CN117233387A - 一种杆状病毒滴度测定方法、试剂盒 - Google Patents

一种杆状病毒滴度测定方法、试剂盒 Download PDF

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CN117233387A CN202311514569.5A CN202311514569A CN117233387A CN 117233387 A CN117233387 A CN 117233387A CN 202311514569 A CN202311514569 A CN 202311514569A CN 117233387 A CN117233387 A CN 117233387A
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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种杆状病毒滴度测定方法、试剂盒。方法包括步骤：选取细胞进行稀释，稀释细胞后将细胞液放入多孔细胞培养板，细胞培养；按不同倍数稀释杆状病毒液；在多孔细胞培养板中，吸弃细胞上清，将稀释后的病毒液感染细胞；弃上清，成膜孵育；加入固定液固定；吸弃上清，洗板，封闭；弃上清，加入一抗，孵育，弃上清，洗板；弃上清，加入二抗，孵育，弃上清，洗板；弃上清，加入显色液，避光放置，计数，观察蓝斑，计算蓝斑数，计算病毒滴度。本发明能在确保检测效果的情况下，用BSA替换山羊血清，降低成本，还能缩短成膜孵育时间。

Description

一种杆状病毒滴度测定方法、试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种杆状病毒滴度测定方法、试剂盒。
背景技术
杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是一种真核表达系统，该系统表达的蛋白在生物活性、翻译后修饰、结构和免疫活性等方面与天然蛋白质相似，应用于疫苗、抗体、生物农药和基因治疗中。在大规模表达蛋白之前，需要进行大量优化试验以确保最合适的表达条件。BEVS表达外源蛋白过程中需要对各种工艺参数进行优化，如细胞接种密度、接毒时间、接毒量等，其中感染复数（multiplicity of infection，MOI）是优化表达的重耍的参数之一。为获得合适的MOI，需要准确测定杆状病毒原液的滴度，并确保在后续实验中具有参考性，即需要一种快速稳定的杆状病毒滴度测定方法。
现有技术中，美国Clontech公司研发了BacPAK杆状病毒快速滴度测定试剂盒，该试剂盒是以杆状病毒gp64蛋白的抗体作为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体作为二抗，显微镜下计数蓝斑数量，根据公式（病毒含量（IFU/mL）＝平均蓝斑数量×稀释度的倒数×40）计算病毒滴度。该试剂盒操作过程中，通常成膜孵育阶段需要27℃孵育43~47h，封闭阶段都使用山羊血清进行封闭。一般情况下，山羊血清能降低背景和假阳性，但成本也高于其他血清，如BSA；但为了检测结果的准确性，在杆状病毒快速滴度测定中，目前还未有用其他血清替代山羊血清的方法。
另外，此类试剂盒对细胞活力（如细胞代次）、病毒新鲜度（如病毒感染时间）要求较高，这会导致此类试剂盒的限制性较高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种杆状病毒滴度测定方法，该方法能在确保检测效果的情况下，用BSA替换山羊血清，降低成本，还能缩短成膜孵育时间。
一种杆状病毒滴度测定方法，包括以下步骤：
细胞培养：稀释细胞后将细胞液放入多孔细胞培养板，然后进行细胞培养，得到培养后的细胞；
稀释病毒液：按不同倍数稀释杆状病毒液，得到稀释后的病毒液；
病毒感染细胞：在所述多孔细胞培养板中，吸弃细胞上清，将所述稀释后的病毒液感染细胞，病毒感染细胞后，得到感染过病毒的多孔细胞培养板；
成膜孵育：吸弃所述感染过病毒的多孔细胞培养板中的病毒上清液，再加入成膜孵育溶剂，孵育，得到孵育后的多孔细胞培养板；
固定：在所述孵育后的多孔细胞培养板中加入固定液固定；固定后，吸弃上清，洗板，得到洗板后的多孔细胞培养板；
封闭：将封闭液加入所述洗板后的多孔细胞培养板进行封闭，弃上清，洗板，得到加过封闭液的多孔细胞培养板；所述封闭液包括复配血清，所述复配血清包括BSA、PBST；
采用上述技术方案，结合其他步骤，本申请成功用BSA替换常规的山羊血清，能够降低成本，并验证了技术效果不逊色现有的试剂盒。
加入一抗：弃去所述加过封闭液的多孔细胞培养板的上清，加入一抗，孵育，弃上清，洗板，得到加入一抗的多孔细胞培养板；
加入二抗：弃去所述加入一抗的多孔细胞培养板的上清，加入二抗，孵育，弃上清，洗板，得到加入二抗的多孔细胞培养板；
检测：弃去所述加入二抗的多孔细胞培养板的上清，加入显色液，避光放置，计数，观察蓝斑，计算所述加入二抗的多孔细胞培养板每孔中的蓝斑数，计算病毒滴度。
优选的，在细胞培养中，选取细胞代次3~18代的细胞进行稀释。
