CN113201476A - 提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白培养基适应性的方法 - Google Patents

提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白培养基适应性的方法 Download PDF

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CN113201476A CN202110488711.8A CN202110488711A CN113201476A CN 113201476 A CN113201476 A CN 113201476A CN 202110488711 A CN202110488711 A CN 202110488711A CN 113201476 A CN113201476 A CN 113201476A
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Abstract

本发明公开了提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白培养基适应性的方法，涉及发酵工程领域。克服该类微生物在蛋白质培养基上适应性差的难题。本发明包括提高芽孢萌发率、菌体生物量和蛋白酶活性等方面。(1)用低强度超声对解淀粉芽孢杆菌芽孢悬液进行短时间处理，所得的芽孢萌发率最高可以提高3倍以上。(2)在培养期间将发酵液进行一个低强度短时间超声处理和热激作用(40～45℃)，可以显著提高生物量和蛋白酶活等指标。该方法不仅克服了解淀粉芽孢杆菌由于芽孢体萌发率低而导致生长延滞期延长的缺点，而且有效提高菌株整体发酵性能，从而提高其对蛋白培养基的适应性，操作简便，成本低。

Description

提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白培养基适应性的 方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，更具体地说，本发明涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白质培养基适应性的方法。
背景技术
芽孢杆菌因具有培养条件简单、生长迅速、产酶能力强等特性而被广泛应用于发酵工业，从而获得工业生产上需要的蛋白酶、淀粉酶、菌多糖等。
在营养缺乏、干旱等条件下，芽孢杆菌会以芽孢形式存在，其典型结构由外到内依次为芽孢衣、皮层和核心。芽孢在条件适宜时再重新萌发成营养体，其萌发生长通常是由营养性萌发剂所引发，常见的营养性萌发剂包括氨基酸类、嘌呤衍生物和糖类等单一成分或者多种成分组合。当芽孢暴露于营养性萌发剂中时，萌发剂渗入穿透芽孢衣和皮层，与位于芽孢内膜的萌发受体蛋白结合，细胞开始吸收水分，进而启动芽孢萌发(徐智勇,闫岩,王卫,等.芽孢生成和萌发相关机制[J].中西医结合护理(中英文),2016,2(011):169-172)。但是由于有些营养性萌发剂穿透能力弱，短时间无法有效打破芽孢休眠，造成大部分芽孢并不能在短时间内萌发，而导致生长延滞期延长。解决的方法通常是优化萌发条件或者选择更强的诱导萌发剂，而利用超声波的传质效应加速萌发因子到达芽孢内膜促进其芽孢萌发的研究还尚未报道。
培养基对芽孢杆菌的生长非常重要，为了实现较好的发酵，提高生物量和产酶能力，目前大部分研究集中于优化培养基的组成和培养条件，例如以下专利：
CN111349591A公开了高密度发酵枯草芽孢杆菌菌种的方法及应用，包括以下步骤：
a)用接种环挑取试管斜面上的菌苔一环，接种到摇瓶中，制备种子液：接种量为0.5～2cm2/200mL，培养5～7h，培养温度为35～39℃，摇床转速为200～240r/min，得到种子液；所述种子液培养基由如下质量组分组成：豆粕粉3％～7％，玉米淀粉2％～6％，氯化钠0.1％～0.5％，轻质碳酸钙0.1％～0.5％，余量为水，补足100％，pH 6.8～7.2；b)将种子液接种到发酵罐中，接种量为10％，于37℃下培养18～24h，初始转速为200r/min，初始通气量为1:0.6，根据溶氧对转速和通气量进行调节，保持溶氧在20％以上，最高转速为400r/min，最高通气量为1：1.2；c)发酵罐中发酵培养基组成：豆粕粉3％～7％、葡萄糖0.5％～1％、玉米淀粉4％～6％、玉米粉1％～2％、玉米浆0.4％～0.6％、氯化钠0.2％～0.4％、硫酸镁0.2％～0.4％、磷酸二氢钾0.2～0.4％、硫酸锰0.02％～0.04％、消泡剂0.1％、pH值为7.3，当芽孢率和成熟度都达到90％以上时，停止发酵。
CN109055270A公开了一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基，其特征在于，包括如下步骤：1)菌种活化：将在4℃温度下斜面保存的枯草芽孢杆菌划线于斜面培养基(马铃薯粉15％～18％，葡萄糖2％～2.5％，琼脂粉2.5％)上，于25～30℃，pH 6～7条件下培养4～9天；2)种子液制备：挑取活化的菌落，接种到灭菌后的种子培养基(蔗糖4％～6％，蛋白胨1.5％～2％，酵母粉1.5％～2％，玉米淀粉0.2％～2.5％，硫酸镁0.03％～0.08％，磷酸二氢钾0.2％～0.5％)中，于25～30℃、pH 5～7，搅拌转速为180～200r/m条件下培养5～6天，得到摇瓶种子培养液；3)种子液放大培养：将摇瓶种子液移至含有种子培养基的种子罐中进行放大培养，培养基(蔗糖4～6％，蛋白胨1.5％～2％，酵母粉1.5％～2％，玉米淀粉0.2％～2.5％，硫酸镁0.03％～0.08％，磷酸二氢钾0.2％～0.5％)中，于25～35℃、pH 5～7，搅拌转速为200～250r/m条件下培养18h，得到种子培养液；4)发酵罐培养：种子培养液按5％～10％接种到装有发酵培养基的发酵罐，于30～38℃、pH 5～7，搅拌转速为110～130r/m，溶氧浓度控制在30％以上，发酵10h，补加相同量的发酵培养基，继续培养10h，重复补加培养操作3-6次，即得高密度芽孢杆菌；5)发酵培养基组成：蔗糖0.8％～1.5％，玉米芯粉2.5％～5％，蛋白胨1.5％～3％，酵母粉1.5％～3％，玉米淀粉3％～4％，硫酸镁0.05％～0.09％，氯化锌0.01％～0.07％，磷酸二氢钾0.05％～0.13％，磷酸氢二钾0.08～0.15％，硫酸铵0.003％～0.01％，鱼类肠液0.01％～0.1％。
