CN114903154A - 一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海藻及发酵制品加工技术领域，尤其涉及一种基于酵母‑乳酸菌分步发酵的降血糖型海藻制品加工预处理方法。本发明的加工步骤包括：（1）预处理：新鲜海带除泥烘干，粉碎；（2）酶解：按1：30固液比加水稀释，加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶、碱性果胶酶，获得海藻酶解液；（3）酿酒酵母发酵：海藻酶解液灭菌后，接种经选育获得的酿酒酵母，好氧发酵至还原糖耗尽；（4）植物乳杆菌发酵：酵母发酵液中加入3%葡萄糖、灭菌，接种经选育获得的植物乳杆菌，厌氧发酵至还原糖耗尽；（5）粉状产品制备：干燥发酵液上清，获得产品。本发明采用生物酶解—双菌发酵偶联技术，制备获得了具有降血糖功能的海藻发酵制品，产品降糖效果优良、方法安全。
Description
技术领域
本发明属于海藻及发酵制品加工技术领域，具体涉及一种基于酵母-乳酸菌分步发酵的降血糖型海藻制品加工预处理方法。
背景技术
关于发酵海藻降血糖的方法，以下文献进行过相关披露：
于婷在《发酵技术改善中药降血糖作用的研究进展》中记载，对灵芝、人参、扯根菜、鸡腿菇等优质中药材进行发酵，发酵后有益成分如真菌多糖类和植物皂苷等得到显著提高，降血糖作用也明显增强；进一步的，若利用指定菌种和发酵方案，有针对性地对中药进行发酵，使发酵中药降糖因子的含量最大化。
该文献仅指出了发酵对中药发酵能够起到降血糖的作用以及一些作用机理，但对于海藻类的发酵是否能增加降血糖作用并未进行披露。
CN108850773A公开了一种富含乳酸菌活菌的海藻发酵固体饮料的制备方法，具体为(1)食用海藻浆的制备:海藻洗净后，绞碎，加入饮用水浸泡后打浆，得到平均粒径≤10um细浆；并加入占海藻浆重量5～25％的蔗糖或葡萄糖搅拌均匀后加热至100℃并在此温度下保温30min，冷却备用；(2)发酵剂的制备:将乳酸菌菌种无菌活化扩大达到10CFU/g以上的乳酸菌液，将干酵母加入糖液中，30～35℃保温 10小时得到活化酵母菌液；(3)海浆发酵:将步骤(1)制得的海藻浆加入0.1～1％的食用酒精，并加入占海藻浆重量0.1～1％的乳酸菌液和占海藻浆重量0.05～1％的活化酵母菌液混合均匀并密封后，调节发酵罐内温度为30～40℃，保温发酵12～48小时，得到富含活性乳酸菌的发酵海藻浆；(4)真空喷雾干燥:将步骤(3)得到的发酵海藻浆用真空喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到富含活性乳酸菌的海藻发酵固体饮料。通过发酵作用，有效消除和遮蔽了海藻的腥味成分，对人体肠道健康具有良好的调节作用。
但该文献没有披露发酵处理后的海藻产品是否具有增加降血糖的保健作用，且食用海藻浆制备工艺较为复杂，仅通过发酵制备，可能会导致海藻营养成分不能被充分利用。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种生物酶解—双菌发酵偶联技术，制备获得了具有降血糖功能的海藻发酵制品。
本发明产品加工方法的具体步骤为：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎；
(2)生物酶解：将(1)粉碎后海藻加水稀释，并加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶、碱性果胶酶进行酶解，获得海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液灭菌，接种酿酒酵母，在发酵罐中好氧发酵，至还原糖耗尽，停止发酵；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液中加入葡萄糖，灭菌，接种植物乳杆菌，并进行厌氧发酵，至还原糖耗尽后，停止发酵；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得产品。
其中，酿酒酵母于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：酿酒酵母AMnb091 Saccharomyces cerevisiae AMnb091，保藏编号：CCTCC NO:M 20211499；
植物乳杆菌于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：植物乳杆菌LP1406 Lactiplantibacillus plantarum LP1406，保藏编号:CCTCC NO:M 20211500。
所述的酿酒酵母与植物乳杆菌的接种量分别为2.5～3.5％(v/v)。
优选的，酿酒酵母与植物乳杆菌的接种量依次为3％(v/v)、3％ (v/v)。
所述的海藻为褐藻中的可食用的任意一种海藻，例如裙带菜、海带、羊栖菜、马尾藻、昆布等。
优选的，(1)中粉碎目数为：30～150目。
更优选的，(1)中粉碎目数120目。
优选的，(2)中，在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：28～32 的固液重量体积比加水，调pH至4.8～5.0，并加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶，在45～55℃下搅拌酶解0.5～1.5h，获得一次酶解液。
更优选的，(2)中，在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液重量体积比加水，调pH至5.0，并加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液。
优选的，(2)中将一次酶解液调pH至7.5～9.0，加入碱性果胶酶，于50～60℃下酶解1～2h，然后于90～100℃下灭酶5～10min，获得二次酶解液，即海藻酶解液。
更优选的，(2)中将一次酶解液调pH至8.0，加入碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液。
优选的，(2)中以海藻的重量计，酸性纤维素酶为2～6wt％，酸性果胶酶为0.2～3wt％；碱性果胶酶为0.2～3wt％。
更优选的，(2)中以海藻的重量计，酸性纤维素酶为2.5wt％，酸性果胶酶为0.25wt％；碱性果胶酶为0.3wt％。
优选的，(3)中将海藻酶解液于110～121℃灭菌15～25min，接种酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.1～0.5，罐压0.05～ 0.07Mpa，溶氧维持在5％～10％，好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为16h～48h。
更优选的，(3)中将海藻酶解液于115℃灭菌20min，接种酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为 48h。
优选的，(4)中，在(3)中的酵母发酵液加入2～4％葡萄糖， 0.2-2％乳清蛋白粉，110～120℃灭菌15～25min，接种植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为 48～72h。
更优选的，在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.25％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h。