采用上述技术方案，本申请能扩大细胞代次的选择范围，能够降低细胞活力对病毒滴度检测结果的影响。
优选的，在细胞培养中，将细胞液放入多孔细胞培养板中，所述多孔细胞培养板的细胞密度为3.25×104~13×104个/孔；
在稀释中，用培养基梯度稀释病毒液，稀释倍数包括104、105、106倍，当病毒液滴度较低时，可稀释较低倍数，如101、102、103倍；
在病毒感染细胞中，病毒加入到细胞中后，27~30℃孵育1~5h，得到感染过病毒的细胞板。
优选的，在成膜孵育中，所述成膜孵育溶剂包括甲基纤维素，孵育时间为24~48h；所述甲基纤维素的加入量为50~150μL，所述甲基纤维素的浓度为0.7~1.5%。
优选的，在固定中，所述固定液包括多聚甲醛、丙酮、自制多聚甲醛中的至少一种，固定时间为10~60 min。
优选的，所述多聚甲醛的加入量为100~150μL，所述多聚甲醛的浓度为1~3%。
优选的，所述多聚甲醛为自制多聚甲醛，所述自制多聚甲醛的配制方法为：用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制磷酸盐缓冲液，取多聚甲醛粉末放入纯水中水浴加热，边搅拌边加入NaOH，搅拌至澄清，冷却至室温，除菌过滤，加入所述磷酸盐缓冲液，混匀测pH，pH为7~8的为可使用的自制多聚甲醛。
优选的，在加入一抗中，加入的一抗为用稀释液一稀释的gp64抗体，所述稀释液一包括PBST，稀释倍数为2000~40000倍；加入一抗后孵育的时间和温度分别为20~60min和30~40℃；
在加入二抗中，加入的二抗为用稀释液二稀释的HRP羊抗鼠抗体，所述稀释液二包括PBST，稀释倍数为250~1000倍；加入二抗后孵育的时间和温度分别为20~60min和30~40℃。
优选的，在检测中，所述显色液包括TMB显色液、自制沉淀型TMB显色液。
优选的，所述TMB显色液为自制沉淀型TMB显色液，所述自制沉淀型TMB显色液的配制方法为：取化合物海藻酸、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、硫酸葡聚糖钠盐、卡拉胶于反应瓶中，再加入单组份TMB显色液，超声溶解，得到自制沉淀型TMB显色液。
采用上述技术方案，先用病毒感染细胞，然后用AcMNPV包膜糖蛋白(gp64)的一级单克隆抗体标记样本中的感染细胞，再用二级酶标抗体（HRP）结合被一抗标记的受感染的细胞，最后用TMB显色液结合二抗与一抗结合的产物，接着可以在倒置显微镜下计数蓝斑的数量，计算滴度。
优选的，洗板的清洗剂包括PBST，该PBST包括加钙离子和镁离子的PBST、不加钙离子和镁离子的PBST中的至少一种。
本发明的另一个目的在于还提供一种杆状病毒滴度测定试剂盒，所述试剂盒采用所述的杆状病毒滴度测定方法测定杆状病毒滴度。
本发明的有益效果是：
第一，结合下述技术手段，在封闭步骤中，本申请成功用BSA替换常规的山羊血清，能够降低成本，并验证了技术效果不逊色现有的试剂盒。
第二，本申请通过控制变量分别进一步研究各步骤对结果的影响，降低测定方法和试剂盒使用的限制性，发现：
1）细胞密度：细胞培养中，当细胞液的细胞密度限定为3.25~13×104个/孔时，蓝斑形态比较稳定，此细胞密度范围较佳。
2）感染时间：病毒感染细胞中，在成膜孵育48h的前提下，病毒感染细胞1h和病毒感染细胞5h，滴度数据显示都在一个数量级，但病毒感染细胞5h后蓝斑更大更圆更容易计数。所以，病毒感染细胞1~5h是较佳范围，优选5h。
3)成膜孵育时间：成膜孵育中，成膜孵育24h和48h的滴度平均值相差不大，孵育48h后蓝斑更大更圆更容易计数，说明本申请能将成膜孵育时间缩短至24h，大大降低了时间成本，如果不考虑时间，可优选48h，如果为了节省时间，可优选24h，在本申请的方法中24h也可确保检测效果。
4）多聚甲醛的浓度：固定中，本申请测试了不同浓度的自制多聚甲醛对实验结果的影响，0.5%自制多聚甲醛蓝斑图中小斑点略多，不利于最终计数，4.0%自制多聚甲醛无蓝斑，所以优选1.0%~3.0%自制多聚甲醛，此浓度范围的多聚甲醛用于杆状病毒滴度测定效果更佳。
5）固定时间：在使用1.0%~3.0%自制多聚甲醛进行固定时，可以固定10~60min，优选30min。如果为了节约时间，可以选择固定10min，同样具有很好的固定效果。
6）一抗稀释倍数：在对gp64一抗进行稀释时，可以稀释2000~40000倍，优选30000倍。如果为了节约试剂，可以选择稀释40000倍，同样具有很好的结合效果。
7）二抗稀释倍数：在对HRP二抗进行稀释时，可以稀释250~1000倍，优选1000倍。如果为了节约试剂，可以选择稀释1000倍，同样具有很好的结合效果。
8）发明人进一步研究了洗板和摇床时间，在洗板3次情况下，每次摇床时间不同，滴度和蓝斑结果没有太大区别，摇床时间可选择0~5min，所以为了节约时间，洗板后可省去摇床。