CN111349591A所述的生产工艺复杂，还需要酸碱罐进行pH调控；CN109055270A公开的方法中不仅工艺繁琐，而且含有蛋白胨与酵母粉等价格较高的原料，生产成本较高，不适合推广使用。
一般来说芽孢杆菌产蛋白酶的活性较高，对各种蛋白类、多肽/胨类(蛋白质经酶解制备)培养基都有较好的适应性，均能实现较好的生长，但有一些芽孢杆菌，例如解淀粉芽孢杆菌，该类菌具有比较高的淀粉酶和蛋白酶活性，但在蛋白培养基上生长缓慢，芽孢萌发率低，只有在多肽类培养基上才能实现较好的生长，这对降低发酵成本和简化工艺是极为不利的。目前，关于提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基的适应性研究尚无报道。
发明内容
为克服已有方法存在的缺陷，本发明的目的提供一种生产工艺简单、易于对反应进行调控且生产成本较低的提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白质培养基适应性的方法。
本发明提供的提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率及对蛋白质培养基适应性的方法，主要包括提高芽孢萌发率、菌体生物量和蛋白酶活。
一、本发明提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率方法，按照如下步骤进行：
(1)芽孢制备：将活化的解淀粉芽孢杆菌菌液(细菌浓度达到或超过108cfu/mL)，平铺涂布于营养肉汤固态培养基(营养肉汤培养基粉末18g/L，琼脂15g/L，MnCl2 0.5g/L，pH 7.2)，在37℃条件下培养10d，再在20℃条件下培养2d。培养结束后用无菌蒸馏水浸没培养基5min，用接种环刮下菌落形成悬浮液。收集悬浮液，在4℃、1000g的条件下离心15min，共计3轮，每轮结束后弃去上清，用无菌蒸馏水重悬浮沉淀，以清洗芽孢表面杂质。最后一次离心后，控制无菌蒸馏水添加量，使芽孢悬液中芽孢浓度达到107～108cfu/mL，于4℃冰箱中保存。
(2)芽孢萌发：将芽孢悬液稀释至106cfu/mL，作为芽孢悬液母液。按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为20～60kHz、功率密度为10～50W/L的条件下处理15～30min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，之后转移至70℃水浴锅再进行10min热处理，计算芽孢萌发率。
二、本发明提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法，按照下述步骤进行：
(1)菌种活化：取-80℃超低温保藏的菌株，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30～35℃培养24h。
(2)种子液制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白液体培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)或者大豆蛋白液体培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)中，于30～35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为1％～5％(体积比)，30～35℃摇床中培养至2～6h后，将三角锥形瓶置于超声设备中，同时进行一个低强度短时间的超声处理和热激处理(处理时间为5～20min，超声功率密度为10～60W/L，超声频率为20～60kHz，热激温度为40～45℃)。然后继续放回摇床中培养至24h，测定发酵液蛋白酶活和生物量。
通过本设定，(1)利用超声波的传质效应加速水分到达芽孢内膜，短时间有效打破芽孢休眠，使大部分芽孢在短时间内萌发，克服因芽孢体萌发率低而导致生长延滞期延长的缺点，操作简单，成本低；(2)在不改变原有发酵工艺的前提下，低强度短时间的超声处理和热激作用结合，改变细胞膜通透性，促进细胞内外的物质和能量交换，加速培养基中的营养物质渗透至细胞内，促进诱导性基因表达某些功能蛋白质；另外，一定的超声处理通过使底物蛋白大分子暴露内部疏水基团，从而增加芽孢杆菌分泌的蛋白酶与底物蛋白的接触，促进蛋白质水解供菌体生长，提高芽孢杆菌对蛋白质培养基的适应性，有效促进发酵产物的积累。