基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，包括以下的步骤：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数30～150目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：28～32 的固液体积比加水，调pH至4.8～5.0，并加入2～6wt％酸性纤维素酶、0.2～3wt％酸性果胶酶，在45～55℃下搅拌酶解0.5～1.5h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至7.5～9.0，加入0.2～3wt％碱性果胶酶，于50～60℃下酶解1～2h，然后于90～100℃下灭酶5～10min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于110～121℃灭菌15～ 25min，接种酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.1～0.5，罐压 0.05～0.07Mpa，溶氧维持在5％～10％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为16h～48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2～4％葡萄糖，0.2-2％乳清蛋白粉，110～120℃灭菌15～25min，接种植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48～72h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，包括以下的步骤：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入4.5wt％酸性纤维素酶、3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.5，加入1wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于121℃灭菌15min，接种酿酒酵母3％(v/v)，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为24h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，121℃灭菌20min，接种植物乳杆菌种子液3％(v/v)，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
本发明的有益效果为：
1.本发明所述及的发酵海藻制品具有优异的降糖效果，通过链脲佐菌素(STZ)诱导建立高血糖小鼠模型评价本发明制备产品的功效，结果表明，本发明所提供的发酵海藻制品可降低空腹血糖水平，改善小鼠的氧化应激水平，有较好的降糖活性，表明本发明所制备的发酵海藻制品降糖效果显著；
2.本发明采用先酿酒酵母后植物乳杆菌的两步发酵工艺，可使菌种呈现出优良的生长状态，经益生菌代谢和转化，使海藻中大分子的多糖降解成中低分子量的高活性分子，降糖效果更显著。
3.本发明优选优势益生菌进行发酵，在降解海带的同时，产生γ -氨基丁酸、没食子酸等活性小分子代谢产物，通过协同作用增加了发酵海藻制品的降血糖作用。
附图说明
图1为发酵海藻制品的实物照片；
图2为海藻酶解样品；
图3为发酵海藻制品喷干过程照片。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、1wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.5，加入2wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌20min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.2％乳清蛋白粉，120℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例2
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数40目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：32的固液体积比加水，调pH至4.9，并加入4wt％酸性纤维素酶、2wt％酸性果胶酶，在55℃下搅拌酶解1h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.2，加入2wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶10min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌20min，接种 3％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为24h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，120℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为55h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例3
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数100目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：28的固液体积比加水，调pH至4.8，并加入3.5wt％酸性纤维素酶、2.5wt％酸性果胶酶，在54℃下搅拌酶解1.5h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至7.6，加入1.5wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于97℃下灭酶5min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌15min，接种 3％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为36h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，1.5％乳清蛋白粉，120℃灭菌20min，接种3.2％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为62h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例4
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：32的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入5wt％酸性纤维素酶、2.7wt％酸性果胶酶，在56℃下搅拌酶解0.8h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.3，加入0.6wt％碱性果胶酶，于55℃下酶解2h，然后于99℃下灭酶5min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于118℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为28h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.6％乳清蛋白粉，121℃灭菌15min，接种3.3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例5
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数85目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：34的固液体积比加水，调pH至4.8，并加入3.5wt％酸性纤维素酶、2.3wt％酸性果胶酶，在60℃下搅拌酶解0.6h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.5，加入2.6wt％碱性果胶酶，于52℃下酶解1h，然后于90℃下灭酶6min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于118℃灭菌15min，接种 3.1％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在10％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为30h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.3％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3.1％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例6
