CN1309826C

CN1309826C - 纳豆激酶纯化工艺

Info

Publication number: CN1309826C
Application number: CNB200410086151XA
Authority: CN
Inventors: 段震文; 郭树仁; 何大林
Original assignee: Beijing Peking University WBL Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Peking University WBL Biotech Co Ltd
Priority date: 2004-10-27
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2007-04-11
Anticipated expiration: 2024-10-27
Also published as: CN1766096A

Abstract

本发明涉及一种纳豆激酶纯化工艺及其肠溶微囊和肠溶微囊制剂工艺。纳豆激酶纯化工艺步骤主要包括：取纳豆芽孢杆菌发酵液或纳豆激酶粗品溶液；离心、上清加硫铵，再离心；取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解，缓冲液室温放置后再离心，取上清，上疏水层析柱，用硫铵梯度洗脱，收集、超滤，得纳豆激酶精品。本发明纳豆激酶微囊剂的微囊丸芯中含由纳豆激酶精品制成的冻干粉38-60%，交联CMC-Na10-25%，微晶纤维素15-30%；其制剂方法为：冻干粉加乙醇溶解，再加交联CMC-Na和微晶纤维素混合，制软材，制丸芯；喷入包衣液包衣，装胶囊。

Description

纳豆激酶纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种生化药物的纯化工艺及其微囊剂和微囊制剂工艺，特别是涉及一种纳豆激酶纯化工艺及其肠溶微囊和肠溶微囊制剂工艺。

背景技术

纳豆(natto)及纳豆激酶(Nattokinase)作为现代食品和功能食品的研发得到国内外普遍重视。纳豆是日本的传统食品，食用已逾千年。纳豆激酶从1987年须见洋行博士发现至今更为人们关注，关注的焦点是食用纳豆激酶食品与人的健康长寿紧密相关。据报道纳豆激酶制品具有很强的溶解纤维蛋白作用，降低血液粘度、降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能。因此纳豆激酶制剂主要用于预防和治疗心脑血栓、脑中风、老年痴呆症等。根据WHO公布的统计数字，全世界现在患有各种血栓性疾病的患者在1500万之多，其中每年约有300万患者死亡，同时还发现这种状况向低年龄化发展。开发纳豆激酶产品作为预防和治疗血栓性疾病、老年痴呆症等具有深远的意义。

目前纳豆激酶的纯化工艺采用以下步骤：疏水层析(填料为Butyl-Toyopearl)、离子交换(填料为CM-Toyopearl)、凝胶过滤(SephadexG-50)以及透析、离心、溶缩等才能得到纳豆激酶的精品(SDS-PAGE呈单条带)，缺点是其制取步骤繁多，不利于放大、生产。

纳豆激酶是一种单链多肽酶。由于测定技术的不同，测得的分子量由27300KD至35000KD不等。根据已测得的氨基酸序列计算出准确分子量为27728KD。纳豆激酶的等电点为8.6±0.3左右。对底物特异性的研究表明，纳豆激酶的最敏感底物为Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA，其次为H-D-Val-Leu-Lys-PNA(S 2251)，对底物S 2238、S 2266和S 2302有一定活性。纳豆激酶在自然pH状态下比较稳定；pH从7升至12时，10min内稳定；pH低于5时，迅速变性失活。

发明内容

本发明目的在于提供一种纳豆激酶纯化工艺；本发明目的还在于提供一种纳豆激酶肠溶微囊及其制剂工艺。

本发明的纳豆激酶纯化工艺是通过如下技术方案实现的：

按常规方法制备纳豆芽孢杆菌发酵液(如02116667.6号专利申请所述)或市售纳豆激酶粗品按常规方法制成制成溶液；3000-6000转/分离心15-30分钟；取上清，加硫铵至饱和度为30-50％；3000-6000转/分离心；取沉淀，用5倍沉淀体积量的含0.8-1.2摩尔/升硫酸铵的磷酸盐缓冲液溶解，缓冲液PH6.0-10.0，0.05摩尔/升；室温放置12-24小时；3000-6000转/分离心15-30分钟；取上清，上疏水层析柱，填料为苯基类疏水层析介质；预先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩尔/升的含0.4-1.0摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；硫铵浓度以0.4-1.0摩尔/升逐渐至零梯度洗脱，时间为约3-6小时，收集活性最高峰；超滤，得纳豆激酶精品。

