CN101545907A

CN101545907A - 一种检测活病毒滴度的方法

Info

Publication number: CN101545907A
Application number: CN200810102905A
Authority: CN
Inventors: 李益民; 叶祥忠
Original assignee: Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Current assignee: Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2009-09-30

Abstract

本发明公开了一种检测活病毒滴度的方法，包括：(1)将稀释的待检病毒感染二倍体细胞或其他贴壁细胞，培养、固定；(2)向固定的细胞中加入病毒抗血清(一抗)，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，培养后洗涤，加入显色液显色，产生红色或褐色斑点；或者向固定的细胞中加入HRP标记的病毒抗血清，培养后洗涤，加入显色液显色，产生红色或褐色斑点；(3)根据红色或褐色斑点数和稀释倍数计算病毒滴度；或者根据稀释度和产生斑点孔数，计算病毒的1gTCID50值。本发明检测方法可适用于各种活病毒滴度的检测，检测速度快，可缩短病毒滴度检测时间；特异性好，免疫斑点是特异免疫反应所致；不需光学或荧光显微镜等专业仪器设备和其他试剂，检测成本低，操作简便。

Description

一种检测活病毒滴度的方法

技术领域

本发明涉及一种检测活病毒滴度的方法，尤其涉及一种采用酶联免疫斑点方法检测活病毒滴度的方法，属于生物制药领域。

背景技术

迄今为止，对于活病毒滴度的检测方法主要包括蚀斑法，终点稀释法和酶联免疫荧光法等三种，三种检测方法的主要检测过程及优缺点如下：

蚀斑法：该方法是测定病毒滴度最经典的方法，一般而言，1个蚀斑是由1个病毒粒子产生的，以蚀斑形成单位(PFU)表示。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到6孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到细胞形成单层进行试验。弃去培养液，加入合适稀释的水痘病毒，100ul/孔；37℃5％CO₂培养箱吸附，每20分钟摇匀一次，吸附40分钟；补加病毒培养液，3ml/孔，37℃5％CO₂培养箱培养8-10天；弃去病毒培养液，加入考马斯亮蓝染液，1ml/孔，染色10分钟；弃去染液，计蚀斑数，病毒滴度＝蚀斑数×稀释倍数×10(PFU/ml)。该方法存在几个方面的缺陷：1、检测时间长，一般需要8-10天；2、准确性不高，病毒感染细胞培养到8-10天，相邻的蚀斑可能联合到一起，降低了病毒滴度，也可能母斑病毒产生子斑，增加了病毒滴度，即导致试验重复性差；3、蚀斑只有数目多少，没有特异性表征，因而不能反映蚀斑是否由水痘病毒感染细胞引发的病变所致。

终点稀释法：以50％组织培养剂量(TCID₅₀)表示，TCID₅₀是指能使半数单层细胞孔(管)出现病变的病毒稀释度。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到96孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到细胞形成单层进行试验。取水痘病毒悬液，用病毒稀释液按10倍系列稀释(10^-1-10^-4)；稀释的病毒悬液加入到形成单层的组织培养细胞中，每稀释度感染4-12孔细胞，50ul/孔；37℃5％CO₂培养箱吸附40分钟；补加病毒培养液，50ul/孔，37℃5％CO₂培养箱培养8-10天；显微观察并记录每稀释度每孔细胞有无病变，记录的数据按Reed-Muench法或Karber计算病毒TCID₅₀值。该方法所存在的缺陷同蚀斑法一样，需要的时间长；结果观察需要显微操作，比较繁琐；也不能反映病斑的特异性。

