CN102455359A - 一种用于ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用 - Google Patents

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武佳
叶思灵
黄红军
陈国泽
夏清梅
潘讴东
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Abstract

本发明涉及一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用。本发明设计对Ⅴ型腺病毒滴度检测采用酶联免疫的方法，极大地提高了测定的精度，缩短了时程。为Ⅴ型腺病毒滴度检测应用提供了一种新方法。

Description

一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用。
背景技术
腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9 nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55×103Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup）。而Ⅴ型腺病毒是目前最常用的腺病毒，具有广泛的应用前景。腺病毒可以感染并且在HEK293细胞中复制，而5型腺病毒表达一种特殊的外壳蛋白Hexon，感染腺病毒的HEK293细胞使用甲醇固定后，再用抗Hexon的一抗孵育，一抗会与腺病毒上的Hexon蛋白结合，此时加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，待二抗与一抗结合后再加入辣根过氧化物酶的底物DAB进行染色，然后洗脱多余的染色液，被病毒感染的阳性细胞会被染成褐色，计数阳性细胞，利用公式计算病毒滴度。而其测定方法目前仅限于TCID50法，该检测方法耗时长，可重复性低，为精确测定带来极大挑战。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种测定Ⅴ型腺病毒滴度的酶联免疫法。
本发明的目的之二在于提供该酶联免疫法的操作方法。
本发明的目的之三在于提供该酶联免疫法的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒，其特征在于该该试剂盒测定Ⅴ型腺病毒滴度采用了酶联免疫法。
一种制备根据权利要求1所述的用于测定Ⅴ型腺病毒滴度的酶联免疫法，其特征在于该方法的具体步骤为：
(1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5%CO2培养1小时。
(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μl病毒样品。
(3) 37℃、5% CO2感染2天。
(4)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃孵育20min。
(5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
(6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。
(7)加入0.25ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。
(8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
(9)加入0.25ml1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。
(10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
(11)加入0.25ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育10min。
(12)弃DAB，使用PBS冲洗2次，每孔加入1mlPBS。
(13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
(14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度，公式如下：
Figure DEST_PATH_RE-950904DEST_PATH_IMAGE001
根据权利要求1所述的Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒在测定Ⅴ型腺病毒滴度中的应用。
本发明设计对测定Ⅴ型腺病毒滴度采用了酶联免疫法，并应用人胚胎肾细胞HEK293为模型研究其对Ⅴ型腺病毒滴度检测的精确性。为酶联免疫法在Ⅴ型腺病毒滴度检测应用提供了一种新手段。
       具体实施方式：
HEK293细胞的培养：人胚胎肾细胞HEK293细胞系培养于37℃，5%CO2恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混匀细胞；用移液器将其移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，并吹打混匀；加约7ml细胞悬液于装有1ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。
病毒的感染：(1)选取状态良好的两组HEK293细胞：TCID50病毒滴度，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5%CO2培养1小时。(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μl病毒样品。(3) 37℃、5%CO2感染10天或2天。然后分别用TCID50和Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒进行检测，如图1，图2和表一所示。
图1为TCID50法检测Ⅴ型腺病毒滴度的结果。
图2为和Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒检测Ⅴ型腺病毒滴度的结果。
  
表一. Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒和TCID50腺病毒滴度检测的差异
  TCID50法 Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒
实验时间 10天 2.5天
实验原理 病毒感染细胞，在细胞内复制使细胞病变，观察病变细胞 病毒感染细胞，抗体耦合病毒颗粒，染色计数
实验操作 将HEK293细胞接种于96孔板中，病毒原液做梯度稀释，加入96孔板中，共需要加80个孔，操作复杂 只需将HEK293细胞接种于24孔板中，4个孔即可，病毒稀释液也只需加8个孔，操作简单
实验结果 不容易观察，10天之后病变细胞于未病变细胞不容易区分 阳性细胞被染成褐色，容易观察
重复性 实验结果基本不可重复 实验结果重复性高
五、结果：通过Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒进行病毒滴度检测，比传统的TCID50法更精确，可重复性高，时程短，极大地促进了Ⅴ型腺病毒滴度检测的效率和数据可信度。

Claims (3)

1.一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用，其特征在于该试剂盒测定Ⅴ型腺病毒滴度采用了酶联免疫法。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于测定Ⅴ型腺病毒滴度的酶联免疫法，其特征在于该方法的具体步骤为：
  (1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5%CO2培养1小时。
  (2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μl病毒样品。
(3) 37℃、5%CO2感染2天。
  (4)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃孵育20min。
  (5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
  (6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。
  (7)加入0.25ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。
  (8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
   (9)加入0.25ml1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。
   (10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
   (11)加入0.25ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育10min。
    (12)弃DAB，使用PBS冲洗2次，每孔加入1mlPBS。
    (13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
     (14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度，公式如下：
Figure 2010105114462100001DEST_PATH_IMAGE001
。
3.根据权利要求1所述的Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒在测定Ⅴ型腺病毒滴度中的应用。
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Cited By (4)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN104407147A (zh) * 2014-08-25 2015-03-11 北京合康源生物科技有限公司 一种水痘病毒滴度快速检测方法
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Cited By (5)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103777009A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 辽宁成大动物药业有限公司 一种使用辣根过氧化物酶标抗体检测猪瘟弱毒病毒滴度的方法
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CN104407147A (zh) * 2014-08-25 2015-03-11 北京合康源生物科技有限公司 一种水痘病毒滴度快速检测方法
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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