所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1mol/L的乙酸盐缓冲液按5:0.026:5的体积比混合并搅拌均匀后制得。

进一步优化，所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。

有益效果

1、本发明所制备的试剂盒，在临床样品检测时操作流程简单，3小时之内可完成检测，结果判定只需要一台普通的倒置显微镜即可，不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用。

2、本发明试剂盒采用的二抗是能跟哺乳动物IgG结合的酶标SPA，其特异性很好，本发明试剂盒不仅能够用于检测犬腺病毒感染犬或者其疫苗免疫犬体内的特异性IgG抗体，同时也可以用于在采用小鼠或者兔子作为实验动物开展犬腺病毒免疫研究时，评价犬腺病毒Ⅱ型抗体IgG水平。也就是说，只要研究的对象——犬腺病毒不改变，换成其他哺乳动物作为研究模型时，不需要更换试剂盒中的二抗，这具有一般试剂盒不可比拟的优势。

3、本发明采用全病毒抗原制备反应板，能够检测到病毒编码的所有结构蛋白的抗体，因此，其检测十分敏感。

4、相比现有实验室方法中所采用的“中和试验”测定犬腺病毒Ⅱ型抗体，本发明所制备的试剂盒具有材料来源稳定、单一、可控；本发明所采用的犬肾细胞（MDCK）为传代细胞系，国际通用材料，背景清楚，本发明所制备抗原反应板后可长期保存，现场检测时无需临时细胞培养；而“中和试验”需要成熟的技术员和较好的硬件条件，要进行动物细胞培养，操作复杂、耗时、结果重复性不稳定，不具备工业化生产的前提条件。在安全性方面，本试剂盒所包被的为全病毒灭活抗原，在生物安全方面有很好的保障，而中和试验如果没有较好的试验硬件条件，病毒扩散的可能性很大。

5、相对于现有商品化的犬腺病毒ELISA抗体检测试剂盒制备所需要的高成本、高技术制备工艺和生产条件，本发明所制备的试剂盒，材料成本低廉、制备工艺简单，而其稳定性、灵敏度和高通量的特性可与商品化的犬腺病毒ELISA抗体检测试剂盒媲美。

具体实施方式

一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 µL阳性血清1管、50 µL阴性血清1管、20 µL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物显色液B液2管。

为了使本发明具有更好的实施效果，所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1mol/L的乙酸盐缓冲液按5:0.026:5的体积比混合并搅拌均匀后制得。所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg 3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。

每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.2 g、KH₂PO₄2.7g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入温度为4℃下密闭保存即可。

所述辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体制备方法，包括以下步骤：（1）SPA的制备：将金黄色葡萄球菌5 μL接种于液体培养基（培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl10g，葡萄糖5g，酵母提取物5g，水解酪蛋白0.5g，牛肉浸膏10g，去离子水1000 mL，充分搅拌溶解，高压灭菌使用），于37℃，220r/min摇床培养20 h，将菌液于98℃水中煮沸1.5 h，然后迅速冷却至4℃，在4000r/min条件下离心20 min，取上清液，再用1mol/L的HCl调pH至3.3，在4000r/min条件下离心20 min，弃掉上清，将沉淀溶于0.1mol/L pH 5.9的PBS中，4000r/min条件下离心20 min，取上清，加入95%乙醇至其浓度为70%，4000 r/min离心20 min，弃掉上清，所得到的沉淀即为粗制SPA，采用SephadexG-75凝胶层析进行SPA纯化,调整SPA浓度为5mg/mL；