酶联免疫荧光法：该方法的细胞培养、病毒感染培养同蚀斑法或终点稀释法。以96孔板为例，感染细胞培养24-48小时，弃去病毒维持液后，每孔加2％甲醛溶液100ul固定已感染的2BS细胞或MRC-5细胞；10分钟后，弃去甲醛溶液，用200ul PBS洗3次，2分钟/次；加50ulPBS稀释的1％牛血清白蛋白(BSA)到每个孔内孵育1小时；弃去BSA液，立即加入30ul人抗VZV血清，室温孵育1小时；用200ul PBS洗4次，2分钟/次；加入荧光素标记的羊抗人抗体，室温孵育1小时，然后用200ul PBS洗5次，2分钟/次；用装有CCD相机100X荧光显微镜观察每个孔的荧光灶，计数，荧光灶是由于感染所引起的；观察每孔中荧光灶数目，确定感染是否阳性；按标准方法计算病毒滴度(TCID₅₀)。该方法优点是检测所需的时间短，能反映病毒的特异性，但是，需要荧光显微镜，操作者需要专业经验，不同操作者之间测得结果相差较大。

总之，目前尚缺乏一种快速、准确、特异性高、检测成本低的活病毒滴度的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的检测病毒滴度的方法，该方法不仅快速，而且可以反映检测的特异性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种检测病毒滴度的方法，包括：

(1)将一步稀释或系列稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固定细胞；

(2)向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者向已固定的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；

(3)根据以下公式计算病毒滴度：病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量(毫升)；或者根据稀释度和产生红色或褐色斑点的孔数，计算病毒的lgTCID50值。

上述检测方法中，步骤(1)中所述的贴壁细胞优选自MRC-5细胞，2BS细胞、WI-38细胞、KMB17细胞或Vero细胞等贴壁细胞；步骤(1)中所述的培养优选为在以下条件进行细胞培养：培养温度为37℃，在5％CO₂培养箱中培养形成单层；步骤(1)中所述的固定剂优选自甲醛、甲醇、乙醇-乙酸、戊二醛或丙酮中的任意一种或一种以上按任意比例所组成的混合物。

步骤(2)中：所述的培养优选为在以下条件下进行细胞培养：培养温度25～37℃，培养时间为20-90分钟(更优选为30-60分钟)；所述的显色剂可以是3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)、二氨基联苯胺(DAB)等能被氧化生成不溶性沉淀物的HRP底物，优选为AEC；所述的酶标记的二抗优选为辣根过氧化物酶标记的二抗。

本发明利用了AEC、DAB等显色剂可被HRP催化生成不溶性沉淀的原理，采用免疫斑点的方法检测活病毒滴度，免疫沉淀的红色或褐色斑点都为待检病毒感染增殖所为，所染成的红色或褐色的斑点皆为待检病毒所特异的病斑。

本发明方法可适用于检测各种活病毒的滴度，用蚀斑法、终点稀释法或免疫荧光法检测滴度的病毒都可适用于本发明的方法检测其病毒滴度，例如，采用本发明方法可以检测甲肝病毒、狂犬病毒、风疹病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、水痘-带状疱疹病毒或SARS病毒等各种常见病毒的滴度。

本发明方法与现有的病毒滴度检测方法相比，主要具有以下几方面的优点：

1、检测速度快，可以缩短细胞病变的培养时间，如水痘病毒滴度的蚀斑法检测细胞病变需要培养8～10天，用该方法检测细胞病变只需要培养3天。

2、特异性好，免疫斑点是特异免疫反应结果，染成红/褐色的斑点皆为待检病毒所特异的病斑；

3、检测成本低，不需光学或荧光显微镜等专业仪器设备和其他试剂，不需要专业人士操作；

4、操作简便、快速。

附图说明

图1采用本发明酶联免疫斑点法检测水痘-带状疱疹病毒滴度的显色结果；

图2采用蚀斑法检测水痘-带状疱疹病毒滴度，细胞用考马斯兰染色的显色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