9）耐用性-细胞代次不同：细胞状态随代次增加会降低，但是并不影响滴度检测；用P3代细胞检测病毒滴度结果在107数量级，使用P18代细胞，滴度检测结果仍在107数量级，所以细胞P18代时仍可以用来做滴度检测，且根据实验，可选取细胞代次3~18代的细胞。说明本申请方法中，较高代次的细胞仍可使用，扩大了可使用细胞的代次范围，避免现有试剂盒对细胞活力的高要求。
10）耐用性-PBST配方不同：从滴度看，加钙离子镁离子的PBST洗板滴度平均值为5.20E+07，不加钙离子镁离子的PBST洗板滴度平均值为4.27E+07，差别不大。从蓝斑形态看，蓝斑清晰圆润，都有个别小的蓝斑，差别不大。所以，使用加/不加钙离子镁离子的PBST洗板，对实验结果无影响。说明本申请方法中，降低了甚至避免了钙镁离子对实验结果的影响。
11）专属性：观察杆状病毒/ CHO-S细胞上清/293F细胞上清/Sf9细胞上清对滴度检测是否有影响，发现本申请的方法只能检测出杆状病毒，本申请的检测方法对杆状病毒检测的专属性和特异性较高。
12）精密度-重复性：进行了6次平行实验，变异系数为16.31%，小于30%，说明本申请方法重复性良好。
13）精密度-中间精密度：使用不同的操作人员，进行了共12次平行实验，12次操作滴度数据的变异系数为17.71%，小于30%，且不同操作人员的数据相接近。说明此方法中间精密度良好，可避免人为因素影响，抗干扰性强。
14）与市售TaKaRa杆状病毒滴度检测试剂盒对标实验：自制试剂盒与市售TaKaRa试剂盒的变异系数分别是14.65%和23.15%，均小于30.0%，说明自制试剂盒用来测杆状病毒滴度与市售试剂盒测杆状病毒滴度效果几乎无差别，甚至采用本申请的测定方法的自制试剂盒的变异系数更低。
15）将自制沉淀型TMB显色液与外购的TMB显色液Ⅲ进行显色对比，显色结果表明，滴度结果基本一致，自制沉淀型TMB显色液的蓝斑更圆润和清晰，自制的显色液效果更佳。
综合上述，本申请耗时短，可缩短从准备到检测的时间，且保证检测效果的准确性，本申请的方法抗干扰性强，检测效果佳，从多方面进行优化，包括细胞密度、固定液的比例、孵育时间等。对建立的杆状病毒滴度测定方法的各项条件摸索，并且进行方法验证，验证结果显示该方法具有良好的耐用性、精密度；与同类型市售试剂盒对标，结果相差不大，甚至本申请的变异系数更低，而且本方法能用BSA替代山羊血清，成本低，实用性更高，更加稳定，为杆状病毒表达外源蛋白的工艺参数提供了依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中不同细胞密度下的蓝斑对比系列图（10倍物镜）；
图2为本发明实施例3中病毒感染不同时间下的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图3为本发明实施例4中不同成膜孵育时间下的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图4为本发明实施例5中不同浓度自制多聚甲醛的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图5为本发明实施例6中不同固定时间下的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图6为本发明实施例7中不同稀释倍数的一抗的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图7为本发明实施例8中不同稀释倍数的二抗的蓝斑对比系列图（20倍物镜）；
图8为本发明实施例9中不同摇床时间下的蓝斑对比系列图（20倍物镜）；
图9为本发明实施例10中自制沉淀型TMB显色液与外购TMB显色液对比图（4倍物镜）；
图10为本发明实施例11中不同PBST的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图11为本发明实施例12中不同病毒液类型的蓝斑对比系列图（4倍物镜）；
图12为本发明实施例13中精密度实验的折线对比图；
图13为本发明实施例14中自制杆状病毒试剂盒的蓝斑系列图（4倍物镜）；
图14为本发明实施例14中TaKaRa试剂盒的蓝斑系列图（4倍物镜）；
图15为本发明实施例14中本发明试剂盒与TaKaRa杆状病毒滴度检测试剂盒对标实验的折线对比图。
其中，图2和图3中的第二张蓝斑图相同，其实验条件相同，但是用于不同实施例中设置的不同对比实验，因此并不矛盾。
上述不同实施例中，发明人每个平行实验放入一个组别的蓝斑图来表明实验效果，计算蓝斑个数时，过小或不清晰的蓝斑不计入。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
若如无特别说明，实施例中所使用的材料均可容易地从商业公司获取，其中，
一、厂家型号：
Sf9细胞，购自Thermo Fisher Scientific公司的ExpiSf9细胞；
Gp64 抗体，购自义翘神州，AcmNPV-gp64 Antibody（40496-M001）；
HRP羊抗鼠抗体（HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG），购自生工生物工程(上海)股份有限公司，D110087-0001；
