CN110231481A - 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种水痘‑带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的快速检测方法，该方法在传统的VZV抗原的双抗体夹心ELISA检测方法的基础上，通过增加已知滴度的VZV样品进行定量标定，绘制VZV抗原含量滴度曲线，来测定水痘‑带状疱疹病毒的病毒滴度，该检测方法操作简单快捷，相对传统的pfu测定方法，极大提高了水痘‑带状疱疹病毒滴度的检测效率，特别适用于的病毒快速测定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，属于人疱疹病毒属，人类疱疹病毒3型，其初次感染引发水痘，随后病毒潜伏在神经节中，当机体免疫力下降时，再次激活引起带状疱疹。
目前，国内对于水痘的主要预防手段是疫苗接种，且水痘疫苗均为减毒活疫苗，而带状疱疹疫苗在国外上市的也主要是高滴度的减毒活疫苗。最近，美国FDA批准了葛兰素史克生产的gE亚单位佐剂疫苗用来预防带状疱疹的发生。目前对于水痘-带状疱疹减毒活疫苗的滴定，均使用的经典的pfu法测定，该方法是目前VZV滴度检测的金标准。然而，该方法也存在不足，例如，检测周期长，常常需要一周以上的时间，其次，病毒滴度的检测受细胞基质的影响较大，当细胞状态不好时，极大影响了检测结果。
作为疫苗生产企业来说，疫苗滴度的检测，在生产工艺中是不可或缺的环节，因此，病毒滴度的快速检测，对于生产者十分重要。
因此，目前急需一种能够快速准确的检测水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的快速检测方法，所述快速检测方法在基于VZV抗原的双抗体夹心ELISA检测方法上，将已知滴度的VZV样品进行系列稀释，进行抗原定量后绘制VZV抗原含量-病毒滴度曲线，然后对待检测VZV样品的滴度测定。
进一步地，所述双抗体夹心ELISA检测方法包括如下步骤：用抗VZV单克隆抗体抗体包被ELISA板后，封闭，加VZV抗原结合，加标记的抗VZV抗体，显色，酶标仪检测。
更进一步地，将双抗体夹心ELISA检测方法相关试剂制备成VZV双抗体夹心ELISA试剂盒。
更进一步地，利用VZV双抗体夹心ELISA试剂盒对已知浓度的VZV样品进行抗原含量测定，确定其OD450值；再利用VZV双抗体夹心ELISA试剂盒对系列稀释的已知滴度的VZV样品进行抗原定量，确定其OD450值，根据上述OD450值与VZV抗原、VZV样品滴度关系，绘制VZV抗原含量-病毒滴度曲线。
本发明还提供一种用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的快速检测的试剂盒，所述试剂盒包括：VZV双抗体夹心ELISA试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括系列稀释的已知滴度的VZV样品。
更进一步地，所述VZV样品为已知滴度的VZV减毒活疫苗标准品。
更进一步地，所述试剂盒中包括抗VZV单克隆抗体mAb-11包被的ELISA检测板，优选地，还包括HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP。
更进一步地，所述抗VZV单克隆抗体mAb-11的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
更进一步地，所述HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP的重链氨基酸序列如SEQID NO：9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明提供的VZV病毒滴度检测方法的原理是，根据VZV双抗体夹心ELISA试剂盒对已知病毒滴度的疫苗标准品和待检测的疫苗进行抗原定量，然后根据已知病毒的滴度和抗原含量绘制VZV抗原含量-病毒滴度曲线，根据待检测疫苗的抗原含量，计算出其病毒滴度。
有益效果
传统的水痘-带状疱疹病毒的病毒滴度利用经典的pfu法测定，该方法是目前VZV滴度检测的金标准。然而，该方法也存在不足，例如，检测周期长，常常需要一周以上的时间，其次，病毒滴度的检测受细胞基质的影响较大，当细胞状态不好时，极大影响了检测结果。
本发明的检测方法克服了经典pfu法测定的不足，能够极大缩短病毒滴定测定所用的时间，根据提供的具体实施方式，本方法测定时间可仅需2.5-3小时，并且利用本发明的检测方法测定的病毒滴度与经典pfu法测定结果一致。
本发明的检测方法特别适用于实际疫苗生产中对VZV病毒滴定的测试，当用于实际疫苗生产中时，由于疫苗生产企业的生产工艺具有一致性和稳定性，因此，各批次疫苗中的活病毒数与抗原含量的比例关系具有一致性，该检测方法对于生产工艺稳定的疫苗企业来说是切实可行的，对于生产中的病毒快速测定具有重要意义。
附图说明
图1：VZV抗原定量标准曲线。
图2：VZV抗原-病毒滴度曲线。
图3：VZV抗原定量标准曲线。
图4：VZV抗原-病毒滴度曲线。
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：VZV双抗体夹心ELISA检测试剂盒
VZV双抗体夹心ELISA检测试剂盒可选用已有的VZV双抗体夹心ELISA检测试剂盒，更优选地，所述试剂盒包括：抗VZV单克隆抗体mAb-11包被的ELISA检测板，HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP，VZV抗原标准品，已知病毒滴度VZV疫苗标准品，TMB显色液。