（2）辣根过氧化物标记SPA：将5mg辣根过氧化物酶溶于1.0 mL 0.3mol/L pH8.1碳酸氢钠溶液中，加入含质量分数为1%二硝基氟苯的乙醇溶液0.1 mL，室温下搅拌1 h，加入1.0 mL0.08 mol/L NaIO₄,室温搅拌1h，然后加入0.16 mol/L 的乙二醇1 mL，室温搅拌1h，转入透析袋置于4℃条件下，对0.01 mol/L、 pH 为9.5碳酸钠缓冲液透析，换液3~4次；透析完毕将袋内溶液加入到0.1 mol/L、 pH为 9.5碳酸钠缓冲液1mL中去，室温搅拌1h,置于4℃，对0.02mol/L pH为7.1的PBS透析24 h，再用4 mmol/L硼氢化钠的PBS溶液透析12 h，置于4℃，对0.02 mol/L、pH为7.1 PBS透析24 h，透析结束后在4000r/min条件下离心10 min，取上清，用SephadexG-100凝胶层析,0.02mol/L pH7.1 PBS洗脱，得到辣根过氧化物标记SPA，产物加入终浓度为30%的甘油于-20℃保存备用。

该方法制备的辣根过氧化物标记SPA理化特点：SPA的分子量为15kDa，辣根过氧化物标记SPA在终浓度为30%的甘油缓冲液中于-20℃保存2年保持98%的活性。于-20℃保存1年保持96%的活性。

该方法制备的辣根过氧化物标记SPA能够跟多数哺乳动物（人、犬、兔、猪、豚鼠、小鼠和山羊）的免疫球蛋白IgG的Fc片段特异性结合。本该方法制备的辣根过氧化物标记SPA与犬的免疫球蛋白IgG的结合效率在98%以上，与禽类的免疫球蛋白不结合。

该方法制备的辣根过氧化物标记SPA在使用时采用PBS缓冲溶液（配制方法：NaCl8 g、kCl 0.2 g、Na2HPO4 1.42 g、KH2PO4 0.27g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入4℃下密闭保存即可。）稀释用，一般的稀释比例在1：3000至1:10000之间，用于一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测时最佳稀释比例为1：3000，与检测血清抗体的最佳反应时间为1小时。

所述犬腺病毒IgG抗体检测试剂盒的具体使用方法包括以下步骤：

一、试剂准备：

1．血清样品准备：新鲜、冷藏（4℃）和冷冻的猪血清样品均可用于检测。冷冻的血清在4℃下解冻，然后3000 r/min离心10 min，取上清用于检测。

2．洗涤液：10倍浓缩的洗涤液应恢复至室温，并充分的混合，确保结晶的盐溶解；在使用前用蒸馏水或去离子水作1：10稀释。无菌条件下配制的洗涤液可在4℃保存1周。例如，200 mL洗涤液需用20 mL浓缩洗涤液加入180 mL蒸馏水充分混合即可。

3．酶标抗体工作液：在使用前，用样品稀释液将酶标抗体作1：4000稀释，混匀，注意现用现配。例如，10 mL的酶标抗体工作液，取3 µL的酶标抗体加入到9 mL的样品稀释液中混匀，注意现用现配。

4．底物显色液：显色前，将底物A液和底物B液按照20：1的比例混匀即可，注意现用现配。

二、操作步骤

1．预温：在使用前，根据检测血清样本数量，取免疫检测反应板（根据样品数量，将未用孔用塑料膜封闭）、洗涤液及稀释液恢复至室温，轻轻均匀。

2．浸板：每孔注入200 µL的洗涤液，置室温浸洗一次，轻轻甩出洗液，吸水纸上轻叩。

3．样品稀释：用样品稀释液将待检样品、阴性血清对照品和阳性血清对照品作1：100倍稀释。例如：分别将待检和对照血清样品3 µL加入300 µL样品稀释液，混匀。如果要测定样品中IgG的滴度可以按照10倍的梯度稀释法稀释。

4．与血清样品反应：取上述稀释的血清样品分别加入到对应孔，每孔100 µL，依次注入反应板孔中，记录每个样品位置，将反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1 h。

5．洗板：每孔注入200 µL洗涤液，立即排除洗液，吸水纸上轻叩，重复3次。

6．与酶标抗体反应：每孔注入100 µL稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体，将反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1 h。