Rapid Titer Kit User Manual BacPAK™ Baculovirus，购自TaKaRa，631406；
杆状病毒液，购自云舟生物，批号：230103；
甲基纤维素，购自阿拉丁，M112866；
多聚甲醛，购自sigma，8187150100；
牛血清蛋白BSA，购自北京索莱宝科技有限公司，A8010；
吐温20，购自碧云天生物技术，ST825-100ml；
TMB显色液Ⅲ，购自湖州英创生物科技有限公司，TMB-P-001；
单组份TMB显色液，购自碧云天生物技术，P0209(用于配制自制沉淀型TMB显色液)；
自制沉淀型TMB显色液，自制方法在实施例1中说明。
二、以下为部分母液配制方法：
1、PBS（5×）配制：将3.36g磷酸二氢钠、10.22g磷酸氢二钠，以及87.66g氯化钠放至2L烧杯中，加入960mL纯水将其超声溶解，再用16mL 0.1M氢氧化钠调节pH至7.4，定容至1L，再用0.22μm滤膜过滤，常温保存。取用时稀释至1×即可。
2、PBST：500ml PBS（1×）+250μL 吐温20(0.05%)；
3、甲基纤维素：先用纯水配成3%的甲基纤维素溶液：称取甲基纤维素3.02g加入纯水100ml，121℃，40min，灭菌，4℃过夜搅拌均匀，得到3%的甲基纤维素溶液。使用时，于生物安全柜用培养基稀释4.3倍后使用。稀释方法为： 3%的甲基纤维素溶液1ml和3.3ml培养基稀释得到4.3ml的0.7%甲基纤维素。
甲基纤维素平时保存于-20℃，使用时需提前取出融化。
多聚甲醛保存于-20℃中使用时要提前取出放置至常温，取出后4℃最多保存一周。
实施例1
一种杆状病毒滴度测定方法，包括如下步骤：
(1)细胞培养：Sf9细胞计数，将细胞稀释至0.5~2.0×106cell/mL，于96孔板中每个孔中加65μL细胞液，细胞液的细胞密度为3.25~13×104个/孔，放入湿纸袋中，密封，27~30℃培养30~90 min，得到培养后的细胞；
此步骤中，铺细胞板铺好后需要在显微镜下观察96孔板中是否有细胞，细胞是否均匀。
(2)稀释：用培养基10倍梯度从10-1、10-2、10-3、10-4，10-5和10-6稀释杆状病毒液，得到稀释后的病毒液；测定时只加入稀释倍数为104、105、106的病毒液；
(3)病毒感染细胞：在96孔板中，吸弃细胞上清，加入稀释后的病毒液，稀释后的病毒液的稀释倍数为104、105、106，这三种稀释倍数的病毒液各加入25μL，104、105稀释梯度设置2~4个复孔，106稀释梯度设置2~4个复孔，27~30℃孵育1~5h；对照孔加相同体积稀释液，得到感染过病毒的96孔板；
(4)成膜孵育：吸弃感染过病毒的96孔板中的病毒上清液以及对照孔上清液，再加入浓度为0.7~1.5%的甲基纤维素50~150μL，将96孔板放置于湿袋中，于27~30℃培养箱孵育24~48 h，得到孵育后的96孔板；
(5)固定：取出孵育后的96孔板，每孔加入浓度为1~3%的多聚甲醛100~150μL进行固定，室温固定10~60 min，吸弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0-5 min/次，得到洗板后的96孔板，其中多聚甲醛使用前提前拿出融化，多聚甲醛也可用丙酮或自制多聚甲醛替代；
不同比例的自制多聚甲醛的配制方法：
配制NaOH：取4g氢氧化钠至10ml纯水中，得到10N的NaOH，
配制磷酸盐缓冲液：准备800ml纯水倒入1L烧杯中，加入磷酸氢二钠23.08g，再加入磷酸二氢钠7.11g，调节pH到7.4，0.22um过滤，得到磷酸盐缓冲液。最后取多聚甲醛0.5g、1g、2g、3g、4g分别放入50ml纯水中，60℃水浴加热，边搅拌边加入1滴10N的NaOH，搅拌至澄清，冷却至室温，除菌过滤，各加50ml 0.2M磷酸盐缓冲液，总体积100ml，混匀测pH，pH在7-8范围内的为可使用的自制多聚甲醛，然后将可使用的自制多聚甲醛分装，在-80℃保存备用。
(6)封闭：将50μL的4%的BSA加入洗板后的96孔板，然后置于摇床上室温封闭5-20min，弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0-5 min/次，得到加过封闭液的96孔板；
其中，4%的BSA用PBST配制，配制比例为0.8g牛血清蛋白加20ml的PBST。
(7)加入一抗：弃去加过封闭液的96孔板的上清，每孔25μL的一抗，一抗为PBST稀释的gp64抗体，稀释倍数为2000~40000倍，加完将96孔板置于37℃培养箱孵育20~60min；之后弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0~5 min/次，得到加入一抗的96孔板；
(8)加入二抗：弃去加入一抗的96孔板的上清，每孔加入50μL二抗，二抗为用PBST稀释的HRP羊抗鼠抗体，稀释倍数为250~1000倍，加完将96孔板置于37℃培养箱孵育20~60min；弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0~5 min/次，得到加入二抗的96孔板；