本发明人对分泌VZV病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤进行了筛选，获得了亲和性及特异性均十分优异的抗VZV单克隆抗体mAb-11及12-HRP，经竞争结合方法测定上述抗体的亲和常数，结果显示：mAb-11的亲和常数高达1014L/mol，12-HRP的亲和常数也达到了了1012L/mol，两者对于VZV抗原均有非常强的特异性结合能力。
因此，相较于其余单克隆抗体，mAb-11能更加有效地将VZV病毒固定到ELISA检测板上，从而能够显著提高VZV病毒的检测准确性；而12-HRP与mAb-11识别不同的VZV抗原位点，两者的抗原位点之间不存在竞争性抑制、空间位阻等不利于双抗体夹心检测的因素，两者配合使用能够达到高效特异的检测VZV的有益效果。
进一步对抗VZV单克隆抗体mAb-11、HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP进行了测序，mAb-11重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其属于IgG1亚型；12-HRP重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
进一步地，抗VZV单克隆抗体mAb-11的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示；轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。12-HRP的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13所示；轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16所示。
实施例2：VZV疫苗病毒滴度的测定
本实施例利用实施例1制备的试剂盒测定VZV疫苗病毒滴度，具体测定方法包括如下步骤：
(1)样品稀释：
VZV标准抗原稀释：用PBS溶液将VZV标准抗原分别稀释成50ug/ml、25ug/ml、20ug/ml、15ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0ug/ml；
已知滴度的疫苗标准品稀释：用PBS溶液将已知滴度的疫苗标准品(5.5lg pfu/ml)做2倍系列稀释，样品每稀释一倍，其病毒滴度在原有基础上降低0.3lg pfu/ml，稀释至病毒滴度为3.1lg pfu/ml。
(2)加样：
取实施例1试剂盒中的抗VZV单克隆抗体mAb-11包被的ELISA检测板室温平衡；在ELISA检测板中分别加入上述稀释样品以及待检测样品(1-3号样品)，每个样品做3个重复。
(3)孵育：
将上述样品放入37℃培养箱孵育60min。
(4)洗板：
PBST溶液洗涤ELISA板，300ul/孔，洗涤5次。
(5)加酶标抗体：
加入HRP标记的抗VZV的单克隆抗体12-HRP(浓度为0.1ug/ml)，100ul/孔，37℃培养箱孵育60min。
(6)洗板：
PBST溶液洗涤ELISA板，300ul/孔，洗涤5次。
(7)显色：
加入TMB进行显色100ul/孔，室温8min后，加入2M H2SO4终止，50ul/孔。
(8)读数计算：
使用酶标仪在450nm处检测OD450值。
根据VZV抗原标准品的检测结果绘制VZV抗原定量标准曲线：
表1.VZV抗原标准品ELISA检测OD450结果：
根据表1的检测结果，以抗原浓度作为横坐标，以OD450检测值作为纵坐标绘制VZV抗原定量标准曲线(图1)，标准曲线方程为：y＝0.0313x+0.0546，相关系数R2＝0.9966。证明VZV抗原含量与OD450nm检测结果具有良好的相关性。
利用稀释的已知滴度的疫苗标准品的OD450值，根据上述标准曲线求出疫苗标准品的抗原含量(表2)。
表2.疫苗标准品抗原含量测定结果：
进一步根据计算得到的疫苗标准品的抗原含量，以抗原含量作为横坐标，以病毒滴度作为纵坐标绘制VZV抗原-病毒滴度曲线(图2)，标准曲线方程为：y＝0.4936ln(x)+3.4882，相关系数R2＝0.9964。对于VZV抗原与病毒滴度的相关性，我们采用的是对数方程曲线，其相关系数达到了0.99以上，相比线性方程，其相关性更好，更能真实的反映出抗原与滴度的关系。
根据VZV抗原含量标准曲线以及VZV抗原-病毒滴度曲线，计算待检测样品的病毒抗原含量及病毒滴度，结果见表3。
表3.检测样品病毒抗原含量及病毒滴度结果：
依据经典pfu测定方法对待检测样品1-3的病毒滴度pfu进行测定，结果分别为：5.2lg pfu/ml、4.2lg pfu/ml、3.9lg pfu/ml。与表3的病毒滴度结果相比，本发明的检测方法与经典pfu测定方法的检测结果差值在±0.2pfu/ml之内，其误差范围符合疫苗生产质控标准要求。
实施例3：VZV疫苗病毒滴度的测定
本实施例利用实施例1制备的试剂盒测定四个样品的病毒滴度，四个样品的编号分别为：627-1、627-2、627-3、627-4，具体测定方法包括如下步骤：
(1)样品稀释：
VZV标准抗原稀释：用PBS溶液将VZV标准抗原分别稀释成50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0ug/ml；
已知滴度的疫苗标准品稀释：用PBS溶液将已知滴度的疫苗标准品(5.43lg pfu/ml)做2倍系列稀释，样品每稀释一倍，其病毒滴度在原有基础上降低0.3lg pfu/ml，将病毒稀释至3.03lg pfu/ml。
后续(2)加样、(3)孵育、(4洗板、(5)加酶标抗体(浓度为0.05ug/ml)、(6)洗板、(7)显色步骤与实施例2相应步骤操作参数相同。
(8)读数计算：
