CN106811486B - 一种桔子皮发酵提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桔子皮发酵提取物及其制备方法和应用，属于黄酒酿造技术领域。所述制备方法，包括：将桔子皮粉碎后接入发酵菌种，恒温发酵；发酵结束后，将发酵基质烘干粉碎，加水混匀，置于40～60℃水浴中浸提，收集滤液，干燥即得所述桔子皮发酵提取物。在黄酒酿造过程中，将本发明的桔子皮发酵提取物作为添加剂加入，可有效降低成品酒中氨基甲酸乙酯(EC)的含量，降幅达到90％以上。本发明选择适合酿酒的安全菌株用于桔子皮的发酵，保证成品酒的生物安全性。

Description

一种桔子皮发酵提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及黄酒酿造技术领域，具体涉及一种桔子皮发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)为2A级致癌物(世界卫生组织，2007)，联合国粮农组织建议成年人每天的氨基甲酸乙酯最大总摄入量不超过15ng/kg体重。黄酒中的氨基甲酸乙酯是发酵过程中酵母及其他微生物代谢产生的。尿素、精氨酸、氰化物等都可以代谢形成氨基甲酸乙酯的前体物质，如氨甲酰磷酸、瓜氨酸等。
黄酒、葡萄酒等发酵酒的生产过程中有多种途径会导致氨基甲酸乙酯的形成，且含量相对较高，饮酒被认为是人体摄入氨基甲酸乙酯最主要的途径。因此，加拿大、韩国、欧盟等国家和地区对葡萄酒中氨基甲酸乙酯制订了限量标准，一般要求不超过100μg/L。控制酒中氨基甲酸乙酯含量对保障长期饮酒人群的身体健康具有重要意义。
目前在黄酒、葡萄酒等发酵酒的生产过程中，根据氨基甲酸乙酯的形成机理，可以建立相对应的控制方法，降低产品中氨基甲酸乙酯的浓度。主要有以下几种方式：
(1)对酿酒用大米的精制或多次清洗，可以降低原料中50％以上的尿素，但会导致原料中其他营养物质流失，影响产品质量。
(2)在酿酒过程中添加脲酶，对发酵体系中的尿素进行酶解，也可以降低酒中氨基甲酸乙酯含量。
(3)选育尿素和精氨酸含量较低的葡萄新品种，对降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量具有重要价值和意义。
(4)发酵过程中的温度、pH、贮藏时间和蒸馏方法等工艺条件均对氨基甲酸乙酯的形成有显著影响，可以通过改善酿造工艺来控制产品中氨基甲酸乙酯含量。
温度是影响氨基甲酸乙酯形成的最重要环境因子之一，当发酵温度控制在24℃以下时，黄酒原酒中基本不形成氨基甲酸乙酯；改变黄酒的煎酒工艺可以显著降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。
部分白兰地的氨基甲酸乙酯含量高达10 000μg/kg，因为铜制蒸馏锅对氨基甲酸乙酯的形成有催化作用，因此改进白兰地的蒸馏方式和用具，也可以降低产品中的氨基甲酸乙酯。
(5)利用吸附或生物降解的方法对酒中已经形成的氨基甲酸乙酯进行终端清除。由于酒的品质受生产工艺条件影响较大，改变现有工艺条件通常会导致产品质量下降或风味变化，影响商品价值。
(6)由于氨基甲酸乙酯的大部分前体物质来源于发酵过程的微生物代谢，通过代谢过程控制或者菌种选育减少前体物质的形成，可以降低产品中氨基甲酸乙酯浓度。最近的研究表明，利用精氨酸代谢酶抑制剂控制瓜氨酸等前体物质的形成；精氨酸酶缺陷型或表达受阻的酵母突变菌株不能转化精氨酸形成尿素；将脲基酰胺酶基因整合到酵母菌中，提高脲基酰胺酶的表达能力，可以降低尿素含量；精氨酸转化能力受阻的酒类酒球菌不能转化精氨酸为瓜氨酸和氨甲酰磷酸，利用以上菌株生产的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量显著下降。
因此，酒中氨基甲酸乙酯的形成机理不同，控制方法各异。
发明内容
本发明提供了一种桔子皮发酵提取物，应用到黄酒酿造过程中，可有效降低成品酒中氨基甲酸乙酯(EC)的含量。
一种桔子皮发酵提取物的制备方法，包括：将桔子皮粉碎后接入发酵菌种，恒温发酵；发酵结束后，将发酵基质烘干粉碎，加水混匀，置于40～60℃水浴中浸提，收集滤液，干燥即得所述发酵桔子皮提取物。