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数130目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：29的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入6wt％酸性纤维素酶、3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.3h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至9，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于95℃下灭酶7min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌25min，接种 2.6％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在5％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为21h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入4％葡萄糖， 0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种2.5％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为 66h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例7
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至4.9，并加入4.5wt％酸性纤维素酶、2.5wt％酸性果胶酶，在55℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.5，加入1wt％碱性果胶酶，于55℃下酶解2h，然后于95℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌20min，接种 2.9％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，1.8％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种2.9％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为60h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
实施例8
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数130目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：31的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在52℃下搅拌酶解1h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.8，加入0.7wt％碱性果胶酶，于58℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶9min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌25min，接种 3％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在10％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为21h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3.4％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为70h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例1
本对比例提供了一种基于酵母发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，未采用乳杆菌发酵，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例2
本对比例提供了一种基于乳酸菌发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，未采用酵母发酵，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)植物乳杆菌发酵：将海藻酶解液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，调节初始pH为6.9，接种3.0％(v/v) 植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(4)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例3
本对比例提供了一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，发酵菌种不同，具体步骤如下：
对比例3-1
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)裂殖酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)裂殖酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3.0％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例3-2
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)嗜酸乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3.0％(v/v)嗜酸乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例4
本对比例提供了一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，发酵前未进行生物酶解，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)酿酒酵母发酵：将(1)获得的粉碎海藻于115℃灭菌22min，接种2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(3)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(4)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例5
本对比例提供了一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，发酵前进行了1次生物酶解，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶、0.4wt％碱性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，121℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例6
本对比例提供了一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，发酵前的生物酶解顺序不同，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数120目；
(2)生物酶解：在(1)获得的粉碎海藻中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解 1.5h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，120℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
对比例7
本对比例提供了一种基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，与实施例1的主要区别在于，对海藻预处理制备成海藻浆，具体步骤如下：
(1)海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，用绞碎机绞碎，再加入8～16倍海藻重量的水浸泡40min后分别用粗浆机和细浆机打浆，得到平均粒径≤8um的食用海藻细浆，冷却备用。