本发明的优点：与传统的优化培养基方法相比，可以有效提高芽孢萌发率，提高微生物对蛋白质培养基的适应性，还促进中间产物(蛋白酶)的分泌；另外，适度的超声处理还可以增加已分泌的蛋白酶与底物的接触面积，有效促进产物的积累。该方法适用于对廉价蛋白原料适应性差的高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，此方法操作简便，成本低，与普通聚能式超声(如超声细胞破碎仪)相比，超声场强均匀，对细胞伤害少；与普通的发散式超声(如超声波洗槽)相比，相对强度高，衰减少，该方法可提高生物量15％以上，蛋白酶活35％以上，芽孢萌发率最高可以达到对照组的4倍以上。下面通过附图、对照例和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1：A为扫频超声设备结构示意图，1-控制柜，2-超声波发生器，3-发酵培养液，4-超声换能器，5-恒温水浴器。B为发散式超声设备六边形俯视图(同一频率对称分布)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中的两株菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，1号-解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌种编号为CICC 21096；2号-解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌种编号为CICC 20029；3号-解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，菌种编号为CICC 10160。其中1和2号菌用于蛋白酶活和生物量指标评价，3号菌用于芽孢萌发率指标评价。
一、本发明提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率方法的对照例和实施例如下述对照例1～2和实施例1～4所示。
芽孢萌发率计算方法：由于10min、70℃的热处理条件能杀灭营养体细胞，剩余存活的为芽孢体，涂布于计数平板时会萌发为营养体并生长，所以计数时统计出的细胞数实为未被热处理杀灭的芽孢体数量，相比初始芽孢量的下降部分即为受处理而萌发的芽孢量。
对照1
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，保持温度37℃放置15min；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为14.23％。
对照2
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，保持温度37℃放置30min；随之将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为17.67％。
实施例1
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为20kHz、功率密度为10W/L的超声参数下处理15min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为37.44％，是对照例1的2.63倍。
实施例2
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为60kHz、功率密度为20W/L的超声参数下处理30min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为48.52％，是对照例2的2.75倍。
实施例3
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为40kHz、功率密度为40W/L的超声参数下处理15min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为67.73％，是对照例1的4.76倍。
实施例4
按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释3号菌芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为40kHz、功率密度为50W/L的超声参数下处理30min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，再移至70℃水浴锅热处理10min，芽孢萌发率为73.57％，是对照例2的4.16倍。
二、本发明提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法的对照例和实施例如下述对照例3～8和实施例5～8所示。
对照例3：
(1)菌种活化：取出甘油管保存的1号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于30℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为2％(体积比)，于30℃、160r/min摇床中培养至24h，最后将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为56.10mg/100mL，蛋白酶活为7.57U/mL。
对照例4
(1)菌种活化：取出甘油管保存的1号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于30℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为2％(体积比)，30℃、160r/min摇床中培养6h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理5min(超声功率60W/L，超声频率60kHz，温度30℃)。然后继续于30℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体。经测定生物量为57.95mg/100mL，蛋白酶活为8.21U/mL，与对照例3相比，分别提升3.29％和8.45％。
对照例5