(1)细胞基质：二倍体细胞，如MRC-5细胞、WI-38细胞、Vero细胞(购自ATCC)，2BS细胞，KMB17(中科院昆明研究所)；

(2)细胞培养液：MEM，含0.03％谷氨酰胺、0.17％碳酸氢钠和10％牛血清；

(3)病毒维持液：MEM，含0.03％谷氨酰胺、0.24％碳酸氢钠和5％牛血清；

(4)固定液：甲醛、甲醇、乙醇-乙酸、戊二醛或丙酮；

(5)水痘-带状疱疹病毒抗血清(自制，水痘病毒抗体阳性血清，且乙肝、丙肝和艾滋病毒阴性的血清，在60℃灭活后分装，-70℃冻存)，羊抗人IgG-HRP(购自KPL)，AEC(购自Maxin-Bio)；

(6)狂犬病毒抗血清(自制，狂犬病毒抗体阳性血清，且乙肝、丙肝和艾滋病毒阴性的血清，在60℃灭活后分装，-70℃冻存)，羊抗人IgG-HRP(购自KPL)，AEC(购自Maxin-Bio)

实施例1 采用本发明方法测定水痘-带状疱疹病毒的滴度

(1)细胞培养

二倍体细胞(MRC-5、2BS或WI-38细胞)按1∶2分种率接种6孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到单层细胞。

(2)病毒感染、培养

将待检测的水痘-带状疱疹病毒(购自ATCC)用稀释液(1xPBS，含5％蔗糖，1％谷氨酸钠和10％小牛血清)按1:100稀释后，取0.1ml感染弃去培养液的6孔板细胞，轻轻摇匀后，放到37℃5％CO₂培养箱培养40分钟，期间摇匀1-2次后，补加病毒维持液，3ml/孔，细胞板置37℃5％CO₂培养箱培养3天。

(3)培养物固定

弃去6孔板的病毒维持液，用0.1％戊二醛固定培养物，1ml/孔，室温固定15分钟。

(4)过氧化氢处理

固定后的细胞用PBST洗涤2次后，加3％H₂O₂，1ml/孔，室温处理15分钟。

(5)酶联免疫检测

水痘-带状疱疹病毒抗血清用病毒稀释液按1:50稀释后，加入6孔板中，3ml/孔，37℃培养60分钟；1×PBST洗涤5次；加入HRP标记的二抗(羊抗人IgG)，37℃培养30分钟；1×PBST洗涤5次；加入AEC显色液，1ml/孔，室温显色不少于10分钟。

(6)结果判定及分析

AEC在HRP催化下生成红色不溶性物质沉积在病毒感染增殖位置，肉眼计红/褐色斑点数，病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量(ml)。

培养3天的病毒增殖的数目还较少，病斑比较小，没有出现病毒培养8-10天时的病斑较大所产生的临近病斑融合现象(图1、采用本发明酶联免疫斑点法检测病毒滴度的结果)。水痘-带状疱疹病毒感染培养3天的显色结果如下：

水痘-带状疱疹病毒滴度＝(28+25+25)÷3×100÷0.1＝26000PFU/ml

同时，将同一待检测的水痘-带状疱疹病毒按照现有的蚀斑法检测其病毒滴度，病毒感染培养8天后，细胞用考马斯兰染色，染色结果见图2，水痘-带状疱疹病毒滴度的结果如下：

水痘-带状疱疹病毒滴度＝(21+22+16)÷3×100÷0.1＝19667PFU/ml。

结论与分析：两种检测方法所得结果显示，本发明酶联免疫斑点法所检测的水痘病毒滴度要高于现有的蚀斑法。原因在于，本发明方法的细胞病变培养时间短，病斑小，没有邻近病斑融合带来的斑数减少、也不会出现细胞培养时间长而引发子斑产生所带来的斑数增加的问题，所以本发明方法相比于现有的蚀斑法，其检测结果更为准确；此外，本发明检测方法所呈现的红色或褐色免疫斑点是特异免疫反应所致，反映的是病毒感染细胞的结果，所以本发明检测方法的特异性更高。