(2)生物酶解：在(1)获得的海藻细浆中，按照1：30的固液体积比加水，调pH至5.0，并加入2.5wt％酸性纤维素酶、0.3wt％酸性果胶酶，在50℃下搅拌酶解1.2h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至8.0，加入0.4wt％碱性果胶酶，于60℃下酶解1.5h，然后于90℃下灭酶8min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
(3)酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于115℃灭菌22min，接种 2.5％(v/v)酿酒酵母，调节初始pH为7.0，通风比为0.4，罐压0.07Mpa，溶氧维持在7％，在发酵罐中好氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为48h；
(4)植物乳杆菌发酵：在(3)中的酵母发酵液加入2.5％葡萄糖，0.5％乳清蛋白粉，120℃灭菌20min，接种3％(v/v)植物乳杆菌种子液，厌氧发酵至还原糖含量低于0.2％时，停止发酵，发酵周期为65h；
(5)粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
动物评价方法：将雄性C57BL/6实验小黑鼠置于环境室温 22～28℃，湿度50～60％，明暗各12h，自由饮水和饮食条件下适应性饲养7d；7d后，将小鼠按体重随机分组：空白组、模型组和不同条件的发酵海藻组。空白组喂普通饲料，其它组喂高糖高脂饲料，喂养21d；21d后，全部小鼠禁食不禁水12h，空白组注射100ul新鲜制备的柠檬酸缓冲液，其它组腹腔注射100ul STZ溶液；继续喂养7d后禁食不禁水，12h后测定血糖值，血糖值大于11.1mmol/L即得到链脲佐菌素糖尿病模型小鼠。空白和模型组每日灌胃200μL生理盐水，其它组分别按照实施例和对比例制备的样品每日灌胃200μL发酵海藻样品。灌胃持续4周，首次灌胃前、开始灌胃后每周的最后一天，禁食不禁水12h，测定所有小鼠的空腹血糖值。实验结束前禁食不禁水12h，眼球取血，处死小鼠，收集血清于4℃保存，用于胰岛素水平、MDA、CAT、GSH-PX酶活检测，具体方法按试剂盒严格进行。
将实施例1-8与对比例1-7的发酵海藻产品进行糖尿病小鼠降糖活性测定，检测结果见下表所示。
表1不同试验组对糖尿病小鼠空腹血糖水平、胰岛素水平及对氧化应激的调控能力的影响
从以上表格中的数据可以看出，本发明发酵方式制备的产品对糖尿病小鼠空腹血糖水平、胰岛素水平及对氧化应激的调控能力，均要优于其它的菌种及发酵方式制备的样品。
Claims (10)
1.酿酒酵母与植物乳杆菌在分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的酿酒酵母与植物乳杆菌的接种量均为2.5～3.5%（v/v）。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，酿酒酵母于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：酿酒酵母AMnb091 Saccharomycescerevisiae AMnb091，保藏编号：CCTCC NO: M 20211499；
植物乳杆菌为：植物乳杆菌已于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：植物乳杆菌LP1406 Lactiplantibacillus plantarumLP1406，保藏编号: CCTCC NO: M 20211500。
4.基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，包括以下步骤：
（1）海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎；
（2）生物酶解：将（1）粉碎后海藻加水稀释，并加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶、碱性果胶酶进行酶解，获得海藻酶解液；
（3）酿酒酵母发酵：将海藻酶解液灭菌，接种酿酒酵母，在发酵罐中好氧发酵，至还原糖耗尽，停止发酵；
（4）植物乳杆菌发酵：在（3）中的酵母发酵液中加入葡萄糖，灭菌，接种植物乳杆菌，并进行厌氧发酵，至还原糖耗尽后，停止发酵；
（5）粉状产品制备：发酵液经分离上清后，干燥，获得产品。
5.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，其特征在于：所述的海藻为褐藻中的可食用的任意一种海藻，例如裙带菜、海带、羊栖菜、马尾藻、昆布等。
6.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，其特征在于：（1）海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数30~150目。
7.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，其特征在于：（2）生物酶解：按照1：28～32的固液体积比加水，调pH至4.8～5.0，并加入酸性纤维素酶、酸性果胶酶，在45～55℃下搅拌酶解0.5～1.5h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至7.5～9.0，加入碱性果胶酶，于50～60℃下酶解1～2h，然后于90～100℃下灭酶5～10min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
以海藻的重量计，酸性纤维素酶为2～6wt%，酸性果胶酶为0.2～3wt%；碱性果胶酶为0.2～3wt%。
8.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，其特征在于：（3）酿酒酵母于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：酿酒酵母AMnb091 Saccharomyces cerevisiae AMnb091，保藏编号：CCTCC NO: M 20211499；
（3）中，将海藻酶解液于110～121℃灭菌15～25min，接种酿酒酵母添加量为2.5～3.5%，调节初始pH为7.0，通风比为0.1~0.5，罐压0.05～0.07Mpa，溶氧维持在5%~10%，发酵至还原糖含量低于0.2%时，停止发酵，发酵周期为16h~48h。
9.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，其特征在于：（4）中，植物乳杆菌于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：植物乳杆菌LP1406 Lactiplantibacillus plantarumLP1406，保藏编号: CCTCC NO: M 20211500；
（4）中，在（3）中的酵母发酵液加入2～4%葡萄糖，0.2-2%乳清蛋白粉，110～121℃灭菌15～25min，接种植物乳杆菌种子液添加量为2.5～3%，发酵至还原糖含量低于0.2%时，停止发酵，发酵周期为48~72h。
10.如权利要求4所述的基于酵母-乳酸菌分步发酵获得降血糖型发酵海藻产品的方法，包括以下的步骤：
（1）海藻预处理：将新鲜海藻去除泥沙后，烘干脱水，并用粉碎机处理，粉碎目数30~150目；
（2）生物酶解：在（1）获得的粉碎海藻中，按照1：28～32的固液体积比加水，调pH至4.8～5.0，并加入2～6wt%酸性纤维素酶、0.2～3wt%酸性果胶酶，在45～55℃下搅拌酶解0.5～1.5h，获得一次酶解液；
将一次酶解液调pH至7.5～9.0，加入0.2～3wt%碱性果胶酶，于50～60℃下酶解1～2h，然后于90～100℃下灭酶5～10min，获得二次酶解液，即海藻酶解液；
（3）酿酒酵母发酵：将海藻酶解液于110～121℃灭菌15～25min，接种酿酒酵母添加量为2.5～3%（v/v），调节初始pH为7.0，通风比为0.1~0.5，罐压0.05～0.07Mpa，溶氧维持在5%~10%，在发酵罐中发酵至还原糖含量低于0.2%时，停止发酵，发酵周期为16h~48h；
（4）植物乳杆菌发酵：在（3）中的酵母发酵液加入2～4%葡萄糖，0.2-2%乳清蛋白粉，110～121℃灭菌15～25min，接种植物乳杆菌种子液添加量为2.5～3%（v/v），厌氧发酵至还原糖含量低于0.2%时，停止发酵，发酵周期为48~72h；
（5）粉状产品制备：发酵液经分离上清后，将上清喷干，获得降糖型海藻发酵制品。
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