本发明的桔子皮发酵是采用固态发酵方法，因此对发酵体系含水量有严格要求。如果体系含水量低于50％，则会在长达30～60天的发酵过程，由于水分的挥发导致体系含水进一步下降，发酵菌的生长会受到抑制，桔子皮的生物转化率下降；如果体系含水量高于70％，则会在粉碎的桔子皮果粒间隙充满水，影响体系的通气性能，导致发酵失败。因此，过多和过低的含水量均对桔子皮发酵产生重要影响。作为优选，桔子皮在粉碎之前，先进行清洗、干燥至含水量为50～70％。更为优选，桔子皮干燥至含水量为60％。
为保障后续生产的酿造酒的生物安全性，所述的发酵菌种为用于酿酒的安全菌株，可选用根霉菌、毛霉菌、黑曲霉菌等。作为优选，所述发酵菌种为米根霉菌，具体地，选用编号为CCTCC AF 93144的米根霉菌(源自中国典型培养物保藏中心)，该米根霉菌为干燥的固体麸皮菌种。
接种前，先活化发酵菌种。作为优选，所述米根霉菌需要经过PDA平板培养基的活化，进一步地，将平板菌种接种于麸皮培养基上，28℃恒温培养5天，麸皮培养基为麸皮和水按1：1混合均匀后经121℃灭菌60分钟即成；将麸皮培养基上长好的米根霉于45℃干燥即得米根霉发酵用菌种。
作为优选，所述米根霉菌的接种量为桔子皮质量的0.1～1％。接种量少于0.1％将导致米根霉在桔子皮上的生长比较慢，桔子皮的转化率低，产生的活性物质少；由于菌种生产时以麸皮为原料，因此接入的菌种中含有大量没有被米根霉利用的麸皮，如果接种量过大，米根霉就会以麸皮为原料进行生长和代谢，对桔子皮上的利用和转化率降低，并且产生大量以麸皮为原料形成的的代谢产物，影响产品对黄酒中氨基甲酸乙酯的抑制作用。更为优选，米霉菌的接种量占桔子皮质量的0.5％。
作为优选，往粉碎的桔子皮中加入一定量的葡萄糖或果糖，对米根霉的生长有明显的促进作用，可以将发酵周期缩短10～20天。
米根霉发酵桔子皮的生长温度范围较宽，在20～32℃均可生长，但是较低温度时要求的发酵时间较长，较高温度可以明显缩短发酵周期；如果发酵温度超过32℃，米根霉的生长会受到抑制，表现为对桔子皮的转化率较低。作为优选，所述恒温发酵的温度为20～32℃，时间为30～60天。更为优选，发酵温度为28℃，发酵时间为30天。
发酵结束后，用水提法提取发酵产物中的活性物质，作为优选，所述发酵基质粉碎至50～200目，再加入发酵基质质量5～10倍的水混合。粉碎程度越高、加水量越多，发酵基质中活性物质的提取得率越高；但是，粉碎程度过高，加水量过多，导致生产成本过高，影响产品的经济可行性。更为优选，将发酵基质粉碎至100目，再加入10倍质量的水混合。
浸提时间的长短对提取物中活性物质的得率有重要影响，时间过短，活性物质的得率低；研究证明，浸提时间超过4h时，浸提物的活性不再明显增加。作为优选，所述浸提的时间为0.5～4h。更为优选，置于40℃水浴中浸提3h。
本发明提供了由上述制备方法制备得到的桔子皮发酵提取物。研究发现，在黄酒酿造过程中，将桔子皮发酵提取物作为添加剂加入，可有效降低成品酒中的氨基甲酸乙酯(EC)的含量。机理研究分析得出：桔子皮发酵提取物中的活性成分通过控制黄酒中乳酸菌的生长，减少其代谢产物瓜氨酸的含量，进而减少氨基甲酸乙酯(EC)的生成；另外，由于乳酸菌发酵会导致黄酒酸度变高而影响黄酒的品质，因此乳酸菌受抑制可以改善产品品质。
本发明还提供了一种黄酒酿造方法，包括发酵，在发酵过程中，向发酵液中添加所述的桔子皮发酵提取物。通过比较研究发现，在糖化后添加本发明的提取物对成品黄酒中氨基甲酸乙酯的控制效果最好，在后发酵、生酒等阶段再加入提取物，则成品黄酒中的氨基甲酸乙酯含量会较高；另一方面，如果在落缸拌曲时加入提取物，则对糖化有一定的抑制作用。因此最佳添加时间为糖化之后。
作为优选，以质量百分比计，所述桔子皮发酵提取物的添加量为用米量的0.1～0.5％。添加量过低，对成品黄酒中的氨基甲酸乙酯含量的控制效果较差，添加剂用量过高，导致生产成本增加，而氨基甲酸乙酯含量并不再显著降低。更为优选，桔子皮发酵提取物的添加量为用米质量的0.1％。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明通过在黄酒酿造阶段添加桔子皮发酵提取物，可有效降低成品酒中的氨基甲酸乙酯(EC)的含量，降幅达到90％以上。