实施例2 采用本发明方法测定狂犬病毒的滴度

(1)细胞培养

KMB17细胞按1:2分种率接种96孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到单层细胞。

(2)病毒感染、培养

将待检测的狂犬病毒(引自堪萨斯州立大学)用病毒维持液按10倍系列稀释后，感染弃去培养液的微孔板细胞，每个稀释度感染6孔，每孔0.1ml，摇匀后，放到37℃5％CO₂培养箱1天。

(3)培养物固定

弃去96孔板的病毒维持液，用0.1％甲醛和0.1％戊二醛溶液灭活固定培养物，0.1ml/孔，33℃灭活固定26小时。

(4)过氧化氢处理固定后的细胞

(5)酶联免疫检测

将待检测的狂犬病毒抗血清用病毒稀释液按1:50稀释后，加入96孔板中，0.1ml/孔，37℃培养60分钟；1×PBST洗涤5次；加入HRP标记的二抗(羊抗人IgG)，37℃培养30分钟；1×PBST洗涤5次；加入AEC显色液，1ml/孔，37℃显色不少于10分钟。

(6)结果判定及分析

AEC在HRP催化下生成红色不溶性物质沉积在病毒感染增殖位置，肉眼计每稀释度生成红色斑点的孔数。狂犬病毒滴度测定试验结果见表1：

表1 狂犬病毒滴度测定(接种剂量0.1ml)

10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8
10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8	+	+	+	+	+	+	-	-
+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-
+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+	+	+	-	+	-
+	+	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	+	-
+	+	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	-	-
+	+	+	+	+	-	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-

注：“+”表示有红/褐色斑点产生，“-”表示无红/褐色斑点产生。

实验数据用Karber法分析，计算狂犬病毒的组织细胞半数感染量(TCID₅₀)。lgTCID₅₀＝L+d(S-0.5)，L为每孔都有细胞病变的病毒最大稀释度的对数，d为组距，d＝log₁₀ ^稀释度，10倍系列稀释时d为1，S为阳性比率之和(从每孔都有细胞病变的病毒最大稀释度始)。lgTCID₅₀/0.1ml＝5+1×(6/6+4/6+2/6+0/6-0.5)＝6.5，则lgTCID₅₀＝1+6.5＝7.5/ml。

结论与分析：TCID₅₀是诸多病毒滴度检测的常用方法，常规采用蚀斑法或荧光法进行检测，前一种方法存在培养时间长的缺点，后者存在背景高、需要专业人士操作和需要使用特殊仪器的缺陷。而用本方法不仅可以缩短培养时间，不需要特殊仪器和专业人士，而且可以反映病斑的特异性。因而，本发明酶联免疫斑点是一种便利的检测病毒滴度的方法。

Claims

1、一种检测病毒滴度的方法，包括：

(1)将稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固定细胞；

(2)向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者向固定的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；

(3)根据以下公式计算病毒滴度：病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量，待检测病毒感染贴壁细胞的剂量单位为毫升；或者根据稀释度和产生斑点的孔数，计算病毒的1gTCID50值。

2、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的贴壁细胞选自MRC-5，2BS、WI-38、KMB17或Vero细胞。

3、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养是在5％CO₂培养箱中在培养温度为37℃的条件下培养。

4、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的固定剂选自甲醛、甲醇、乙醇-乙酸、戊二醛或丙酮中的一种或几种的混合物。

5、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中将待检测的病毒采用一步稀释或系列稀释法稀释后感染贴壁细胞。

6、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的培养为在温度为25-37℃的条件下培养20-90分钟。

7、按照权利要求6的方法，其特征在于：所述的培养为在温度为25-37℃的条件下培养30-60分钟。

8、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的显色剂是3-氨基-9-乙基-咔唑或二氨基联苯胺。

9、按照权利要求1的方法，其特征在于：所述的待检测病毒为甲肝病毒、狂犬病毒、风疹病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、水痘-带状疱疹病毒或SARS病毒。