7．洗板：按步骤5进行。

8．底物显色：每孔注入100 µL底物显色液（现用现配），避光，于37℃温箱中反应15min。

9．终止反应：甩出反应液，每孔注入200 µL蒸馏水洗一次，每孔加入100 µL ddH2O观察结果。

10．在显微镜下观察各孔显色情况，进行样品结果判定。

三、结果判定

免疫检测反应板内细胞核内呈棕红色，细胞质无着色，判为阳性；细胞核内无着色反应判定为阴性。以检测血清阳性终点时最高稀释度的倒数表示抗体效价。

本发明试剂盒质量标准及检定：

特异性：120份阴性血清、120份阳性血清，分别采用进口ELISA试剂盒和本试剂盒进行检测，符合率不低于98%。

灵敏性：犬腺病毒Ⅱ型阳性血清12800倍稀释能检出（即1μL血清加到12800μL样品稀释液中，取其中100μL加入样品检测孔）能检出。

稳定性：将试剂盒置于37℃不少于3天与4℃存放的试剂盒同步检测10份样品，其符合率为100%。

试验1：

用本发明试剂盒检测初生犬体内腺病毒Ⅱ型IgG抗体水平：从广东一比格犬繁殖场采集出生后20天的犬血清30份（母犬均经过腺病毒疫苗免疫接种），用犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒按程序进行检测。

试验结果

生后20天的犬血清30份，其中27份为阳性犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体阳性，3份为阴性。阳性血清中最高的效价为800倍（800×），最低效价为10倍（10×）。所有阴性血清样品均已原倍检测为阴性结果。这些结果表明，30份血清中犬腺病毒IgG抗体阳性率为90%，说明，母犬的犬腺病毒疫苗免疫效果较好，幼犬经过哺乳后得到很好的母源抗体，对疾病具有一定的抵抗力；而其中3份，血清为犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体阳性，说明其母犬接种疫苗效果不佳，仔猪面临感染犬腺病毒的风险。

对比试验：30份血清样品同时采用国外商品化的是犬腺病毒ELISA抗体试剂盒进行同步检测，结果显示30份血清中2#、5#、27#样品为阴性，其他均为阳性。这些数据表明，本发明试剂盒与商品化的犬腺病毒ELISA抗体试剂盒具有很好的符合性。

表1 犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒检测广东一比格犬繁殖场犬血清抗体

试验2：

用本发明试剂盒检测犬腺病毒活疫苗免疫犬体内IgG动态变化：从乡村选取2只犬腺病毒抗体阴性（采用商品化的ELISA试剂盒检测）、4月龄犬，采用商品化的犬五联疫苗（犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感、犬钩端螺旋体）接种，免疫2次，间隔21天，在首次免疫前3天和第2次免疫后第7、14、21采集血清样本，采用本试剂盒程序进行IgG抗体检测。

试验结果

用本发明试剂盒检测商品化的犬五联疫苗免疫犬体内IgG动态变化：免疫前血清中犬腺病毒抗体均为阴性（血清原倍检测），2次免疫后第7、14、21天所采集的血清中IgG抗体呈明显的上升趋势。1#犬二次次免疫后第7、14、21天IgG滴度分别达到800倍、3200倍、12800倍。2#犬第二次免疫后第7、14、21天IgG滴度分别达到800倍、6400倍、12800倍。

试验1、试验2试剂的质量检定：

特异性：犬腺病毒IgG抗体检测试剂盒和ELISA分别对20份阴性血清、10阳性质控血清进行检测，符合率为98.5%；

灵敏度：两种试剂的灵敏度检定所用质控血清是用犬腺病毒活疫苗免疫试验犬制备的犬腺病毒阳性血清。检定结果表明：犬腺病毒IgG抗体检测试剂盒灵敏度可达到1：12800。

Claims

1.一种犬腺病毒Ⅱ型IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒内设有包被犬腺病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物酶标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5 mL每管的底物显色液B液2管；

（7）、将步骤（6）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被犬腺病毒Ⅱ型抗原的96孔免疫检测反应板；

所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1mol/L的乙酸盐缓冲液按5:0.026:5的体积比混合并搅拌均匀后制得；

所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg 3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。