(1)菌种活化：取出甘油管保存的1号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于30℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为2％(体积比)，30℃、160r/min摇床中培养6h后，将三角锥形瓶置于超声设备中放置5min(不做超声处理，热激温度45℃)。然后继续于30℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体。经测定生物量为50.70mg/100mL，蛋白酶活为7.74U/mL，与对照例3相比，分别降低9.62％和提升2.24％。
对照例6
(1)菌种活化：取出甘油管保存的2号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，35℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至大豆蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为1％(体积比)，于35℃、160r/min摇床中培养至24h，最后将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为47.35mg/100mL，蛋白酶活为14.95U/mL。
对照例7
(1)菌种活化：取出甘油管保存的2号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，35℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至大豆蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为1％(体积比)，35℃、160r/min摇床中培养2h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理20min(超声功率10W/L，超声频率20kHz，温度35℃)。然后继续于35℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为51.06mg/100mL，蛋白酶活为15.72U/mL，与对照例6相比，分别提升7.84％和5.15％。
对照例8
(1)菌种活化：取出甘油管保存的2号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，35℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至大豆蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为1％(体积比)，35℃、160r/min摇床中培养2h后，将三角锥形瓶置于超声设备中放置20min(不做超声处理，热激温度40℃)。然后继续于35℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为49.35mg/100mL，蛋白酶活为13.37U/mL，与对照例6相比，分别提升4.22％和降低10.59％。
实施例5
(1)菌种活化：取出甘油管保存的1号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于30℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为2％(体积比)，30℃、160r/min摇床中培养6h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理5min(超声功率60W/L，超声频率60kHz，热激温度45℃)。然后继续于30℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体。经测定生物量为67.52mg/100mL，蛋白酶活为10.42U/mL，与对照例3相比，分别提升20.35％和37.61％。
实施例6
(1)菌种活化：取出甘油管保存的1号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于30℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为5％(体积比)，30℃、160r/min摇床中培养3h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理10min(超声功率30W/L，超声频率40kHz，热激温度42℃)。然后继续于30℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体。经测定生物量为74.15mg/100mL，蛋白酶活为11.09U/mL，与对照例3相比，分别提升32.17％和46.52％。
实施例7
(1)菌种活化：取出甘油管保存的2号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，35℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至大豆蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有大豆蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为1％(体积比)，35℃、160r/min摇床中培养2h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理20min(超声功率10W/L，超声频率20kHz，热激温度40℃)。然后继续于35℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为58.47mg/100mL；蛋白酶活为21.04U/mL，与对照例6相比，分别提升23.48％和40.73％。