(2)本发明选择适合酿酒的安全菌株用于桔子皮的发酵，保证成品酒的生物安全性。
附图说明
图1为黄酒酿造工艺示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、根霉菌发酵桔子皮
发酵所用微生物菌种为米根霉(CCTCC AF 93144)，来自中国典型培养物保藏中心。
菌种活化：配制PDA培养基，将菌种接入PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3d后作为菌种备用。
发酵菌种制备：将麸皮和水按1：1比例混合均匀后，置于121℃灭菌60分钟后冷却备用。将PDA平板上活化好的菌种接入灭菌麸皮基质上，置于28℃恒温培养5d，然后将发酵基质置于45℃干燥，即制得发酵用米根霉菌种。
将桔子皮清洗干净后置于干燥器内，至桔子皮的含水量为60％时取出，粉碎得到桔子皮细粉。按桔子皮粉质量的0.5％接入米根霉菌种，混合均匀后置于28℃恒温室中培养，发酵30d后取出备用。
2、添加剂的制备
将发酵基质取出后烘干，然后粉碎过100目筛，按基质粉质量的10倍加水，然后混合均匀，置于40℃水浴中浸提3h。过滤除去体系中的固形物，收集滤液，干燥后即制得添加剂。
3、添加剂在黄酒酿造中的应用
黄酒酿造工艺如图1所示。在糖化发酵过程中按用米量的0.1％加入制备的添加剂。检测生酒和成品酒中的EC含量，分别为10μg/L和12μg/L。依照图1所示工艺流程，不加入添加剂时生酒和成品酒的EC含量分别为52μg/L和213μg/L。
4、黄酒中的乳酸菌检测和分析
分别利用MRS培养基和BCG培养基分离生酒中的乳酸菌，并对其进行鉴定。
MRS培养基配方如下：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二氨2g，吐温8O 1mL，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.2g，水1000mL；pH自然，121℃灭菌20min。
BCG培养基配制如下：(A)溶液：取脱脂乳粉50g，水250ml，加入1.6％溴甲酚氯乙醇溶液0.5ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20min；
(B)溶液：酵母膏5g，水250ml，CaCO3 5g，琼脂10g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20min。
以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。
将生酒适当稀释后采用混菌法分离，先加入10-12mLMRS培养基或BCG培养基，凝固后再注入4-5mL水琼脂培养基，制成厌氧环境，37℃培养2d，可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，并进一步镜检。
结果表明，加入添加剂的生酒中乳酸菌的含量仅为100CFU/mL，而不加入添加剂的生酒中乳酸菌的含量高达12000CFU/mL。
分析：乳酸菌发酵精氨酸形成EC前体物质，然后在煎酒和贮藏过程中形成EC是黄酒中EC形成的主要途径。因此，添加剂通过控制黄酒中乳酸菌的生长，降低产品中的EC含量。

Claims (1)

1.一种黄酒酿造方法，包括发酵，其特征在于，在发酵过程中，糖化后向发酵液中添加桔子皮发酵提取物，以质量百分比计，所述桔子皮发酵提取物的添加量为用米量的0.1％，所述桔子皮发酵提取物的制备方法，包括：将含水量为60％的桔子皮粉碎后接入发酵菌种保藏编号为CCTCC AF 93144的米根霉菌，所述米根霉菌的接种量为桔子皮质量的0.5％，28℃恒温发酵30d；发酵结束后，将发酵基质烘干粉碎，加水混匀，置于40℃水浴中浸提3h，收集滤液，干燥即得所述桔子皮发酵提取物。
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