(9)检测：弃去加入二抗的96孔板的上清，每孔加入50μL过氧化物酶显色底物TMB显色液，室温避光放置20min~3h后，计数，于显微镜镜下观察蓝斑，先从106稀释的病毒液孔中开始计数，计算每孔中的蓝斑数，计算IFU/mL。
其中，TMB显色液为自制沉淀型TMB显色液，自制沉淀型TMB显色液的配制方法为：取化合物海藻酸25mg、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物50mg、硫酸葡聚糖钠盐175mg、卡拉胶40mg于50ml棕色塑料瓶中，再加入单组份TMB显色液（碧云天生物技术的P0209型号）50ml，超声溶解，得到自制沉淀型TMB显色液。
另外，发明人发现，上述步骤中，1）需要移液时，选择低吸附枪头效果较佳，滴加病毒液时需从孔正上方滴加。2）吸弃细胞上清、吸弃病毒液时需从侧面小心吸弃，不可破坏细胞层。3）装有96孔板和湿纸的密封袋放入培养箱时，需密封或留有小口，不可敞开大口。4）拍板时用力不要太大，拍掉液体即可。
以下在实施例2~实施例10中，通过控制变量分别进一步研究各步骤对结果的影响。
实施例2
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（1）进一步研究，
(1)细胞培养：Sf9细胞计数，将细胞稀释至0.5~2.0×106cell/mL（即为铺板时细胞密度），于96孔板中每个孔中加65μL细胞液，细胞液的细胞密度为3.25~13×104个/孔，放入湿纸袋中，密封，27~30℃培养30~90 min，得到培养后的细胞；
分别记录细胞密度为3.25×104个/孔、6.5×104个/孔、13×104个/孔且选取被稀释105病毒液感染的蓝斑图和滴度数据，结果参照图1和表1。
表1
结果分析：细胞密度3.25×104个/孔、6.5×104个/孔、13×104个/孔都可以测滴度，蓝斑形态没有很大区别，不影响滴度计算。
实施例3
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（3）进一步研究，
(3)病毒感染细胞：在96孔板中，吸弃细胞上清，加入稀释后的病毒液，稀释后的病毒液的稀释倍数为104、105、106，这三种稀释倍数的病毒液各加入25μL，104、105稀释梯度设置2~4个复孔，106稀释梯度设置2~4个复孔，27~30℃孵育1~5h；对照孔不做处理，得到感染过病毒的96孔板；
选取病毒感染细胞中孵育时间分别1h和5h，成膜孵育48h且选取被稀释106病毒液感染的进行记录，结果参照图2和表2。
表2
结果分析：在成膜孵育48h的前提下，病毒感染细胞1h和病毒感染细胞5h，滴度数据显示都在相同数量级，但病毒感染细胞5h后蓝斑更大更圆更容易计数，病毒感染细胞1h后形态较小的蓝斑较多。所以，病毒感染细胞1~5h都适用于病毒滴度测定，5h更易于计数。
实施例4
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（4）进一步研究，
(4)成膜孵育：吸弃感染过病毒的96孔板中的病毒上清液，再加入浓度为0.7~1.5%的甲基纤维素50~150μL，将96孔板放置于湿袋中，于27~30℃培养箱孵育24~48 h，得到孵育后的96孔板；
细胞被稀释106病毒液感染，病毒感染细胞5h，甲基纤维素浓度0.7%，上述实验条件下，记录27℃成膜孵育24h和48h的结果，参照图3和表3。
表3
结果分析：图3可看出孵育48h后蓝斑更大更圆更容易计数，表3可看出成膜孵育24h和48h的滴度平均值相差不大，对滴度检测影响较小，说明本申请能将成膜孵育时间缩短至24h，大大降低了时间成本。
实施例5
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（5）进一步研究，
(5)固定：取出孵育后的96孔板，每孔加入浓度为1~3%的自制多聚甲醛100~150μL进行固定，室温固定30 min，吸弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0~5 min/次，得到洗板后的96孔板；
本实施例中，控制细胞被稀释106病毒液感染，改变自制多聚甲醛的比例/浓度，选取0.5%自制多聚甲醛、1.0%自制多聚甲醛、2.0%自制多聚甲醛、3.0%自制多聚甲醛、4.0%自制多聚甲醛，记录滴度检测结果，参照图4和表4。
表4
结果分析：0.5%自制多聚甲醛蓝斑图中小斑点略多，不方便蓝斑计数，4.0%自制多聚甲醛无蓝斑，所以1.0%-3.0%自制多聚甲醛用于杆状病毒滴度测定效果更佳。
实施例6
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例5，对步骤（5）进一步研究，
(5)固定：取出孵育后的96孔板，每孔加入浓度为1~3%的自制多聚甲醛100~150μL进行固定，室温固定10~60 min，吸弃上清，用200μL PBST洗板三次，0~5 min/次，得到洗板后的96孔板；