使用酶标仪在450nm处检测OD450值，根据检测结果绘制VZV抗原定量标准曲线及VZV抗原-滴度曲线(见图3、图4)，计算待检测样品的滴度。
另外，对于上述四个样品，依据经典pfu测定方法对其病毒滴度pfu进行测定。
本发明的检测方法与pfu滴定结果对比见表4。
表4.样品滴度ELISA测定结果与pfu测定结果：
由表4可知，本发明的检测方法与经典pfu测定方法的检测结果差值在±0.2pfu/ml之内，其误差范围符合疫苗生产质控标准要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 长春祈健生物制品有限公司
<120> 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法
<130> YZ20014
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
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Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
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Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Lys Phe Tyr
65 70 75 80
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Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
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<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Glu Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Gly Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Ser Asp Gly Met Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
Claims (10)
1.一种水痘-带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的快速检测方法，其特征在于：在基于VZV抗原的双抗体夹心ELISA检测方法上，将已知滴度的VZV样品进行系列稀释，进行抗原定量后绘制VZV抗原含量-病毒滴度曲线，然后对待检测VZV样品的滴度测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双抗体夹心ELISA检测方法包括如下步骤：用抗VZV单克隆抗体抗体包被ELISA板后，封闭，加VZV抗原结合，加标记的抗VZV抗体，显色，酶标仪检测；优选地，所述抗VZV单克隆抗体为单克隆抗体mAb-11，所述标记的抗VZV抗体为HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用VZV双抗体夹心ELISA试剂盒对已知浓度的VZV样品进行抗原含量测定，确定其OD450值；再利用VZV双抗体夹心ELISA试剂盒对系列稀释的已知滴度的VZV样品进行抗原定量，确定其OD450值，根据上述OD450值与VZV抗原、VZV样品滴度关系，绘制VZV抗原含量-病毒滴度曲线。
4.一种用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括VZV双抗体夹心ELISA试剂盒。
5.根据权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括系列稀释的已知滴度的VZV样品，优选地，所述VZV样品为已知滴度的VZV减毒活疫苗标准品。
6.根据权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括抗VZV单克隆抗体mAb-11包被的ELISA检测板，优选地，还包括HRP酶标记的抗VZV单克隆抗体12-HRP。
7.根据权利要求6所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述抗VZV单克隆抗体mAb-11的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.根据权利要求6所述的快速检测试剂盒，其特征在于：抗VZV单克隆抗体mAb-11的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5所示；轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8所示。
9.根据权利要求6所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体12-HRP的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
10.根据权利要求6所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述所述单克隆抗体12-HRP的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示；轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。
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