其中所述的纳豆激酶粗品液体可以按如下方法制成：取100毫克纳豆激酶粗品，溶于20-40毫升pH6-9，0.01-0.05摩尔/升的磷酸盐缓冲液，30-50℃水浴8-12小时；

本发明还提供一种纳豆激酶微囊剂，该微囊剂中的微囊丸芯中含冻干粉38-60％，交联CMC-Na 10-25％，微晶纤维素15-30％；所述冻干粉是由纳豆激酶精品按常规方法加入注射剂的附加剂或附形剂制成冻干粉。

上述纳豆激酶微囊剂中的微囊丸芯中优选冻干粉50％，交联CMC-Na25％，微晶纤维素25％。

本发明的微囊制剂工艺方案是通过如下技术方案实现的：

按本发明方法或者其它常规方法制备纳豆激酶精品，纳豆激酶精品按常规方法加入注射剂的附加剂或附形剂(如右旋糖酐40)制成冻干粉；冻干粉加入浓度为20％-40％乙醇溶液，冻干粉和乙醇溶液的重量比为1∶0.8-1.2，再按冻干粉38-60％，交联CMC-Na 10-25％，微晶纤维素15-30％加入交联CMC-Na和微晶纤维素，混合，制软材，挤出滚圆机制微囊丸芯；30℃烘干；按EUDRAGIT L30D-55(丙烯酸树脂聚合物)40％，柠檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入滑石粉柠檬酸三乙酯，乳匀机高速乳匀30分钟，得包衣液，将其搅拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，搅拌致均匀；将小丸倒入流化床包衣机内，喷入包衣液包衣；包衣参数为：流化床温度25-28℃，喷雾压力0.2Mpa，进风流量0.4-0.45m³/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小时；包衣小丸装胶囊。

本发明纳豆激酶的纯化工艺采用一次柱层析，以Phenyl Sepharose 6Fast flow为填料柱层析，产率高，速度快，可室温操作，条件易控制，处理方便。本发明还发现纳豆激酶相对稳定，从而使纳豆激酶粗品的纯化大为简化。实际上，从发酵液离心后所得的上清开始，通过醇沉(得粗品)、热降解(或盐析)，层析这主要三步，基本上完成了纯化，使工艺大为简化，产品纯度高，成本低，收率较高，可大规模生产。纳豆激酶精品及冻干粉SDS-PAGE显示呈单条带，分子量为28,000-30,000Dalton；凝块溶解时间法测定活性为1020尿激酶单位/毫克；Lowry法测定蛋白质含量为105微克/毫升；澄明度和不溶性微粒符合规定；细菌内毒素检查和无菌实验合格。4℃-10℃保存6个月，复测SDS-PAGE仍呈单条带，分子量为28,000-30,000Dalton；凝块溶解时间法测定活性为1008尿激酶单位/毫克，凝块溶解时间法(CLT)显示精品较粗品的上清液比活性提高10倍以上；Lowry法测定蛋白质含量为103微克/毫升；澄明度和不溶性微粒符合规定。

发明采用肠溶微囊制剂技术，有利于减少活性损失，微囊技术制剂颗粒小，均匀度好，活性损失小，体内生物利用度高。

下列实验例用于说明但不限于本发明。

实验例1：苯基疏水层析填料(Phenyl-)与辛基疏水层析填料(Octyl-)之比较

1.上样量的比较

1.1填料：Phenyl--；柱体积：2.6×30cm；流速：5.8cm/min

表一：苯基填料检测

1.2填料：Octyl--；柱体积：2.6×30cm；流速：5.8cm/min

表二：辛基填料检测

有以上两表可知：苯基填料(Phenyl--)的上样量大些，即每次的样品处理量较辛基(Octyl--)大约20％。

2.流速的比较

2.1填料：Phenyl--；柱体积：2.6×30cm；上样量：5ml

表三：苯基填料检测

2.2填料：Octyl-；柱体积：2.6×30cm；上样量：5ml

表四：辛基填料检测

由表三，四可知，苯基填料的最高流速远大于辛基填料的最高流速；在相同的分离条件下，苯基填料分离纳豆激酶的生产周期远小于辛基填料。

综上所述，苯基填料分离纳豆激酶的上样量和流速均大于辛基填料。生产中使用苯基填料分离纳豆基酶样品处理量较大，生产周期短。

实验例2：微囊检测指标：(注：“2、释放度检查”这一部分文章最后有全文)