实施例8
(1)菌种活化：取出甘油管保存的2号菌，划线接种于固体培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，35℃培养24h。
(2)种子液的制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至大豆蛋白培养基(Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0)上，于35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液。
(3)发酵培养：将种子液接种于装有大豆蛋白培养基的三角锥形瓶中(250mL)，其中接种量为2.5％(体积比)，35℃、160r/min摇床中培养2h后，将三角锥形瓶置于超声设备中处理10min(超声功率30W/L，超声频率40kHz，热激温度42℃)。然后继续于35℃、160r/min摇床中培养至24h，将发酵液在12000r/min离心10min，得到上清粗酶液和湿菌体，经测定生物量为55.52mg/100mL，蛋白酶活为24.26U/mL，与对照例6相比，分别提升17.26％和62.30％。
以上对照例1～2和实施例1～4的结果表明，在对解淀粉芽孢杆菌(3号菌)的芽孢悬液进行超声处理时，其芽孢萌发率显著增加；另外，对照例3～8和实施例5～8的结果表明，在对解淀粉芽孢杆菌(1号与2号菌)在酪蛋白培养基或大豆培养基中的发酵进行超声和热激处理，生物量和蛋白酶活均显著增加，效果均优于单独进行超声或者热激处理(单独的热激处理会引起生物量或者蛋白酶活的下降)，这表明热激能够强化超声作用，起到更为显著的效果。这些结果表明，超声不仅能提高解淀粉芽孢杆菌的芽孢萌发率，而且能提高其发酵时生物量和蛋白酶活，提高其整体发酵性能，增强其在蛋白质培养基上的适应性，从而降低发酵成本，具有一定的经济效益。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (6)

1.提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)芽孢制备：将活化的解淀粉芽孢杆菌菌液，细菌浓度达到或超过108cfu/mL；平铺涂布于营养肉汤固态培养基，在37℃条件下培养10d，再在20℃条件下培养2d；培养结束后用无菌蒸馏水浸没培养基5min，用接种环刮下菌落形成悬浮液；收集悬浮液，在4℃、1000g的条件下离心15min，共计3轮，每轮结束后弃去上清，用无菌蒸馏水重悬浮沉淀，以清洗芽孢表面杂质；最后一次离心后，控制无菌蒸馏水添加量，使芽孢悬液中芽孢浓度达到107～108cfu/mL，于4℃冰箱中保存；
(2)芽孢萌发：将芽孢悬液稀释至106cfu/mL，作为芽孢悬液母液；按照1:99的体积比用无菌蒸馏水稀释芽孢悬液母液，取6L稀释后的芽孢悬液注入超声设备的超声腔内，在超声频率为20～60kHz、功率密度为10～50W/L的条件下处理15～30min，处理时超声腔内芽孢悬液保持37℃；随后将芽孢悬液置于37℃下温育20min，之后转移至70℃水浴锅再进行10min热处理，即可达到提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率的目的。
2.根据权利要求1所述的提高解淀粉芽孢杆菌芽孢萌发率方法，其特征在于所述的营养肉汤固态培养基成分为：营养肉汤培养基粉末18g/L，琼脂15g/L，MnCl2 0.5g/L，pH 7.2。
3.提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)菌种活化：取-80℃超低温保藏的菌株，划线接种于固体培养基；
(2)种子液制备：从固体培养基上挑取单菌落，接种至酪蛋白液体培养基或者大豆蛋白液体培养基中，于30～35℃、160r/min摇床中培养24h，即得种子液；
(3)发酵培养：将种子液接种于装有酪蛋白培养基的三角锥形瓶中，其中接种量为1％～5％(体积比)，30～35℃摇床中培养至2～6h后，将三角锥形瓶置于超声设备中，同时进行一个低强度短时间的超声处理和热激处理；然后继续放回摇床中培养至24h，即可达到提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的目的。
4.根据权利要求3所述的提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法，其特征在于步骤(1)中的固体培养基成分如下：胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
5.根据权利要求3所述的提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法，其特征在于步骤(2)中的酪蛋白液体培养基成分为：Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，干酪素5g/L，KH2PO40.36g/L，pH 7.0；大豆蛋白液体培养基成分为：Na2HPO4·12H2O 1.43g/L，大豆蛋白5g/L，KH2PO4 0.36g/L，pH 7.0。
6.根据权利要求3所述的提高解淀粉芽孢杆菌对蛋白质培养基适应性的方法，其特征在于步骤(3)中的超声处理和热激处理参数如下：处理时间为5～20min，超声功率密度为10～60W/L，超声频率为20～60kHz，热激温度为40～45℃。
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