本实施例中，控制细胞被稀释106病毒液感染，自制多聚甲醛的浓度为2%，改变固定时间，记录其结果，参照图5和表5。
表5
结果分析：以使用2%多聚甲醛为例，当多聚甲醛固定时间分别为10、20、30、40、50、60min时，检测的病毒滴度均在相同数量级且差异不大，实验中可在10~60min选择多聚甲醛固定时间。
实施例7
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（7）进一步研究，
(7)加入一抗：弃去加过封闭液的96孔板的上清，每孔25μL的一抗，一抗为PBST稀释的gp64抗体，稀释倍数为2000~40000倍，加完将96孔板置于37℃培养箱孵育20~60min；之后弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0~5 min/次，得到加入一抗的96孔板；
本实施例中，控制细胞被稀释106病毒液感染，改变一抗稀释倍数，记录其结果，参照图6和表6。
表6
结果分析：由图6和表6可知，当一抗稀释2000~40000倍时，检测的病毒滴度均在一个数量级上且差异不大，在实验中可在2000~40000倍范围内选择一抗稀释倍数。
实施例8
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（8）进一步研究，
(8)加入二抗：弃去加入一抗的96孔板的上清，每孔加入50μL二抗，二抗为用PBST稀释的HRP羊抗鼠抗体，稀释倍数为250~1000，加完将96孔板置于37℃培养箱孵育20~60min；弃上清，用200μL的PBST洗板三次，0~5 min/次，得到加入二抗的96孔板；
本实施例中，控制被稀释106病毒液感染，改变二抗稀释倍数，记录其结果，参照图7和表7。
表7
结果分析：由图7和表7可知，当二抗稀释250~1000倍时，检测的病毒滴度均在一个数量级上且差异不大，在实验中可在250~1000倍范围内选择二抗稀释倍数。
实施例9
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对各步骤的洗板进一步研究，
各步骤中，洗板，即清洗细胞板，是将细胞板加入PBST后放在摇床上摇晃，时间是0~5min，设定被稀释105病毒液感染，洗板次数为3次，改变摇床时间，记录其结果，参照图8和表8。
表8
/>
结果分析：洗板3次，每次摇床时间不同，滴度和蓝斑结果没有太大区别。
实施例10
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对步骤（9）中的TMB显色液进一步研究。
(9)检测：弃去加入二抗的96孔板的上清，每孔加入50μL过氧化物酶显色底物TMB显色液，室温避光放置20min~3h后，计数，于显微镜镜下观察蓝斑，先从106稀释的病毒液孔中开始计数，计算每孔中的蓝斑数，计算IFU/mL。
其中，TMB显色液为TMB显色液Ⅲ（湖州英创生物科技有限公司的TMB-P-001型号）。
本实施例中，控制细胞被稀释106病毒液感染，改变显色液种类，记录其结果，对比外购显色液和自制显色液的结果，参照图9和表9。
表9
结果分析：自制沉淀型TMB显色液与外购的TMB显色液Ⅲ进行显色对比，显色结果表明，滴度结果基本一致，自制沉淀型TMB显色液的蓝斑更圆润和清晰，自制的显色液效果更佳。
以下在实施例11~实施例14中，对本方法进行方法验证，包括耐用性、重复性、专属性，并与市售试剂盒（TaKaRa的Clontech，型号631406）对标。
实施例11
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对耐用性进一步研究，
1.耐用性-细胞代次不同，采用控制变量法，改变铺板细胞代次，其他条件不变，观察不同细胞代次对滴度检测是否有影响。
不同细胞代次滴度计算结果如下述表10。
表10
结果分析：6个代次细胞检测杆状病毒滴度变异系数为34.10%，略高于30%，细胞状态随代次增加会降低，但是并不影响滴度检测；P3代细胞测得的病毒滴度为6.80×107IFU/mL，P18代滴度检测结果仍在1E+07数量级，所以细胞P18代时仍可以用于做滴度检测。
2.耐用性-PBST配方不同，采用控制变量法，改变清洗细胞板的PBST配方，其他条件不变，观察用含/不含钙离子和镁离子的PBST洗板对滴度检测是否有影响。
不同PBST洗板滴度结果参照表11和图10：
表11
结果分析：从滴度看，加钙离子镁离子的PBST洗板滴度平均值为5.20E+07，不加钙离子镁离子的PBST洗板滴度平均值为4.27E+07，差别不大。从蓝斑看，蓝斑清晰圆润，都有个别小的蓝斑，差别不大。所以，加/不加钙离子镁离子的PBST洗板，对实验结果无影响。
实施例12
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对专属性进一步研究，