1、外观：黄白色小丸，球形圆整，流动性好，小丸粒径400-700μm。

2、释放度检查：溶出测定方法：小杯法，转速：100rpm，温度：37℃，溶出介质：0.1mol/L HCl 150ml中2小时，取样；向溶出杯中加入0.2mol/L磷酸钠溶液50ml，继续溶出45分钟，取样。溶出介质使用前脱气处理。

3、对照样品酶活：分别取上诉6批样品三粒，去调胶囊壳，准确称重，置250ml烧杯中，加入100ml PBS缓冲液(0.2mol/L PH6.8，于37℃水浴45分钟，加磁力搅拌，使其充分溶解，再离心(4000rpm20min)，取上清夜测定酶活。

结果：(1)2小时0.1mol/l盐酸释放液中均未测出酶活；(2)45分钟PH6.8PBS释放酶活及对照样品酶活测定结果，微囊制剂酶活的平均释放度为96％。

实验例3：微囊检测指标：

释放度的检查：溶出测定方法：小杯法，转速：100rpm，温度：37℃，溶出介质：0.1mol/L盐酸150ml中2小时，取样；向溶出杯中加入0.2mol/L磷酸钠溶液50ml，继续溶出45分钟，取样测定酶活。溶出介质使用前脱气处理。

对照样品酶活：准确称取上述微囊样品，置250ml烧杯中，加入100ml PBS缓冲液(0.2mol/L PH6.8)，于37℃水浴45分钟，加磁力搅拌，使其充分溶解，再离心(4000rpm20min)，取上清液测定酶活。

具体实施方式：

实施例1：

纳豆激酶发酵液500毫升，4000转/分离心20分钟；取上清，加硫铵至饱和度为40％；4000转/分离心；取沉淀，溶于50ml 1.0摩尔/升硫酸铵的磷酸盐缓冲液，PH7.0，0.05摩尔/升；室温放置过夜；2000转/分离心15分；取上清，上疏水层析柱；填料为苯基琼脂糖，柱尺寸：内径1.6厘米，高20厘米，预先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩尔/升的含0.8摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；上样量为30ml，流速8ml/min，梯度洗脱；即硫酸铵浓度由0.8摩尔/升逐渐至零，时间约为4小时；

蛋白核酸紫外检测在开始有一个大通过峰，无活性；在硫酸铵浓度接近40％时，出现了一个活性最高峰，收集此峰，超滤除盐得40毫升纳豆激酶精品，收率为15％(精品蛋白质毫克/粗品毫克*100％)；

纳豆激酶精品经SDS-PAGE(考马斯亮兰R250染色和银染法)呈单条带，分子量为28,000-30,000Dalton；凝块溶解时间法测定活性为1500尿激酶单位/毫克；Lowry法(微量法)测蛋白质含量为117.8微克/毫升；比活性为12733尿激酶单位/毫克蛋白质。

实施例2：

取100毫克纳豆激酶粗品，溶于30毫升PH7.4，0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液；40℃水浴10小时；5000转/分离心20分；取上清加硫酸铵，使终溶度达1.0摩尔/升；4000转/分离心20分；取上清，上疏水层析柱，填料为苯基琼脂糖，柱尺寸：内径1.6厘米，高20厘米，予先用PH7.0，0.05摩尔/升的含0.8摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；上样量为10ml，流速8ml/min，梯度洗脱，即硫酸铵浓度由0.8摩尔/升逐渐至零，洗脱时间约3小时；蛋白紫外检测开始有一个大通过峰，无活性；在硫酸铵浓度接近40％时，出现了一个活性最高峰，收集此峰，超过滤除盐得25毫升纳豆激酶精品，收率为20％(精品蛋白质毫克/粗品毫克*100％)；

纳豆激酶精品经SDS-PAGE(考马斯亮兰R250染色和银染法)呈单条带，分子量为28,000-30,000Dalton；凝块溶解时间法测定活性为1200尿激酶单位/毫克；Lowry法(微量法)测蛋白质含量为93.57微克/毫升；比活性为12824尿激酶单位/毫克蛋白质。

实施例3：

将纳豆激酶精品调节浓度为1000尿激酶单位/毫升，加入3％-10％右旋糖酐20-80；分装为1.25毫升/西林瓶，30帕，最低温度为-40℃冷冻干燥24小时；压塞即得纳豆激酶的注射用冻干粉；

取纳豆激酶精品的冻干粉按重量比为1∶1加入浓度为30％乙醇溶液，按冻干粉∶交联CMC-Na∶微晶纤维素制软材，挤出滚圆机制微囊丸芯，30℃烘干；按EUDRAGIT L30D-5540％，柠檬酸三乙酯1％，水59％的比例，在水中加入柠檬酸三乙酯，乳匀机高速乳匀30分钟，得包衣液；将其搅拌加入到EUDRAGIT L30D-55中，搅拌致均匀；将小丸倒入流化床包衣机内，喷入包衣液包衣；包衣参数为：流化床温度25-28℃，喷雾压力0.2Mpa，进风流量0.4-0.45m³/min，包衣液流速2ml/min；包衣后小丸30℃烘箱膜愈合8小时；包衣小丸装胶囊。

纳豆激酶精品肠溶微囊的外观黄白色小丸，球形圆整，流动性好，小丸粒径400-700μm。2小时0.1mol/l盐酸释放液中均无酶活。45分钟PH6.8PBS缓冲液中酶活的释放度约为96％。

Claims

1、一种纳豆激酶纯化工艺，其特征在于该工艺方法由以下步骤组成：

取按常规方法制备纳豆芽孢杆菌发酵液或市售纳豆激酶粗品按常规方法制成的溶液，3000-6000转/分离心15-30分钟；取上清，加硫铵至饱和度为30-50％；3000-6000转/分离心；取沉淀，用5倍沉淀体积量的含0.8-1.2摩尔/升硫酸铵的磷酸盐缓冲液溶解，缓冲液PH6.0-10.0，0.05摩尔/升；室温放置12-24小时；3000-6000转/分离心15-30分钟；取上清，上疏水层析柱，填料为苯基类疏水层析介质；预先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩尔/升的含0.4-1.0摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；硫铵浓度以0.4-1.0摩尔/升逐渐至零梯度洗脱，时间为3-6小时，收集活性最高峰；超滤，得纳豆激酶精品。

2、如权利要求1所述的一种纳豆激酶纯化工艺，其特征在于该工艺方法由以下步骤组成：

取纳豆激酶发酵液500毫升，4000转/分离心20分钟；取上清，加硫铵至饱和度为40％；4000转/分离心；取沉淀，溶于50ml 1.0摩尔/升硫酸铵的磷酸盐缓冲液，PH7.0，0.05摩尔/升；室温放置过夜；2000转/分离心15分；取上清，上疏水层析柱；填料为苯基琼脂糖，柱尺寸：内径1.6厘米，高20厘米，预先用PH6.0-10.0，0.01-0.05摩尔/升的含0.8摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；上样量为30ml，流速8ml/min，梯度洗脱；即硫酸铵浓度由0.8摩尔/升逐渐至零，时间为4小时；收集活性最高峰；超滤，得纳豆激酶精品。

3、如权利要求1所述的一种纳豆激酶纯化工艺，其特征在于该工艺方法由以下步骤组成：取纳豆激酶粗品100毫克，常规方法制成溶液，5000转/分离心20分；取上清加硫酸铵，使终溶度达1.0摩尔/升；4000转/分离心20分；取上清，上疏水层析柱，填料为苯基琼脂糖，柱尺寸：内径1.6厘米，高20厘米，予先用PH7.0，0.05摩尔/升的含0.8摩尔/升硫酸铵磷酸盐缓冲液平衡；上样量为10ml，流速8ml/min，梯度洗脱，即硫酸铵浓度由0.8摩尔/升逐渐至零，洗脱时间3小时；蛋白紫外检测开始有一个大通过峰，无活性；在硫酸铵浓度接近40％时，出现了一个活性最高峰，收集此峰，超过滤除盐得25毫升纳豆激酶精品。

4、如权利要求1或3所述的一种纳豆激酶纯化工艺，其特征在于该工艺方法中纳豆激酶粗品溶液是由如下方法制成，所述方法由以下步骤组成：取100毫克纳豆激酶粗品，溶于20-40毫升pH6-9，0.01-0.05摩尔/升的磷酸盐缓冲液，30-50℃水浴8-12小时。

5、如权利要求4所述的一种纳豆激酶纯化工艺，其特征在于该工艺方法中纳豆激酶粗品溶液是由如下方法制成，所述方法由以下步骤组成：纳豆激酶粗品100毫克，溶于30毫升PH7.4，0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液；40℃水浴10小时，即得。