专属性，采用控制变量法，改变病毒液类型，其他条件不变，观察杆状病毒/ CHO-S细胞上清/293F细胞上清/Sf9细胞上清对滴度检测是否有影响，结果参照表12和图11。
表12
结果分析：CHO-S细胞、293F细胞、SF9细胞检测结果呈阴性；杆状病毒检测结果呈阳性。此3种细胞可能感染其他病毒，但是此方法只能检测出杆状病毒，换言之，此方法只适用于杆状病毒检测。本申请的检测方法对杆状病毒检测的专属性和特异性较高。
实施例13
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对精密度进一步研究，
1.精密度-重复性，取杆状病毒液，操作人员A重复6次进行平行操作，对比滴度数据，计算变异系数CV值，观察是否超过30%。
将6次重复性滴度结果汇总，平行测定均取细胞板第一行滴度，结果参照表13。
表13
计算得到，实验1~6组别的SD为8.26×106IFU/mL，总滴度平均值为5.07×107IFU/mL，CV为16.31%。
结果分析：6次平行测定数据变异系数为16.31%，小于30%，说明该方法重复性良好。
2.精密度-中间精密度，取杆状病毒液，操作人员B重复6次进行平行操作，计算变异系数CV值，观察是否超过30%。将6次重复性滴度结果汇总，去除异常数据，平行测定均取细胞板第一行滴度，结果参照表14。
表14
计算得到，实验7~12组别的SD为7.98×106IFU/mL，总滴度平均值为4.177×107IFU/mL，CV为19.11%。
综合上述表13和表14，得到下述表15，
表15
根据表13~表15，得到图12。
结果分析：操作人员A与操作人员B共12次操作滴度数据的变异系数为17.71%，小于30%，且实验1~6组别和实验7~12组别的数据相接近。说明此方法中间精密度良好。
实施例14
一种杆状病毒滴度测定方法，区别于实施例1，对与市售TaKaRa杆状病毒滴度检测试剂盒（TaKaRa的Clontech，型号631406）对标，即进行对比实验。
本申请还提供一种杆状病毒滴度测定试剂盒，该试剂盒使用本申请的测定方法，在下述中表述为自制试剂盒。
与TaKaRa杆状病毒滴度检测试剂盒对标，按照TaKaRa试剂盒说明书操作，使用同一批次杆状病毒液，重复5次平行实验，将数据与精密度-重复性实验（实施例13）前5次滴度测定结果相比较。
TaKaRa试剂盒说明书具体操作如下：
(1) 于96孔细胞板每个样品孔中加入6.5×104个Sf9细胞，细胞密度为3-4×105cell/mL。
(2) 细胞板放入含有湿纸的密封袋中，27℃培养1h。
(3) 取100μL病毒液加入到900μL培养基中进行梯度稀释，终浓度稀释至10-3、10-4，10-5倍，病毒液和稀释液充分混合。
(4) 使用排枪从96孔细胞板中吸出细胞上清。
(5) 加入25μL稀释后的病毒液，10-3稀释梯度设置3个复孔，10-4、10-5稀释梯度设置4个复孔。阴性对照孔加入25μL培养基。
(6) 细胞板放入含有湿纸的密封袋中，室温培养1h。
(7) 使用排枪从中吸出病毒液或培养基。
(8) 加入50μL甲基纤维素，细胞板放入含有湿纸的密封袋中27℃培养43-47h。
(9) 加入150μL丙酮至样品孔中，室温孵育10min。
(10) 弃去孔中液体，在纸巾上轻拍96孔细胞板，使用PBST（1×PBS+0.05%Tween20）洗涤三次，每次5min。
(11) 加入50μL稀释后的山羊血清，在摇床上室温孵育5min。
(12) 弃去孔中液体，在纸巾上轻拍96孔细胞板，不洗板。
(13) 加入25μL 稀释后的鼠源gp64抗体，37℃孵育25min。
(14) 弃去孔中液体，在纸巾上轻拍96孔细胞板，使用PBST（1×PBS+0.05%Tween20）振荡洗涤两次，每次5min。
(15) 加入50μL 稀释后的山羊抗鼠HRP抗体，37℃孵育25min。
(16) 弃去孔中液体，在纸巾上轻拍96孔细胞板，使用PBST（1×PBS+0.05%Tween20）振荡洗涤三次，每次5min。
(17)加入50μL 蓝色过氧化物酶底物，室温孵育3h。
(18) 显微镜镜下观察蓝斑，先从稀释105倍的病毒液孔中开始计数，计数每孔中的蓝斑数，计算IFU/mL。
从重复性6组数据中抽取后5组，除去异常数据，平行操作取第一行数据，计算平均值、标准偏差、变异系数，与对标的5组数据进行对比，自制杆状病毒试剂盒的数据参照表16和图13，TaKaRa试剂盒的数据参照表17和图14：
表16
计算得到，自制杆状病毒试剂盒的实验1~5组别的SD为7.69×106IFU/mL，总滴度平均值为5.25×107IFU/mL，CV为14.65%。
表17
计算得到，市售TaKaRa试剂盒的实验1~5组别的SD为7.73×106IFU/mL，总滴度平均值为3.34×107IFU/mL，CV为23.15%。
根据表16和表17，得到图15。
结果分析：所用杆状病毒滴度测定的试剂盒不同，实验人员、杆状病毒、操作器具等相同，自制试剂盒与市售TaKaRa试剂盒所测总滴度平均值分别是5.25×107IFU/mL和3.34×107IFU/mL，数值都在107数量级，随着使用的病毒保存时间的增加，测定的滴度略微降低属于正常现象。自制试剂盒与市售TaKaRa试剂盒的变异系数分别是14.65%和23.15%，均小于30.0%，说明自制试剂盒用来测杆状病毒滴度与市售试剂盒测杆状病毒滴度效果几乎无差别，甚至变异系数更低。
另外，发明人还发现，上述步骤中，通常情况下，计数时取4-28个蓝斑的孔为可信数据。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
细胞培养：选取细胞进行稀释，稀释细胞后将细胞液放入多孔细胞培养板，然后进行细胞培养，得到培养后的细胞；
稀释病毒液：按不同倍数稀释杆状病毒液，得到稀释后的病毒液；
病毒感染细胞：在所述多孔细胞培养板中，吸弃细胞上清，将所述稀释后的病毒液感染细胞，病毒感染细胞后，得到感染过病毒的多孔细胞培养板；
成膜孵育：吸弃所述感染过病毒的多孔细胞培养板中的病毒上清液，再加入成膜孵育溶剂，孵育，得到孵育后的多孔细胞培养板；
固定：在所述孵育后的多孔细胞培养板中加入固定液固定；固定后，吸弃上清，洗板，得到洗板后的多孔细胞培养板；
封闭：将封闭液加入所述洗板后的多孔细胞培养板进行封闭，弃上清，洗板，得到加过封闭液的多孔细胞培养板；所述封闭液包括复配血清，所述复配血清包括BSA、PBST；
加入一抗：弃去所述加过封闭液的多孔细胞培养板的上清，加入一抗，孵育，弃上清，洗板，得到加入一抗的多孔细胞培养板；
加入二抗：弃去所述加入一抗的多孔细胞培养板的上清，加入二抗，孵育，弃上清，洗板，得到加入二抗的多孔细胞培养板；
检测：弃去所述加入二抗的多孔细胞培养板的上清，加入显色液，避光放置，计数，观察蓝斑，计算所述加入二抗的多孔细胞培养板每孔中的蓝斑数，计算病毒滴度。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在细胞培养中，选取细胞代次3~18代的细胞进行稀释。
3.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在细胞培养中，将细胞液放入多孔细胞培养板中，所述多孔细胞培养板的细胞密度为3.25×104~13×104个/孔；
在稀释病毒液中，用培养基梯度稀释病毒液，稀释倍数包括104、105、106倍；
洗板的清洗剂包括PBST，该PBST包括加钙离子和镁离子的PBST、不加钙离子和镁离子的PBST中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在病毒感染细胞中，病毒加入到细胞中后，27~30℃孵育1~5h，得到感染过病毒的细胞板。
5.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在成膜孵育中，所述成膜孵育溶剂包括甲基纤维素，孵育时间为24~48h；所述甲基纤维素的加入量为50~150μL，所述甲基纤维素的浓度为0.7~1.5%。
6. 根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在固定中，所述固定液包括多聚甲醛、丙酮、自制多聚甲醛中的至少一种，固定时间为10~60 min；所述多聚甲醛的加入量为100~150μL，所述多聚甲醛的浓度为1~3%；
所述自制多聚甲醛的配制方法为：用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制磷酸盐缓冲液，取多聚甲醛粉末放入纯水中水浴加热，边搅拌边加入NaOH，搅拌至澄清，冷却至室温，除菌过滤，加入所述磷酸盐缓冲液，混匀测pH，pH为7~8的为可使用的自制多聚甲醛。
7.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在加入一抗中，加入的一抗为用稀释液一稀释的gp64抗体，所述稀释液一包括PBST，稀释倍数为2000~40000倍；加入一抗后孵育的时间和温度分别为20~60min和30~40℃。
8.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在加入二抗中，加入的二抗为用稀释液二稀释的HRP羊抗鼠抗体，所述稀释液二包括PBST，稀释倍数为250~1000倍；加入二抗后孵育的时间和温度分别为20~60min和30~40℃。
9.根据权利要求1所述的杆状病毒滴度测定方法，其特征在于，在检测中，所述显色液包括TMB显色液、自制TMB显色液；所述自制TMB显色液为自制沉淀型TMB显色液，所述自制沉淀型TMB显色液的配制方法为：取化合物海藻酸、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、硫酸葡聚糖钠盐、卡拉胶于反应瓶中，再加入单组份TMB显色液，超声溶解，得到自制沉淀型TMB显色液。
10.杆状病毒滴度测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1~9中任一项所述的杆状病毒滴度测定方法测定杆状病毒滴度。
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